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KR20140044324A - 페길화된 올리고뉴클레오티드의 제조방법 - Google Patents

페길화된 올리고뉴클레오티드의 제조방법 Download PDF

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KR20140044324A
KR20140044324A KR1020137031212A KR20137031212A KR20140044324A KR 20140044324 A KR20140044324 A KR 20140044324A KR 1020137031212 A KR1020137031212 A KR 1020137031212A KR 20137031212 A KR20137031212 A KR 20137031212A KR 20140044324 A KR20140044324 A KR 20140044324A
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KR
South Korea
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pegylated
oligonucleotides
oligonucleotide
ultrafiltration
impurities
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020137031212A
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English (en)
Inventor
더글라스 브룩스
크리스토퍼 피. 루스코니
Original Assignee
레가도 바이오사이언스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 레가도 바이오사이언스, 인코포레이티드 filed Critical 레가도 바이오사이언스, 인코포레이티드
Publication of KR20140044324A publication Critical patent/KR20140044324A/ko
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Abstract

치료용 페길화 올리고뉴클레오티드의 제조방법을 기술하였다. 본 방법은 효율을 개선하기 위해 설계된 합성, 분해 및 정제 스텝을 포함하며, 이 방법으로 치료용 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 또한, 개선된 효율의 대량 제조방법을 기술하였다.

