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CN108136041A - 寡核苷酸缀合方法 - Google Patents

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CN108136041A CN201680058142.0A CN201680058142A CN108136041A CN 108136041 A CN108136041 A CN 108136041A CN 201680058142 A CN201680058142 A CN 201680058142A CN 108136041 A CN108136041 A CN 108136041A
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Abstract

本发明涉及寡核苷酸缀合物领域，及其合成方法。在本方法中，低含水量溶剂环境保证更有效的缀合，减少所需的缀合物部分的量，并提高缀合反应速度。

Description

寡核苷酸缀合方法
发明领域
本发明涉及寡核苷酸缀合物领域及其合成方法。在本方法中，低含水量溶剂环境保证更有效的缀合，减少所需的缀合部分(conjugate moiety)的量，并提高缀合反应速度。
发明背景
最近，寡核苷酸类与非核苷酸部分的缀合一直是关注的焦点，所述非核苷酸部分为寡核苷酸增加额外的功能，例如使治疗性寡核苷酸在体内靶向特定的器官和组织。由于靶向肝脏的肝细胞，已发现能结合至脱唾液酸糖蛋白受体的三价GalNAc缀合部分(conjugation moieties)使剂量大大降低，同时递送有效的治疗作用，参见例如WO2014/118267。WO 2013/033230还描述各种寡核苷酸缀合物，包括抗体、碳水化合物、胆固醇、胰岛素、PEG、转铁蛋白和维生素。因此，寡核苷酸缀合物的生产是非常重要的，特别是当考虑到缀合基团的生产成本增加，以及缀合中额外的处理步骤时。
Milesi等人，Methods in Enzymology(1999)313，164-173页报道寡核苷酸缀合物在无水二甲基亚砜中的合成。Milesi等人所用的方法使用三乙基铵盐将10bp DNA寡核苷酸溶解于DMSO中，然后缀合至亲脂的5’小沟结合的缀合物，并推荐与亲脂性和流体静力学不稳定的基团一起使用。根据Milesi等人，与寡核苷酸相比，使用2.5摩尔当量的缀合基团，并典型地使用高达20摩尔当量的缀合基团。
发明内容
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％(v/v)极性非质子溶剂的溶剂组合物中完成，并且其中溶剂组合物中所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比是小于约2，例如约0.5至约2，并且其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子。
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％二甲基甲酰胺(DMF)(v/v)的溶剂组合物中完成，并且其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子。
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％极性非质子溶剂(v/v)的溶剂组合物中完成，并且其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子，所述亲脂性阳离子包含至少1个亲脂C4-36烷基基团，例如含有至少1个亲脂C4-36烷基基团的季铵阳离子。
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％极性非质子溶剂(v/v)的溶剂组合物中完成，其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子，并且其中所述缀合基团是非亲脂性基团。
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％极性非质子溶剂(v/v)的溶剂组合物中完成，其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子，并且其中所述缀合基团是脱唾液酸糖蛋白受体配体。
本发明提供合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％(v/v)极性非质子溶剂的溶剂组合物中完成，并且其中溶剂组合物中所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比是小于约2，例如约0.5至约2，其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子；其中极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)；并且其中亲脂性阳离子是例如十六烷基三甲基铵。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
i)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
ii)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂(v/v)，并且其中步骤ii)中所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比是约0.5至约2。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
i)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
ii)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂二甲基甲酰胺(DMF)(v/v)。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
i)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
ii)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂(v/v)；并且，其中亲脂性阳离子包含至少1个亲脂C4-36烷基基团，例如含有至少1个亲脂C4-36烷基基团的季铵阳离子。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
i)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
ii)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中步骤i)的溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂(v/v)；并且其中所述缀合基团是非-亲脂性基团。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
i)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
ii)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中步骤i)的有机溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂(v/v)；并且其中缀合基团是脱唾液酸糖蛋白受体配体。
本发明提供合成寡核苷酸酰胺连接的缀合物的方法，其包含下述步骤：
iii)提供含有亲脂性阳离子、极性非质子溶剂的溶剂组合物，以及包含反应活性氨基的寡核苷酸，和
iv)使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应，以生产寡核苷酸酰胺连接的缀合物；
