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CN106998695A - 包含重组芽孢杆菌细胞和杀虫剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的(a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及(b)至少一种本文公开的特定杀虫剂。此外，本发明涉及该组合物的用途以及用于增强植物生长、促进植物健康和/或降低植物和植物部位的整体损害的方法。

Description

包含重组芽孢杆菌细胞和杀虫剂的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月17日提交的美国临时专利申请第62/051,919号的优先权，通过引用的方式将其内容整体纳入本文中。
关于电子提交的序列表
序列表的官方副本通过EFS-Web电子提交为ASCII-格式的序列表，文件名为“BCS149059WO_ST25.txt”，在2015年9月14日创建，大小为152千字节，与本说明书同时提交。包含在该ASCII-格式文件中的序列表是说明书的一部分，通过引用的方式将其整体纳入本文中。
背景
技术领域
本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的(i)表达融合蛋白的产生外生孢子(exosporium)的重组芽孢杆菌(Bacillus)细胞，所述融合蛋白包含：(x)至少一种植物生长刺激蛋白或肽；和(y)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及(ii)选自本文公开的特定杀虫剂的至少一种杀虫剂，所述杀虫剂表现出改善植物生长和/或健康和/或抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的能力。此外，本发明涉及该组合物的用途以及用于增强植物生长、促进植物健康和/或降低植物和植物部位的整体损害的方法。
背景技术
在作物保护中，持续需要增强植物健康和/或植物生长的应用。更健康的植物通常带来植物或其产品更高的产量和/或更好的质量。
为了促进植物健康，全世界都在使用基于有机和无机物质的肥料。肥料可以是单一物质或组合物，用于向植物提供营养物质。肥料施用的重大突破是1840年左右Justusvon Liebig开发了基于氮的肥料。然而，肥料可导致土壤酸化和土壤养分平衡不稳定，包括矿物质的消耗及盐和重金属的富集。此外，过量的肥料使用可导致土壤动物群落的改变并且污染地表水和地下水。此外，不健康的物质(例如硝酸盐)可能会在植物和果实中富集。
此外，全世界都在使用杀虫剂和杀真菌剂防治害虫。合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的，因此可对目标生物体以外的生物体(包括其他天然存在的有益生物体)起作用。由于它们的化学性质，它们还可能是有毒的和不可生物降解的。全世界的消费者越来越多地意识到与化学品残留(特别是食物产品中的化学品残留)有关的潜在的环境和健康问题。这导致减少化学(即合成)农药的使用或至少减少其数量的消费者压力越来越大。因此，需要管理食物链需求同时仍能够有效防治害虫。
使用合成杀虫剂或杀真菌剂带来的另一问题是，重复或排他性地施用杀虫剂或杀真菌剂通常导致选择出抗性动物害虫或微生物。通常，这些菌株也交叉抵抗具有相同作用方式的其他活性成分。然后，使用所述活性化合物不再能够有效防治病原体。然而，开发具有新作用机制的活性成分是困难且昂贵的。
使用作为植物健康增强剂和/或植物保护剂的生物防治剂(BCA)是肥料和合成农药的替代选择。在某些情况下，BCA的有效性与常规杀虫剂和杀真菌剂不在相同水平，特别是在严重感染压力的情况下。因此，在某些情况中，生物防治剂、其突变体以及由其产生的代谢物(特别是在低施用率下)不完全令人满意。因此，不断需要开发新的植物健康增强组合物和/或植物保护组合物，包括与合成杀真菌剂和杀虫剂组合使用的生物防治剂，以努力满足上述要求。
发明内容
鉴于此，具体地，本发明的目的是提供具有增强的改善植物生长和/或增强植物健康的能力或表现出增强的抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的组合物。
因此，发现用下文定义的本发明的组合物实现这些目的。通过施用a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，以及保护植物免受病原体或害虫侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)本文公开的至少一种特定杀虫剂，组合物能够优选以超加和的方式增强(i)植物生长、植物产量和/或植物健康和/或(ii)抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
本文提及的靶向序列、外生孢子蛋白、外生孢子蛋白片段、融合蛋白及表达这种融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞不应被认为是独立的实施方案。相反，在本申请全文中，提及的靶向序列、外生孢子蛋白、外生孢子蛋白片段、融合蛋白及表达这种融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞应被认为是仅以与本文所述的一种或多种特定杀虫剂组合的方式(且优选以协同组合的方式)被公开或要求保护。此外，提及的“本文公开的特定杀虫剂”旨在包括下文[000185]-[000186]段描述的杀虫剂。
本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的：a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，以及保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)至少一种杀虫剂，其选自啶虫脒(acetamiprid)、涕灭威(aldicarb)、双甲脒(amitraz)、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfiuthrin)、甲萘威(carbaryl)、噻虫胺(clothianidin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、硫丹(endosulfan)、乙硫磷(ethion)、乙虫腈(ethiprole)、灭线磷(ethoprophos)、苯线磷(fenamiphos)、仲丁威(fenobucarb)、倍硫磷(fenthion)、氟虫腈(fipronil)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、氟吡呋喃酮(flupyradifurone)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、伐虫脒(formetanate)、庚烯磷(heptanophos)、吡虫啉(imidacloprid)、甲胺磷(methamidophos)、甲硫威(methiocarb)、灭多威(methomyl)、氯硝柳胺(niclosamide)、砜吸磷(oxydemeton-methyl)、伏杀硫磷(phosalone)、灭虫硅醚(silafluofen)、螺螨酯(spirodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、噻虫啉(thiacloprid)、硫双威(thiodicarb)、四溴菊酯(tralomethrin)、三唑磷(triazophos)、杀虫隆(triflumuron)、蚜灭磷(vamidothion)、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺以及含有α-萜品烯、对-聚伞花素和柠檬烯这三种萜烯的农药萜烯混合物。
在一些实施方案中，靶向序列包含：与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的靶向序列；包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-35的靶向序列；包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31的靶向序列；包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-33的靶向序列；包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-31的靶向序列；包含SEQ ID NO：1的靶向序列；或包含与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列的外生孢子蛋白。
在一些实施方案中，产生外生孢子的芽孢杆菌细胞是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)家族成员的细胞。产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可以是以下中的任一种：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、Bacillusweihenstephensis、Bacillus toyoiensis及其组合。在另一个实施方案中，重组芽孢杆菌细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在某些方面，所述融合蛋白包含参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，所述酶选自：乙偶姻还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrile hydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5’核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺反异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡萄糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2，5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、壳聚糖酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶以及参与产生结瘤(nod)因子的酶。
在其他方面，所述融合蛋白包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，所述酶选自：纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡萄糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体(siderophore)。
在另外的其他方面，所述融合蛋白包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽，且所述蛋白或肽具有杀昆虫活性、杀蠕虫活性、抑制昆虫或蠕虫捕食，或它们的组合。这种蛋白可包括杀昆虫的细菌毒素、内毒素、Cry毒素、蛋白酶抑制剂蛋白或肽、半胱氨酸蛋白酶或几丁质酶。所述蛋白或肽可包括VIP杀昆虫毒素、胰蛋白酶抑制剂、慈姑蛋白酶抑制剂、Cry毒素(例如，来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素)。
在某些实施方案中，所述杀虫剂选自啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫双酰胺、氟吡呋喃酮、氟吡菌酰胺、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、砜吸磷、伏杀硫磷、灭虫硅醚、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺以及含有α-萜品烯、对-聚伞花素和柠檬烯这三种萜烯的农药萜烯混合物。
在其他实施方案中，所述杀虫剂选自噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮、吡虫啉、甲硫威和硫双威。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含协同有效量的a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶以及降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶或至少一种保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)至少一种杀虫剂，其选自噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮、吡虫啉、甲硫威和硫双威。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是噻虫胺；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是氯氰菊酯；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是乙虫腈；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是氟虫腈；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是氟吡菌酰胺；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是氟吡呋喃酮；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是吡虫啉；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是甲硫威；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在以上实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀虫剂是硫双威；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO：l的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包括内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与SEQ ID NO：107、108和109具有至少95％的序列同一性；以及(iv)重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在另外的其他实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀真菌剂。所述至少一种杀真菌剂可以是合成的。
在某些方面，所述组合物还包含至少一种助剂，所述助剂选自填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、霜冻保护剂、增稠剂和佐剂。
在其他方面，本发明涉及用本文公开的任何组合物处理的种子。
此外，本发明涉及所公开的组合物作为杀虫剂和/或杀真菌剂的用途。在某些方面，所公开的组合物用于减少植物和植物部位的整体损害，以及减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的采收果实或蔬菜的损失。在其他方面，所公开的组合物用于增强植物生长和/或促进植物健康。
此外，本发明涉及处理植物、植物部位(例如种子、根、根茎、球根、球茎或块茎)和/或植物或植物部位在其上或其附近生长的地方(例如土壤)以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，所述方法包括以下步骤：同时或按顺序向植物、植物部位和/或植物所在地施用协同有效量的：a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，以及保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)选自本文公开的特定杀虫剂的至少一种杀虫剂，所述杀虫剂表现出抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
在另一个实施方案中，本发明是用于减少植物和植物部位的整体损害，以及减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的采收果实或蔬菜的损失的方法，所述方法包括以下步骤：同时或按顺序向植物、植物部位(例如种子、根、根茎、球根、球茎或块茎)和/或植物或植物部位在其上或其附近生长的地方(例如土壤)施用协同有效量的：a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，以及保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；以及(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)选自本文公开的特定杀虫剂的至少一种杀虫剂，所述杀虫剂表现出抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
在以上段落中，术语“包括”或其任何派生词可被“由......组成”或其合适的相应的派生词代替。
附图说明
图1示出了炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BclA的氨基末端部分的氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌家族成员的各种外生孢子蛋白的相应区域的比对。
具体实施方式
一般而言，“农药的”表示物质增加植物害虫死亡率或抑制其生长率的能力。该术语在本文中用于描述物质表现出的抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体活性的性质。在本发明的意义上，术语“害虫”包括昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。
NRRL是农业研究菌种保藏中心的简称，其地址是：美国伊利诺斯州皮奥里亚市，北大学街1815号，美国农业部农业研究院国家农业应用研究中心，邮编61604。
ATCC是美国模式菌种收集中心的简称，其地址是：美国弗吉尼亚州马纳萨斯市，大学大道10801号，ATCC专利保藏中心，邮编10110。
根据“国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯公约”，本文所述的以及具有前缀为NRRL或ATCC的登录号的所有菌株已经保藏在上述各保藏机构中。
“参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶”包括催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的非活性或较低活性的衍生物转变成活性或更大活性形式的化合物的任何酶。例如，这种化合物包括但不限于小分子植物激素(例如生长素和细胞分裂素)、生物活性肽、以及由细菌或真菌在根际合成的小植物生长刺激分子(例如，2，3-丁二醇)。
本文所用的“植物免疫系统增强剂蛋白或肽”包括对植物的免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。
本文所用的术语“植物生长刺激蛋白或肽”包括任何蛋白或肽，其在暴露于所述蛋白或肽的植物中增强植物生长。
术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，并且是指增强或增加植物高度、重量、叶片大小、根大小或茎大小中的至少一种以增加植物中蛋白质产量或增加植物的籽粒产量。
本文所用的“保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽”包括任何蛋白或肽，其使暴露于所述蛋白或肽的植物更少受病原体感染。
本文所用的“增强植物中的胁迫耐受性的蛋白或肽”包括任何蛋白或肽，其使暴露于所述蛋白或肽的植物对胁迫具有更大耐受性。
术语“植物结合蛋白或肽”是指能够特异性地或非特异性地结合植物的任何部位(例如，植物的根或空中部分例如叶子、茎、花或果实)或植物物质的任何肽或蛋白。
本文所用的术语“靶向序列”是指使得将更长的多肽或蛋白定位于蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子的多肽序列。
表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞
融合蛋白包含将融合蛋白靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子的靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段以及：(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；(c)增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽；(d)植物结合蛋白或肽；或(e)植物免疫系统增强剂蛋白或肽。当在蜡状芽孢杆菌家族成员细菌中表达时，这些融合蛋白被靶向至孢子的外生孢子层，并被物理定向使得蛋白或肽排列在孢子的外部。
这种芽孢杆菌外生孢子排列(BEMD)系统可用于向植物(例如，植物叶子、果实、花、茎或根)或植物生长基质(例如土壤)递送肽、酶和其他蛋白质。以这种方式向土壤或其他植物生长基质递送的肽、酶和蛋白质在土壤中存留并表现出活性持续延长的时间段。将本文所述的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞引入土壤或植物根际中带来在许多不同的土壤条件下植物生长的有益增强。使用BEMD产生这些酶可以使得它们在植物生命的前几个月持续向植物和根际发挥其有益效果。
靶向序列、外生孢子蛋白和外生孢子蛋白片段
为了便于参考，本文所提及的肽和蛋白序列的SEQ ID NO列于下表1中。
表1.肽和蛋白质序列
AA＝氨基酸
＊炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BclA与苏云金芽孢杆菌BclA具有100％的序列同一性。因此，SEQ IDNO：1、2和59还分别代表苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-41、全长苏云金芽孢杆菌BclA和苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-196。同样地，SEQ ID NO：60还代表甲硫氨酸残基加苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸20-35。