Description

페길화된 올리고뉴클레오티드의 제조방법{A METHOD FOR MANUFACTURING PEGYLATED OLIGONUCLEOTIDES}
관련 출원
본 출원은 2011년 4월 26일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/479,226호에 대하여 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 참조로 여기에 포함되었다.
핵산은 일반적으로 생물학적 공정에서 주로 정보 역할을 하는 것으로 생각되어 왔다. 지난 수십 년 내에 핵산 3차원 구조가 단백질과 상호작용하고 단백질을 조절하는 능력을 핵산에 제공할 수 있다는 것이 명백하게 되었다. 이러한 핵산 리간드 또는 "앱타머(aptamer)"는 높은 친화도와 특이성을 갖는 주어진 리간드에 결합할 수 있는 짧은 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 전체로서는, 앱타머의 3차원 구조가 충분히 가변적이어서 모노머성이든 폴리머성이든 사실상 임의의 화학적 화합물에 대한 리간드로서 앱타머가 결합 및 작용할 수 있다. 앱타머는 특히 암 치료와 혈액 응고의 조절에서 유망한 새로운 진단 및 치료 화합물로 부상하고 있다.
수많은 제3자들이 앱타머의 동정, 제조 및 용도를 포함하는 특허를 출원하고 확보하였다. 골드와 투에르크(Gold and Tuerk)는 일반적으로 앱타머를 단리하기 위한 SELEX 방법을 처음으로 개발한 것으로 여겨지고 있으며, 이들의 방법은 미국 특허 제5,670,637호, 제5,696,249호, 제5,843,653호, 제6,110,900호 및 제5,270,163호를 포함하여 다수의 미국 특허에 기술되어 있다. 토마스 브뤼스(Thomas Bruice) 등은 미국 특허 제5,686,242호에서 앱타머를 제조하는 방법을 보고한 바, 스크리닝 서열에 있어서 오로지 랜덤 올리고뉴클레오티드를 사용하므로 이는 골드 및 투에르크에 의해 보고된 원래 SELEX 방법과는 상이하다. 미국 특허 제5,686,242호에서 스크린된 올리고뉴클레오티드는 SELEX 방법에서 스크린된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 결여되어 있다.
슐렌저(Sullenger), 루스코니(Rusconi), 콘토스(Kontos) 및 화이트(White)는 WO 02/26932에서 응고 인자, E2F류 전사 인자, Ang1, Ang2, 및 이들의 단편 또는 펩티드, 전사 인자, 자가면역성 항체 및 지혈(hemostasis)과 기타 생물학적 상태의 조절에 유용한 세포 표면 리셉터에 결합하는 RNA 앱타머를 기술하고 있다 (참조 문헌: Rusconi et al, Thrombosis and Haemostasis 83: 841-848 (2000), White et al, J. Clin Invest 106:929-34 (2000), Ishizaki et al, Nat Med 2: 1386-1389 (1996), 및 Lee et al, Nat. Biotechnol. 15: 41-45 (1997)).
앱타머가 치료제로 사용하는데 적합하기 위해서는 바람직하게 합성하는 비용이 비싸지 않고 생체 내에서 안전하고 안정해야 한다. 포스포디에스테르 골격에 변성이 없는 모든 리보스 또는 데옥시리보스 뉴클레오티드로 구성되는 RNA 및 DNA 앱타머들은 전형적으로 뉴클레아제로의 분해에 대한 이들의 감수성으로 인해 생체 내에서 불안정하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은 2'-위치에 변성 그룹을 결합하여 크게 증가될 수 있다.
뉴클레아제에 의한 클리어런스(clearance) 이외에, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과에 의해 제거된다. 이처럼, 정맥내 투여된 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드는 여과를 차단할 수 없다면 전형적으로 10분 미만의 생체내 반감기를 나타낸다. 이것은 혈류에서 조직 내로의 빠른 분포를 촉진하거나 올리고뉴클레오티드의 겉보기 분자량을 사구체에 대한 효과적 크기 컷오프 이상으로 증가시켜서 이루어질 수 있다. 작은 치료제와 폴리알킬렌 옥사이드 폴리머의 컨쥬게이션(예를 들어, 페길화(PEGylation))은 순환 중 앱타머의 체류시간을 급격하게 연장시킬 수 있어서 투약 빈도를 줄이고 혈관 타겟에 대한 효율성을 증강한다.
미국식품의약국(FDA) 및 기타 국제규제기관이 설정한 표준을 만족하는 페길화 올리고뉴클레오티드의 대량 제조는 환자에게 투여되는 최종 생성물의 합성, 정제 및 특성화에 대해 수많은 스텝을 포함한다. 각 스텝은 상당량의 시간과 돈이 소요된다. 따라서, 이러한 종류의 치료제의 효율적이고 실행가능한 제조방법을 최적화하는 것이 필요하다.
일 측면에서, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)와 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 RNA 앱타머이며, 여기에서 앱타머는 2차 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 중화제 또는 앱타머의 활성 조절제이다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 고체상(solid phase) 합성을 사용하여 합성된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변성 뉴클레오티드를 사용하여 합성된다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 페길화되지 않은(비페길화, non-pegylated) 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 합성하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에서 분리하여 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈보호하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈염하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 페길화하여 페길화 올리고뉴클레오티드를 생산하고, 페길화 올리고뉴클레오티드를 정제하여, 페길화 올리고뉴클레오티드를 탈염한다. 일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 탈염은 한외여과 (ultrafiltration)를 포함한다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 비페길화 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 합성하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에서 분리하여 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈보호하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 염-교환(salt-exchanging)하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 페길화하여 페길화 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 페길화 올리고뉴클레오티드를 정제하여, 페길화 올리고뉴클레오티드를 탈염한다. 일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 염-교환은 한외여과를 포함한다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 비페길화 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 합성하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에서 분리하여 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈보호하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈염 및 염-교환(salt-exchanging)하고, 비페길화 올리고뉴클레오티드를 페길화하여 페길화 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 페길화 올리고뉴클레오티드를 정제하여, 페길화 올리고뉴클레오티드를 탈염한다. 일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 탈염 및 염-교환은 한외여과를 포함한다.
일 구체예에서, 본 방법은 페길화 올리고뉴클레오티드의 동결건조를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 동결건조 스텝은 한외여과를 사용한 페길화 올리고뉴클레오티드의 탈염 및 추가 정제 단계 후에 수행한다.
다른 구체예에서, 페길화 올리고뉴클레오티드의 정제는 분자량 컷오프가 페길화 올리고뉴클레오티드의 분자량 미만인 한외여과막을 갖는 한외여과법 사용을 포함한다. 또다른 구체예에서, 한외여과막의 분자량 컷오프는 약 10 kD, 20 kD 또는 30 kD이다. 또다른 구체예에서, 한외여과막의 분자량 컷오프는 약 10 kD 내지 약 20 kD 또는 약 20 kD 내지 약 30 kD이다.
일 구체예에서, 본 방법은 고체 지지체에서 비페길화 올리고뉴클레오티드를 분리(cleaving)하고 비페길화 올리고뉴클레오티드를 탈보호한 후에 비페길화 올리고뉴클레오티드의 이온교환 정제를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 방법은 한외여과를 사용한 비페길화 올리고뉴클레오티드의 탈염 및/또는 염교환 전에 비페길화 올리고뉴클레오티드의 이온교환 정제를 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 페길화 올리고뉴클레오티드의 정제는 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 사용을 포함한다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변성된 염기성 잔기를 포함한다.
다른 구체예에서, 적어도 하나의 변성된 염기성 잔기는 5-플루오로유라실, 5-플루오로시토신, 5-브로모유라실, 5-브로모시토신, 5- 클로로유라실, 5-클로로시토신, 5-요오도유라실, 5-요오도시토신, 5-메틸시토신, 5-메틸유라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸) 유라실, 5-카복시메틸아민-O-메틸 티오유리딘, 5-카복시메틸아민-O-메틸유라실, 디하이드로유라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신(galactosylqueosine), 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 6-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아민-O-메틸유라실, 5-메톡시아민-O-메틸-2-티오유라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸유라실, 5-메톡시유라실, 5-메톡시시토신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 유라실 옥시아세트산 (v), 부톡소신(butoxosine), 슈도유라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸 티오유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-메틸유라실, 유라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 유라실 옥시아세트산 (v), 5-메틸 티오유라실, 3-(3-아미노-3-N 카복시프로필)유라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린으로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-0-메틸 변성 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-0-메틸 및 하나 이상의 2'-플루오로 변성을 함유한다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 2차 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 2차 구조는 적어도 하나의 스텝(stem)과 적어도 하나의 루프(loop)를 포함한다. 다른 구체예에서, 2차 구조는 2개 스템과 3개 루프를 포함한다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-0-메틸 및/또는 하나 이상의 2'-플루오로 변성을 포함한다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 스템 및/또는 적어도 하나의 루프 내에 하나 이상의 2'-0-메틸 및/또는 하나 이상의 2'-플루오로 변성을 포함한다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 스템 내 적어도 하나의 구아닌은 하이드록실 당(2'-OH)을 포함한다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 스템 내 적어도 하나의 유리딘은 2'-플루오로 또는 2'-0-메틸로 변성된다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 스템 내 적어도 하나의 시티딘은 2'-플루오로 변성된다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 스페이서(spacer)를 포함한다. 다른 구체예에서, 스페이서는 글리콜 스페이서이다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1-20 중 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1-20 중 하나로 구성된다. 또다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 본 명세서의 표 1과 2에 기술된 변성 올리고뉴클레오티드 중 하나를 포함한다. 또다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 본 명세서의 표 1과 2에 기술된 변성 올리고뉴클레오티드 중 하나로 구성된다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 PAO와 컨쥬게이션하기 전에 링커와 결합하여 링커가 컨쥬게이트된 비페길화 올리고뉴클레오티드를 생산한다. 일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 반응성 아미노 그룹을 갖는 링커를 포함하고, 폴리알킬렌 옥사이드는 활성화 에스테르 그룹으로 작용화된다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 반응성 티오 그룹을 갖는 링커를 포함하고, 폴리알킬렌 옥사이드는 말레이미드 그룹으로 작용화된다. 일 구체예에서, 활성화 에스테르 그룹은 NHS이다.