其中溶剂组合物含有至少约85％的极性非质子溶剂二甲基甲酰胺(v/v)，并且其中步骤ii)中所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比是约0.5至约2，并且其中亲脂性阳离子是例如十六烷基三甲基铵。
在本发明的上述实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂可包含例如至多约15％例如至多约10％的质子溶剂例如水和醇。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是极性非质子溶剂和质子溶剂例如水或醇的混合物。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是至少85％极性非质子溶剂(v/v)和至多约15％的水的混合物。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是至少90％极性非质子溶剂(v/v)和至多约10％的水的混合物。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂包含例如至少0.05％诸如至少0.1％、诸如至少0.5％、诸如至少1％的质子溶剂例如水或醇。
术语“方法(method)”和“方法(process)”在本发明的描述中可互换使用。
附图
图1：可用于合成含脂肪族氨基的寡核苷酸的市售氨基联接剂连接体亚磷酰胺的示例。
图2：GalNAc缀合物的示例。对于本发明方法中使用，可以使用所述缀合物的反应活性的酯形式。
图3：水溶液中氨基标记的-寡核苷酸与NHS酯反应2h后的正常转化。清楚的是如果寡核苷酸溶解于水中，相对于氨基标记的寡核苷酸，需要至少两倍摩尔过量的NHS酯。A＝氨基标记的寡核苷酸，且C＝寡核苷酸缀合物。
图4：在无水DMF中2h后，氨基标记的寡核苷酸的CTA盐转化为GalNAc缀合物。发现转化与所用的摩尔当量相关，因此降低所用的NHS酯的摩尔过量是可能的。A＝氨基标记的寡核苷酸，且C＝寡核苷酸缀合物。
图5：在无水DMF中2h后，氨基标记的寡核苷酸的CTA盐转化为洋地黄毒苷缀合物。发现转化与所用的摩尔当量相关，因此降低所用的NHS酯的摩尔过量是可能的。本试验利用不同的NHS酯，并由此形成不同的缀合物类型(洋地黄毒苷)。这确证该反应是广泛适用的。A＝氨基标记的寡核苷酸，且C＝寡核苷酸缀合物。
图6：在无水DMF中2h后，氨基标记的寡核苷酸的CTA盐转化为荧光素缀合物。发现转化与所用的摩尔当量相关，因此降低所用的NHS酯的摩尔过量是可能的。本试验利用不同的NHS酯，并由此形成不同的缀合物类型(荧光素)。这确证该反应是广泛适用的。由于荧光素NHS酯是两种异构体的混合物，存在两个产物峰。A＝氨基标记的寡核苷酸，且C＝寡核苷酸缀合物。
图7：在无水DMF中1h后，氨基标记的寡核苷酸的CTA盐和TEA盐转化为GalNAc缀合物的比较(i)。在DMSO中两种盐之间明显的动力学差异(ii)，表明CTA盐是更有利的。类似地，对于CTA盐，在DMF中，转化得到改善。24h后，在所有情况下，观察到完全转化。A＝氨基标记的寡核苷酸，且C＝寡核苷酸缀合物。
图8：含水量对寡核苷酸缀合功效的影响。
图9：实施例中所用的并且其可以例如用于本发明缀合反应的NHS酯的结构。
详述
本发明提供寡核苷酸缀合领域的众多优点，其提供缀合基团更有效的利用，以及提高缀合率，是当利用不含水或者含很少一部分水的溶剂时候实现的。
寡核苷酸
文中所用的术语“寡核苷酸”定义为本领域技术人员通常理解的包含两个或更多个共价键连接的核苷酸的分子。所述共价键连接的核苷酸还可以称作核酸分子或者低聚体。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成、随后纯化来制备。当提到寡核苷酸序列时，提及的是核碱基部分或其修饰物的序列或顺序，共价连接的核苷酸或核苷的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常将其纯化或分离。本发明的寡核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷或核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。
文中所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能通过杂合至目标核酸特别是目标核酸上的连续序列而调控目标基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本不是双链的，并由此不是siRNAs。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
寡核苷酸可以是修饰的寡核苷酸。术语修饰的寡核苷酸描述含有一个或多个糖-修饰核苷和/或修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语嵌合寡核苷酸是已经在文献中用于描述含修饰核苷的寡核苷酸的术语。
在一些实施方案中，本发明方法的寡核苷酸是反义寡核苷酸、LNA寡核苷酸或gapmer寡核苷酸。
在非限制性实施方案中，寡核苷酸可选自：
5′caGS mCSGStSaSaSaSgSaSgSaSGSG-3′SEQ ID NO 1
5′caGS mCSGStSaSaSaSgSaSgSaSGSGST-3′SEQ ID NO 2
5′-caGS mCSGStSaSaSaSgSaSgSASGSG-3′SEQ ID NO 3
其中大写字母指β-D-氧基-LNA单元；小写字母指DNA单元；下标“s”指硫代磷酸酯(phosphorothioate)连接；上标m指DNA或β-D-氧基-LNA单元，其含有5-甲基胞嘧啶碱基。寡核苷酸还可以含有5’氨基己基连接体。这些可以例如与GalNAc缀合物(例如GalNAc2的NHS活化的酯)一起用于本发明的方法中，以形成下述缀合物：
5′-GN2-C6-caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3′SEQ ID NO 1
5′-GN2-C6′caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3′SEQ ID NO 2
5′-GN2-C6-caGs mCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3′SEQ ID NO 3
GN2-C6指具有C6连接体的GalNAc2载体组件(图2中所示的)。
其他示例性寡核苷酸包括：
5′-AM-C6-GS TS tS gS aS cS aS cS tS gS TS mC-3′(SEQ ID NO 4，化合物1，包含5’氨基己基连接体)。
含有氨基连接体的寡核苷酸
本发明方法的步骤i)中提供的寡核苷酸包含共价连接的氨基基团，还可以将其称作反应活性氨基，其适合于形成氨基连接体。反应活性氨基或氨基连接体可连接在寡核苷酸的任何适当基团上，例如在5’或3’末端基团。氨基可以是脂肪族氨基。氨基连接体可以例如是氨基-烷基连接体或者乙二醇连接体。在一些实施方案中，氨基连接体是C2-12氨基烷基连接体，例如氨基己基连接体。
示例性氨基连接体可选自5′-氨基-修饰物(Modifier)-C12、氨基-修饰物C2、氨基-修饰物C6、N2-氨基-修饰物C6、3′-氨基-修饰物C7、3′-氨基-修饰物C6、3＇-PT-氨基-修饰物C6；或者PC 5′-氨基-修饰物、5′-氨基-修饰物TEG、氨基-修饰物丝氨醇&3'-氨基-修饰物丝氨醇。
图1解释说明可用于本发明中所用的寡核苷酸合成的一些市售氨基连接体。
脂肪族氨基基团是在氮原子上不直接存在芳香环的氨基基团，并因此通常是非-核苷氨基基团。核苷氨基基团是其中氨基基团的氮原子直接连接至嘌呤或嘧啶碱基的芳香环的氨基基团。
脂肪族氨基基团可以是伯氨基或者仲氨基基团。
在一些实施方案中，脂肪族氨基基团选自氨基烷基、烷基氨基烷基、哌啶、哌嗪、吡咯烷和咪唑。
亲脂性阳离子