＊＊蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720与蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234具有100％的序列同一性。因此，SEQ IDNO：57和58还分别代表蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234的氨基酸1-136和全长蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234。
芽孢杆菌为杆状细菌属。细菌的蜡状芽孢杆菌家族包括以下种：炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、Bacillus toyoiensis和Bacillus weihenstephensis。在胁迫的环境条件下，蜡状芽孢杆菌家族细菌经过孢子形成并形成可长时间保持休眠的椭圆形内生孢子。内生孢子的最外层被称为外生孢子并包括由外部的毛状突起的绒毛围绕的基底层。毛状绒毛上的丝状体主要由胶原状糖蛋白BclA形成，而基底层由许多不同的蛋白质组成。另一个胶原相关的蛋白BclB也存在于外生孢子中，并暴露于蜡状芽孢杆菌家族成员的内生孢子。
已证明表面绒毛的主要组成物BclA附着于外生孢子，其氨基端(N-末端)位于基底层，其羧基端(C-末端)从孢子向外延伸。
此前已经发现，来自BclA和BclB的N-末端区域的某些序列可用于将肽或蛋白靶向至蜡状芽孢杆菌内生孢子的外生孢子(参见美国专利公开第2010/0233124和201I/0281316号以及Thompson，et al.，“Targeting of the BclA and BclB Proteins to theBacillus anthracis Spore Surface，”Molecular Microbiology，70(2)：421-34(2008)，它们各自的全部内容通过引用的方式纳入本文中)。还发现，炭疽芽孢杆菌的BetA/BAS3290蛋白定位于外生孢子。
具体地，已发现来自炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BclA的氨基酸20-35足以靶向至外生孢子。BclA的氨基酸1-41(SEQ ID NO：1)与具有相关序列的其他几种蜡状芽孢杆菌家族外生孢子蛋白和蜡状芽孢杆菌家族蛋白的相应N-末端区域的序列比对示于图1中。从图1可看出，在对应于BclA的氨基酸20-41的区域中的所有蛋白质之间存在高同源性的区域。然而，在这些序列中，对应于BclA的氨基酸36-41的氨基酸含有二级结构，并且不需要融合蛋白定位于外生孢子。BclA的保守的靶向序列区域(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)在图1中以粗体显示，并对应于定位于外生孢子所需的最小靶向序列。在靶向序列中跨越BclA的氨基酸25-35的更高度保守的区域在图1的序列中加下划线，并且是ExsFA/BxpB/ExsFB及其同系物的识别序列，其在外生孢子的表面上引导和组装所述蛋白。图1中的SEQ ID NO.3、5和7氨基酸序列分别为炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BetA/BAS3290的氨基酸1-33、甲硫氨酸及其后的炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BAS4623的氨基酸2-43、和炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BclB的氨基酸1-34。(对于BAS4623，已发现用甲硫氨酸替换天然蛋白中在位置1处存在的缬氨酸带来更好的表达)。从图1可看出，这些序列各自含有对应于BclA的氨基酸20-35的保守区域(SEQID NO：1；粗体显示)和对应于BclA的氨基酸20-35的更高度保守区域(下划线)。
来自蜡状芽孢杆菌家族成员的其他蛋白还含有保守的靶向区域。具体地，在图1中，SEQ ID NO：9为炭疽芽孢杆菌Sterne菌株BAS1882的氨基酸1-30、SEQ ID NO：11为Bacillus weihenstephensis KBAB42280基因产物的氨基酸1-39、SEQ ID NO：13为Bacillus weihenstephensis KBAB43572基因产物的氨基酸1-39、SEQ ID NO：15为蜡状芽孢杆菌VD200外生孢子前导肽的氨基酸1-49、SEQ ID NO：17为蜡状芽孢杆菌VD166外生孢子前导肽的氨基酸1-33、SEQ ID NO：19为蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663的氨基酸1-39、SEQ ID NO：21为Bacillus weihenstephensis KBAB4YVTN β-螺旋蛋白的氨基酸1-39、SEQ ID NO：23为Bacillus weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1-30、SEQ ID NO：25为Bacillus weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1-30、SEQ ID NO：27为Bacillus weihenstephensis KBAB4含有胶原的三重螺旋重复物的氨基酸1-36、SEQ ID NO：29为蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc00001_21660的氨基酸1-39、SEQ ID NO：31为蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30、SEQ IDNO：33为蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21、SEQ ID NO：35为苏云金芽孢杆菌35646胶原三重螺旋重复蛋白的氨基酸1-22、SEQ ID NO：43为蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652的氨基酸1-35、SEQ ID NO：45为蜡状芽孢杆菌外生孢子前导物WP016117717的氨基酸1-41、SEQ ID NO：47为蜡状芽孢杆菌外生孢子肽WP002105192的氨基酸1-49、SEQ ID NO：49为蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353的氨基酸1-38、SEQ ID NO：51为蜡状芽孢杆菌外生孢子肽02112369的氨基酸1-39、SEQ ID NO：53为蜡状芽孢杆菌外生孢子蛋白WP016099770的氨基酸1-39、SEQ ID NO：55为苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525的氨基酸1-36、以及SEQ ID NO：57为蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的氨基酸1-136。如图1所示，这些蛋白的N-末端区域各自含有BclA(SEQ ID NO：1)的氨基酸20-35的保守区域，以及对应于BclA的氨基酸25-35的更高度保护的区域。
包括氨基酸20-35的BclA的任何部分可用作靶向序列。此外，全长外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段可用于将融合蛋白靶向至外生孢子。因此，全长BclA或包括氨基酸20-35的BclA片段可用于靶向至外生孢子。例如，可使用全长BclA(SEQ ID NO：2)或缺乏羧基端的BclA的中等尺寸的片段例如SEQ ID NO：59(BclA的氨基酸1-196)将融合蛋白靶向至外生孢子。中等尺寸的片段例如SEQ ID NO：59片段具有比全长BclA更少的二级结构，并且已发现其适合用作靶向序列。靶向序列还可包括含有氨基酸20-35的BclA的更短部分，例如SEQ IDNO：1(BclA的氨基酸1-41)、SEQ ID NO：1的氨基酸1-35、SEQ ID NO：1的氨基酸20-35或SEQID NO：60(与BclA的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基)。仅包括氨基酸20-35中的某些氨基酸的BclA的甚至更短的片段也表现出将融合蛋白靶向至外生孢子的能力。例如，靶向序列可包括SEQ ID NO：1的氨基酸22-31、SEQ ID NO：1的氨基酸22-33或SEQ ID NO：I的氨基酸20-31。
或者，含有对应于BclA的氨基酸20-35的氨基酸的BetA/BAS3290、BAS4623、BclB、BAS1882、KBAB42280基因产物、KBAB43572基因产物、蜡状芽孢杆菌VD200外生孢子前导肽、蜡状芽孢杆菌VD166外生孢子前导肽、蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663、B.weihenstephensis KBAB4YVTN β-螺旋蛋白、B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363、B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131、B.weihenstephensis KBAB4含有胶原的三重螺旋重复物、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510、苏云金芽孢杆菌35646胶原三重螺旋重复蛋白、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652、蜡状芽孢杆菌外生孢子前导物WP016117717、蜡状芽孢杆菌外生孢子肽WP002105192、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353、蜡状芽孢杆菌外生孢子肽02112369、蜡状芽孢杆菌外生孢子蛋白WP016099770、苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525或蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的任何部分可用作靶向序列。从图1中可看出，BetA/BAS3290的氨基酸12-27、BAS4623的氨基酸23-38、BclB的氨基酸13-28、BAS1882的氨基酸9-24、KBAB42280基因产物的氨基酸18-33、KBAB43572基因产物的氨基酸18-33、蜡状芽孢杆菌VD200外生孢子前导肽的氨基酸28-43、蜡状芽孢杆菌VD166外生孢子前导肽的氨基酸12-27、蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663的氨基酸18-33、B.weihenstephensis KBAB4YVTN β-螺旋蛋白的氨基酸18-33、B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24、B.Weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24、B.WeihenstephensisKBAB4含有胶原的三重螺旋重复物的氨基酸15-30、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-15、苏云金芽孢杆菌35646胶原三重螺旋重复蛋白的氨基酸1-16、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652的氨基酸14-29、蜡状芽孢杆菌外生孢子前导物WP016117717的氨基酸20-35、蜡状芽孢杆菌外生孢子肽WP002105192的氨基酸28-43、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353的氨基酸17-32、蜡状芽孢杆菌外生孢子肽02112369的氨基酸18-33、蜡状芽孢杆菌外生孢子蛋白WP016099770的氨基酸18-33、苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525的氨基酸15-30和蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的氨基酸115-130对应于BclA的氨基酸20-35。因此，含有上述所列的相应氨基酸的这些蛋白的任何部分可以用作靶向序列。
此外，含有BclA的氨基酸20-35或任何上述所列的相应氨基酸的任何氨基酸序列可用作靶向序列。
因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：1的氨基酸1-35、SEQ ID NO：1的氨基酸20-35、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：1的氨基酸22-31、SEQ ID NO：1的氨基酸22-33或SEQ ID NO：1的氨基酸20-31。或者，靶向序列由SEQ ID NO：1的氨基酸1-35、SEQ ID NO：1的氨基酸20-35、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60组成。或者，靶向序列可由SEQ ID NO：1的氨基酸22-31、SEQ ID NO：1的氨基酸22-33或SEQ ID NO：1的氨基酸20-31组成。或者，外生孢子蛋白可包含全长BclA(SEQ ID NO：2)，或外生孢子蛋白片段可包含缺乏羧基端的BclA的中等尺寸的片段例如SEQ ID NO：59(BclA的氨基酸1-196)。或者，外生孢子蛋白片段可由SEQID NO：59组成。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：3的氨基酸1-27、SEQ ID NO：3的氨基酸12-27、或SEQ ID NO：3，或外生孢子蛋白可包括全长BetA/BAS3290(SEQ ID NO：4)。还已发现，与BetA/BAS3290的氨基酸12-27连接的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：61。靶向序列还可包括SEQ ID NO：3的氨基酸14-23、SEQ ID NO：3的氨基酸14-25或SEQ ID NO：3的氨基酸12-23。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：5的氨基酸1-38、SEQ ID NO：5的氨基酸23-38、或SEQ ID NO：5，或外生孢子蛋白可包括全长BAS4623(SEQ ID NO：6)。
或者，靶向序列可包括SEQ ID NO：7的氨基酸1-28、SEQ ID NO：7的氨基酸13-28、或SEQ ID NO：7，或外生孢子蛋白可包括全长BclB(SEQ ID NO：8)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：9的氨基酸1-24、SEQ ID NO：9的氨基酸9-24、或SEQID NO：9，或外生孢子蛋白可包括全长BAS1882(SEQ ID NO：10)。与BAS1882的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：69。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：11的氨基酸1-33、SEQ ID NO：11的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：11，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4 2280基因产物(SEQ ID NO：12)。与B.weihenstephensis KBAB4 2280基因产物的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：62。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：13的氨基酸1-33、SEQ ID NO：13的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：13，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4 3572基因产物(SEQ ID NO：14)。与B.weihenstephensis KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：63。
或者，靶向序列可包括SEQID NO：15的氨基酸1-43、SEQ ID NO：15的氨基酸28-43、或SEQ ID NO：15，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌VD200外生孢子前导肽(SEQ IDNO：16)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：17的氨基酸1-27、SEQ ID NO：17的氨基酸12-27、或SEQ ID NO：17，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌VD166外生孢子前导肽(SEQ IDNO：18)。与蜡状芽孢杆菌VD166外生孢子前导肽的氨基酸12-27连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：64。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：19的氨基酸1-33、SEQ ID NO：19的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：19，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663(SEQID NO：20)。
或者，靶向序列包括SEQ ID NO：21的氨基酸1-33、SEQ ID NO：21的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：21，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4YVTN β-螺旋蛋白(SEQ ID NO：22)。与B.weihenstephensis KBAB4YVTN β-螺旋蛋白的氨基酸18-33连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：65。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：23的氨基酸1-24、SEQ ID NO：23的氨基酸9-24、或SEQ ID NO：23，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363(SEQ ID NO：24)。与B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：66。
靶向序列包括SEQ ID NO：25的氨基酸1-24、SEQ ID NO：25的氨基酸9-24、或SEQID NO：25，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131(SEQ ID NO：26)。与B.weihenstephensis KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：67。
或者，靶向序列包括SEQ ID NO：27的氨基酸1-30、SEQ ID NO：27的氨基酸15-30、或SEQ ID NO：27，或外生孢子蛋白可包括全长B.weihenstephensis KBAB4含有胶原的三重螺旋重复物(SEQID NO：28)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：29的氨基酸1-33、SEQ ID NO：29的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：29，或外生孢子蛋白可包括全长蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660(SEQ ID NO：30)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：31的氨基酸1-24、SEQ ID NO：31的氨基酸9-24、或SEQ ID NO：31，或外生孢子蛋白可包括全长蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540(SEQID NO：32)。与蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：68。
或者，靶向序列包括SEQID NO：33的氨基酸1-15、SEQ ID NO：33，或外生孢子蛋白包括全长蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510(SEQ ID NO：34)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：35的氨基酸1-16、SEQ ID NO：35，或外生孢子蛋白可包括全长苏云金芽孢杆菌35646胶原三重螺旋重复蛋白(SEQ ID NO：36)。
靶向序列可包括SEQ ID NO：43的氨基酸1-29、SEQ ID NO：43的氨基酸14-29、或SEQ ID NO：43，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652(SEQ ID NO：44)。
或者，靶向序列可包括SEQ ID NO：45的氨基酸1-35、SEQ ID NO：45的氨基酸20-35、或SEQ ID NO：45，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌外生孢子前导物WP016117717(SEQ ID NO：46)。与蜡状芽孢杆菌外生孢子前导物WP016117717的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包括SEQ ID NO：70。
靶向序列可包括SEQ ID NO：47的氨基酸1-43、SEQ ID NO：47的氨基酸28-43、或SEQ ID NO：47，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌外生孢子肽WP002105192(SEQ IDNO：48)。
靶向序列可包括SEQ ID NO：49的氨基酸1-32、SEQ ID NO：49的氨基酸17-32、或SEQ ID NO：49，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353(SEQ ID NO：50)。