일 구체예에서, 폴리알킬렌 옥사이드는 활성화되지 않는다. 다른 구체예에서, 폴리알킬렌 옥사이드는 추가로 카복실산 잔기를 포함한다. 또다른 구체예에서, 링커-컨쥬게이트 비페길화 올리고뉴클레오티드와 PAO의 컨쥬게이션은 원위치에서 수용성 커플링제를 컨쥬게이션 반응에 포함하여 이루어진다. 일 구체예에서, 수용성 커플링제는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)이다. 다른 구체예에서, 수용성 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDAC)이다.
일 구체예에서, 링커를 함유하는 비페길화 올리고뉴클레오티드는 링커 전구체를 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션하거나 결합하여 제조된다. 다른 구체예에서, 링커 전구체는 6-(트리플루오로아세트아미도)헥사놀 (2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포아미다이트, TFA-아미노 C4 CED 포스포아미다이트, 5'-아미노 변성제 C3 TFA, 5'-아미노 변성제 5, 5'-아미노 변성제 C12, 및 5' 티올-변성제 C6 (이하에 예시된 링커)로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, 링커는 헥실아미노 링커이다.
일 구체예에서, 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 또다른 구체예에서, PEG는 약 20 kD 내지 약 60 kD, 약 20 kD, 약 30kD, 약 40 kD, 약 50 kD 또는 약 60 kD의 분자량을 갖는다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 링커-함유 올리고뉴클레오티드의 한외여과를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드의 한외여과는 염 용액에 대한 디아필트레이션(diafiltration)이다. 또다른 구체예에서, 염은 소듐 또는 포타슘 염이다.
일 구체예에서, 한외여과는 정제수 존재 하에 수행된다. 다른 구체예에서, 한외여과는 염 용액 존재 하의 한외여과 후에 정제수 존재 하에 수행된다. 일 구체예에서 염은 일가 염이다. 다른 구체예에서, 염은 소듐, 포타슘 또는 리튬 염이다. 또다른 구체예에서, 염은 다음 음이온 중 하나의 소듐, 포타슘 또는 리튬이다: Cl-, HS03 -, Br03 -, Br-, N03 -, Cl03 -, HS04 -, HC03 -, I03 -, HP04 2 -, 포르메이트, 아세테이트 또는 프로피오네이트. 또다른 구체예에서, 염은 염화나트륨이다.
일 구체예에서, 최종 투과물(permeate)의 전도도는 0 μS/cm 초과 및 약 75 μS/cm 미만, 약 50 μS/cm 미만 또는 약 40 μS/cm 미만이거나, 약 20 μS/cm 내지 약 70 μS/cm, 약 20 μS/cm 내지 약 50 μS/cm 또는 약 20 μS/cm 내지 약 40 μS /cm의 범위이다.
일 구체예에서, 최종 투과물의 삼투질 농도(osmolality)는 0 mOsm 초과 및 약 4 mOsm 이하, 약 2 mOsm 이하, 약 1 mOsm 이하이다. 다른 구체예에서, 최종 투과물의 삼투질 농도는 약 0.001 mOsm 내지 약 1.0 mOsm, 약 0.5 mOsm 내지 약 2.0 mOsm, 약 0.5 mOsm 내지 약 4.0 mOsm의 범위이다.
일 구체예에서, 한외여과는 0 ℃ 내지 약 50 ℃, 또는 주위 온도, 예컨대 약 15 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도에서 수행된다.
일 구체예에서, 링커-함유 올리고뉴클레오티드는 약 1 kD 내지 약 10 kD의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 막(membrane)을 사용하여 한외여과한다. 또다른 구체예에서, 한외여과는 1 kD 막, 2 kD 막, 3 kD 막, 5 kD 막, 8 kD 막 또는 10 kD 막을 사용하여 수행한다. 다른 구체예에서, 한외여과는 약 1 kD 내지 약 5 kD 또는 약 3 kD 내지 약 5 kD의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용하여 수행한다. 또다른 구체예에서, 한외여과막은 링커-함유 올리고뉴클레오티드의 분자량 미만인 분자량 컷오프를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 최종 투과물의 최종 전도도는 약 50 μS/cm 이하이다. 다른 구체예에서, 최종 투과물의 최종 삼투질 농도는 약 1.0 mOsm 이하이다.
일 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 링커-함유 비페길화 올리고뉴클레오티드의 한외여과에 의해 농축된다. 다른 구체예에서, 비페길화 올리고뉴클레오티드는 증류에 의해 농축된다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 링커-컨쥬게이트 비페길화 올리고뉴클레오티드의 링커에 폴리알킬렌 글리콜 전구체 잔기를 컨쥬게이팅하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 전구체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 이온교환 크로마토그래피에 의한 PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 정제를 추가로 포함한다. 일 구체예에서 이온교환 크로마토그래피는 음이온 교환 HPLC이다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 이온교환 크로마토그래피 용출물의 한외여과 정제를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 한외여과에 의한 농축을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 한외여과에 의한 정제 이전의 음이온 교환 정제 없이 페길화 혼합물의 한외여과에 의한 정제를 포함한다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드는 증류에 의해 농축된다.
일 구체예에서, PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 PAO-컨쥬게이트 올리고뉴클레오티드의 동결건조를 추가로 포함한다.
도 1은 올리고뉴클레오티드 조성물의 합성과 정제방법을 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 올리고뉴클레오티드와 PEG 잔기의 링커 잔기에 의한 컨쥬게이션을 나타낸 것이다.
도 3a-3c는 RB006과 RB007 및 이들에 의해 형성된 컴플렉스의 구조를 나타낸 것이다.
도 4a-4b는 올리고뉴클레오티드 조성물의 합성 및 정제를 위한 방법 1과 방법 2의 일부 구체예를 나타낸 것이다.
도 5는 여기에 기술된 방법에서 관찰된 일부 불순물의 화학식을 나타낸 것이다.
도 6은 올리고뉴클레오티드 조성물의 합성 및 정제를 위한 방법 1과 방법 2의 일부 구체예를 나타낸 것이다.
도 7은 페길화 반응 혼합물을 분석하기 위해 수행된 음이온 교환 HPLC 분석 스펙트럼이다.
도 8은 페길화 반응 혼합물을 한외여과한 후 잔류물을 분석하기 위해 수행된 음이온 교환 HPLC 분석 스펙트럼이다.
도 9는 페길화 반응 혼합물을 한외여과한 후 투과물을 분석하기 위해 수행된 음이온 교환 HPLC 분석 스펙트럼이다.
도 10은 페길화 반응 혼합물을 한외여과한 후 잔류물을 분석하기 위해 수행된 이온쌍 HPLC 분석 스펙트럼이다.
후기 임상시험과 이어지는 상업적 마케팅을 지원하는데 필요한 약물의 충분한 양을 생산하기 위해서, 제품 물질을 유지하면서 제조과정의 견고성(robustness)과 수율을 증강하려는 다양한 노력이 이루어지고 있다. 또한, 전체 과정과 품질의 양호한 조절을 보장하는 주요 원료물질의 엄중한 조절이 반드시 존재해야 한다.
제조과정 전체에서 생성물은 다양한 스텝에서 과정 내내 필요한 품질과 분량을 확인하기 위해 상세히 특성화된다. 이러한 특성화 결과, 추가 개발 및 최적화로부터 유리할 수 있는 과정 중의 스텝을 찾아낼 수 있게 된다.
여기에서는 페길화 올리고뉴클레오티드 앱타머를 제조하는 보다 효율적이며 개선된 방법의 개발을 기술하였다. 페길화 반응을 수행하기 전에 올리고뉴클레오티드 불순물 제거를 위한 음이온 교환 크로마토그래피를 생략하여 놀라웁게도 음이온 교환 정제를 페길화 반응 전에 수행하여 생산된 것과 구분되지 않는 최종 물질이 얻어지는 것을 발견하였다. 또한, 링커-함유 올리고뉴클레오티드 페길화의 효율이 페길화 반응 전 음이온 교환 정제 스텝이 과정에서 생략된 방법에서도 유지되며 페길화 반응이 링커-함유 및 링커를 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드의 미정제 혼합물로 수행된다는 것은 예상치 못했다. 더욱이, 놀라웁게도 한외여과로 음이온 교환 정제에서 페길화 올리고뉴클레오티드 생성물과 동시 용출되는 비페길화 올리고뉴클레오티드 종류를 효과적으로 제거할 수 있는 것을 발견하였다.
치료용 올리고뉴클레오티드의 제조는 올리고뉴클레오티드 가닥의 고체상 화학 합성, 미정제 올리고뉴클레오티드의 분리 및 탈보호화, 제조용 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제, 탈염 후 페길화, 제조용 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 페길화 올리고뉴클레오티드를 정제하여 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드 불순물과 미반응 PAO 제거, 탈염을 위한 한외여과, 및 최종 생성물의 농축 및 동결건조를 포함하는 다단계 과정이다. 전체 과정은 도 1에 과정의 흐름도로 도식적으로 나타내었다.
올리고뉴클레오티드의 화학 합성은, 예를 들어 당분야에서 잘 알려져 있는 포스포아미다이트 또는 포스포로티오에이트 화학에 의해 수행될 수 있다. 합성은 활성화된 모노머와 연장 폴리머의 순차적 결합을 포함하며, 여기서 그 한쪽 터미널은 고체 지지체 매트릭스에 공유결합된다. 고체상 방법은 합성의 각 스텝에서 고체상에 대한 간단한 용매 세척으로 반응 생성물의 용이한 정제가 가능하다. 올리고뉴클레오티드는 3'-말단에서 5'-말단쪽으로, 지지체 결합 분자의 5'-말단을 탈보호하여 지지체 결합 분자를 첨가된 테트라졸-활성화 포스포아미다이트 모노머와 반응시키고, 얻어진 포스파이트 트리에스테르를 포스페이트 트리에스테르로 산화하고, 미반응 하이드록실 그룹을 차후 첨가되는 모노머와의 비순차적 결합을 방지하는 아세틸화(캡핑(capping))로 블로킹하여 "결실 서열"을 형성하여 순차적으로 조립된다. 이러한 스텝들의 순서는 전체 길이의 올리고뉴클레오티드가 합성될 때까지 차후 커플링 반응 동안 반복한다.
생체 내에서 증가된 안정성을 갖는 치료용 올리고뉴클레오티드의 생산에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 당업자들에게 공지된 다양한 변성방법을 사용하여 합성된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,670,633호 및 제6,005,087호(Cook 등)는 RNA 또는 DNA 염기 서열에 상보하는 열적으로 안정한 2'-플루오로 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있다. 미국 특허 제6,222,025호 및 제5,760,202호(Cook 등)는 2'-O 치환된 피리미딘과 변성 피리미딘을 함유하는 올리고머의 합성을 기술하고 있다. 추가 설명은 미국 특허 제7,531,524호에 기술되어 있으며, 그 내용은 참조로 여기에 포함되었다.
폴리알킬렌 옥사이드 분자 같은 담체 잔기에 대한 후속 컨쥬게이션이 가능하도록 올리고뉴클레오티드의 합성을 적절한 링커 잔기를 첨가하여 완료할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 C6 헥실아미노 링커 같은 아미노 링커를 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 첨가할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 링커들을 이하에 기술하였으나, 이에 한정되지는 않는다:
다음 화학식을 갖는 6-(트리플루오로아세트아미도)헥산올 (2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포아미다이트:
Figure pct00001
다음 화학식을 갖는 TFA-아미노 C4 CED:
Figure pct00002
다음 화학식을 갖는 5'-아미노 변성제 C3 TFA:
Figure pct00003
다음 화학식을 갖는 5'-아미노 변성제 5:
Figure pct00004