溶剂组合物中亲脂性阳离子的应用使得有机溶剂组合物中寡核苷酸溶解。通常将亲脂性阳离子以亲脂盐的形式添加到溶剂中。亲脂盐包含亲脂性阳离子和适当的阴离子。适当的亲脂性阳离子的示例包括季铵阳离子，其包含至少一个亲脂取代基例如烷基基团。适当的亲脂性阳离子的另一个示例是季阳离子，其包含至少一个亲脂取代基例如烷基基团。在一些实施方案中，亲脂性阳离子例如季铵/阳离子包含1、2、3或4个亲脂取代基例如1、2、3或4个烷基基团。在一些实施方案中，全部亲脂取代基中存在的碳原子的总数是大于6，例如7～40。在一些实施方案中，各个亲脂取代基(例如烷基取代基)上存在的碳原子的总数是2或更多，例如3或更多，例如4或更多。在一些实施方案中，在至少一个例如1、2、3或4个亲脂取代基(例如烷基取代基)上存在的碳原子的总数是2或更多，例如2-6、4-36或6-36。在一些实施方案中，亲脂性阳离子是三乙铵阳离子。然而，在本发明中已发现：利用含有较长烷基链的亲脂性阳离子是有用的例如C4-36或C6-36烷基基团，例如C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35和C36。在一些实施方案中，亲脂性阳离子包含至少1个C4-36烷基基团。在一些实施方案中，亲脂性阳离子仅包含至少1个C4-C36或者C6-C36烷基基团。在一些实施方案中，亲脂性阳离子包含2个C4-C36或者C6-C36烷基基团。在一些实施方案中，亲脂性阳离子包含3个C4-C36或者C6-C36烷基基团。在一些实施方案中，亲脂性阳离子是季铵或离子，其包含至少1个C4-36烷基基团，并且任选地至多3个其他烷基基团例如C1-3，诸如甲基)。在一些实施方案中，至少1个C4-36烷基是C8-C24烷基例如C12-C20烷基，诸如C16烷基。在一些实施方案中，亲脂性阳离子是十六烷基三甲基铵(鲸蜡基三甲基铵)或者四丁基铵。
亲脂盐还包含适当的阴离子，其可以例如是简单离子，诸如卤素离子如溴或者氯离子。
其他适当的阴离子包括磺酸根阴离子诸如甲苯磺酸根、甲磺酸根；或者羧酸根。
在一些实施方案中，亲脂盐选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基三甲基氯化铵。
溶剂组合物中亲脂性阳离子的量取决于所用的溶剂、盐和寡核苷酸。在一些实施方案中，使用的寡核苷酸中存在的每一磷核苷间连接(phosphorus internucleosidelinkage)(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)，使用至少约0.5摩尔当量的亲脂性阳离子。在一些实施方案中，使用的寡核苷酸中存在的每一磷核苷间连接(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)，使用至少约0.7摩尔当量的亲脂性阳离子。在一些实施方案中，使用的寡核苷酸中存在的每一磷核苷间连接(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)，使用至少约1摩尔当量的亲脂性阳离子。应该认识到：对于其他非磷核苷间连接，可以使用类似摩尔当量的亲脂性阳离子，并且还可以适用于亲脂盐的摩尔当量。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的亲脂性阳离子的浓度是1mM-1M，例如10mM-300mM。
溶剂
本发明方法的溶剂组合物中所用的溶剂是极性非质子溶剂，或者包含至少约85％极性非质子溶剂例如至少90％或者至少95％或者至少99％极性非质子溶剂(v/v)。可以根据其溶解亲脂性阳离子和寡核苷酸的能力，选择溶剂。通常，根据极性，将溶剂分类，并且根据介电常数所指出的，考虑为极性或者非极性的。一般来讲，具有比约5更大的介电常数的溶剂被认为“极性的”，而具有小于5的介电常数的溶剂被认为“非极性的”。
质子溶剂是这样的溶剂，其含有不稳定H+、具有结合至氧(羟基)或氮(氨基)的氢原子，并且易于向试剂贡献质子。相反地，非质子溶剂不包含不稳定H+或者不易于向试剂贡献质子。本发明方法中所用的溶剂组合物可以含有少量极性质子溶剂(例如水或醇诸如乙醇或甲醇)，例如至多15％(v/v)或者至多10％(v/v)。在一些实施方案中，溶剂组合物不包含有机极性质子溶剂。
在本发明的一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂可以包含例如至多约15％诸如至多约10％的极性溶剂如水或醇。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是极性非质子溶剂和质子溶剂例如水或醇的混合物。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是至少85％极性非质子溶剂(v/v)和至多约15％水的混合物。在一些实施方案中，溶剂组合物中存在的溶剂是至少90％极性非质子溶剂(v/v)和至多约10％水的混合物。
可以根据其溶解寡核苷酸和亲脂性盐的能力，选择溶剂组合物中所用的极性非质子溶剂。示例性溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。根据实施例中所示的，DMF是特别受关注的用于本发明方法的溶剂。在一些实施方案中可使用的其他溶剂包括二甲基乙酰胺和环丁砜。在一些实施方案中，溶剂组合物包含DMSO或DMF。在一些实施方案中，本发明组合物中所用的溶剂是DMSO或DMF，任选含有至多15％质子溶剂(例如水或醇，诸如乙醇或甲醇)，例如至多10％质子溶剂(例如水或醇，诸如乙醇或甲醇)。
在一些实施方案中，溶剂组合物中所用的溶剂是DMSO或DMF，任选含有至多15％水例如至多10％的水。
在一些实施方案中，本发明方法中提供的溶剂组合物基本是无水的，例如包含少于0.1％的水，诸如少于0.01％的水如0.005％的水或更少。在一些实施方案中，溶剂组合物包含多于0.01％的水，例如多于0.1％的水，例如多于0.1％的水，例如多于0.5％的水。西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出售的无水DMF和DMSO含有小于0.005％的水。
在一些实施方案中，在有机溶剂组合物中，少量的水(或替代的质子溶剂，例如醇，诸如乙醇或甲醇)是可接受的。事实上如实施例中所述的，存在少量质子溶剂例如水可提高转化率。例如在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件可包含小于15％的水(或者在一些实施方案中，替代的质子溶剂例如醇，诸如乙醇或甲醇)例如小于14％、或者小于13％、或者小于12％、或者小于11％、或者小于10％、或者小于9％、或者小于8％、或者小于7％、或者小于6％、或者小于5％、或者小于4％、或者小于3％、或者小于2％、或者小于1％。基于水体积/极性非质子溶剂的体积，测量含水量。基于质子溶剂的体积/极性非质子溶剂的体积，测量质子溶剂的含量。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含至少0.1％的水，例如至少0.5％的水、例如至少1％的水、例如至少2％的水、例如至少3％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0％-10％的水，例如0％-10％的水、例如0％-9％的水、例如0％-8％的水、例如0％-7％的水、例如0％-6％的水、例如0％-5％的水、例如0％-4％的水、例如0％-3％的水和0％-2％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.01％-10％的水，例如0.01％-10％的水、例如0.01％-9％的水、例如0.01％-8％的水、例如0.01％-7％的水、例如0.01％-6％的水、例如0.01％-5％的水、例如0.01％-4％的水、例如0.01％-3％的水、例如0.01％-2％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.1％-10％的水，例如0.1％-10％的水、例如0.1％-9％的水、例如0.1％-8％的水、例如0.1％-7％的水、例如0.1％-6％的水、例如0.1％-5％的水、例如0.1％-4％的水、例如0.1％-3％的水和0.1％-2％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.5％-10％的水，例如0.5％-9％的水、例如0.5％-8％的水、例如0.5％-7％的水、例如0.5％-6％的水、例如0.5％-5％的水、例如0.5％-4％的水、例如0.5％-3％的水和0.5％-2％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含1％-10％的水，例如1％-9％的水、例如1％-8％的水、例如1％-7％的水、例如1％-6％的水、例如1％-5％的水、例如1％-4％的水、例如1％-3％的水和1％-2％的水。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含2％-10％的水，例如2％-9％的水、例如2％-8％的水、例如2％-7％的水、例如2％-6％的水、例如2％-5％的水、例如2％-4％的水、例如2％-3％的水。应该理解在一些实施方案中，给定的％指精确值，而在其他实施方案中，％指大约值，即任选地提供绝对值周围+/-10％变化。此外，应该理解在一些实施方案中，可以使用替代的质子溶剂例如醇诸如乙醇或甲醇代替部分水或者基本所有的水。