或者，靶向序列可包括SEQ ID NO：51的氨基酸1-33、SEQ ID NO：51的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：51，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌外生孢子肽02112369(SEQID NO：52)。
靶向序列可包括SEQ ID NO：53的氨基酸1-33、SEQ ID NO：53的氨基酸18-33、或SEQ ID NO：53，或外生孢子蛋白可包括全长蜡状芽孢杆菌外生孢子蛋白WP016099770(SEQID NO：54)。
或者，靶向序列可包括SEQ ID NO：55的氨基酸1-30、SEQ ID NO：55的氨基酸15-30、或SEQ ID NO：55，或外生孢子蛋白可包括全长苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525(SEQ ID NO：56)。
靶向序列还可包括SEQ ID NO：57的氨基酸1-130、SEQ ID NO：57的氨基酸115-130、或SEQ ID NO：57，或外生孢子蛋白可包括全长蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720(SEQID NO：58)。
此外，从图l的序列比对中可容易看出，尽管BclA的氨基酸20-35是保守的，且氨基酸25-35是更保守的，但是在该区域中可发生一定程度的改变，而不影响靶向序列将蛋白靶向至外生孢子的能力。图1列出了每个序列的每个相应氨基酸与BclA的氨基酸20-35(“20-35％的同一性”)和BclA的氨基酸25-35(“25-35％的同一性”)的百分比同一性。因此，例如，与BclA的氨基酸20-35相比，BetA/BAS3290的相应氨基酸为约81.3％同一的、BAS4623的相应氨基酸为约50.0％同一的、BclB的相应氨基酸为约43.8％同一的、BAS1882的相应氨基酸为约62.5％同一的、KBAB42280基因产物的相应氨基酸为约81.3％同一的、KBAB43572基因产物的相应氨基酸为约81.3％同一的。与其余序列的该区域的序列同一性列于图1中。
相对于BclA的氨基酸25-35，BetA/BAS3290的相应氨基酸为约90.9％同一的、BAS4623的相应氨基酸为约72.7％同一的、BclB的相应氨基酸为约54.5％同一的、BAS1882的相应氨基酸为约72.7％同一的、KBAB42280基因产物的相应氨基酸为约90.9％同一的、以及KBAB43572基因产物的相应氨基酸为约81.8％同一的。与其余序列的该区域的序列同一性列于图1中。
因此，靶向序列可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约50％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约56％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
或者，靶向序列可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。靶向序列还可由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约62％的同一性，其中与SEQIDNO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少68％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与SEQ ID NO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与SEQ ID NO：1的氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。或者，靶向序列由这样的氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
本领域技术人员将认识到还可使用以上序列的变体作为靶向序列，只要靶向序列包含BclA的氨基酸20-35，BetA/BAS3290、BAS4263、BclB、BAS1882、KBAB42280基因产物或KBAB3572基因产物的相应氨基酸，或存在含有与BclA的氨基酸20-35和25-35的任何上述序列同一性的序列。
还已发现，缺乏与BclA的氨基酸25-35具有同源性的区域的某些蜡状芽孢杆菌家族外生孢子蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子。具体地，融合蛋白可包括包含SEQ ID NO：71(蕈状芽孢杆菌InhA)的外生孢子蛋白、包含SEQID NO：72(炭疽芽孢杆菌Sterne BAS1141(ExsY))的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：73(炭疽芽孢杆菌Sterne BAS1144(BxpB/ExsFA))的外生孢子蛋白、包含SEQID NO：74(炭疽芽孢杆菌Sterne BAS1145(CotY))的外生孢子蛋白、包含SEQID NO：75(炭疽芽孢杆菌SterneBAS1140)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：76(炭疽芽孢杆菌H9401 ExsFB)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：77(苏云金芽孢杆菌HD74InhA1)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：78(蜡状芽孢杆菌ATCC 10876ExsJ)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：79(蜡状芽孢杆菌ExsH)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：80(炭疽芽孢杆菌Ames YjcA)的外生孢子蛋白、包含SEQID NO：81(炭疽芽孢杆菌YjcB)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：82(炭疽芽孢杆菌Sterne BclC)的外生孢子蛋白、包含SEQ ID NO：83(苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97-27酸磷酸酶)的外生孢子蛋白，或包含SEQ ID NO：84(苏云金芽孢杆菌HD74InhA2)的外生孢子蛋白。本文所述的融合蛋白包括包含SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84的外生孢子蛋白会实现靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子。
此外，与任何上述全长外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段具有高度序列同一性的外生孢子蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子。因此，融合蛋白可包括含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸的外生孢子蛋白。或者，融合蛋白可包括与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的外生孢子蛋白。
或者，融合蛋白可包括由与SEQ ID NO：59具有至少85％同一性的氨基酸序列组成的外生孢子蛋白片段。或者，融合蛋白可包括由与SEQ ID NO：59具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列组成的外生孢子蛋白片段。
在本文所述的任何靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段中，靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段在其羧酸端可包括氨基酸序列GXT，其中X为任意的氨基酸。
在本文所述的任何靶向序列、外生孢子蛋白和外生孢子蛋白片段中，靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸2的靶向序列的位置处可包括丙氨酸残基。
融合蛋白
融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段，以及至少一种植物生长刺激蛋白或肽。植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶。靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段可为任何上述靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段。
融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段，以及至少一种保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段可为任何上述靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段。
可使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制备融合蛋白。例如，编码蛋白或肽(例如，编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)的基因可通过聚合酶链反应(PCR)扩增，并连接至编码任何上述靶向序列的DNA上，以形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可被克隆至任何合适的载体中，例如质粒载体。所述载体适当地包括可以容易地插入编码融合蛋白的DNA分子的多克隆位点。所述载体还适当地含有可选择标记，例如抗生素抗性基因，使得可以容易地识别和分离用所述载体转化、转染或配对的细菌。当载体是质粒时，所述质粒还适当地包含复制起点。编码融合蛋白的DNA适当地处于孢子形成启动子的控制下，所述孢子形成启动子将引起融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员内生孢子(例如，来自蜡状芽孢杆菌家族成员的天然bclA启动子)的外生孢子上表达。或者，编码融合蛋白的DNA可被整合至蜡状芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。
融合蛋白还可包括不属于靶向序列、外生孢子蛋白、外生孢子蛋白片段、或植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽的一部分的额外的多肽序列。例如，融合蛋白可包括促进融合蛋白纯化或可视化的标签或标记物(例如，多组氨酸标签或荧光蛋白如GFP或YFP)或促进表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞孢子的可视化的标签或标记物。
由于在这些序列的氨基末端缺乏二级结构，使用本文所述的靶向序列、外生孢子蛋白和外生孢子蛋白片段增强了在外生孢子上的融合蛋白表达，其允许天然折叠融合蛋白和保留活性。通过在靶向序列、外生孢子蛋白、外生孢子蛋白片段和融合配偶体蛋白之间包含短的氨基酸接头可进一步增强适当的折叠。
因此，本文所述的任何融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白，或外生孢子蛋白片段和植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽，或植物结合蛋白或肽之间的氨基酸接头。
接头可包括聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。还可使用包含丙氨酸和甘氨酸残基的混合物的接头。例如，当靶向序列包括SEQ ID NO：1时，融合蛋白可具有以下结构之一：
无接头：SEQ ID NO：1-融合配偶体蛋白
丙氨酸接头：SEQ ID NO：1-An-融合配偶体蛋白
甘氨酸接头：SEQ ID NO：1-Gn-融合配偶体蛋白
混合的丙氨酸和甘氨酸接头：SEQ ID NO：1-(A/G)n-融合配偶体蛋白
其中An、Gn和(A/G)n分别是任何数量的丙氨酸、任何数量的甘氨酸，或任何数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。例如，n可为1至25，优选为6至10。当接头包括丙氨酸和甘氨酸残基的混合物时，可使用甘氨酸和丙氨酸残基的任何组合。在以上结构中，“融合配偶体蛋白”表示植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽，或植物结合蛋白或肽。
或者，或此外，接头可包括蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点允许在暴露于识别蛋白酶识别位点的蛋白酶时，能够靶向去除植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽，或植物结合蛋白或肽。
植物生长刺激蛋白和肽
如上所述，融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段和至少一种植物生长刺激蛋白或肽。例如，植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶。
例如，当植物生长刺激蛋白或肽包含肽激素时，肽激素可包括植物磺肽素(例如，植物磺肽素-α)、拟南芥(clavata 3，CLV3)、系统素、ZmlGF或SCR/SP11。
当植物生长刺激蛋白或肽包含非激素肽时，非激素肽可包括RKN16D10、Hg-Syv46、eNOD40肽、蜂毒肽、黄蜂毒素、Mas7、RHPP、POLARIS或kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)。
植物生长刺激蛋白或肽可包括涉及植物生长刺激化合物的生产或活化的酶。涉及植物生长刺激化合物的生产或活化的酶可为催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的非活性或更低活性衍生物转化成活性或更大活性形式的化合物的任何酶。
植物生长刺激化合物可包括由根际中的细菌或真菌产生的化合物，例如，2，3-丁二醇。
或者，植物生长刺激化合物可包括植物生长激素，例如，细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙烯、植物生长素或植物生长素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。
当植物生长刺激化合物包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物时，细胞分裂素或细胞分裂素衍生物可包括激动素、顺式-玉米素、反式-玉米素、6-苄基氨基嘌呤、二羟基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺嘌呤、核糖基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-顺式-核糖基玉米素、顺式-核糖基玉米素、反式-核糖基玉米素、2-甲硫基-反式-核糖基玉米素、核糖基玉米素-5-单磷酸酯、N6-甲基氨基嘌呤、N6--二甲基氨基嘌呤、2’-脱氧玉米素核苷、4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯基氨基嘌呤、邻-拓扑啉(ortho-topolin)、间-拓扑啉(meta-topolin)、苄基腺嘌呤、邻-甲基拓扑啉(ortho-methyltopolin)、间-甲基拓扑啉(ortho-methyltopolin)或其组合。
当植物生长刺激化合物包括植物生长素或植物生长素衍生物时，植物生长素或植物生长素衍生物可包括活性植物生长素、非活性植物生长素、缀合的植物生长素、天然存在的植物生长素、或合成的植物生长素，或其组合。例如，植物生长素或植物生长素衍生物可包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯基乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖-缀合的植物生长素，或其组合。
参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶可包括乙偶姻还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶(例如，色氨酸氨基转移酶)、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5’核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺反异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡萄糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CKN-葡萄糖基转移酶、2，5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，或参与产生结瘤因子(例如，nodA、nodB或nodI)的酶。
当酶包括蛋白酶或肽酶时，所述蛋白酶或肽酶可为裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。
生物活性肽的实例包括RKN 16D10和RHPP。
裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。
蛋白酶或肽酶可以裂解富含蛋白质的膳食(例如大豆粉或酵母提取物)中的蛋白。
植物生长刺激蛋白还可包括降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶。这种酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡萄糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体。当被引入植物生长基质或施用于植物、种子、或植物或植物种子周围的区域时，包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶的融合蛋白可有助于植物附近营养物质的加工，并且提高植物对营养物质的摄入或植物附近的有益细菌或真菌对营养物质的摄入。
合适的纤维素酶包括内切纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡状芽孢杆菌内切葡聚糖酶、或克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(例如，里氏木霉外切纤维素酶)以及β-葡萄糖苷酶(例如，枯草芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶、蜡状芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶、或克劳氏芽孢杆菌B-葡萄糖苷酶)。
脂肪酶可包括枯草芽孢杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡状芽孢杆菌脂肪酶、或克劳氏芽孢杆菌脂肪酶。
在一个实施方案中，脂肪酶包括枯草芽孢杆菌脂肪酶。枯草芽孢杆菌脂肪酶可使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatggctgaacacaatcc(正向，SEQ ID NO：37)和ggatccttaattcgtattctggcc(反向，SEQ ID NO：38)。
在另一实施方案中，纤维素酶为枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶。枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶可使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatgaaacggtcaatc(正向，SEQ ID NO：39)和ggatccttactaatttggttctgt(反向，SEQ ID NO：40)。
在又一个实施方案中，融合蛋白包括大肠杆菌(E.coli)蛋白酶PtrB。大肠杆菌蛋白酶PtrB可使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatgctaccaaaagcc(正向，SEQ ID NO：41)和ggatccttagtccgcaggcgtagc(反向，SEQ ID NO：42)。
在某些实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO：104中的核苷酸序列的内切葡聚糖酶。
可以与靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及任选地接头序列(例如多聚-A接头)融合的示例性内切葡聚糖酶的氨基酸序列是作为SEQ ID NO：107提供的融合蛋白。
在其他实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO：105中所示核苷酸序列的磷脂酶。
可以与靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及任选地接头序列(例如多聚-A接头)融合的示例性磷脂酶的氨基酸序列是作为SEQ ID NO：108提供的融合蛋白。
在另外的其他实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO：106中所示核苷酸序列的脱乙酰壳多糖酶。可以与靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及任选地接头序列(例如多聚-A接头)融合的示例性脱乙酰壳多糖酶的氨基酸序列是作为SEQ ID NO：109提供的融合蛋白。
为了产生融合构建体，可以使用重叠延伸拼接(SOE)技术将基因融合到编码BclA的前35个氨基酸(SEQ ID NO：1的氨基酸1-35)的苏云金芽孢杆菌DNA的天然bclA启动子上。将正确的扩增子克隆至大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体pHP13，并通过DNA测序筛选正确的克隆物。将正确的克隆物电穿孔至苏云金芽孢杆菌(Cry-，质粒-)中并筛选氯霉素抗性。让正确的转化体在脑心浸液中在30℃下过夜生长，将其放置在营养琼脂板上，并在30℃下培养3天。表达融合构建体的孢子(BEMD孢子)可通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤而从板上收集，并通过离心并再在PBS中洗涤而纯化。