다음 화학식을 갖는 5'-아미노 변성제 C12:
Figure pct00005
MMT: 4-모노메톡시트리틸 5'-아미노-변성제 C12
다음 화학식을 갖는 5'-티올 변성제 C6:
Figure pct00006

폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 생물학적으로 활성인 화합물과 컨쥬게이션하여 잠재적으로 (1) 순환계에서 화합물의 반감기를 연장하고, (2) 화합물의 분포 패턴을 변경하거나/하고, (3) 화합물을 위장하여 면역원성을 경감하고 효소 분해로부터 보호하는 "불활성" 담체로서 작용할 수 있다. PEG의 크기는 5 내지 200 KD의 범위일 수 있으며, 약학 제제에서 사용되는 전형적 PEG는 10-60 KD 범위이다. 최대 약 30 KD의 직쇄 PEG를 생산할 수 있다. 30 KD를 초과하는 PEG는, 다수의 PEG를 함께 결합(다중 가지 또는 '분지된' PEG)하여 원하는 크기의 PEG를 만들 수 있다. 분지된 "mPEG2" 결합(아미노산으로 연결된 2개 mPEG2)을 갖는 화합물의 일반적 합성은 Monfardini, 등, (1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69에 기술되어 있다. '분지된' PEG, 즉 하나 초과의 PEG 또는 통상적 반응그룹에 연결된 mPEG를 포함하는 화합물에 있어서, PEG 또는 mPEG는 함께 리신 같은 아미노산에 의해 함께 결합하거나 이들을, 예를 들어 글리세린에 의해 연결할 수 있다. 각각의 mPEG가 약 10, 약 20, 또는 약 30 KD인 분지된 PEG의 경우, 총 질량은 약 20, 약 40 또는 약 60 KD이고, 이 화합물은 그의 총 질량에 의해 지칭된다(즉, 40 kD mPEG2는 2개의 연결된 20 kD mPEG이다). 총 분자량 40 KD의 PEG는 PEG화 화합물을 생산하는 시약으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 다음 화학식을 갖는 [N2-(모노메톡시 20K 폴리에틸렌 글리콜 카바모일)-N6-(모노메톡시 20K 폴리에틸렌 글리콜 카바모일)]-리신 N-하이드록시숙신이미드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다:
Figure pct00007
, 및
Figure pct00008
안정화된 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 추가적인 PEG 시약은 40 kD 또는 60kD의 총 분자량을 갖는, 다음 화학식의 다른 분지된 PEG N-하이드록시숙신이미드(mPEG-NHS)를 포함한다(여기에서, 각각의 mPEG는 약 20 또는 약 30 kD이다):
Figure pct00009
기술된 화합물을 위한 PEG 시약은 mPEG가 약 20 kD 또는 약 30 kD인, 다음 화학식을 갖는 분지되지 않은 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA)를 포함할 수 있다:
Figure pct00010
특정 구체예에서, 반응성 에스테르는 -O-CH2CH2-CO2-NHS이다.
추가적인 PEG 시약은 다음을 포함한다:
글리세롤에 의해 연결된 분지된 PEG
Figure pct00011
Figure pct00012
및
Figure pct00013

다음 화학식을 갖는 분지되지 않은 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트(mPEG-SMB):
Figure pct00014
예를 들어 다음 화학식의, 니트로페닐 카보네이트 연결 PEG:
Figure pct00015
티올 변성 링커와 사용될 수 있는 티올 반응성 그룹을 갖는 PEG는 다음 화학식의 화합물을 포함한다.
Figure pct00016
상기 식에서, mPEG는 약 10, 약 20 또는 약 30 kD이다. 또한, 구조는 다음과 같이 분지될 수 있다:
Figure pct00017
상기 식에서, 각각의 mPEG는 약 10, 약 20 또는 약 30 kD이고, 총 질량은 약 20, 약 40 또는 약 60 kD이다.
분지된 PEG는 또한 다음 화학식의 화합물을 포함할 수 있다:
Figure pct00018
이하에 페길화 올리고뉴클레오티드를 제조하는 개선된 방법의 예로서 RB006이라고 알려진 페길화 앱타머 생성물의 대안적 제조방법을 기술하였다. RB006은 올리고뉴클레오티드 앱타머: P-L-guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT라고 지칭되며, 여기에서 P=mPEG2-NHS 에스테르 MW 40 kDa; L=C6 NH2 링커; G=2-OH G; g=2'-0-Me G; C=2-F C; c=2'-0-Me C; U=2-F U; u=2'-0-Me U; a=2-0-Me A; 및 T=역전된(inverted) 2'-H T이다(도 3a, 서열번호: 1 참조). RB006은 REG1의 약물 성분이며, 고친화도와 특이성으로 응고인자 IXa와 결합하는 직접적인 FIXa 저해제이다(미국 특허 제7,304,041호 및 Dyke 등의 Circulation, 114:2490-97 (2006) 참조). RB006은 FX의 FXa로의 FVIIIa/FIXa-촉매화 전환을 블로킹하여 항응고 효과를 유발한다. RB006은 31 뉴클레오티드 길이의 변성된 RNA 앱타머이며, 이것은 2'-플루오로 및 2'-0-메틸 당 함유 잔기의 존재에 의해 엔도뉴클레아제 분해에 대해 안정화되고 3' 역전 데옥시티미딘 캡으로 엑소뉴클레아제 분해에 대해 안정화된다. 앱타머의 핵산 부분은 40-킬로달톤 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 담체와 컨쥬게이션되어 그의 혈액 반감기를 증강한다.
RB006의 유리한 특징은 그의 생체내 효과를 활성 조절제(active control agent) 투여에 의해 반전하는 능력으로, 활성 조절제는 적어도 일부의 앱타머에 상보할 수 있다. 본 발명에 있어서, RB006의 활성 조절제는 도 3b에 나타낸 cgcgguauaguccac (서열번호: 2)의 (5'-3') 서열을 갖는 RB007일 수 있다. 다른 가능한 활성 조절제는 다음 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드(5'-3') 서열일 수 있다: cgcgguauaguccccau (서열번호: 3); cgcgguauaguccc (서열번호: 4), cgcgguauaguccauc (서열번호: 5), cgcgguauagucag (서열번호: 6), cgcgguauagucagg (서열번호: 7), cgcgguauagucagag (서열번호: 8), 또는 cgcgguauaguccucac (서열번호: 9), 또는 이들의 변성체 또는 유도체. 특정 구체예에서, 활성 조절제는 본질적으로 상기한 서열 중 하나로 구성되거나, 전적으로 상기한 서열 중 하나로 구성된다.
RB007은 효과적으로 RB006에 결합하여, 그의 항-FIXa 활성을 중화할 수 있다. 일 구체예에서, RB007의 2'-0-메틸 변성은 분자에 중등도(moderate)의 뉴클레아제 내성을 부여하여 RB007이 RB006을 찾아서 결합할 수 있는 충분한 생체내 안정성을 제공하지만, 생체내 지속성의 연장을 지원하지는 않는다.
현재 기술된 제조방법은 어떠한 올리고뉴클레오티드 또는 앱타머에도 적용할 수 있다. 페길화 형태로 여기서 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 추가 앱타머와 올리고뉴클레오티드의 예를 표 1과 2에 기술하였다.
Figure pct00019


RB006, RB007, GPVI와 결합하고 조절하는 앱타머, 및 기타 치료용 앱타머와 관련된 추가 설명은 미국 특허 제7,300,922호; 제7,304,041호; 제7,312,325호; 제7,531,524호, 및 미국 공개특허 제2010/0311820호에서 찾을 수 있으며, 그 내용들은 참조로 여기에 포함되었다.
RB006을 제조하는 두 가지 방법을 여기에 예시를 위해 기술하였으나, 다양한 변경과 변성이 본 발명에서 벗어나지 않고 가능하다는 것은 당업자들에게 명백하기 때문에 범위의 제한을 의미하지는 않는다. 또한, 하기한 방법은 상기한 바와 같이 앱타머를 결합하는 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 다른 치료용 앱타머에 사용될 수 있다. 두 가지의 제조방법을 방법 1과 방법 2라 지칭하고 이하에 상세히 설명하였다.
표 3에는 방법 1과 방법 2로 RB006을 제조하는데 사용된 원료 물질을 기재하였다. 시약의 화학적 반응성이 동등하고 변경의 결과로서 생성된 API 품질에 영향이 없는 것으로 예상된다면 어떠한 치환도 심각하지 않은 것으로 간주한다.
Figure pct00021