在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含至少0.1％的质子溶剂，例如至少0.5％的质子溶剂、例如至少1％的质子溶剂、例如至少2％的质子溶剂、例如至少3％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0％-10％的质子溶剂，例如0％-10％的质子溶剂、例如0％-9％的质子溶剂、例如0％-8％的质子溶剂、例如0％-7％的质子溶剂、例如0％-6％的质子溶剂、例如0％-5％的质子溶剂、例如0％-4％的质子溶剂、例如0％-3％的质子溶剂和0％-2％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.01％-10％的质子溶剂，例如0.01％-10％的质子溶剂、例如0.01％-9％的质子溶剂、例如0.01％-8％的质子溶剂、例如0.01％-7％的质子溶剂、例如0.01％-6％的质子溶剂、例如0.01％-5％的质子溶剂、例如0.01％-4％的质子溶剂、例如0.01％-3％的质子溶剂和0.01％-2％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.1％-10％的质子溶剂，例如0.1％-10％的质子溶剂、例如0.1％-9％的质子溶剂、例如0.1％-8％的质子溶剂、例如0.1％-7％的质子溶剂、例如0.1％-6％的质子溶剂、例如0.1％-5％的质子溶剂、例如0.1％-4％的质子溶剂、例如0.1％-3％的质子溶剂和0.1％-2％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含0.5％-10％的质子溶剂，例如0.5％-9％的质子溶剂、例如0.5％-8％的质子溶剂、例如0.5％-7％的质子溶剂、例如0.5％-6％的质子溶剂、例如0.5％-5％的质子溶剂、例如0.5％-4％的质子溶剂、例如0.5％-3％的质子溶剂和0.5％-2％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含1％-10％的质子溶剂，例如1％-9％的质子溶剂、例如1％-8％的质子溶剂、例如1％-7％的质子溶剂、例如1％-6％的质子溶剂、例如1％-5％的质子溶剂、例如1％-4％的质子溶剂、例如1％-3％的质子溶剂和1％-2％的质子溶剂。在一些实施方案中，溶剂组合物/反应条件包含2％-10％的质子溶剂，例如2％-9％的质子溶剂、例如2％-8％的质子溶剂、例如2％-7％的质子溶剂、例如2％-6％的质子溶剂、例如2％-5％的质子溶剂、例如2％-4％的质子溶剂、例如2％-3％的质子溶剂。质子溶剂能单独地溶解亲脂性盐或阳离子和寡核苷酸，或者当质子溶剂作为溶剂组合物的一部分时，能溶解亲脂性盐或阳离子和寡核苷酸。在一些实施方案中，质子溶剂选自水和醇(例如乙醇或甲醇)或其混合物。在一些实施方案中，质子溶剂是醇例如乙醇或甲醇或丙醇。
缀合基团
术语“缀合物”旨在表示文中所述的寡核苷酸共价连接(“缀合”)至一种或多种非-核苷酸或非-多核苷酸部分而形成的异种(heterogenous)分子。缀合基团包含或者是非-核苷酸或非-多聚核苷酸部分(moiety)。术语缀合基团和缀合部分可在文中互换使用。
在一些实施方案中，缀合基团包含或者是碳水化合物、非-核苷碳水化合物或碳水化合物复合物。在一些实施方案中，碳水化合物选自半乳糖、乳糖、n-乙酰半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。
在一些实施方案中，缀合基团包含或者选自蛋白质、糖蛋白、多肽、肽、抗体、酶和抗体片段。
在一些实施方案中，缀合基团是亲脂性部分例如选自脂质、磷脂、脂肪酸和甾醇的部分(moiety)。
在一些实施方案中，缀合基团选自小分子药物、毒素、报道分子和受体配体。
在一些实施方案中，缀合基团是或者包含维生素。水溶性维生素包括硫胺素、核黄素、烟酸或尼克酸、维生素B6吡哆醛组、泛酸、生物素、叶酸、肌醇、胆碱和抗坏血酸。脂溶性维生素包括维生素A家族、维生素D、维生素E生育酚家族和维生素K(和叶绿醇)。
在一些实施方案中，报道分子选自洋地黄毒苷(digoxigenin)和荧光素(fluorescein)。可以使用的其他报道分子包括荧光探针或荧光蛋白例如GFP或者酶报道蛋白例如荧光素酶。
在一些实施方案中，缀合基团是聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇。
在一些实施方案中，缀合基团是或者包含脱唾液酸糖蛋白受体靶向基团，其可以包括例如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-n-丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。在一些实施方案中，缀合基团包含半乳糖簇(cluster)例如N-乙酰半乳糖胺三聚体。在一些实施方案中，缀合基团包含GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)，例如单价、二价、三价、或四价的GalNAc。三价GalNAc缀合物可用于将化合物靶向肝脏(参见例如US 5,994517和Hangeland等人，Bioconjug Chem.1995Nov-Dec；6(6)：695-701，WO2009/126933，WO2012/089352，WO2012/083046，WO2014/118267，WO2014/179620&WO2014/179445)，参见图2中的具体实施例。所述GalNAc参考文献和其中所用的具体缀合物引入文中作为参考。适当地，所用的GalNAc部分可以是反应活性酯的形式。
在一些实施方案中，本发明方法中所用的GalNAc缀合基团是或者包含：
其中T2是反应活性的酯基团。
在一些实施方案中，缀合基团不是亲脂性的。在一些实施方案中，缀合基团不是小沟结合部分。小沟结合分子通常由一系列杂环或者芳香烃环(其具有旋转自由)构成。这保证所述分子代替水，适配到DNA双螺旋的小沟里。在一些实施方案中，缀合基团不包含：
活化的酯
活化的酯通常用于有机化学中，作为羧酸的活化试剂。然后，活化的酸例如与胺反应，形成酰胺。
在一些实施方案中，缀合基团包含活化的酯基，其用于与氨基连接体的氨基基团反应，形成寡核苷酸酰胺连接的缀合物。在一些实施方案中，活化的酯可以在缀合之前原位制备或者可以在单独的化学反应中制备然后纯化。适当活化的酯基可以例如选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、五氟苯基(PFP)酯、磺基四氟苯基(STP)酯、O-酰基异脲、羟基苯并三唑(HOBt)酯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)酯和酸酐。
缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率