在这种融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可包括编码分别与SEQ ID NO：107、108或109具有至少85％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在这种融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可包括分别与SEQID NO：107、108或109具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在这种融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可包括分别与SEQID NO：107、108或109具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在这种融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可包括分别与SEQID NO：107、108或109具有至少98％同一性的氨基酸序列。
在这种融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可包括分别与SEQID NO：107、108或109具有至少99％同一性的氨基酸序列。
合适的木质素氧化酶包括木质素过氧化物酶、漆酶、乙二醛氧化酶、木质酶、和锰过氧化物酶。
蛋白酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。
磷酸酶可包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶(例如，PhoA4)、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酸酐水解酶、焦磷酸酶、植酸酶(例如，枯草芽孢杆菌EE148植酸酶或苏云金芽孢杆菌BT013A植酸酶)、三偏磷酸酶、或三磷酸酶。
固氮酶可包括Nif家族固氮酶(例如，马赛类芽孢杆菌(Paenibacillusmassiliensis)NifBDEHKNXV)。
保护植物免受病原体侵害的蛋白和肽
融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及至少一种保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。
蛋白或肽可包括刺激植物免疫应答的蛋白或肽。例如，刺激植物免疫应答的蛋白或肽可包括植物免疫系统增强剂蛋白或肽。植物免疫系统增强剂蛋白或肽可为对植物的免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。合适的植物免疫系统增强剂蛋白和肽包括harpin、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、系统素、苯基丙氨酸氨裂解酶、诱发素、防御素、隐地蛋白、鞭毛蛋白和鞭毛肽(例如，flg22)。
或者，保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可为具有抗细菌活性、抗真菌活性、或同时具有抗细菌和抗真菌活性的蛋白或肽。这种蛋白和肽的实例包括细菌素、溶菌酶、溶菌酶肽(例如，LysM)、铁载体、非核糖体活性肽、伴清蛋白、清蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽(例如，LfcinB)、TasA和链霉亲合素。
保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽还可为具有杀昆虫活性、杀蠕虫活性、抑制昆虫或蠕虫捕食的蛋白或肽，或其组合。例如，保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可包括杀昆虫细菌毒素(例如，VIP杀昆虫蛋白)、内毒素、Cry毒素(例如，来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素)、蛋白酶抑制剂蛋白或肽(例如，胰蛋白酶抑制剂或慈姑蛋白酶抑制剂)、半胱氨酸蛋白酶、或几丁质酶。当Cry毒素为来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素时，Cry毒素可为Cry5B蛋白或Cry21A蛋白。Cry5B和Cry21A均同时具有杀昆虫和杀线虫活性。
保护植物免受病原体侵害的蛋白可包括酶。合适的酶包括蛋白酶和内酯酶。蛋白酶和内酯酶可对细菌信号分子(例如，细菌内酯高丝氨酸信号分子)是特异性的。
当所述酶为内酯酶时，所述内酯酶可包括1，4-内酯酶、2-吡喃酮-4，6-二羧酸内酯酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、放射菌素内酯酶、脱氧柠檬酸A-环-内酯酶、葡萄糖酸内酯酶L-鼠李糖酸-1，4-内酯酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶，或木糖酸-1，4-内酯酶。
所述酶还可为对细菌或真菌的细胞成分具有特异性的酶。例如，所述酶可包括β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、几丁质酶、脱乙酰壳多糖酶样酶、溶细胞酶、肽酶、蛋白酶、蛋白酶(例如，碱性蛋白酶、酸蛋白酶，或中性蛋白酶)、变溶菌素、消旋溶素(stapholysin)或溶菌酶。
增强植物胁迫耐受性的蛋白和肽
融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及至少一种增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽。
例如，增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽包括降解胁迫相关的化合物的酶。胁迫相关的化合物包括但不限于氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧种类、一氧化氮、氧脂素和酚类。具体的活性氧种类包括羟基、过氧化氢、氧气和过氧化物。降解胁迫相关的化合物的酶可包括过氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化酶或抗氧化肽。
增强植物胁迫耐受性的蛋白或肽还可包括保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽。例如，环境胁迫可包括：旱、涝、热、冻、盐、重金属、低pH、高pH，或其组合。例如，保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽可包括冰核蛋白、脯氨酸酶、苯基丙氨酸氨裂解酶、异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸盐裂解酶、或胆碱脱氢酶。
植物结合蛋白和肽
融合蛋白可包括靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段以及至少植物结合蛋白或肽。植物结合蛋白或肽可为能够特异性地或非特异性地结合植物的任何部位(例如，植物根或植物空中部分例如叶子、茎、花或果实)或植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可为根结合蛋白或肽、或叶结合蛋白或肽。
合适的植物结合蛋白和肽包括粘附素(例如，根钙粘素(rhicadhesin))、鞭毛蛋白、omptin、凝集素、棒曲霉素、生物膜结构蛋白(例如，TasA或YuaB)、菌毛蛋白、卷曲蛋白(curlus protein)、紧密粘附素、侵袭素、凝集素和afimbrial蛋白。
表达融合蛋白的重组芽孢杆菌
本文所述的融合蛋白可通过产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞表达。融合蛋白可为上文讨论的任何融合蛋白。
产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可共表达上文讨论的任何融合蛋白中的两个或更多个。例如，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可共表达包含植物结合蛋白或肽的至少一种融合蛋白，以及包含植物生长刺激蛋白或肽的至少一种融合蛋白、包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽的至少一种融合蛋白、或增强植物胁迫耐受性的至少一种蛋白或肽。
产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、Bacillus weihenstephensis、Bacillus toyoiensis或其组合。例如，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。具体地，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
为了产生表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，可使用本领域已知的标准方法(例如通过电穿孔)用编码融合蛋白的载体缀合、转导或转化任意蜡状芽孢杆菌家族成员。然后可以通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包含抗生素抗性基因时，可筛选细菌的抗生素抗性。或者，编码融合蛋白的DNA可被整合至蜡状芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。然后，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可以暴露于会引起孢子形成的条件。用于引起孢子形成的合适的条件是本领域已知的。例如，可将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞放置到琼脂板上，并在约30℃的温度下培养数天(例如，3天)。
还可以适当地使用非活性的菌株、非毒性的菌株或任何上述物种的经遗传操作的菌株。例如，可以使用缺乏Cry毒素的苏云金芽孢杆菌。或者，或此外，一旦产生了表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族孢子，就可以将其灭活，以防止在使用中再次萌发。可以使用本领域已知的灭活细菌孢子的任何方法。合适的方法包括但不限于热处理、γ照射、x-射线照射、UV-A照射、UV-B照射、化学处理(例如，用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或它们的任何组合进行处理)，或其组合。或者，可以使用衍生自非毒性菌株或经遗传或物理灭活的菌株的孢子。
具有植物生长促进作用和/或其他有益特征的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞
许多蜡状芽孢杆菌家族成员菌株具有固有的有益特征。例如，某些菌株具有植物生长促进作用。可以在这些菌株中表达本文所述的任何融合蛋白。
例如，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括细菌的植物生长促进菌株。
细菌的植物生长促进菌株可包括这样的细菌的菌株：产生杀昆虫毒素(例如，Cry毒素)，产生杀真菌化合物(例如，β-1，3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或它们的组合)，产生杀线虫化合物(例如，Cry毒素)，产生杀细菌化合物一一其对一种或多种抗生素具有抗性，包含一种或多种自由复制质粒，结合植物根，定植植物根，形成生物膜，溶解营养物质，分泌有机酸；或它们的组合。
例如，当产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞包括细菌的植物生长促进菌株时，细菌的植物生长促进菌株可包括蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL号B-50921)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL号B-50918)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL号B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL号B-50922)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL号B-50917)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL号B-50924)或蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL号B-50928)。苏云金芽孢杆菌BT013A还被称为苏云金芽孢杆菌4Q7。这些菌株的每一种都于2014年3月10日保藏于美国农业部(USDA)农业研究院(ARS)，其地址为：美国伊利诺斯州皮奥里亚市，北大学街1815号，邮编61604，并且通过在括号中提供的NRRL保藏号来识别。
这些植物生长促进菌株从各种活力植物的根际分离出，通过其16S rRNA并通过生物化学试验鉴定。通过常规生物化学和形态学指标将菌株至少鉴定至其属名称。用于确认的革兰氏阳性菌株(例如芽孢杆菌)的生物化学试验包括在PEA培养基和营养琼脂上生长、显微镜观察、在5％和7.5％NaCl培养基上生长、在pH 5和pH 9下生长、在42℃和50℃下生长、在用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d-甘露醇和淀粉发酵时产生酸的能力；荧光颜料生成；明胶水解；硝酸盐还原；过氧化氢酶生成；淀粉水解；氧化酶反应、脲酶生成和运动性。
例如，包括细菌的植物生长促进菌株的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE141或苏云金芽孢杆菌BT013A。产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可表达任何上述融合蛋白，例如，包含SEQ ID NO：60的靶向序列和非激素肽(例如，kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI))、参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶(例如，脱乙酰壳多糖酶)、植物结合蛋白或肽(例如，TasA)；保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽(例如，TasA)，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶(例如，磷酸酶例如PhoA或植酸酶或内切葡聚糖酶)的融合蛋白。
启动子
在本文所述的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞中，融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子对融合蛋白的靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段是天然的。例如，当融合蛋白包括衍生自炭疽芽孢杆菌Sterne BclA的靶向序列(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸20-35、SEQ ID NO：1的氨基酸1-35、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：60)时或当融合蛋白包括全长BclA(SEQ ID NO：2)或全长BclA的片段(例如，SEQ ID NO：59)时，融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子通常与炭疽芽孢杆菌Sterne基因组中的BclA基因相关(例如，SEQ ID NO：85的启动子)。
或者，融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在一些情况下，对靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段为天然的启动子会是高表达孢子形成启动子。在其他情况中，对靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段为天然的启动子不会是高表达孢子形成启动子。在后面的情况下，可能有利的是，用高表达孢子形成启动子替换天然的启动子。在高表达孢子形成启动子的控制下的融合蛋白的表达提供了融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员的外生孢子上增加的表达。
高表达孢子形成启动子可包括一种或多种σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
在蜡状芽孢杆菌家族成员中用于表达融合蛋白的合适的高表达孢子形成启动子包括在下表2中列出的那些：
表2.启动子序列
在上文表2中列出的启动子序列中，σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列的位置用粗体和下划线标出。Cry1A启动子(苏云金芽孢杆菌HD-73；SEQ ID NO：90)具有总共四个σ-K序列，其中两个彼此重叠，如在表2中用双下划线标出的。
在蜡状芽孢杆菌家族成员中用于表达融合蛋白的优选的高表达孢子形成启动子包括BetA启动子(炭疽芽孢杆菌Sterne；SEQ ID NO：86)、BclA启动子(炭疽芽孢杆菌Sterne；SEQ ID NO：85)、BclA簇糖基转移酶操纵子1和2启动子(炭疽芽孢杆菌Sterne；SEQID NO：101和102)和YVTNβ-螺旋蛋白启动子(B.weihenstephensis KBAB 4；SEQ ID NO：89)。
在本文所述的任何产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞中，融合蛋白可在包含以下核酸序列的孢子形成启动子的控制下表达：所述核酸序列与SEQ ID NO：85-103中任一种的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
当孢子形成启动子包含与SEQ ID NO：85-103中任一种的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列时，σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列优选与SEQ ID NO：85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103的相应核苷酸具有100％的同一性。例如，如上表2所示，炭疽芽孢杆菌Sterne的BclA启动子(SEQ ID NO：85)在核苷酸24-32、35-43和129-137处具有σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。因此，如果孢子形成启动子包含与SEQ ID NO：85的核酸序列具有至少90％同一性的序列，则优选对应于SEQ ID NO：85的核苷酸24-32、35-43和129-137的孢子形成启动子的核苷酸与SEQ ID NO：85的核苷酸24-32、35-43和129-137具有100％的同一性。
在任何本文所述的刺激植物生长的方法中，在包含产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种选自本文公开的特定杀虫剂的杀虫剂的植物生长培养基中生长的植物与在不含产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的相同的植物生长培养基中的植物的生长相比表现出增加的生长。
在任何本文所述的刺激植物生长的组合物和方法中，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞可包括任何上文所述的细菌的重组植物生长促进菌株。
在任何本文所公开的刺激植物生长的组合物或方法中，融合蛋白可在任何上文所述的启动子的控制下表达。
杀虫剂
“杀虫剂”和术语“杀昆虫的”指物质提高昆虫的死亡率或抑制其生长率的能力。在本说明书中，术语“昆虫”包括昆虫纲的所有生物体。术语“成年前”昆虫指在成年阶段前的生物体的任何形式，包括例如卵、幼虫和若虫。如本文所用的，术语“杀虫剂”和“杀昆虫的”还涵盖“杀线虫剂”和“杀线虫的”以及“杀螨虫剂”和“杀螨虫的”。
“杀线虫剂”和“杀线虫的”指物质提高线虫死亡率或抑制其生长率的能力。一般而言，术语“线虫”包括所述生物体的卵、幼虫(larva)、幼体(juvenile)和成虫形式。
“杀螨虫剂”或“杀螨虫的”指物质提高属于蛛形纲蜱螨亚纲的外寄生虫的死亡率或抑制其生长率的能力。
本文以其“通用名”具体指明的活性成分是已知的并且记载于例如农药手册(“ThePesticide Manual”，第16版，英国作物保护委员会2012)或者可在因特网中发现(例如http：//www.alanwood.net/pesticides)。
在一些实施方案中，所述杀虫剂选自啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫双酰胺、氟吡呋喃酮、氟吡菌酰胺、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、砜吸磷、伏杀硫磷、灭虫硅醚、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺及含有α-萜品烯、对-聚伞花素和柠檬烯这三种萜烯的农药萜烯混合物，以及任选地最小的萜烯成分，包括以出售的含有三种萜烯(即α-萜品烯、对-聚伞花素和柠檬烯)的混合物的模拟的天然农药。
根据本发明的一个优选实施方案，所述杀虫剂选自噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮、吡虫啉、甲硫威和硫双威。
本发明的组合物
根据本发明，所述组合物包含协同有效量的a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，和保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)至少一种本文公开的特定杀虫剂。
根据本发明，“协同有效量”代表一定量的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和本文所述的至少一种杀虫剂的组合，所述组合在抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体方面，比单独的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞或单独的杀虫剂更加有效。根据本发明，“协同有效量”还代表一定量的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂的组合，所述组合在增强植物生长和/或促进植物健康方面比单独的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞或单独的杀虫剂更加有效。
本发明包括每一种本文公开的特定杀虫剂和产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的各自和每个组合。