방법 1
페길화 올리고뉴클레오티드를 제조하는 한 가지 방법은 2 스텝의 음이온 교환 정제를 포함한다. 이 방법은 여기에서 방법 1이라 지칭되고 도 4a에 도식적으로 나타내었으며, 다섯 단계로 기술되었다. 단계(Stage) 1은 고체 지지체 상에서의 합성과 탈보호화이다. 단계 2는 페길화를 위한 올리고뉴클레오티드의 제조공정을 포함하며 음이온 교환 HPLC에 의한 정제가 있다. 소듐 양이온을 사용하여 정제하기 때문에 정제 스텝에서는 또한 암모늄과 알킬암모늄 염의 소듐에 의한 염 교환도 유발된다. 이 단계의 최종 스텝은 페길화 반응 전의 올리고뉴클레오티드의 탈염이다. 단계 3은 페길화와 페길화 올리고뉴클레오티드의 형성을 포함한다. 단계 4는 음이온 교환 HPLC에 의한 정제와 단계 5에서 동결건조 하기 전의 탈염 스텝을 포함한다.
방법 1, 단계 1
단계 1은 RB005의 고체상 합성과 후속하는 분해 및 탈보호화를 포함한다. 고체상 합성에 의해 31 염기 올리고뉴클레오티드를 조립하는 동안, 커플링 반응의 최종 스텝에서는 페길화를 위한 부위 특이적 결합을 제공하는 헥실아미노 링커를 첨가한다(도 2a 참조). 헥실아미노 링커를 갖는 얻어진 전장 생성물은 페길화 이전에 비(non)PEG화 앱타머(RB005)라 지칭한다. 미정제 올리고뉴클레오티드의 특성화에서 두 종류의 불순물이 나타났다. 첫 번째는 헥실아미노 링커가 없기 때문에 페길화할 수 없다. 두 번째는 페길화할 수 있으며 헥실아미노 링커를 함유한다. 페길화할 수 있는 불순물의 특성화에서 더 짧고(N-1) 더 긴(N+1) 서열이 나타났으며, 둘 다 헥실아미노 링커를 함유하였다. 또한, 비PEG화 앱타머와 밀접하게 연관된 분자량을 갖는 페길화할 수 있는 불순물도 검출되었다. 이러한 불순물들을 M-x와 M+x로 표시하였으며, 여기서 M은 RB005의 분자량이고 x는 얻거나 잃은 분자량이다. 불순물을 페길화할 수 있는 것 또는 페길화할 수 없는(nonpegylatable) 것으로 특성화하기 위해 2 세트의 실험을 수행하였다.
올리고뉴클레오티드를 함유하는 비링커(non-linker)가 페길화할 수 없는 것을 확인하기 위해 헥실아미노 링커 없이 합성된 비페길화 앱타머의 버전으로 실험을 수행하였다. 비PEG화 앱타머를 함유하는 비링커를 표준 반응조건 하에서 mPEG2 NHS 에스테르와 결합하였고 페길화하지 않은 것을 확인하였다. 조합성(crude synthesis)에서의 불순물이 페길화가능한 지를 평가하기 위해 모델 시험을 수행하였으며, 여기에서 조합성 생성물과 mPEG2 NHS 에스테르의 대용물을 표준 페길화 조건 하에서 반응시키고 생성물의 분자량을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)으로 측정하였다. 대용물 NHS 에스테르는 mPEG2와 동일한 코어 구조를 가지며 동일한 반응성을 갖는 것으로 추정된다. PEG의 다분산성과 올리고뉴클레오티드의 전하 상태로 인하여 RB005(RB06)에 결합된 mPEG2로 동일한 특성화는 수행할 수 없다. 얻어진 특성화에 의해 N-1, M-x, M+x, 및 N+1을 페길화가능한 종류로 동정하였다. 그러므로, 이 방법의 특성화의 초점은 이후에 다양한 제조 단계에서 N-1, M-x, M+x, 및 N+1의 수준을 평가하는데 있다.
올리고뉴클레오티드의 특성화는 합성 사이클 매개변수의 추가 최적화가 N-1 및 N+1 페길화가능한 불순물의 농도를 저하시킬 수 있음을 시사하였다.
방법 1, 단계 2
방법 1에서 페길화 이전에 사용된 음이온 교환 정제 스텝은 페길화할 수 없는 및 페길화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 불순물을 제거하고 탈보호 스텝에서 시약을 제거할 것으로 예상된다. 그러나, 정제전 및 정제후 샘플에 대한 대량 분석에서는 놀라웁게도 이러한 정제 스텝이 약물 물질의 최종 품질에 영향을 미치는 올리고뉴클레오티드 불순물 제거에서 단지 부분적으로 효과적일 뿐인 것으로 나타났다. LC-MS와 크로마토그래피 기술을 이 분석에 적용하였다.
사용된 LC-MS 방법은 상대적 이온 카운트-%에 기초한 반정량 데이터를 제공한다. LC-MS 방법에 의한 분석으로 음이온 교환의 결과, 비PEG화 앱타머 순도에서 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 표 4에 나타낸 데이터는 음이온 교환 정제 전후 불순물의 분포에서 약간의 이동은 있으나 전체 순도는 비슷한 것을 나타내고 있다. 음이온 교환 정제 후에 M-x 방법 관련 불순물이 증가하였고 M + 98, N-1 및 N+1 불순물이 상응하여 감소하였다. M-x 불순물에 대하여는 이하에 더욱 상세히 언급하였다.
Figure pct00022

요약하면, 페길화 전이 아니라 비PEG화 앱타머의 합성 후 음이온 교환 HPLC가 비PEG화 앱타머 품질에서 최소한의 개선을 제공하는 것으로 보인다. 또한, 페길화 스텝으로 얻어진 비PEG화 앱타머 품질의 의미있는 개선은 정제가 아니라 합성 품질에서의 지속적 개선으로 얻어질 수 있을 것으로 예상된다.
방법 1, 단계 3
방법 1에서, 2당량의 mPEG2 NHS 에스테르를 각 당량의 비PEG화 앱타머에 대해 사용하고 페길화 반응을 아세토니트릴과 소듐 보레이트의 수성 혼합물 중에서 수행하였다. 이 반응이 적절한 것으로 보이지만, PEG화 앱타머 (RB006)의 생산에 필요한 시약의 당량수를 줄이고, 그리하여 하류 공정 동안 제거될 미반응 mPEG2의 농도를 최소화하기 위한 개발 노력이 수행되었다. 페길화 속도는 pH, mPEG2 NHS 에스테르의 용해도, 비PEG화 앱타머의 용해도, 및 반응 내에 존재하는 물의 양에 의해 달라진다. 물이 너무 많으면 반응성 NHS 에스테르의 가수분해를 유발하고, 너무 적으면 올리고뉴클레오티드의 침전을 유발할 수 있다. 이러한 조건의 어떤 것도 약물 물질의 품질에 영향을 주지 않지만, 페길화 반응의 효율이 절하된다.
방법 1, 단계 4
방법 1에서 사용된 PEG화 앱타머의 음이온 교환 정제를 과량의 mPEG2와 페길화할 수 없는 불순물을 제거하는 그의 작용에 대해 평가하였다. mPEG2의 비음이온성 성질에 의해 음이온 교환 컬럼이 비반응성 mPEG2를 효과적으로 제거할 수 있다. 미량의 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드 불순물이 단계 2의 음이온 교환 스텝 동안 제거되었다. 비PEG화 앱타머와 밀접하게 연관된 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드 불순물은 단계 2에서 제거되지 않았고, PEG화 앱타머의 PEG 잔기가 비PEG화 앱타머와 밀접하게 연관된 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드 불순물 보다 훨씬 더 조기에 PEG화 앱타머 용출을 유발하기 때문에 조제용 음이온 교환 정제에 의해 단계 4에서 효과적으로 제거된다.
RB006을 바이알 내에 동결건조하는 포장 요건을 지원하기 위해 물을 증류하여 PEG화 앱타머를 추가 농축하였다.
방법 1, 단계 5
PEG화 앱타머의 이화학적 특성을 동결건조 공정의 스케일 확장 일부로서 동결 및 1차 건조의 적절한 유통온도를 측정하기 위해 평가하였다.
방법 2
방법 1의 다양한 단계에 대한 특성화에 기초하여 하기한 PEG화 앱타머 제조의 효율을 증가하는 변경을 수행하였다. 방법 1과 방법 2를 병행 비교하여 도 4b에 나타내었다.
방법 2의 제조공정을 다시 5 단계로 기술하였다. 단계 1은 고체 지지체 상에서의 합성과 탈보호화이다. 단계 2는 페길화를 위한 비PEG화 앱타머의 제조공정을 포함하며 한외여과에 의한 페길화 전의 생성물 탈염을 포함한다. 단계 3은 페길화와 페길화 앱타머의 형성을 포함한다. 단계 4는 음이온 교환 HPLC에 의한 정제와 단계 5에서 동결건조하기 전 한외여과를 사용한 정제 및 탈염을 포함한다.
방법 2, 단계 1
방법 1에서, 비PEG화 앱타머의 합성은 3 mmol 스케일로 수행되었다. 임상시험과 상업적 실현가능성을 위한 물질 요건은 방법 2에서 스케일의 증가를 필요로 하였다. 방법 2의 합성을 10 및 20 mmol 및 250 mmol 스케일로 수행하였고, 추가적인 스케일 확장은 진행 과정에 따라, 예컨대 300 mmol, 350 mmol, 또는 400 mmol 스케일로 가능하다. 더 큰 스케일의 합성기를 방법 2에서 사용하였다. 합성의 화학적 경로는 출발 모노머와 함께 변하지 않았다. 합성 단계의 순도는 방법 1로 얻어진 것과 비교하여 증가했다. 표 5에 합성 스케일, 음이온 HPLC에 의한 순도 및 ODs/mmol로 표시된 전장 생성물(FLP)의 수율을 요약하였다. 목적하는 용도와 제조방법 또한 표시하였다. 스케일 확장된 과정의 물질은 더 낮은 스케일로 생산된 물질과 비슷하였다. 조품질(crude quality)은 이전 임상적 로트(lot)와 비교할 때 Lot# 5에 있어서 6% 이상이었다.
Figure pct00023