本发明方法的优点之一是降低缀合反应中所需缀合基团的量，实现寡核苷酸的高效缀合，即使当利用小于2的缀合物与寡核苷酸的摩尔比率时。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是小于约2，例如小于约1.8、例如小于约1.6、例如小于约1.5、例如小于约1.4、例如小于约1.3、例如小于约1.2、例如小于约1.1、例如约1。
在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是大于约0.25，例如大于约0.5、例如大于约0.75。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是约0.25-约2，例如约0.5-约2、例如约0.75-约2。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是约0.25-约1.5，例如约0.5-约1.5、例如约0.75-约1.5。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是约0.25-约1.5，例如约0.5-约1.5、例如约0.75-约1.5。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是约0.25-约1.25，例如约0.5-约1.25、例如约0.75-约1.25。在一些实施方案中，所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是约0.8-约1.2，例如约0.9-约1.1。在一些实施方案中，使用化学计算量的缀合基团和寡核苷酸(即比率为约1)。
溶剂组合物的制备
溶剂组合物可以例如通过下述准备步骤制备：
a)提供包含含有反应活性的氨基基团的寡核苷酸的含水(aqueous)组合物；
b)加入亲脂性盐，以形成寡核苷酸盐沉淀；
b)除去步骤b)的产物中的水，以提供水减少的组合物或者基本干燥的组合物，
c)将步骤b)中获得的水减少的组合物或者基本干燥的组合物溶解于极性非质子溶剂例如DMF或DMSO中，以提供溶剂组合物。
利用技术人员已知的任何适当方法，例如通过用溶剂过滤、蒸发例如在真空容器或者通过冷冻干燥蒸发或者离心蒸发，可将水从含水溶剂中除去。在一些实施方案中，将寡核苷酸用溶剂例如丁醇、乙腈、二氧六环、THF或丙酮洗涤，并可通过离心或过滤收集。可以利用这些溶剂，通过另外的洗涤步骤除去额外的水，并且然后可通过例如真空下蒸发，除去洗涤溶剂。还可以将水或替代的质子溶剂(例如醇诸如乙醇或甲醇)加入，以优化缀合步骤的水/质子溶剂的水平。
在一些实施方案中，步骤a)中寡核苷酸的含水溶液的摩尔浓度是约0.1mM至约1M，例如约1mM至约100mM、例如约10mM至约20mM。
在一些实施方案中，步骤c)的寡核苷酸的溶剂溶液的摩尔浓度是约0.1mM至约1M，例如约1mM至约100mM、例如约10mM至约20mM。
在一些实施方案中，步骤a)中寡核苷酸的含水溶液的摩尔浓度是在溶剂溶液(例如DMF或DMSO)中的约10mM至约20mM寡核苷酸和约5-10mM、例如约9mM诸如约8.8mM的寡核苷酸。
转化率
转化率确定为寡核苷酸缀合物的量与反应步骤中所用的寡核苷酸的量相比的摩尔比率。在一些实施方案中，来自寡核苷酸的寡核苷酸缀合物产物的转化速是至少约50％、例如至少约75％、例如至少约80％、例如至少约85％、例如至少约90％、例如至少约95％。
定义
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建块，并且对于本发明，核苷酸包括天然存在和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸还可交换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
文中所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分的修饰而修饰的核苷。在一优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2’取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语修饰的核苷还可以与术语“核苷类似物”或者修饰的“单元”或者修饰的“单体”可交换地用于文中。
修饰的核苷间连接(Modified internucleoside linkage)
将术语“修饰的核苷间连接”定义为技术人员普遍理解的，除磷酸二酯(PO)连接之外的连接，所述连接将两个核苷共价偶联在一起。具有修饰的核苷间连接的核苷酸还称为“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯连接相比，修饰的核苷间连接提高寡核苷酸的核酸酶抵抗。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括邻近的核苷之间形成磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间连接特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并可在本发明的寡核苷酸的DNA或RNA核苷区域例如gapmer寡核苷酸的缺口区域内，以及在修饰的核苷的区域内，起到保护免受核酸酶裂解的作用。
在一实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核苷间连接，其由天然磷酸二酯修饰成例如对核酸酶攻击更耐受的连接。可以通过在血清中温孵寡核苷酸或者通过使用核酸酶抵抗测试(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))，测定核酸酶抵抗，所述都是本领域众所周知的。能提高寡核苷酸的核酸酶抵抗的核苷间连接称作核酸酶耐受的核苷间连接。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间连接是修饰的，例如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％、例如至少70％、例如至少80％或者例如至少90％的核苷间连接是修饰的。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是修饰的。应该理解：在一些实施方案中，将本发明的寡核苷酸连接至非-核苷酸官能团例如缀合物的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是核酸酶耐受的核苷间连接。
修饰的核苷间连接可选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(diphosphorothioate)和硼烷磷酸酯(boranophosphate)。在一些实施方案中，修饰的核苷间连接与本发明的寡核苷酸的RNaseH募集是兼容的，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。在一些实施方案中，核苷间连接包含硫(S)，例如硫代磷酸酯核苷间连接。由于核酸酶抵抗、有利的药代动力学和易于生产，硫代磷酸酯核苷间连接是特别有用的。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少50％的核苷间连接是硫代磷酸酯，例如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少60％、例如至少70％、例如至少80％或者例如至少90％的核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间连接是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种中性核苷间连接，特别是选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3(amide-3)、formacetal或thioformacetal的核苷间连接。