在一个高度优选的实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶，和保护植物免受病原体或害虫侵害的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位于芽孢杆菌细胞的外生孢子的靶向序列；以及b)至少一种本文公开的特定杀虫剂，并且所述至少一种杀虫剂选自啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫双酰胺、氟吡呋喃酮、氟吡菌酰胺、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、砜吸磷、伏杀硫磷、灭虫硅醚、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺和1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物还包括至少一种杀真菌剂。
一般而言，“杀真菌的”表示物质提高真菌的死亡率或抑制其生长率的能力。术语“真菌”包括广泛的缺乏叶绿素的携带孢子的有核生物体。真菌的实例包括酵母、霉(mold)、霉菌(mildew)、锈菌和蘑菇。
其他添加剂
本发明的一个方面提供上述的组合物，其还包括至少一种选自填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、增稠剂和佐剂的助剂。这些组合物被称为制剂。
因此，在本发明的一个方面，提供所述制剂及由其制备的施用形式作为包含本发明组合物的作物保护剂和/或农药剂，例如浸液、滴液和喷雾液。所述施用形式可包括其他作物保护剂和/或农药剂，和/或增强活性的佐剂，例如渗透剂，其实例是植物油(如油菜籽油、向日葵籽油)、矿物油(如液体石蜡)、植物脂肪酸烷基酯(如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯)或链烷醇烷氧基化物，和/或铺展剂(spreader)如烷基硅氧烷和/或盐类，其实例是有机或无机铵盐或鏻盐(实例为硫酸铵或磷酸氢二铵)，和/或保留促进剂，如磺基丁二酸二辛基酯或羟丙基瓜尔胶聚合物，和/或保湿剂如甘油，和/或肥料，例如铵肥、钾肥或磷肥。
典型制剂的实例包括水溶性液体(SL)、乳化浓缩剂(EC)、水乳液(EW)、悬浮浓缩剂(SC、SE、FS、OD)、水分散颗粒剂(WG)、颗粒剂(GR)和胶囊浓缩剂(CS)；这些以及其他可能类型的制剂由Crop Life International和在Pesticide Specifications，Manual ondevelopment and use of FAO and WHO specifications for pesticides.FAO PlantProduction and Protection Papers-173(由FAO/WHO关于杀虫剂手册的联合会议制订，2004，ISBN：9251048576)中描述。除了本发明的一种或多种活性化合物以外，所述制剂还可包括农业化学活性化合物。
所讨论的制剂或施用形式优选地包括助剂，例如填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、杀生物剂、增稠剂和/或其他助剂，例如佐剂。在本文中，佐剂是增强所述制剂的生物学作用的组分，该组分本身不具有生物学作用。佐剂的实例为促进保留、扩散、附着于叶片表面或渗透的试剂。
这些制剂以已知的方式制备，例如通过混合所述活性化合物与助剂，例如填充剂、溶剂和/或固体载体和/或其他助剂如表面活性剂。所述制剂或者在合适的设备中制备，或者在施用前或施用过程中制备。
适合用作佐剂的是适于赋予活性化合物的制剂或由这些制剂制备的施用形式(例如，可用的作物保护剂，例如喷雾液体或拌种剂)特殊特性(例如某种物理、技术和/或生物学特性)的物质。
合适的填充剂是，例如，水、极性和非极性有机化学液体，例如芳香族和非芳香族烃(例如，石蜡、烷基苯、烷基萘、氯苯)，醇类和多元醇(如果合适，其还可被取代、醚化和/或酯化)，酮(例如丙酮、环己酮)，酯(包括脂肪和油)和(聚)醚，未取代的或取代的胺、酰胺、内酰胺(例如N-烷基吡咯烷酮)和内酯，砜和亚砜(例如，二甲基亚砜)。
如果使用的填充剂是水，还可以使用例如有机溶剂作为辅助溶剂。基本上，合适的液体溶剂为：芳香族化合物如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯化芳香烃和氯化脂肪烃如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃如环己烷或石蜡；例如石油馏分；矿物油和植物油；醇类，例如丁醇或乙二醇及其醚和酯；酮类，例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。
原则上，可以使用所有合适的溶剂。合适的溶剂为：例如芳香烃如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯化芳香烃或氯化脂肪烃，例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃，例如环己烷；石蜡；石油馏分；矿物油和植物油；醇类，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或乙二醇，及其醚和酯；酮类，例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，例如二甲基亚砜和水。
原则上可以使用所有合适的载体。合适的载体尤其为，例如：铵盐和粉碎的天然矿物质，例如高岭土、粘土、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土，以及粉碎的合成矿物质，例如细分散的二氧化硅、氧化铝和天然或合成硅酸盐、树脂、蜡和/或固体肥料。也可以使用这些载体的混合物。适用于颗粒的载体包括以下：例如粉碎和分级的天然矿物质，例如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石，以及无机和有机粉末的合成颗粒，以及有机材料如锯屑、纸、椰子壳、玉米穗轴和烟草秸秆的颗粒。
还可使用液化的气体填充剂或溶剂。特别合适的是在标准温度和标准压力下是气态的填充剂或载体，其实例是气溶胶喷射剂，例如卤化烃，以及丁烷、丙烷、氮气和二氧化碳。
乳化剂和/或泡沫形成剂、具有离子或非离子特性的分散剂或润湿剂、或这些表面活性物质的混合物的实例为：聚丙烯酸盐、木素磺酸盐、苯磺酸盐或萘磺酸盐、环氧乙烷与脂肪醇或与脂肪酸或与脂肪胺、与取代的苯酚(优选烷基苯酚或芳基苯酚)的缩聚物、磺基丁二酸酯的盐、牛磺酸衍生物(优选烷基牛磺酸盐)、聚乙氧基醇或酚的磷酸酯、多元醇的脂肪酸酯，以及包含硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐的化合物的衍生物，其实例为烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基磺酸盐、蛋白质水解产物、木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。如果活性化合物之一和/或惰性载体之一不溶于水，并且施用发生在水中，则表面活性物质的存在是有利的。
可在制剂及从其衍生的施用形式中存在的其他助剂包括：着色剂，例如无机颜料，其实例为氧化铁、氧化钛、普鲁士蓝，以及有机染料，例如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料(metal phthalocyanine dye)，以及营养素和微量营养素，例如铁盐、锰盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐和锌盐。
也可以存在稳定剂，例如低温稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂或改进化学和/或物理稳定性的其他试剂。此外，可存在泡沫形成剂或消泡剂。
此外，制剂及从其衍生的施用形式还可包括，粘着剂(sticker)例如羧甲基纤维素，粉状、颗粒状或胶乳状的天然和合成聚合物，例如阿拉伯树胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯，以及天然磷脂，例如脑磷脂和卵磷脂，以及合成磷脂，作为附加的助剂。其他可能的助剂包括矿物油和植物油。
在制剂及从其衍生的施用形式中可存在其他助剂。所述添加剂的实例包括香精、保护性胶体、粘合剂(binder)、粘着剂(adhesive)、增稠剂、触变物质、渗透剂、保留促进剂、稳定剂、螯合剂(sequestrant)、络合剂、保湿剂和铺展剂。总体来说，活性化合物可与通常用于制剂目的的任何固体或液体添加剂组合。
合适的保留促进剂包括所有降低动态表面张力的那些物质，例如磺基丁二酸二辛基酯，或增加粘弹性的那些物质，例如羟丙基瓜尔胶聚合物。
本文中合适的渗透剂包括所有通常用于增强活性农业化学化合物向植物渗透的那些物质。在本文中，渗透剂的定义是，其能够从(通常为水性的)施用液体和/或从喷雾包衣渗透植物表皮，从而增加活性化合物在表皮中的迁移。此特性可使用文献(Baur et a1.，1997，Pesticide Science 51，131-152)中描述的方法来确定。实例包括醇烷氧基化物，例如椰子脂肪乙氧基化物(10)或异十三烷基乙氧基化物(12)；脂肪酸酯，例如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯；脂肪胺烷氧基化物，例如牛油脂肪胺乙氧基化物(15)；或铵盐和/或鏻盐，例如硫酸铵或磷酸氢二铵。
基于制剂的重量计，所述制剂优选地包括0.0001～98重量％的活性化合物，或者特别优选地，0.01～95重量％的活性化合物，更优选地，0.5～90重量％的活性化合物。所述活性化合物的含量被定义为产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂之和。
由制剂所制备的施用形式(作物保护产品)中活性化合物的含量可在较大范围内变化。施用形式的活性化合物浓度通常可为0.0001～95重量％的活性化合物，优选0.0001～1重量％，基于该施用形式的重量计。施用以适合于施用形式的常规方式进行。
此外，在本发明的一个方面，提供了一种成套试剂盒，其包含协同有效量的在空间上分开放置的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂。
在本发明的另一个实施方案中，上述成套试剂盒还包含至少一种其他的杀真菌剂和/或至少一种本文公开的特定杀虫剂。所述杀真菌剂和/或杀虫剂可存在于该成套试剂盒的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞组分中，或存在于空间上分开的该成套试剂盒的杀虫剂组分中，或同时存在于这些组分中。优选地，所述杀真菌剂和/或杀虫剂存在于产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞组分中。
此外，本发明的成套试剂盒还可包含至少一种助剂，所述助剂选自下文所述的填充剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、增稠剂和佐剂。所述至少一种助剂可存在于该成套试剂盒的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞组分中，或存在于空间上分开的该成套试剂盒的杀虫剂组分中，或者同时存在于这些组分中。
在本发明的另一个方面中，上述组合物用于减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的总体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。
此外，在本发明的另一个方面中，所述组合物增加了总体植物健康。
术语“植物健康”通常包括与害虫防治无关的多种植物改进。例如，可提到的有利特性是改进的作物特征，包括：出苗(emergence)、作物产量、蛋白质含量、油含量、淀粉含量、更发达的根部系统、改善的根部生长、改善的根部大小维持、改善的根部效率、改善的胁迫耐受性(例如，耐受干旱、热、盐、紫外线、水、冷)、减少的乙烯(减少产生和/或抑制接受)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、基底部死叶减少、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合作用活性、所需输入减少(例如肥料或水)、所需种子减少、更高产的分蘖、开花更早、谷物成熟早、植物倒伏(lodging)减少、幼苗生长加快、植物活力增强、植物承受力(stand)增加、更早和更好的发芽。
对于本发明的用途，改进的植物健康优选地指改进的植物特征，包括：作物产量、更发达的根部系统(改善的根部生长)、改善的根部大小维持、改善的根部效率、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、基底部死叶减少、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、光合作用活性、更高产的分蘖、植物活力增强及植物承受力增加。
对于本发明，改进的植物健康优选地尤其指选自以下的改进的植物特征：作物产量、更发达的根部系统、改善的根部生长、改善的根部大小维持、改善的根部效率、分蘖增加和植物高度增加。
如本文定义，本发明的组合物对植物健康的效果可通过将在相同环境条件下生长的植物进行比较而确定，其中将所述植物的一个部位用本发明组合物处理，而所述植物的另一部位不用本发明组合物处理。相反，所述其它部位完全不处理，或者用安慰剂处理(即不用本发明组合物的施用，例如不用所有活性成分(即，不用本文所述的基于产生外生孢子的重组芽孢杆菌家族成员的生物防治剂且不用本文所述的杀虫剂)的施用，或不用本文所述的基于产生外生孢子的重组芽孢杆菌家族成员的生物防治剂的施用，或不用本文所述的杀虫剂的施用。
本发明的组合物可以任何需要的方式施用，例如以种子包衣、土壤浸液、和/或直接施用于犁沟中和/或叶片喷雾的形式，可在出苗前、出苗后或同时使用。换言之，所述组合物可被施用于种子、植物或采收的果实和蔬菜，或施用至植物生长或希望其生长的土壤(植物生长地)。
减小植物和植物部位的整体损害通常得到更健康的植物和/或植物活力及产量增加。
优选地，本发明的组合物用于处理传统植物或转基因植物或其种子。
本发明还涉及使用上述任何组合物刺激植物生长的方法，所述组合物包含表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂。刺激植物生长的方法包括向植物、植物部位、植物周围场所或将被种植植物的场所(例如，土壤或其他生长基质)施用组合物，所述组合物包含协同有效量的表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞以及至少一种其他的本文公开的特定杀虫剂，所述融合蛋白包含(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和(ii)靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段。
在本发明的另一个方面，提供减少植物或植物部位的整体损害以及减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的采收果实或蔬菜的损失的方法，所述方法包括以下步骤：同时或按顺序地施用协同有效量的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂。
在本发明的另一个实施方案中，除了产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和本文公开的特定杀虫剂以外，所述组合物包括至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂。在一个实施方案中，所述至少一种杀真菌剂是合成杀真菌剂。
本发明的方法包括以下施用方法，即将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂可制备成具有农业上可接受的保质期的单一、稳定的组合物(被称为“单一制剂”)，或在使用前或使用时组合到一起(被称为“组合制剂”)。
如果未另外提及，表述“组合”代表产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂的各种组合，其以单一制剂、单一的“混合即用”形式、由单一制剂组成的组合喷雾混合物形式(例如“桶混物”)，特别是当以依次的方式施用时组合使用单个活性成分，即在合理的短时间段(例如几小时或几天，如2小时到7天)内一种成分接着另一种成分施用。施用本发明组合物的次序对于进行本发明不是必要的。因此，术语“组合”还包括产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂存在于待处理的植物上或待处理的植物中或其环境、生境或贮存空间，例如，在同时或依次将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂、以及任选地至少一种杀真菌剂施用于植物或其环境、生境或贮存空间后。
如果将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂依次施用或使用，则优选地按照以下方法处理植物或植物部位(包括种子和从种子萌发的植物)、采收果实和蔬菜：首先，将至少一种本文公开的特定杀虫剂和任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种其他杀虫剂施用于植物或植物部位；其次，将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞施用于相同的植物或植物部位。通过这种施用方式，使得收获时植物上的杀虫剂/杀真菌剂的残余物的量尽可能低。在一个(作物)生长周期内，第一次施用和第二次施用之间的时间间隔可不同，并取决于要实现的效果。例如，首次施用是为了防止植物或植物部位被昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵害(这特别是对处理种子的情况)，或者是为了应对昆虫、线虫和/或植物病原体感染(这特别是对处理植物和植物部位的情况)；而第二次施用是为了防止或防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体感染和/或促进植物生长。在本文中，“防治”指产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞不能完全根除害虫或植物病原菌，但是能够将感染保持在可接受的水平。
本发明还提供通过多次施用提高本发明组合物的杀死、抑制、预防和/或对抗的活性的方法。在一些其他实施方案中，在任何期望的生长阶段或在任何预定的害虫压力下，在间隔为约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间下，将本发明的组合物施用至植物和/或植物部位两次。在一些实施方案中，在任何期望的生长阶段或在任何预定的害虫压力下，在间隔为约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间下，将本发明的组合物施用至植物和/或植物部位超过两次，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次，或更多次。如果需要，每次施用之间的间隔可以变化。根据植物种类、植物害虫种类和其他因素，本领域技术人员能够确定施用次数和间隔长度。
通过遵循前述步骤，可以在被处理的植物、植物部位和采收的果实和蔬菜上达到所述至少一种杀真菌剂和/或至少一种本文公开的特定杀虫剂和/或其他杀虫剂的非常低水平的残留。
如果没有另外提及，使用本发明的组合物对植物或植物部位(包括种子和从种子萌发的植物)、采收果实和蔬菜的处理直接进行，或者通过作用于其环境、生境或贮存空间而进行，所述处理使用常规的处理方法，例如浸泡、喷雾、雾化、灌溉、蒸发、撒粉、成雾、播种、成泡、涂覆、涂抹、浇水(浇灌)、滴灌。还可通过超低容量法将产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞、至少一种本文公开的特定杀虫剂和任选地至少一种杀真菌剂作为单一制剂或组合制剂施用，或者将本发明的组合物作为一种组合物或单一制剂注射进土壤(犁沟中(in-furrow))。
术语“待处理的植物”包括植物的每一个部位，包括其根部系统及分别在待处理植物的主茎或主干周围半径为至少10cm、20cm、30cm，或者在所述待处理植物的根部系统周围半径为至少10cm、20cm、30cm的物质(例如土壤和营养基)。
与至少一种本文公开的特定杀虫剂、任选地在至少一种杀真菌剂存在的情况下组合使用或施用的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的量取决于最终的制剂及待处理的植物、植物部位、种子、采收果实和蔬菜的大小或种类。通常，根据本发明施用或使用的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞在其单一制剂或与所述至少一种本文公开的特定杀虫剂和任选地杀真菌剂的组合制剂中，以约1％～约80％(w/w)、优选地约1％～约60％(w/w)、更优选地约10％～约50％(w/w)存在。
同样地，与产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞、任选地在至少一种杀真菌剂存在的情况下组合使用的至少一种本文公开的特定杀虫剂的量取决于最终的制剂及待处理的植物、植物部位、种子、采收果实和蔬菜的大小或种类。通常，根据本发明施用或使用的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞在其单一制剂或与所述至少一种本文公开的特定杀虫剂和任选地杀真菌剂的组合制剂中，以约1％～约80％(w/w)、优选地约1％～约60％(w/w)、更优选地约10％～约50％(w/w)存在。
产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的施用可以以叶面喷雾、土壤处理和/或种子处理/包衣的方式进行。在一个实施方案中，当以叶面处理的方式使用时，每英亩施用约1/16至约5加仑的全液体(whole broth)。在一个实施方案中，当以土壤处理的方式使用时，每英亩施用约1至约5加仑的全液体。当用于种子处理时，每英亩施加约1/32至约1/4加仑的全液体。对于种子处理而言，最终使用的制剂含有1x 104、至少1x 105、至少1x 106、1x 107、至少1x 108、至少1x 109或至少1x 1010个集落形成单位/g。
产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂以及如果存在(优选地)还有杀真菌剂以协同重量比使用。技术人员能够通过常规方法找出本发明的协同重量比。技术人员了解，这些比值指的是本文所述的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂在组合制剂中的比值以及两种组分以单一制剂施用于待处理植物时的计算比值。因为在单一制剂中，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂的体积和用量分别对技术人员是已知的，所以技术人员通过简单的数学计算可计算出该比值。