방법 2, 단계 2
방법 1에서, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 페길화할 수 없는 불순물을 제거하고 탈보호반응의 아민염을 소듐염으로 교환하였다. 방법 2에서, 페길화할 수 없는 불순물을 단계 4에서 음이온 교환과 한외여과의 조합으로 제거하였다. 표 6에서는 페길화할 수 없는 불순물을 제거하는 두 공정을 비교하였다.
Figure pct00024

한외여과를 올리고뉴클레오티드 용액을 한외여과막을 통과시켜서 수행하였고, 그에 따라 암모늄과 알킬 암모늄염 같은 저분자량 불순물, 합성과 분해 및 탈보호화의 잔류물로서 존재할 수 있는 용매는 막을 통과하고 올리고뉴클레오티드는 막을 통과하지 않고 유지되었다. 한외여과는 저분자량 불순물 대 올리고뉴클레오티드의 비율을 저하시키는 작용을 한다. 한외여과는 한외여과막을 통과하는 부피를 대체하는 새로운 용매(통상적으로 물)를 첨가하지 않거나 통과된 부피보다 더 적은 물을 첨가하여 용액 내 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키는 방식으로 작동될 수 있다. 선택적으로, 막을 통과한 것과 동등 이상의 용매 부피를 첨가할 수 있다. 용액은 일반적으로 증가된 압력을 사용하여 한외여과막을 통과시킨다.
올리고뉴클레오티드를 원하는 소듐염 형태로 형성하고 알킬암모늄, 이온을 포함한 잔류 암모늄을 대체하기 위해서 염화나트륨 용액 같은 소듐염 수용액 존재 하에 한외여과 스텝을 실시할 수 있다.
필요하다면, 여러 번의 한외여과 스텝을 실시할 수 있다. 일부 구체예에서, 한외여과는 특히 소듐염 존재 하의 한외여과 스텝 후에 정제수 존재 하에서 수행된다. 정제수를 사용한 한외여과는 통상적으로 올리고뉴클레오티드에서 암모늄과 잔류 무기 소듐염이 실질적으로 제거될 때까지 수행된다.
잔류 이온의 농도는 대개 전도도 측정으로 관찰되며, 최종 투과물 중에서 75 μS/cm 미만, 50 μS/cm 미만 또는 40 μS/cm 미만, 또는 약 20 μS/cm 내지 50 μS/cm 범위의 값을 갖는다. 다른 구체예에서, 최종 투과물의 최종 삼투질 농도는 약 4 mOsm 이하, 약 2 mOsm 이하, 약 1 mOsm 이하, 약 0.001 내지 약 1.0 mOsm, 약 0.5 mOsm 내지 약 2.0 mOsm, 또는 약 0.5 mOsm 내지 약 4.0 mOsm이다.
상기 방법에서 사용된 한외여과막은 올리고뉴클레오티드 분자량보다 낮게 선택된 분자량 컷오프를 가질 수 있다. 용액에서 알킬암모늄 이온을 제거하는 것이 바람직한 구체예에서, 알킬암모늄 이온의 분자량을 초과하는 분자량 컷오프가 사용될 수 있다. 수많은 구체예에서, 예를 들어 약 4.5 내지 12 kD의 분자량을 갖는 전형적인 15 내지 40 mer 올리고뉴클레오티드라면 1 kD 내지 3 kD 범위의 분자량 컷오프를 사용한다.
본 발명에 따른 방법은 대개 0 ℃ 내지 약 50 ℃, 또는 주위 온도, 예컨대 약 15 ℃ 내지 약 30 ℃ 범위의 온도에서 수행된다.
방법 2의 단계 4에서 페길화할 수 없는 불순물의 음이온 교환 정제를 수행하는 이유는 mPEG2 NHS 에스테르와 헥실아미노 링커 반응의 특이성에 의해 설명된다. LC-MS 분석으로 합성의 초기 품질 개선과 M-x 불순물의 감소가 뒷받침된다. 방법 2는 방법 1과 비교하여 비PEG화 앱타머의 전체 품질을 유지한다.
공정 중 비PEG화 앱타머에 대한 데이터를 표 7에 요약하였다. 비PEG화 앱타머의 분자량은 이론적 분자량과 일치하고 관찰된 값은 두 방법에 대해 일치하였다. 서열화 데이터는 방법 2가 예상된 서열에 영향을 미치지 않는 것을 나타내고 있다. 방법 1의 음이온 교환 스텝에서 제거된 불순물이 방법 2에 존재하기 때문에 방법 1과 방법 2에서 생산된 물질의 순도는 이 단계에서 직접 비교할 수 없다. 방법 2에서, 불순물은 단계 4 말기에 제거된다.
Figure pct00025

상기한 바와 같이, 헥실아미노 링커를 함유하는 불순물만 페길화될 수 있으며, 방법 1의 음이온 교환 정제 스텝은 이러한 불순물을 제거하는데 최소한으로 영향을 미친다. LC-MS 분석을 사용하여 방법 1과 방법 2에 의해 생산된 물질 내에 존재하는 페길화가능한 불순물을 이 단계에서 동정하고 비교하였다. 사용된 LC-MS 방법은 상대적 이온 카운트-%에 기초한 반정량 데이터를 제공한다. LC-MS 데이터는 방법 1과 방법 2에서 유래한 페길화 생성물에서 동일한 종류의 불순물이 예상되는 것을 나타내었다. 표 8에서 페길화가능한 불순물의 계산된 질량과 잠정적 표시는 방법 1과 방법 2의 상대적 불순물 농도와 함께 나타내었다. 표 8에 방법 1과 방법 2로부터의 상대적 N-1, M-x, 비PEG화 앱타머, M+x, 및 N+1을 요약하였다. M-x와 M+x의 명명은 질량으로 비PEG화 앱타머와 밀접하게 연관된 불순물을 지칭하고, 여기에서 M은 비PEG화 앱타머의 질량이고 x는 얻거나 손실된 질량이다. N+1과 N-1이란 하나의 추가 뉴클레오티드가 존재하거나 임의 뉴클레오티드가 결실된 종류이다. 페길화할 수 없는 불순물은 반응하지 않는 것으로 나타났기 때문에, 이들은 분석에 포함되지 않았으며 데이터를 비PEG화 앱타머에 대해 정규화하였다.
Figure pct00026