此外，核苷间连接公开于WO2009/124238(引入文中作为参考)中。在一实施方案中，核苷间连接选自WO2007/031091(引入文中作为参考)中公开的连接体。特别是，核苷间连接可选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-和/或核苷间连接体可选自-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
当与目标核酸形成双螺旋时，在能募集核酸酶的寡核苷酸区域例如gapmer的G区域或者头聚物(headmer)和尾聚物(tailmer)的非-修饰核苷区域，核酸酶耐受的连接例如硫代磷酸酯连接是特别有用的。然而，硫代磷酸酯连接还可以用于非-核酸酶募集区域和/或增加亲合力区域例如gapmer的F和F’区域或者头聚物和尾聚物的修饰核苷区域。
然而，每个设计的区域可包含除硫代磷酸酯之外的核苷间连接，例如磷酸二酯连接，特别是在修饰的核苷例如LNA保护连接免于核酸酶降解的区域中。特别是在修饰的核苷单元之间或者与修饰的核苷单元邻近(通常在非-核酸酶募集区域)的磷酸二酯连接例如一个或两个连接的引入，可改良寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布–参见WO2008/113832，将其引入文中作为参考。
在一实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接是硫代磷酸酯和/或硼烷磷酸酯连接。优选地，寡核苷酸的所有核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
核碱基
术语核碱基包括核苷和核苷酸中存在的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包含修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间是有功能的。在一些实施方案中，通过修饰或替换核碱基，修饰核碱基部分。在上下文中，“核碱基”指天然存在的核碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。所述变体是例如Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，45卷，2055页和Bergstrom(2009)，Current Protocols in Nucleic Acid ChemistrySuppl.37 1.4.1中所述的。
在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶变为修饰的嘌呤或嘧啶，例如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶(5-thiozolo-cytosine)、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴脲嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶(5-thiazolo-uracil)、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基，来修饰核碱基部分。
可利用各相应核碱基的字母代码例如A、T、G、C或U表示核碱基部分，其中各字母可任选地包括功能同等的修饰的核碱基。例如在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmers，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
LNA寡核苷酸
LNA寡核苷酸是包含至少一个LNA核苷的寡核苷酸。因此，本发明涉及制备LNA反义寡核苷酸缀合物的方法。LNA寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。
将文中所用的术语寡核苷酸定义为技术人员通常所理解的，包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。对于用作反义寡核苷酸，寡核苷酸通常合成为7-30核苷酸长度。LNA反义寡核苷酸通常包含一种或多种修饰的核苷间连接，并且作为非限制性实例，可以是LNAgapmer或混合翼(mixed wing)gapmer。在一些实施方案中，寡核苷酸可以是LNA mixmer(LNA和非-LNA核苷酸，例如LNA和DNA(参见例如WO2007/112754，引入文中作为参考)，或者LNA和2’-O-MOE核苷酸，或者LNA、DNA和2’O-MOE核苷酸)，或者LNA totalmers(仅LNA核苷酸–参见例如WO2009/043353，引入文中作为参考)。
连接体
连接(linkage)或连接体(linker)是两个原子之间的联接(connection)，其通过一个或多个共价键，将关注的化学基团或片段连接至另一个关注的化学基团或片段。缀合部分可直接或通过连接部分(例如连接体或连接链(tether))，连接至寡核苷酸。连接体用于共价连接第三区域例如缀合基团至第一区域诸如寡核苷酸(区域A)。
在本发明的上下文中，连接体可包含氨基基团，例如脂肪族氨基基团诸如伯或仲脂肪族氨基基团。在一些实施方案中，连接体是脂肪族氨基烷基例如C2-C36脂肪族氨基烷基基团，包括例如C6-C12脂肪族氨基烷基基团。在一些实施方案中，连接体是C6脂肪族氨基烷基基团。在一些实施方案中，寡核苷酸包含DNA磷酸二酯核苷酸区域，例如1-5DNA PO核苷酸，其位于反义寡核苷酸和脂肪族氨基连接体之间，例如寡核苷酸5’或3’末端-参见WO2014/076195，将其引入文中作为参考。
锁核酸核苷(LNA)
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个LNA核苷。LNA核苷是修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖糖环的C2’和C4’之间的连接体基团(称作二基(biradicle)或桥)。在文献中所述核苷还称作桥连的核酸或二环核酸(BNA)。
示例性LNA核苷包括图1中所示的那些：
图1
如实例中所示，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是或包含β-D-氧基-LNA核苷。
Gapmer
文中所用的术语gapmer指包含募集RNase H的寡核苷酸的区域(gap)的反义寡核苷酸，所述区域通过一个或多个增加亲合力的修饰的核苷(侧翼)带有5’和3’侧翼。文中描述各种gapmer设计。头聚物和尾聚物是能募集RNase H的寡核苷酸，其中一个侧翼是缺失的，即仅寡核苷酸的一个末端包含增加亲合力的修饰的核苷。对于头聚物，3’侧翼是缺失的(即5’侧翼包含增加亲合力的修饰的核苷)，并且对于尾聚物，5’侧翼是缺失的(即3’侧翼包含增加亲合力的修饰的核苷)。
LNA Gapmer
术语LNA gapmer是一种gapmer寡核苷酸，其中至少一个增加亲合力的修饰的核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，本发明方法中所用的寡核苷酸是LNA gapmer。
混合翼gapmer
术语混合翼gapmer指LNA gapmer，其中侧翼区域含有至少一个LNA核苷和至少一个非-LNA修饰的核苷，例如至少一个2’取代的修饰的核苷，诸如2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，混合翼gapmer具有包含LNA核苷的一个侧翼(例如5’或3’)，并且另一个侧翼(3’或5’)包含2’取代的修饰的核苷。
长度
当提到文中所述的核苷酸分子的长度时，长度对应于单体单元即核苷酸的数量，不考虑所述单体单元是否是核苷酸或核苷酸似物。对于核苷酸，术语单体和单元可在文中互换使用。
本发明方法特别适合于短的寡核苷酸缀合物的制备，例如其由7-30个核苷酸例如7-10个、诸如7、8、9、10，或者10-20个核苷酸例如12-18个核苷酸诸如12、13、14、15、16、17或18个核苷酸构成。
实施例
除非另外说明，在20–25℃的室温，完成实施例。eq＝当量，并且是摩尔比率。
实施例中所用的氨基标记的寡核苷酸是
5'-AM-C6SGSTStSgSaScSaScStSgSTS mC-3(SEQ ID NO 4).