所述比值可基于在将本发明的结合物的所述组分施用至植物或植物部位的时间点时的所述至少一种本文公开的特定杀虫剂的量，和在将本发明的结合物的所述组分施用于植物或植物部位的时间点或不久之前(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h前)的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的量计算。
只要在施用后两种组分都在植物上或植物内，则产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂向植物或植物部位的施用可同时或在不同时间进行。在产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和杀虫剂于不同时间施用，并且杀虫剂明显在产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞之前施用的情况下，在施用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的时间点或之前不久，技术人员可通过本领域中已知的化学分析来确定施用于植物上/植物内的杀虫剂的浓度。反之亦然，当产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞首先被施用于植物时，在施用杀虫剂的时间点或之前不久，可通过本领域已知的试验来确定产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的浓度。
具体地，在一个实施方案中，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂的协同重量比在1∶1000至1000∶1的范围内，优选在1∶500至500∶1的范围，更优选1∶300至500∶1的范围内。尤其优选的比值为20∶1至1∶20，例如10∶1、5∶1或2∶1。应当注意的是，这些比值范围指基于重组蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治剂(将与至少一种本文公开的特定杀虫剂或至少一种本文公开的特定杀虫剂的制剂组合)。例如，比值100∶1指100重量份的基于产生外生孢子的重组芽孢杆菌生物防治剂的孢子制剂与1重量份的杀虫剂组合(或者作为单一制剂、组合制剂，或者分开施用于植物从而在植物上形成结合物)。在本实施方案的一个方面，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的孢子制剂为含有至少约1x104cfu/g、至少约1x 105cfu/g、至少约1x 106cfu/g、至少约1x 107cfu/g、至少约1x108cfu/g、至少约1x 109cfu/g、至少约1x 1010cfu/g、或至少约1x 1011cfu/g的经干燥的孢子制剂。
在另一个实施方案中，产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂的协同重量比在1∶100至20,000∶1，优选在1∶50至10,000∶1范围内或甚至在1∶50至1000∶1范围内。
在本发明的一个实施方案中，分散后产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞的浓度为至少50g/ha，例如50-7500g/ha、50-2500g/ha、50-1500g/ha；至少250g/ha(公顷)、至少500g/ha或至少800g/ha。
根据本发明待使用或施用的组合物的施用率可变化。技术人员通过常规实验能够找到合适的施用率。
在本发明的另一个方面，提供了用上文描述的组合物处理的种子。
通过处理植物的种子来防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体在很长一段时间内是已知的，并且是持续改善的主题。但是，种子处理仍涉及到一系列不能总是以令人满意的方式解决的问题。因此，希望研发保护种子和发芽植物的方法，所述方法免去或至少显著减少在储存过程中、播种后或植物出苗后额外递送作物保护组合物的需要。此外，希望优化以此方式施用的活性成分的量，从而为种子和发芽植物提供尽可能好的保护，使其免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵袭，而所使用的活性成分不会对植物本身造成损害。具体地，处理种子的方法还应考虑抗虫或耐虫的转基因植物固有的杀昆虫和/或杀线虫特性，以使用最少的作物保护组合物实现对种子和发芽植物的最优保护。
因此，本发明还具体涉及保护种子和发芽植物免受害虫侵袭的方法，所述方法通过使用协同有效量的以上定义的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂处理种子。用于保护种子和发芽植物免受害虫侵袭的本发明的方法包括在一次操作中用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂同时处理种子的方法。本发明方法还包括用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂在不同时间处理种子的方法。
本发明还涉及本发明组合物用于处理种子从而保护种子和形成的植物免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵袭的用途。
本发明还涉及用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂同时处理的种子。本发明还涉及用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同的时间处理的种子。在用产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞和所述至少一种本文公开的特定杀虫剂，以及任选地至少一种杀真菌剂在不同的时间处理的种子的情况中，本发明组合物中的各活性成分可存在于种子上的不同层中。
此外，本发明涉及种子，其在用本发明的组合物处理后进行薄膜包衣处理，从而防止所述种子的灰尘磨损。
本发明的优势之一是，由于本发明组合物的特殊内吸特性，用这些组合物处理种子不仅为种子自身还为在萌发后从种子生长出的植物提供了对昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的保护。以此方式，可不必在播种时或其后短时间内直接处理作物。
另一个优势可在以下事实中看到：用本发明的组合物处理种子，可促进被处理过的种子的发芽和出苗。
本发明的组合物还可用在尤其是转基因种子上，这也被认为是有利的。
还陈述了本发明的组合物可与信号技术的试剂组合使用，其结果是，例如，和共生生物的集群得到改善，例如增强根瘤菌、菌根和/或植物内生细菌，和/或优化固氮作用。
本发明的组合物适合于保护用于农业、温室、林业或园艺的任何植物品种的种子。更具体地，所讨论的种子是谷物(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和小米)、玉米、棉花、大豆、稻、马铃薯、向日葵、咖啡豆、烟草、加拿大油菜(canola)、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和饲用甜菜)、花生、蔬菜(例如，西红柿、黄瓜、菜豆、芸苔(brassicas)、洋葱和莴苣)、水果植物、草坪和观赏植物的种子。特别重要的是谷物(例如小麦、大麦、黑麦和燕麦)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的种子的处理。
如上所述，用本发明的组合物处理转基因种子是尤其重要的。所讨论的种子是通常含有至少一个异源基因的植物的种子，所述异源基因控制多肽——尤其是具有杀昆虫和/或杀线虫特性的多肽——的表达。转基因种子中的异源基因可来自微生物例如芽孢杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、棒形杆菌属(Clavibacter)、球囊霉属(Glomus)或者粘帚霉属(Gliocladium)。本发明特别适用于处理含有至少一个来自芽孢杆菌属的异源基因的转基因种子。特别优选地，所讨论的异源基因来自苏云金芽孢杆菌。
用于本发明的目的，本发明的组合物单独或以适合的制剂施用于种子。所述种子优选在这样的条件下处理，在该条件下种子的稳定性在处理过程中不发生损害。通常，种子可在收获和播种之间的任何时间点处理。通常所用的种子是从植物中分离且已经除去肉穗花序、壳、茎、荚、毛或果肉。因此，例如，可使用已收获、净化且干燥至水含量低于15重量％的种子。或者，例如，也可使用干燥后用水处理然后再干燥的种子。
通常，当处理种子时，必须确保选择施加于种子上的本发明的组合物和/或其他添加剂的量使得种子的萌芽不被不利地影响，和/或从所述种子萌发的植物不被损害。对在一定施用率时可表现出植物毒性作用的活性成分来说，情况尤其如此。
本发明的组合物可直接施用，即，不包括其他组分且不被稀释。通常，优选以合适的制剂形式将所述组合物施用于种子。用于种子处理的合适的制剂和方法对于本领域技术人员是已知的并在例如以下文献中记载：美国专利第4272417 A、4245432 A、4808430 A、5876739 A号，美国专利公开第2003/0176428 A1号，WO 2002/080675 A1，WO 2002/028186A2。
可根据本发明使用的组合物可被转化为常规的拌种制剂，如溶液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、泡沫剂、浆剂或其他种子包衣组合物，以及ULV制剂。
这些制剂以已知的方式通过将组合物与常规佐剂混合制备，所述佐剂为，例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、胶粘剂、赤霉素以及水。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的着色剂包括常规用于此目的的所有着色剂。本文中，不仅可使用颜料(其在水中溶解度低)，也可使用水溶性染料。实例包括已知的被命名为罗丹明B(Rhodamine B)、C.I.颜料红112和C.I.溶剂红1的染料。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的润湿剂包括促进润湿且常规用于农用化学活性成分制剂中的所有物质。可优选使用烷基萘磺酸酯，如二异丙基萘磺酸酯或二异丁基萘磺酸酯。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的分散剂和/或乳化剂包括常规用于农业化学活性成分制剂中的所有非离子、阴离子和阳离子的分散剂。可优选使用非离子或阴离子分散剂，或非离子或阴离子分散剂的混合物。合适的非离子分散剂具体为环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、烷基酚聚乙二醇醚和三苯乙烯基酚聚乙二醇醚及其磷酸化或硫酸化衍生物。合适的阴离子分散剂具体为木素磺酸盐、聚丙烯酸盐，和芳基磺酸酯-甲醛缩合物。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂包括常规用于农用化学活性成分制剂中的所有泡沫抑制剂。可优选使用有机硅消泡剂和硬脂酸镁。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的防腐剂包括可在农用化学组合物中用于此目的的所有物质。实例包括二氯苯和苄醇半缩甲醛。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的二次增稠剂包括可在农用化学组合物中用于此目的的所有物质。预期优选的二次增稠剂包括纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、黄原胶、改性粘土以及高度分散的二氧化硅。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的胶粘剂包括可用于拌种产品中的所有常规粘合剂。可优选提及的是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和甲基纤维素。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的赤霉素优选包括赤霉素A1、A3(＝赤霉酸)、A4和A7；特别优选使用赤霉酸。赤霉素是已知的(参见R.Wegler，“Chemie derPflanzenschutz-und ”，Volume 2，Springer Verlag，1970，pp.401-412)。
可根据本发明使用的拌种制剂可以直接使用或在用水稀释后使用，以处理多种种子中的任一种。因此，所述浓缩液或通过用水稀释由其获得的制剂可用于对以下植物的种子进行拌种：谷物如小麦、大麦、黑麦、燕麦和黑小麦的种子，以及玉米、稻、油菜、豌豆、菜豆、棉花、向日葵和甜菜以及多种不同的蔬菜种子。可根据本发明使用的拌种制剂或其稀释的制剂也可用于转基因植物的拌种。在此情况下，额外的协同作用可在通过表达形成的物质相互作用中发生。
对于用可根据本发明使用的拌种制剂或通过加入水从其产生的制剂处理种子，合适的混合装置包括所有通常可用于拌种的设备。更具体地，进行拌种的过程是将所述种子置于混合机内、加入具体需要量的拌种制剂——以其本身或预先以水稀释后——并进行混合直到所述制剂均匀地分布在种子上。之后可进行干燥操作。
可根据本发明使用的拌种制剂的施用率可在相对宽的范围内变化。施用率由制剂中的基于产生外生孢子的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治剂和至少一种本文公开的特定杀虫剂的具体量和种子来决定。在所述组合物的情况下，施用率通常在0.001-50g/kg种子的范围内，优选在0.01-15g/kg种子的范围。
本发明的组合物，如果他们表现出杀昆虫和杀螨虫和/或杀线虫活性，兼具良好的植物耐受性和对温血动物有利的毒性以及良好的环境相容性，适用于保护植物和植物器官，提高采收产量、改善采收材料的质量和防治动物害虫，特别是在农业、园艺、畜牧业、林业、花园和休闲设施、存储产品和材料的保护以及在卫生区域遭遇的昆虫、螨虫、蛛形纲动物、蠕虫、线虫和软体动物。它们可被优选用作植物保护剂。具体地，本发明涉及本发明的组合物作为杀虫剂和/或杀真菌剂的用途。
它们对通常敏感和抗性的物种以及对所有或某些发育阶段具有活性。上述害虫包括：
节肢动物门(Anthropoda)的害虫，特别是蛛形纲(Arachnida)，例如粉螨属种(Acarus spp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮瘿螨属种(Aculops spp.)、针刺瘿螨属种(Aculus spp.)、花蜱属种(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychusviennensis)、锐缘蜱属种(Argas spp.)、牛蜱属种(Boophilus spp.)、短须螨属种(Brevipalpus spp.)、Bryobia graminum、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属种(Centruroides spp.)、皮螨属种(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssus gallinae)、特嗜皮螨(Dermatophagoides pteronyssius)、法嗜皮螨(Dermatophagoides farinae)、革蜱属种(Dermacentor spp.)、始叶螨属种(Eotetranychus spp.)、梨上瘿螨(Epitrimeruspyri)、真叶螨属种(Eutetranychus spp.)、瘿螨属种(Eriophyes spp.)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、红腿地螨(Halotydeus destructor)、半跗线螨属种(Hemitarsonemus spp.)、璃眼蜱属种(Hyalomma spp.)、硬蜱属种(Ixodes spp.)、毒蛛属种(Latrodectus spp.)、斜蛛属种(Loxosceles spp.)、全爪螨属种(Metatetranychusspp.)、Neutrombicula autumnalis、Nuphersa spp.、小爪螨属种(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属种(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属种(Panonychus spp.)、桔芸锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、痒螨属种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属种(Rhipicephalusspp.)、根螨属种(Rhizoglyphus spp.)、疥螨属种(Sarcoptes spp.)、中东金蝎(Scorpiomaurus)、狭趺线螨属种(Steneotarsonemus spp.)、稻细螨(Steneotarsonemus spinki)、跗线螨属种(Tarsonemus spp.)、叶螨属种(Tetranychus spp.)、阿氏真恙螨(Trombiculaalfreddugesi)、Vaejovis spp.、番茄斜背瘤瘿螨(Vasates lycopersici)；
特别是苜蓿红蜘蛛(clover mite)、果苔螨(brown mite)、榛子叶螨(hazelnutspider mite)、芦笋叶螨(asparagus spider mite)、麦岩螨(brown wheat mite)、豆类螨(1egume mite)、酢浆草满(oxalis mite)、黄杨木螨(boxwood mite)、德克萨斯州柑橘螨(Texas citrus mite)、东方红蜘蛛(Oriental red mite)、柑橘红蜘蛛(citrus redmite)、欧洲红蜘蛛(European red mite)、鹅耳枥东方叶螨(yellow spider mite)、无花果叶螨(fig spider mite)、路易氏始叶螨(Lewis spider mite)、六点叶螨(six-spottedspider mite)、魏氏叶螨(Willamette mite)、尤马叶螨(Yuma spider mite)、结网螨(web-spinning mite)、菠萝长叶螨(pineapple mite)、柑橘绿螨(citrus green mite)、皂荚叶螨(honey-locust spider mite)、茶叶螨(tea red spider mite)、冬青小爪螨(southernred mite)、鳄梨褐小爪螨(avocado brown mite)、栗红蜘蛛(spruce spider mite)、鳄梨红小爪螨(avocado red mite)、草地小爪螨(Banks grass mite)、赤叶螨(carmine spidermite)、芜菁红叶螨(desert spider mite)、蔬菜叶螨(vegetable spider mite)、突红叶螨(tumid spider mite)、图格斯坦红叶螨(strawberry spider mite)、二点叶螨(two-spotted spider mite)、麦氏叶螨(McDaniel mite)、太平洋红叶螨(Pacific spidermite)、山楂叶螨(hawthorn spider mite)、四点叶螨(four-spotted spider mite)、肖氏叶螨(Schoenei spider mite)、智利伪叶螨(Chilean false spider mite)、桔短须螨(citrus flat mite)、卵形短须螨(privet mite)、紫红短须螨(flat scarlet mite)、白尾螨(white-tailed mite)、凤梨跗线螨(pineapple tarsonemid mite)、西印度甘蔗螨(WestIndian sugar cane mite)、纳氏狭跗线螨(bulb scale mite)、仙客来螨(cyclamenmite)、细螨(broad mite)、麦圆叶爪螨(winter grain mite)、红腿地螨(red-leggedearth mite)、榛大芽螨(filbert big-bud mite)、葡萄瘿螨(grape erineum mite)、梨肿叶螨(pear blister leaf mite)、苹果叶卷边螨(apple leaf edgeroller mite)、桃花叶载体螨(peach mosaic vector mite)、桤木珠瘿螨(alder bead gall mite)、胡桃叶瘿螨(Perian walnut leaf gall mite)、山核桃叶卷边螨(pecan leaf edgeroll mite)、无花果芽螨(fig bud mite)、橄榄芽螨(olive bud mite)、柑橘芽螨(citrus bud mite)、荔枝毯螨(1itchi erineum mite)、小麦卷叶螨(wheat curl mite)、椰子花及果螨(coconutflower and nut mite)、甘蔗肿螨(sugar cane blister mite)、野牛草螨(buffalo grassmite)、铁绒草螨(bermuda grass mite)、胡萝卜芽螨(carrot bud mite)、番薯叶瘿螨(sweet potato leaf gall mite)、石榴卷叶螨(pomegranate leaf curl mite)、灰亮瘿螨(ash sprangle gall mite)、槭斜背瘤瘿螨(maple bladder gall mite)、桤木毯螨(aldererineum mite)、红浆果螨(redberry mite)、棉花肿螨(cotton blister mite)、蓝莓芽螨(blueberry bud mite)、茶橙绣螨(pink tea rust mite)、茶叶瘿螨(ribbed tea mite)、柑橘灰螨(grey citrus mite)、番薯瘿螨(sweet potato rust mite)、甜栗绣螨(horsechestnut rust mite)、柑橘绣螨(citrus rust mite)、苹果绣螨(apple rust mite)、葡萄绣螨(grape rust mite)、梨绣螨(pear rust mite)、平针鞘松螨(flat needle sheathpine mite)、野生玫瑰花蕾及果实螨(wild rose bud and fruit mite)、细叶刺瘿螨(dryberry mite)、芒果绣螨(mango rust mite)、杜鹃绣螨(azalea rust mite)、李绣螨(plum rust mite)、桃银色刺瘿螨(peach silver mite)、苹果绣螨(apple rust mite)、番茄刺皮瘿螨(tomato russet mite)、粉红柑橘绣螨(pink citrus rust mite)、谷物绣螨(cereal rust mite)、稻谷绣螨(rice rust mite)；
唇足纲(Chilopoda)，例如地蜈蚣属种(Geophilus spp.)、蚰蜒属种(Scutigeraspp.)；
弹尾(Collembola)目或弹尾纲，例如武装棘跳虫(Onychiurus armatus)；