불순물
두 방법에서, 불순물 N+1과 N-1이 관찰되었고 헥실아미노 링커를 함유하였다. 불순물 중 N+1류는 이중 커플링에서 유래하며, N-1류는 내부 결실에 의해 발생하였다. M-94, M-52, 및 M-20은 제조과정에서 발생하는 2'-데옥시-2'-플루오로 유리딘의 변성과 일치한다. 가열과 염기성 pH의 용액이 이러한 불순물 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 이 방법과 연관된 불순물(M-x)의 분자량은 다음 화학식과 일치한다:
Figure pct00027

이들은 2'-데옥시-2'-플루오로 유리딘의 분해와 일치하였다.
방법 1에서, 불순물 M+98은 링커 출발물질과 연관된 불순물과 일치한다. 출발물질 불순물은 2 작용성 헥실아미노 링커 포스포아미다이트인 것으로 잠정 확인되었다. 방법 1에서, 불순물은 페길화 이전에 제조용 음이온 교환 정제에 의해 제거되었다. 방법 2에서, 가스 크로마토그래피/FID QC 방법이 이후 출발물질 내의 이러한 불순물 조절에서 수행되었다. 이 불순물은 원료물질 단계에서 잘 조절되며, 방법 2로 생산된 어떠한 뱃치에도 존재하지 않았다.
Figure pct00028

Figure pct00029
요약하면, 함께 얻어진 LC-MS와 크로마토그래피 데이터는 정제 공정으로 인한 M-x 페길화가능한 불순물의 감소와 최초 음이온 교환 정제 스텝을 제거했을 때 N-1과 N+1의 최소 증가를 나타내고 있다. LC-MS에 의한 뱃치 분석을 표 8에 나타내었다. 마찬가지로, 방법 2로 생산된 임상 뱃치에 존재하는 모든 불순물은 조기 뱃치 내에서 보다 동등하거나 더 낮은 수준으로 존재하였다. 방법 2에서 생산된 물질에 대한 LC-MS에 의한 전체 순도는 방법 1에 대한 것 보다 우수하였다.
방법 1에서 음이온 교환 정제를 사용하여 염 교환을 수행하고 정제 스텝 동안 미정제 비PEG화 앱타머로부터 1차 아민을 제거하였다. 이것은 아민 염 존재하에서는 컨쥬게이션이 진행되지 않기 때문에 중요한 작업이다. 한외여과를 1 kD 분자량 컷오프(MWCO) 막을 사용하여 수행하였다. 방법 2에서, 페길화할 수 없는 불순물 제거는 단계 4로 이동되므로 한외여과 스텝을 개질하여 효과적인 PEG 컨쥬게이션에 필요한 염 교환을 얻기 위해 염화나트륨에 대한 디아필트레이션을 포함하였다. 또한, 1 kD 막을 5 kD MWCO 막으로 대체하여 유속(flux rate)을 개선하였다.
방법 2, 단계 3
방법 1에서, 2 당량의 PEG-NHS 에스테르를 각 당량의 비PEG화 앱타머에 사용하였고 페길화 반응을 아세토니트릴과 소듐 보레이트의 혼합물 중에서 수행하였다. PEG화 앱타머의 생산에 필요한 이 시약의 당량수를 줄이기 위한 개발 노력이 이루어졌다. 반응 시간, 온도, pH, PEG-NHS 당량 및 용매를 포함하여 다양한 조건을 페길화에 대해 평가하였다. 시험 결과, 페길화 효율은 다양한 조건에 따라 변화되었지만 생산된 페길화 생성물의 불순물 특성은 일관 되게 남아 있는 것으로 나타났다. 방법 2에서, 1.5 - 1.75 당량의 PEG-NHS 에스테르를 ACN:DMSO 및 소듐 보레이트 완충액 혼합물에서 사용하여 PEG화 앱타머를 생산하였다. 새로운 페길화 조건의 특이성을 비PEG화 앱타머와 mPEG2 NHS 에스테르를 함유하는 비링커로 평가하였다. 이전에 언급된 바와 같이, 링커가 없는 앱타머는 페길화 조건 하에서 반응성이 없다. 방법 1에 대해, 방법 2로 생산된 공정 중 물질을 비교하는 것은 방법 2에 존재하는 페길화할 수 없는 불순물의 존재로 인해 복잡하게 된다. 페길화할 수 없는 불순물은 단계 4에서 제거된다. 따라서, 두 방법을 사용하여 생산된 물질의 직접적인 비교는 단계 3에서 할 수 없다. 결과적으로, 두 방법으로 생산된 물질의 품질은 표 10의 뱃치 이력에 제공된 데이터와 상기한 추가적인 분석 특성화에 의해 비교한다.
방법 2, 단계 4
제조방법 1에 있어서, 단계 4의 정제에서 제조용 음이온 교환 HPLC 조건은 단계 2 동안 적용된 조건과 유사하였다. 제조방법 2에 있어서, 단계 4의 정제 조건을 방법 1에서 사용된 것으로 최적화하였고; 변경은 단계 3에서 얻어진 반응 혼합물의 정제 및 적재를 위한 그래디언트의 수정을 포함하였다. 방법 1에 대해, 방법 2로 생산된 공정 중 물질을 비교하는 것은 페길화할 수 없는 불순물의 존재로 복잡하며, 따라서 두 방법을 사용하여 생산된 물질은 직접 비교하지 않았다.
제조방법 1에서, 페길화 후 한외여과를 5 kD MWCO 막을 사용하여 수행하였다. 방법 1에서 한외여과 스텝의 1차적 역할은 동결건조 이전에 RB006을 탈염하고 농축하는 것이다. 방법 2에서는 모든 비페길화 올리고뉴클레오티드가 동결건조 이전에 제거되도록 MWCO 막을 10 또는 30 kD로 변경하였다. 또한, 이러한 분자량 컷오프의 증가는 디아필트레이션 동안 유속을 개선하는 추가의 이점이 있다. 제조방법 2를 진행하는데 있어서 중요한 요소는 페길화할 수 없는 불순물을 제거하는 공정 능력을 평가하는 것이다. 이러한 불순물 대부분이 PEG화 앱타머의 음이온 교환 정제에서 제거되지만, 비페길화 올리고뉴클레오티드가 페길화 생성물과 동시 용출되어 최종 API로 이행될 수 있는 가능성이 있다. 30 kD MWCO 막이 2 kD - 10 kD의 범위에서 페길화할 수 없는 불순물을 제거할 수 있는 범위를 시험하기 위해, 단계 3의 페길화 반응 혼합물을 30 kD MWCO 막에 로딩하고 일반적 정제공정을 수행하지 않았다. 방법 2와 관련한 평가 공정의 도해를 도 6에 나타내었다.
AX-HPLC(음이온 교환 HPLC)를 사용하여 페길화 반응 혼합물, UF 투과물 용액 및 UF 잔류물 용액을 분석하였다. 결과를 도 7-도 9에 나타내었다. 한외여과한 후의 물질에 대한 분석 HPLC는 PEG화 앱타머와 동시 용출되는 종류들을 포함하여 페길화할 수 없는 불순물을 제거하는 공정의 능력을 분명히 입증하였다. 도 7에 정제되지 않은 페길화 반응 혼합물을 나타내었다. PEG화 앱타머의 체류시간은 14.3 분이었다. 19 - 20 분의 체류시간은 근사 분자량이 10,000 kD인 전장 생성물(링커가 없는 N-1, N-2 ...)과 밀접하게 연관된 페길화할 수 없는 불순물에 해당한다. 도 8에서, 잔류물 분석은 페길화 반응 혼합물로부터 다수 종들의 제거를 나타내고 있다. 19-20분의 체류시간을 갖는 불순물은 UF 공정에 의해 제거되었다. 또한, 도 9에 투과물 용액의 분석을 나타내었다. 투과물은 PEG화 앱타머와 유사한 체류시간을 갖는 페길화할 수 없는 종도 제거되었음을 나타내고 있다. IP-HPLC와 AX-HPLC는 한외여과 공정 동안 페길화할 수 없는 불순물의 제거를 관찰하기 위해 함께 사용되었다.
제조방법에서 10 kD MWCO의 사용을 평가하기 위해 페길화 올리고뉴클레오티드를 음이온 교환 HPLC(방법의 단계 3)로 정제한 다음, 10 kD 막을 사용한 한외여과를 수행하였다. 이후, 물질을 비PEG화 및 페길화 올리고뉴클레오티드에 선택적인 분석 IP-HPLC에 의해 분석하였다. 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드는 2 내지 6분 사이에 검출되었다. 도 10은 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않고 HPLC 정제와 10 kD 막을 사용하는 공정이 페길화할 수 없는 올리고뉴클레오티드를 제거하였음을 나타내고 있다.
단계 4의 말기에 방법 2로 생산된 물질의 순도는 방법 1로 생산된 물질의 순도와 비슷하다.
방법 2, 단계 5
방법 1에서, PEG화 엡타머를 개별 바이알 내에 동결건조하였다. 방법 2에서, 동결건조 매개변수를 RB006의 물리적 특성화에 기초하여 최적화하고 물질을 라이오가드 트레이(lyoguard tray)를 사용하여 대량으로 동결건조하였다. 라이오가드 트레이와 이화학적 특성화를 사용하므로써 PEG화 앱타머가 바이알 내에서의 동결건조를 유지하는데 필요한 것보다 더 낮은 농도에서 동결건조될 수 있다. 각각의 변경 이유와 생성물 품질에 대한 변화의 잠재적 영향을 기술하였다. 생성물 품질에 대한 영향이 없거나 거의 없으면서, 보다 양호한 공정, 스케일 확장에 대한 가능성, 제조상 융통성과 작업자 안전의 확대를 제공하기 위해 변경되었다. 방법 1을 사용하여 생산된 물질과 방법 2를 사용하여 생산된 물질은 품질 사양을 만족하였고 유사한 불순물 프로필을 가졌으며 전체적으로 비슷한 순도였다. 방법 2를 개발하기 위해 방법 1의 다섯 단계 모두에 대해 수행된 변경으로 제품 품질을 유지하거나 개선하면서 스케일 확장의 용이성과 실행가능성을 증가하였다.
Figure pct00030