其中大写字母指β-D-氧基-LNA单元；小写字母指DNA单元；下标“s”指硫代磷酸酯连接；上标m指DNA或β-D-氧基-LNA单元，其含有5-甲基胞嘧啶碱。AM-C6是氨基己基连接体。
寡核苷酸钠盐的摩尔质量是4398.3g/mol。寡核苷酸CTA盐的摩尔质量是7536.9g/mol。
氨基标记的寡核苷酸和缀合基团向缀合寡核苷酸(也称作缀合物)的转化测定为缀合物峰的面积除以缀合物和氨基标记的寡核苷酸峰的总面积。
实施例1从钠盐的寡核苷酸CTA盐的形成
方法1：利用固体CTACl
在搅拌下，向氨基标记的寡核苷酸(250mg，56.8μmol)的2.5mL水溶液中，加入十六烷基三甲基氯化铵(CTACl)(220mg，688μmol)。所述量相应于1当量/寡核苷酸中存在的“磷酸酯”基团。(存在12个硫代磷酸酯基团：688μmol/(56.8mmol*12)＝1.01)。CTACl的加入致使所需的寡核苷酸十六烷基三甲基氯化铵盐沉淀产生。经离心分离沉淀，并用水洗涤。将固体物经冻干法干燥过夜。寡核苷酸CTA盐的分离产量是414mg，相应于97％的产率。
根据260nm UV吸收测定，上清液是基本无氨基标记的寡核苷酸的，表明所有寡核苷酸沉淀为CTA盐。
方法2：利用CTACl水溶液
在搅拌下，向氨基标记的寡核苷酸(250mg，56.8μmol)的2.5mL水溶液中，加入十六烷基三甲基氯化铵(CTACl)(220mg，688μmol)的1mL水溶液。所述量相应于1当量/寡核苷酸中存在的“磷酸酯”基。(存在12个硫代磷酸酯基团：688μmol/(56.8mmol*12)＝1.01)。CTACl溶液的加入致使所需的寡核苷酸十六烷基三甲基氯化铵盐沉淀产生。经离心分离沉淀，并随后用水洗涤。将固体物经冻干法干燥过夜。寡核苷酸CTA盐的分离产量是419mg，相应于98％的产率。
根据260nm UV吸收测定，上清液是基本无寡核苷酸的，表明所有寡核苷酸沉淀为CTA盐。
方法2是优选的，因为沉淀是更易于处理的，因为CTACl已经在溶液中，并不需要在寡核苷酸CTA盐沉淀的同时被引入到溶液中。
实施例2 GalNAc2 NHS酯的制备
向GalNAc2羧酸(45mg，31μmol)的DMF(0.9mL)溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(3.9mg，34μmol)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(6.5mg，34μmol)。使溶液反应16h，并直接用于寡核苷酸缀合。
实施例3 GalNAc2 NHS酯与水溶液中的氨基标记的寡核苷酸钠盐缀合
向氨基标记的寡核苷酸钠盐(4.4mg，1.0μmol)的100μL 20mM NaHCO3缓冲液(pH8.5)溶液中，加入二异丙基乙胺(1.8μL，10μmol，10eq)和来自34mM贮备液(根据实施例2中所述制备)的所需当量的GalNAc2 NHS酯，如下表1中所示。使反应进行2h，随后用反相LC-MS分析反应混合物。
表1氨基标记的寡核苷酸水溶液和GalNAc2 NHS酯的当量
如图3中所示的，如果将寡核苷酸溶解于纯水中，相对于氨基标记的寡核苷酸，需要至少两倍摩尔过量的NHS酯。
实施例4 GalNAc2 NHS酯与氨基标记的寡核苷酸CTA盐的N,N-二甲基甲酰胺溶液缀合
制备氨基标记的寡核苷酸CTA盐贮备液(根据实施例1的方法2制备的)的1.5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，以产生浓度8.8mM的溶液。
向100μL所述氨基标记的寡核苷酸CTA盐(0.88μmol)的溶液中，加入二异丙基乙胺(DIPEA)(1.4μL，7.9μmol，9eq)，和来自34mM浓度的在DMF中的贮备液(根据实施例2中所述制备)的所需量的GalNAc2 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，如下表2中所述。使反应进行至多24h。1h、2h和24h后，分析反应。用反相LC-MS分析缀合效率。结果用图4图示。发现与寡核苷酸相比，转化率与所用缀合基团的摩尔当量相关，因此实现缀合基团向寡核苷酸缀合物的100％转化。发现：转化对应于所用的摩尔当量，因此与实施例3相比，显著提高。
表2氨基标记的寡核苷酸DMF溶液和GalNAc2 NHS酯的当量
实施例5洋地黄毒苷NHS酯与氨基标记的寡核苷酸CTA盐的N,N-二甲基甲酰胺溶液缀合
如实施例4中所述，制备氨基标记的寡核苷酸CTA盐(100mg，13.2μmol)在1.5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的贮备溶液。
向100μL氨基标记的寡核苷酸CTA盐(0.88μmol)的溶液中，加入二异丙基乙胺(DIPEA)(1.4μL，7.9μmol，9eq.)，和来自DMF中的浓度为40mM的储备溶液的所需量的洋地黄毒苷N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，如下表3中所述。使反应进行2h。2小时后对反应进行分析。用反相LC-MS分析缀合效率。结果在图5中图示。发现与寡核苷酸相比，转化率与所用缀合基团的摩尔当量相关，因此实现缀合基团向寡核苷酸缀合物的100％转化。发现：转化对应于所用的摩尔当量。本试验利用不同于实施例4的NHS酯，并由此形成不同的缀合物类型(洋地黄毒苷)。这确证反应条件是广泛适用的。
表3氨基标记的寡核苷酸的DMF溶液和洋地黄毒苷NHS酯的当量
实施例6荧光素NHS酯与氨基标记的寡核苷酸CTA盐的N,N-二甲基甲酰胺溶液缀合
根据实施例4中所述，制备氨基标记的寡核苷酸CTA盐(100mg，13.2μmol)在1.5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的贮备溶液。
向100μL氨基标记的寡核苷酸CTA盐(0.88μmol)的所述溶液中，加入二异丙基乙胺(DIPEA)(1.4μL，7.9μmol，9eq.)和来自DMF中的浓度为40mM的储备溶液的所需量的荧光素N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，如下表4中所述。使反应进行2h。2h后分析反应。用反相LC-MS分析缀合效率。结果在图6中图示。发现与寡核苷酸相比，转化率与所用缀合基团的摩尔当量相关，因此实现缀合基团向寡核苷酸缀合物的100％转化。发现：转化对应于所用的摩尔当量。本试验利用不同于实施例4和5的NHS酯，并由此形成不同的缀合物类型(荧光素)。这确证反应条件是广泛适用的。
表4氨基标记的寡核苷酸的DMF溶液和荧光素NHS酯的当量
实施例7由CTA盐形成寡核苷酸钠盐
缀合反应完成后，利用两种方法之一，使寡核苷酸沉淀为钠盐，以保证利用常规方法例如离子交换色谱或反相色谱纯化。
方法1)利用NaCl水溶液和乙醇
向1mL缀合寡核苷酸CTA盐(例如根据实施例4-6中制备的)的DMF溶液中，加入0.2mL NaCl水溶液(2M)，随后加入乙醇(5mL)，这使寡核苷酸的钠盐沉淀。利用离心，回收沉淀。