倍足纲(Diplopoda)，例如千足虫(Blaniulus guttulatus)；
昆虫纲(Insecta)，例如，蜚蠊目(Blattodea)，如亚洲蟑螂(Blattellaasahinai)、德国蟑螂(Blattella germanica)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、角腹蠊属种(Panchlora spp.)、木蠊属种(Parcoblatta spp.)、大蠊属种(Periplaneta spp.)、褐带皮蠊(Supella longipalpa)；
鞘翅目(Coleoptera)，例如条纹南瓜甲(Acalymma vittatum)、菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属种(Adoretus spp.)、杨树萤叶甲(Agelasticaalni)、叩甲属种(Agriotes spp.)、步甲虫(Alphitobius diaperinus)、马铃薯鳃角金龟(Amphimallon solstitialis)、家具窃蠹(Anobium punctatum)、星天牛属种(Anoplophoraspp.)、花象属种(Anthonomus spp.)、圆皮蠹属种(Anthrenus spp.)、小象甲属种(Apionspp.)、阿鳃金龟属种(Apogonia spp.)、隐食甲属种(Atomaria spp.)、毛皮蠹属种(Attagenus spp.)、恶条豆象(Bruchidius obtectus)、豆象属种(Bruchus spp.)、龟叶甲属种(Cassida spp.)、菜豆莹叶甲(Cerotoma trifurcata)、龟象属种(Ceuthorhynchusspp.)、跳甲属种(Chaetocnema spp.)、Cleonus mendicus、宽胸叩头虫属种(Conoderusspp.)、根颈象属种(Cosmopolites spp.)、褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica)、叩甲属种(Ctenicera spp.)、象虫属种(Curculio spp.)、锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属种(Cylindrocopturus spp.)、皮蠹属种(Dermestes spp.)、叶甲属种(Diabrotica spp.)、蛀螟属种(Dichocrocis spp.)、水稻铁甲(Dicladispa armigera)、Diloboderus spp.、食植瓢虫属种(Epilachna spp.)、毛跳甲属种(Epitrix spp.)、Faustinus spp.、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、阔角谷盗(Gnathocerus cornutus)、菜心螟(Hellula undalis)、黑异爪蔗金龟(Heteronychus arator)、寡节鳃金龟属种(Heteronyx spp.)、Hylamorphaelegans、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、蓝绿象(Hypomeces squamosus)、咪小蠹属种(Hypothenemus spp.)、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosterna consanguinea)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、长头谷盗(Latheticusoryzae)、薪甲属种(Lathridius spp.)、负泥虫属种(Lema spp.)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、潜叶蛾属种(Leucoptera spp.)、稻根象(Lissorhoptrusoryzophilus)、筒喙象属种(Lixus spp.)、萤叶甲属种(Luperodes spp.)、粉蠹属种(Lyctus spp.)、美洲叶甲属种(Megascelis spp.)、梳爪叩头虫属种(Melanotus spp.)、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、鳃角金龟属种(Melolontha spp.)、Migdolus spp.、墨天牛属种(Monochamus spp.)、象甲(Naupactus xanthographus)、隐跗郭公虫属种(Necrobia spp.)、黄蛛甲(Niptus hololeucus)、椰蛀犀金龟(Oryctes rhinoceros)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、耳喙象属种(Otiorrhynchusspp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶虫(Phaedon cochleariae)、食叶鳃金龟属种(Phyllophaga spp.)、Phyllophaga helleri、黄条跳甲属种(Phyllotreta spp.)、日本弧丽金龟(Popillia japonica)、象甲属种(Premnotrypes spp.)、大谷蠹(Prostephanus truncatus)、油菜金头跳甲属种(Psylliodes spp.)、蛛甲属种(Ptinusspp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、谷象属种(Sitophilus spp.)、米象(Sitophilus oryzae)、尖隐喙象属种(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属种(Sternechus spp.)、Symphyletes spp.、纤毛象属种(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、大谷盗(Tenebrioidesmauretanicus)、拟谷盗属种(Tribolium spp.)、斑皮蠹属种(Trogoderma spp.)、籽象属种(Tychius spp.)、脊虎天牛属种(Xylotrechus spp.)、距步甲属种(Zabrus spp.)；
优选黄瓜条叶甲(Banded cucumber beetle)(带斑黄瓜叶甲(Diabroticabalteata))、北方玉米根虫(Northern corn rootworm)(玉米根虫(Diabroticabarberi))、南方玉米根虫(Southern corn rootworm)(十一星黄瓜甲虫食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi))、西方黄瓜甲虫(Western cucumber beetle)(柔嫩十一星黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata tenella))、西方斑点黄瓜叶虫(Western spotted cucumber beetle)十一星黄瓜叶虫(Diabrotica undecimpunctataundecimpunctata)、西方玉米根虫(Western corn rootworm)(Diabrotica virgiferavirgifera)、墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm)(Diabrotica virgifera zeae)。
双翅目(Diptera)，例如伊蚊属种(Aedes spp.)、潜蝇属种(Agromyza spp.)、按实蝇属种(Anastrepha spp.)、按蚊属种(Anopheles spp.)、瘿蚊属种(Asphondylia spp.)、果实蝇属种(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibio hortulanus)、天青丽蝇(Calliphoraerythrocephala)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、地中海蜡实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属种(Chironomus spp.)、金蝇属种(Chrysomyia spp.)、斑虻属种(Chrysops spp.)、高额麻虻(Chrysozona pluvialis)、锥蝇属种(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属种(Contarinia spp.)、人皮蝇(Cordylobia anthropophaga)、稻环摇蚊(Cricotopussylvestris)、库蚊属种(Culex spp.)、库蠓属种(Culicoides spp.)、脉毛蚊属种(Culiseta spp.)、黄蝇属种(Cuterebra spp.)、橄榄大实蝇(Dacus oleae)、叶瘿蚊属种(Dasyneura spp.)、地种蝇属种(Delia spp.)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、果蝇属种(Drosophila spp.)、稻象属种(Echinocnemus spp.)、厕蝇属种(Fannia spp.)、胃蝇属种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属种(Glossina spp.)、麻虻属种(Haematopota spp.)、毛眼水蝇属种(Hydrellia spp.)、大麦毛眼水蝇(Hydrellia griseola)、黑蝇属种(Hylemyaspp.)、虱蝇属种(Hippobosca spp.)、皮蝇属种(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属种(Liriomyzaspp.)、绿蝇属种(Lucilia spp.)、Lutzomia spp.、曼蚊属种(Mansonia spp.)、家蝇属种(Musca spp.)、狂蝇属种(Oestrus spp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、Paratanytarsusspp.、Paralauterborniella subcincta、泉蝇属种(Pegomyia spp.)、白蛉属种(Phlebotomus spp.)、草种蝇属种(Phorbia spp.)、伏蝇属种(Phormia spp.)、酪蝇(Piophila casei)、Prodiplosis spp.、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属种(Rhagoletis spp.)、麻蝇属种(Sarcophaga spp.)、蚋属种(Simulium spp.)、螫蝇属种(Stomoxys spp.)、虻属种(Tabanus spp.)、根斑蝇属种(Tetanops spp.)、大蚊属种(Tipula spp.)。
异翅目(Heteroptera)，例如南瓜缘蝽(Anasa tristis)、拟丽蝽属种(Antestiopsis spp.)、Boisea spp.、土长蝽属种(Blissus spp.)、俊盲蝽属种(Calocorisspp.)、斑腿微剌盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属种(Cavelerius spp.)、臭虫属种(Cimex spp.)、白瓣麦寄蝇属种(Collaria spp.)、绿盲蝽(Creontiades dilutus)、胡椒缘蝽(Dasynus piperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属种(Dysdercus spp.)、美洲蝽属种(Euschistus spp.)、扁盾蝽属种(Eurygasterspp.)、刺盲蝽属种(Heliopeltis spp.)、Horcias nobilellus、稻缘蝽属种(Leptocorisaspp.)、异稻缘蝽(Leptocorisa varicornis)、叶喙缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属种(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属种(Nezara spp.)、稻蝽属种(Oebalus spp.)、蝽科(Pentomidae)、方背皮蝽(Piesma quadrata)、壁蝽属种(Piezodorus spp.)、杂盲蝽属种(Psallus spp.)、Pseudacysta persea、红猎蝽属种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属种(Scotinophora spp.)、梨冠网蝽(Stephanitis nashi)、Tibraca spp.、锥猎蝽属种(Triatoma spp.)；
同翅目(Homoptera)，例如Acizzia acaciaebaileyanae、Acizzia dodonaeae、Acizzia uncatoides、长头蝗(Acrida turrita)、无网长管蚜属种(Acyrthosipon spp.)、Acrogonia spp.、Aeneolamia spp.、隆脉木虱属种(Agonoscena spp.)、甘蓝粉虱(Aleuyrodes proletella)、甘蔗穴粉虱(Aleurolobus barodensis)、丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus)、Allocaridara malayensis、杧果叶蝉属种(Amrasca spp.)、飞廉短尾蚜(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属种(Aonidiella spp.)、苏联黄粉蚜(Aphanostigma piri)、蚜属种(Aphis spp.)、葡萄叶蝉(Arboridia apicalis)、Arytainilla spp.、小圆盾蚧属种(Aspidiella spp.)、圆盾蚧属种(Aspidiotus spp.)、Atanus spp.、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、烟草粉虱(Bemisia tabaci)、Blastopsylla occidentalis、Boreioglycaspis melaleucae、李短尾蚜(Brachycaudushelichrysi)、微管蚜属种(Brachycolus spp.)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、Cacopsylla spp.、小褐稻虱(Calligypona marginata)、黄头大叶蝉(Carneocephalafulgida)、甘蔗粉角蚜(Ceratovacuna lanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属种(Ceroplastes spp.)、草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)、蔗黄雪盾蚧(Chionaspistegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、棉蝗(Chondracris rosea)、核桃黑斑蚜(Chromaphis juglandicola)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus ficus)、玉米叶蝉(Cicadulinambila)、Coccomytilus halli、软蚧属种(Coccus spp.)、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzusribis)、Cryptoneossa spp.、梳木虱属种(Ctenarytaina spp.)、Dalbulus spp.、柑橘粉虱(Dialeurodes citri)、柑桔木虱(Diaphorina citri)、白背盾蚧属种(Diaspis spp.)、履绵蚧属种(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属种(Dysaphis spp.)、灰粉蚧属种(Dysmicoccusspp.)、小绿叶蝉属种(Empoasca spp.)、绵蚜属种(Eriosoma spp.)、Erythroneura spp.、Eucalyptolyma spp.、褐木虱属种(Euphyllura spp.)、Euscelis bilobatus、拂粉蚧属种(Ferrisia spp.)、咖啡地粉蚧(Geococcus coffeae)、Glycaspis spp.、Heteropsyllacubana、Heteropsylla spinulosa、假桃病毒叶蝉(Homalodisca coagulata)、梅大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属种(Icerya spp.)、片角叶蝉属种(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属种(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、错阶属种(Lecanium spp.)、蛎盾蚧属种(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属种(Macrosiphum spp.)、二点叶蜂(Macrosteles facifrons)、突眼长铸属种(Mahanarvaspp.)、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcalfiella spp.、麦无网蚜(Metopolophiumdirhodum)、黑缘平翅斑蚜(Monellia costalis)、Monelliopsis pecanis、瘤蚜属种(Myzusspp.)、莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)、黑尾叶蝉属种(Nephotettix spp.)、Nettigoniclla spectra、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Oncometopia spp.、Ortheziapraelonga、中华稻蝗(Oxya chinensis)、Pachypsylla spp.、杨梅缘粉虱(Parabemisiamyricae)、Paratrioza spp.、片盾蚧属种(Parlatoria spp.)、瘿绵蚜属种(Pemphigusspp.)、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、绵粉蚧属种(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzus passerinii)、忽布疣蚜(Phorodon humuli)、葡萄根瘤蚜属种(Phylloxeraspp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspis aspidistrae)、臀纹粉蚧属种(Planococcus spp.)、Prosopidopsylla flava、梨形原绵蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属种(Pseudococcus spp.)、Psyllopsis spp.、木虱属种(Psylla spp.)、金小蜂属种(Pteromalus spp.)、Pyrilla spp.、笠圆盾蚧属种(Quadraspidiotus spp.)、Quesada gigas、平刺粉蚧属种(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属种(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属种(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideustitanus)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、苏铁刺圆盾蚧(Selenaspidusarticulatus)、长唇基飞虱属种(Sogata spp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes spp.、三角蝶(Stictocephala festina)、Siphoninus phillyreae、Tenalaphara malayensis、Tetragonocephela spp.、美国核桃黑蚜(Tinocalliscaryaefoliae)、广胸沫蝉属种(Tomaspis spp.)、声蚜属种(Toxoptera spp.)、温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、个木虱属种(Trioza spp.)、小叶蝉属种(Typhlocybaspp.)、尖盾蚧属种(Unaspis spp.)、葡萄根瘤虱(Viteus vitifolii)、么叶蝉属种(Zyginaspp.)；
膜翅目(Hymenoptera)，例如切叶蚁属种(Acromyrmex spp.)、菜叶蜂属种(Athalia spp.)、Atta spp.、松叶蜂属种(Diprion spp.)、实叶蜂属种(Hoplocampaspp.)、毛蚁属种(Lasius spp.)、小家蚁(Monomorium pharaonis)、Sirex spp.、红火蚁(Solenopsis invicta)、蚁属种(Tapinoma spp.)、树蜂属种(Urocerus spp.)、胡蜂属种(Vespa spp.)、Xeris spp.；
等足目(Isopoda)，例如鼠妇(Armadillidium vulgare)、栉水虱(Oniscusasellus)、球鼠妇(Porcellio scaber)；
等翅目(Isoptera)，例如家白蚁属种(Coptotermes spp.)、堆角白蚁(Cornitermes cumulans)、湿木白蚁属种(Cryptotermes spp.)、楹白蚁属种(Incisitermes spp.)、甘蔗白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属种(Odontotermesspp.)、散白蚁属种(Reticulitermes spp.)；