방법들은 음이온 교환 HPLC, 이온쌍(ion-pairing) 역상 HPLC 및 2 컬럼 GPC에 의한 분석을 포함한다. 개선된 음이온 교환 방법은 트리스 완충액/아세토니트릴/메탄올/pH 8 시스템 및 염화나트륨 그래디언트, Dionex DNAPac PA-100 (4 x 250mm) 컬럼을 40 ℃에서 유속 1.5 mL/분으로 사용하였다. 259 nm에서 검출하였다. 이 방법은 다양한 합성방법으로 제조된 N+1 및 N-1 페길화 불순물, RB006 분해 생성물 및 20 kDa와 30 kDa 종으로 페길화된 RB006을 분리하는 것으로 나타났다. 이 방법은 공칭(nominal) 농도(2.0 mg/mL)의 50%-120% 및 0.1%-10% 범위를 직선으로 가로지른다. 개선된 2 컬럼 GPC 방법은 Waters Ultrahydrogel 1000 및 500 (7.8 x 300 mm) 컬럼을 연속하여 사용하고 20 mM 암모늄 아세테이트, pH 7.4를 주위 온도에서 0.4 mL/분의 등용매 용리로 사용하였다. 증기화 광산란(50 ℃ Drift 튜브, 40 PSI 질소, ESI 냉각) 및 259 nm의 UV로 검출하였다. 이 방법에서는 분자량 측정으로 72 kDa 내지 12 kDa 범위인 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리에틸렌 글리콜 표준물 시리즈를 사용하였다. 본 방법은 질량 범위를 직선으로 가로지르고 검출 한계는 0.2%이다. RB006의 개선된 이온쌍 HPLC(IP-HPLC) 분석은 Waters Xbridge BEH300 C4 (4.6 x 100 mm, 3.5 μm) 컬럼으로 이동상 A: 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA), pH 7.2, 5% 메탄올 및 이동상 B: 100 mM TEAA, pH 7.2, 50% 아세토니트릴, 30% 이소프로판올의 그래디언트를 사용하여, pH 8.5에서 35 ℃의 컬럼 온도로 수행되었다. 유속은 1.0 mL/분이었고 259 nm에서 UV로 검출하였다.
달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 사람들이 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 여기에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수도 있지만 예시적인 방법과 물질을 기술하였다. 여기에서 언급된 모든 공개물은 방법 및/또는 물질을 인용된 공개물과 관련하여 기술하거나 설명하기 위해 참조로 여기에 포함되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Rusconi, Christopher P. Brooks, Douglas <120> A Method for Manufacturing Pegylated Oligonucleotides <130> 10815.8011.WO00 <140> Not yet assigned <141> Filed herewith <150> US 61/479,226 <151> 2011-04-26 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl G <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-methyl U <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> 2'-O-methyl G <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-methyl A <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'Fluoro C <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'Fluoro U <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-methyl A <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'Fluoro U <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-O-methyl A <220> <221> modified_base <222> (11)..(12) <223> 2'Fluoro C <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyl G <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'Fluoro C <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyl G <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'Fluoro U <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl A <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'Fluoro U <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-O-methyl G <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'Fluoro C <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-O-methyl U <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> RNA 2'OH <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-O-methyl C <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'Fluoro C <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'Fluoro U <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> 2'-O-methyl C <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> 2'-O-methyl A <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> 2'-O-methyl C <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> inverted 2'H T <400> 1 guggacuaua ccgcguaaug cugccuccac t 31 <210> 2 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 2 cgcgguauag uccac 15 <210> 3 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 3 cgcgguauag uccccau 17 <210> 4 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 4 cgcgguauag uccc 14 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 5 cgcgguauag uccauc 16 <210> 6 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 6 cgcgguauag ucag 14 <210> 7 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 7 cgcgguauag ucagg 15 <210> 8 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 8 cgcgguauag ucagag 16 <210> 9 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic aptamer <400> 9 cgcgguauag uccucac 17 <210> 10 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB448 <400> 10 gggaggacgg cgcuaacgcc uggcauaagc cuccc 35 <210> 11 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide modified RB448 <220> <221> modified_base <222> (35)..(35) <223> inverted 2'H T <400> 11 gggaggacgg cgcuaacgcc uggcauaagc cuccc 35 <210> 12 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide EF-3 CA3 <400> 12 uuacgcaaga cgcggu 16 <210> 13 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide EF-3CA4 <400> 13 ugugauccgc aucguc 16 <210> 14 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB490 CA1 <400> 14 gggaggcuua ugccaggcg 19 <210> 15 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB490 CA2 <400> 15 gaggcuuaug ccaggcg 17 <210> 16 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB490 CA3 <400> 16 uuaugccagg cg 12 <210> 17 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB490 CA4 <400> 17 cgccguccuc cc 12 <210> 18 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB538/571 <400> 18 gcuuaugcca ggcg 14 <210> 19 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB538/571 <400> 19 ggcuuaugcc aggcg 15 <210> 20 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide RB538/571 <400> 20 aggcuuaugc caggcg 16

Claims (11)

  1. (a) 페길화되지 않은(non-pegylated) 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 합성하고;
    (b) 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에서 분리하여 올리고뉴클레오티드를 탈보호하고;
    (c) 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 한외여과를 사용하여 탈염하고;
    (d) 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 페길화하여 페길화 올리고뉴클레오티드를 생산하고;
    (e) 페길화 올리고뉴클레오티드를 음이온 교환 HPLC를 사용하여 정제하고;
    (f) 페길화 올리고뉴클레오티드를 한외여과를 사용하여 탈염 및 추가 정제하는 것을 포함(여기에서, (b)와 (c) 사이에 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드의 이온교환 정제가 수행되지 않는다)하는, 치료용 페길화 올리고뉴클레오티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 최종 생성물을 동결건조하는 스텝 (g)를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 2차 구조를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 2차 구조가 스템(stem)과 루프(loop)를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 변성 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변성 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 2'-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 스텝 (d) 이전에 링커에 결합된 방법.
  9. 제1항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 RB005를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 페길화되지 않은 올리고뉴클레오티드가 RB006을 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 스텝 (f)가 약 10 kD 내지 약 20 kD 또는 약 20 kD 내지 약 30 kD의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 한외여과막 사용을 포함하는 방법.
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