方法2)利用2％NaClO4(w/v)的丙酮溶液
向1mL缀合寡核苷酸CTA盐(例如根据实施例4-6中制备的)的DMF溶液中，加入2％NaClO4(w/v)的丙酮(5mL)溶液，这使寡核苷酸的钠盐沉淀。利用离心，回收沉淀。
实施例8在无水N,N-二甲基甲酰胺和在无水二甲基亚砜中，1h后，氨基标记的寡核苷酸的CTA盐和TEA盐向GalNAc2缀合物转化的比较
根据Milesi等人(Methods in Enzymology(1999)313，164-173页)的方法，制备氨基标记的寡核苷酸的三乙铵(TEA)盐。
分别在无水DMF和无水DMSO中，以8.8mM的浓度，制备TEA盐的溶液。
分别在无水DMF和无水DMSO中，以8.8mM的浓度，制备CTA盐的溶液。
根据实施例2中所述，在DMF中，以34mM浓度，制备GalNAc2 NHS酯的溶液。
根据上述，利用制备的溶液，按照下述通用方法，准备四个反应。
向100μL氨基标记的寡核苷酸(0.88μmol)溶液中，加入二异丙基乙胺(DIPEA)(1.4μL，7.9μmol，9eq.)，GalNAc2 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(26μL，0.884μmol)。1h后分析反应。用反相LC-MS分析缀合效率。在图7和下表5中，显示结果。
发现：1小时后，CTA盐的转化比TEA盐更高。当利用DMSO作溶剂时，效果是特别显著的，表明CTA盐的转化率通常比TEA盐更高，并且此外DMF作为溶剂，产生更高的反应率。
24h反应时间后，在所有情况下，观察到完全转化。
表5与GalNAc2 NHS酯反应的氨基标记的寡核苷酸CTA盐和TEA盐的转化
实施例9–含水量对寡核苷酸缀合效率的影响
在1.5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中制备氨基标记的寡核苷酸CTA盐(100mg，13.2μmol)的储备溶液，以形成8.8mM浓度的溶液。
根据实施例2中所述，在DMF中，以34mM浓度，制备GalNAc2 NHS酯的溶液。
根据下表6，制备含不同量的水的10种反应混合物。
根据下表，向40μL氨基标记的寡核苷酸CTA盐(0.35μmol)的溶液中加入水，二异丙基乙胺(DIPEA)(0.6μL，3.4μmol，10eq.)和GalNAc2 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(9.5μL，0.32μmol)。使反应进行24h。
随后，将反应混合物用0.5mL DMF稀释，以保证样品的完全均一性。利用2.5mL 2％NaClO4，将寡核苷酸从反应混合物中沉淀，并经离心回收。将得到的沉淀物溶解于1mL H2O中，并用反相LC-MS分析。在图8和下表6中，显示结果。
可以发现：在反应混合物中，用至多14％水，可以实现85％或以上的转化。所述是有利的，因为反应中所用的溶液不需要是100％无水的。
表6在不同量的水中，与GalNAc2 NHS反应的氨基标记的寡核苷酸CTA盐的转化

Claims (22)

1.合成酰胺连接的寡核苷酸缀合物的方法，其包含使缀合基团与寡核苷酸的反应活性氨基反应的步骤，其中所述反应步骤是在含有至少约85％(v/v)极性非质子溶剂的溶剂组合物中完成，其中溶剂组合物中所用的缀合基团/寡核苷酸的摩尔比是约0.5至约2，并且其中溶剂组合物含有亲脂性阳离子。
2.根据权利要求1的方法，其中缀合基团包含活化的酯基。
3.根据权利要求1或2的方法，其中溶剂组合物中存在的溶剂包含至少约85％的极性非质子溶剂(v/v)和至多约15％(v/v)的质子溶剂，质子溶剂选自水或醇(例如乙醇或甲醇)或其混合物。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的方法，其中亲脂性阳离子是季铵阳离子或季阳离子。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法，其中亲脂性阳离子包含至少一个亲脂性C4-36烷基基团。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其中亲脂性阳离子是季四烷基铵盐，其包含至少一个亲脂性C4-36烷基基团，例如四丁基铵或十六烷基三甲基铵。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的方法，其中寡核苷酸包含利用核苷间连接的6-30个磷连接的核苷，所述核苷间连接独立或依赖地选自磷酸酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。
8.根据任何权利要求7所述的方法，其中寡核苷酸是硫代磷酸酯寡核苷酸。
9.根据权利要求1-8中任何一项所述的方法，其中寡核苷酸中存在的每一磷核苷间连接，使用至少0.5摩尔当量的亲脂性阳离子。
10.根据权利要求1-9中任何一项所述的方法，其中极性非质子溶剂选自二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。
11.根据权利要求1-9中任何一项所述的方法，其中极性非质子溶剂选自二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
12.根据权利要求1-9中任何一项所述的方法，其中极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺。
13.根据权利要求1-12中任何一项所述的方法，其中活化的酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、五氟苯基(PFP)酯、磺基四氟苯基(STP)酯、O-酰基异脲、酸酐。
14.根据权利要求1-13中任何一项所述的方法，其中寡核苷酸的反应活性氨基基团存在于氨基连接体上，例如氨基-C1-6-烷基连接体或者氨基乙二醇连接体。
15.根据权利要求14的方法，其中氨基连接体包括氨基己基连接体。
16.根据权利要求1-15中任何一项所述的方法，其中缀合基团是或包含非-核苷酸部分，其选自蛋白质例如酶、抗体或抗体片段或肽；亲脂部分例如脂质、磷脂、甾醇；聚合物，例如聚乙二醇或聚丙二醇；受体配体；小分子；报道分子；维生素；和非-核苷碳水化合物。
17.根据权利要求1-16中任何一项所述的方法，其中缀合基团是或包含碳水化合物部分。
18.根据权利要求17中所述的方法，其中碳水化合物基团是脱唾液酸糖蛋白受体配体。
19.根据权利要求16-18中任何一项所述的方法，其中缀合基团包含一个或多个n-乙酰基半乳糖残基，例如一个或多个GalNAc残基。
20.根据权利要求16-19所述的方法，其中缀合基团包含三价GalNAc碳水化合物部分。
21.根据权利要求1-20中任何一项所述的方法，其中缀合基团/寡核苷酸的摩尔比率是小于1.5，例如小于1.2，例如约1。
22.根据权利要求1-21中任何一项所述的方法，其中源自寡核苷酸的寡核苷酸缀合物产物的转化率是至少50％，例如至少75％。
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