鳞翅目(Lepidoptera)，例如小蜡螟(Achroia grisella)、桑剑纹夜蛾(Acronictamajor)、卷叶蛾属种(Adoxophyes spp.)、烦夜蛾(Aedia leucomelas)、地老虎属种(Agrotis spp.)、波纹夜蛾属种(Alabama spp.)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、麦蛾属种(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属种(Anticarsia spp.)、条小卷蛾属种(Argyroplocespp.)、甘蓝夜蛾(Barathra brassicae)、籼弄蝶(Borbo cinnara)、棉潜蛾(Bucculatrixthurberiella)、松尺蠖(Bupalus piniarius)、蛀褐夜蛾属种(Busseola spp.)、卷叶蛾属种(Cacoecia spp.)、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capua reticulana)、苹果小卷蛾(Carpocapsa pomonella)、蛀果蛾(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobiabrumata)、禾草螟属种(Chilo spp.)、枞色卷蛾属种(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、纵卷叶野螟属种(Cnaphalocerus spp.)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、云卷蛾属种(Cnephasia spp.)、Conopomorpha spp.、球颈象属种(Conotrachelus spp.)、Copitarsia spp.、小卷蛾属种(Cydia spp.)、Dalacanoctuides、绢野螟属种(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、埃及金刚钻属种(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)、非洲蔗螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属种(Ephestia spp.)、叶小卷蛾属种(Epinotiaspp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属种(Etiella spp.)、金茅属种(Eulia spp.)、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾属种(Euproctis spp.)、切根虫属种(Euxoa spp.)、脏切夜蛾属种(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属种(Gracillaria spp.)、小食心虫属种(Grapholitha spp.)、蚀叶野螟属种(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属种(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属种(Heliothis spp.)、褐织蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属种(Homoeosoma spp.)、茶长卷蛾属种(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿蒂虫(Kakivoria fiavofasciata)、贪夜蛾属种(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresia molesta)、茄黄斑螟(Leucinodesorbonalis)、潜蛾属种(Leucoptera spp.)、苹细蛾(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophane antennata)、花翅小蛾属(Lobesia spp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotisalbicosta)、毒蛾属种(Lymantria spp.)、潜蛾属种(Lyonetia spp.)、黄褐天幕毛(Malacosoma neustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、Melanitis leda、稻毛胫夜蛾属种(Mocis spp.)、Monopis obviella、粘虫(Mythimma separata)、Nemapogon cloacellus、萍螟属种(Nymphula spp.)、Oiketicusspp.、麦秆夜蛾属种(Oria spp.)、瘤丛螟属种(Orthaga spp.)、秆野螟属种(Ostriniaspp.)、稻负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolis flammea)、稻弄蝶属种(Parnaraspp.)、红铃虫属种(Pectinophora spp.)、Perileucoptera spp.、麦娥属种(Phthorimaeaspp.)、桔潜蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属种(Phyllonorycter spp.)、菜粉蝶属种(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、金翅夜蛾属种(Plusia spp.)、菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属种(Prays spp.)、斜纹夜蛾属种(Prodenia spp.)、烟草天蛾属种(Protoparce spp.)、黏虫属种(Pseudaletia spp.)、Pseudaletia unipuncta、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)、薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu)、禾螟属种(Schoenobius spp.)、白禾螟属种(Scirpophaga spp.)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、黄地老虎(Scotia segetum)、蛀茎夜蛾属种(Sesamia spp.)、大螟(Sesamia inferens)、长须卷蛾属种(Sparganothis spp.)、灰翅夜蛾属种(Spodoptera spp.)、Spodopterapraefica、展足蛾属种(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属种(Synanthedon spp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、干煞夜蛾(Thermesia gemmatalis)、木塞谷蛾(Tinea cloacella)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、栎绿卷蛾属种(Tortrix spp.)、毛毡衣蛾(Trichophagatapetzella)、粉夜蛾属种(Trichoplusia spp.)、Tryporyza incertulas、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)、灰蝶属种(Virachola spp.)；
直翅目(Orthoptera或Saltatoria)，例如家蟋(Acheta domesticus)、Dichroplusspp.、蝼蛄属种(Gryllotalpa spp.)、蔗蝗属种(Hieroglyphus spp.)、飞蝗属种(Locustaspp.)、黑蝗属种(Melanoplus spp.)、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)；
虱目(Phthiraptera)，例如畜虱属种(Damalinia spp.)、血虱属种(Haematopinusspp.)、毛虱属种(Linognathus spp.)、虱属种(Pediculus spp.)、阴虱(Ptirus pubis)、嚼虱属种(Trichodectes spp.)；
啮虫目(Psocoptera)，例如粉啮虫属种(Lepinatus spp.)、书虱属种(Liposcelisspp.)；
蚤目(Siphonaptera)，例如角叶蚤属种(Ceratophyllus spp.)、栉首蚤属种(Ctenocephalides spp.)、致痒蚤(Pulex irritans)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；
缨翅目(Thysanoptera)，例如玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、葡萄链蓟马(Drepanothrips reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属种(Frankliniella spp.)、网蓟马属种(Heliothrips spp.)、温室条篱蓟马(Hercinothrips femoralis)、葡萄蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属种(Scirtothrips spp.)、Taeniothrips cardamom、蓟马属种(Thrips spp.)；
衣鱼目(Zygentoma)(＝缨尾目(Thysanura))，例如Ctenolepisma spp.、衣鱼(Lepisma saccharina)、盗火虫(Lepismodes inquilinus)、小灶衣鱼(Thermobiadomestica)；
综合目(Symphyla)，例如Scutigerella spp.；
来自软体动物(Mollusca)门的害虫，特别是来自双壳纲(Bivalvia)，例如，拙氏蛤属种(Dreissena spp.)，以及来自腹足纲(Gastropoda)的害虫，例如，阿勇蛞蝓属种(Arionspp.)、双脐螺属种(Biomphalaria spp.)、小泡螺属种(Bulinus spp.)、野蛞蝓属种(Deroceras spp.)、土蜗属种(Galba spp.)、椎实螺属种(Lymnaea spp.)、钉螺属种(Oncomelania spp.)、福寿螺属种(Pomacea spp.)、琥珀螺属种(Succinea spp.)；
来自扁虫动物门(Plathelminthes)和线虫动物门(Nematoda)的动物害虫，例如，十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)、斯里兰卡钩口线虫(Ancylostomaceylanicum)、巴西钩口线虫(Acylostoma braziliensis)、钩口线虫属种(Ancylostomaspp.)、蛔虫属种(Ascaris spp.)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、帝汶布鲁线虫(Brugiatimori)、仰口线虫属种(Bunostomum spp.)、夏柏特线虫属种(Chabertia spp.)、枝睾吸虫属种(Clonorchis spp.)、古柏线虫属种(Cooperia spp.)、双腔吸虫属种(Dicrocoeliumspp.)、丝状网尾线虫(Dictyocaulus filaria)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothriumlatum)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinensis)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、蠕形住肠蛲虫(Enterobiusvermicularis)、Faciola spp.、血毛线虫属种(Haemonchus spp.)、异刺线虫属种(Heterakis spp.)、矮小啮壳绦虫(Hymenolepis nana)、猪圆线虫属种(Hyostrongulusspp.)、罗阿罗阿线虫(Loa Loa)、细颈线虫属种(Nematodirus spp.)、结节线虫属种(Oesophagostomum spp.)、后睾吸虫属种(Opisthorchis spp.)、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、奥斯脱线虫属(Ostertagia spp.)、并殖吸虫属(Paragonimus spp.)、裂体吸虫属(Schistosomen spp.)、富氏类圆线虫(Strongyloides fuelleborni)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、粪圆线虫属种(Stronyloides spp.)、牛带绦虫(Taeniasaginata)、猪带绦虫(Taenia solium)、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、本地毛形线虫(Trichinella nativa)、株布氏旋毛虫(Trichinella britovi)、南方旋毛虫(Trichinella nelsoni)、Trichinella pseudopsiralis、毛圆线虫属种(Trichostrongulus spp.)、人鞭虫(Trichuris trichuria)、班氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)；
来自线虫门(Nematoda)的植物寄生害虫，例如滑刃线虫属种(Aphelenchoidesspp.)、伞滑刃线虫属种(Bursaphelenchus spp.)、茎线虫属种(Ditylenchus spp.)、球异皮线虫属种(Globodera spp.)、异皮线虫属种(Heterodera spp.)、长针线虫属种(Longidorus spp.)、根结线虫属种(Meloidogyne spp.)、短体线虫属种(Pratylenchusspp.)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、毛刺线虫属种(Trichodorus spp.)、半穿刺线虫属种(Tylenchulus spp.)、剑线虫属种(Xiphinema spp.)、螺旋线虫属种(Helicotylenchus spp.)、矮化线虫属种(Tylenchorhynchus spp.)、盾线虫属种(Scutellonema spp.)、拟毛刺线虫属种(Paratrichodorus spp.)、瓢线虫属种(Meloinemaspp.)、拟滑刃属种(Paraphelenchus spp.)、粗纹膜垫刃线虫种(Aglenchus spp.)、针刺线虫属种(Belonolaimus spp.)、根瘤线虫属种(Nacobbus spp.)、肾形线虫属种(Rotylenchulus spp.)、盘旋线虫属种(Rotylenchus spp.)、拟茎线虫属种(Neotylenchusspp.)、拟滑刃线虫属种(Paraphelenchus spp.)、锥线虫属种(Dolichodorus spp.)、纽带线虫属种(Hoplolaimus spp.)、斑皮线虫属种(Punctodera spp.)、环状线虫属种(Criconemella spp.)、五沟线虫属种(Quinisulcius spp.)、鞘线虫属种(Hemicycliophora spp.)、蠖线虫属种(Anguina spp.)、亚蠖线虫属种(Subanguinaspp.)、半轮线虫属种(Hemicriconemoides spp.)、平滑垫刃属种(Psilenchus spp.)、Pseudohalenchus spp.、轮线虫属种(Criconemoides spp.)、Cacopaurus spp.、浅根线虫属种(Hirschmaniella spp.)、头线虫属种(Tetylenchus spp.)。
所述组合物在防治植物病害和害虫所需的浓度下被植物良好地耐受，这一事实允许用所述组合物处理植物的地上部位、繁殖物和种子，以及土壤。
根据本发明，所有的植物和植物部位都可被处理。此处植物指所有的植物和植物种群，例如需要和不需要的野生植物、栽培种和植物变种(不论是否受植物品种权或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物变种可以是通过一种或多种生物技术法进行辅助或增补的常规繁殖和育种方法获得的植物，所述生物技术法例如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机诱变和定向诱变、分子标记物或遗传标记物，或通过生物工程和遗传工程的方法进行。植物部位指植物所有地上和地下部位和器官，例如芽、叶、花和根，借此列出例如叶、针叶、茎、干、花、子实体、果实和种子，以及根、球茎和根茎。作物以及无性繁殖和有性繁殖材料，例如插条、球茎、根茎、分檗和种子也属于植物部位。
本发明的组合物，当被植物良好地耐受且兼具对温血动物有利的毒性并被环境良好耐受时，适合用于保护植物和植物器官，用于提高采收产量、改善采收材料的质量。它可优选用作作物保护组合物。它对通常敏感和抗性的品种以及对全部或一些发育阶段具有活性。
可依照本发明处理的植物包括以下主要作物植物：玉米、大豆、紫花苜蓿(alfalfa)、棉花、向日葵、芸苔油籽(Brassica oil seeds)例如甘蓝型油菜(例如加拿大油菜、油菜籽)、芜菁(Brassica rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)(如(田野)芥菜)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、棕榈科种(例如油椰子、椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、黑小麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及来自各种植物分类群的各种水果和蔬菜，例如蔷薇科属种(Rosaceae sp.)(例如仁果，如苹果和梨；以及核果，如杏、樱桃、扁桃、李子和桃；浆果，如草莓、覆盆子、红醋栗(red currant)和黑醋栗(black currant)以及醋栗(gooseberry))、茶藨子科属种(Ribesioidae sp.)、胡桃科属种(Juglandaceae sp.)、桦木科属种(Betulaceae sp.)、漆树科属种(Anacardiaceae sp.)、壳斗科属种(Fagaceaesp.)、桑科属种(Moraceae sp.)、木犀科属种(Oleaceae sp.)(如橄榄树)、猕猴桃科属种(Actinidaceae sp.)、樟科属种(Lauraceae sp.)(例如鳄梨、桂皮、樟脑)、芭蕉科属种(Musaceae sp.)(例如香蕉树和绿化树(plantations))、茜草科属种(Rubiaceae sp.)(例如咖啡)、山茶科属种(Theaceae sp.)(例如茶树)、梧桐科属种(Sterculiceae sp.)、芸香科属种(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙、柑橘和葡萄柚)、茄科属种(Solanaceae sp.)(例如番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)、百合科属种(Liliaceae sp.)、菊科属种(Compositiae sp.)(例如莴苣、朝鲜蓟和菊苣——包括根菊苣、苣荬菜或普通菊苣)、伞形科属种(Umbelliferae sp.)(例如胡萝卜、欧芹、芹菜和块根芹)、葫芦科属种(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜——包括小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦类和甜瓜类)、葱科属种(Alliaceae sp.)(例如韭类和洋葱类)、十字花科属种(Cruciferae sp.)(例如白球甘蓝、红球甘蓝、椰菜、花椰菜、菜花、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝、萝卜、辣根、水芹和大白菜)、豆科属种(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆类、扁豆类和菜豆类——例如普通的菜豆类和广义的菜豆类)、藜科属种(Chenopodiaceae sp.)(例如叶甜菜、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科属种(Linaceae sp.)(例如麻(hemp))、美人蕉科种(Cannabeacea sp.)(例如大麻(cannabis))、锦葵科属种(Malvaceae sp.)(例如黄秋葵、可可)、罂粟科属种(Papaveraceae)(例如罂粟)、天门冬科(Asparagaceae)(例如芦笋)；园艺和森林中的有用植物和观赏植物，包括草皮、草坪、青草和甜叶菊(Stevia rebaudiana)；以及每个情况下，这些植物的遗传修饰种类。
根据植物物种或植物栽培品种，其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养)，通过使用或施用本发明的组合物，根据本发明的处理也可产生超加和(“协同”)效应。因此，例如，通过在根据本发明的处理中使用或施用本发明的组合物，可能出现以下超过实际预期的效果：降低施用率和/或拓宽其活性谱和/或提高其活性、改善植物生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性、提高开花品质、使采收更简易、加速成熟、提高采收收率、使果实更大、使植物更高、使叶色更绿、使开花更早、提高采收产品的品质和/或提高其营养价值、水果中糖浓度更高、采收产品的储存稳定性和/或加工性更好。
在本发明的处理中，本发明的组合物在某些施用率下也可对植物具有强化作用。植物抵抗不想要的植物病原性真菌和/或微生物和/或病毒侵害的防御体系被调动起来。植物强化(抗性诱导)物质在本文中应被理解为意指能够以这样一种方式刺激植物防御体系的那些物质或物质的组合：即当随后用不想要的植物病原性真菌和/或微生物和/或病毒接种时，经处理的植物对这些植物病原性真菌和/或微生物和/或病毒表现出很大程度的抗性。因此，通过在本发明的处理中使用或施用本发明的组合物，可以在处理后的一段时间内保护植物免受上述病原体的侵害。在用所述活性化合物处理植物后，实现保护作用的时间通常持续1-10天，优选1-7天。
同样优选根据本发明进行处理的植物和植物栽培品种对一种或多种生物胁迫因素具有抗性，即所述植物表现出对动物和微生物害虫的更好的防御性，如抵抗线虫、昆虫、螨虫、植物病原性真菌、细菌、病毒和/或类病毒。
还可根据本发明处理的植物和植物栽培品种是对一种或多种非生物胁迫具有抗性的植物，即已经在胁迫耐受方面表现出提高的植物健康的植物。非生物胁迫条件可包括，例如干旱、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、水涝、提高的土壤含盐量、增强的矿物暴露、臭氧暴露、强光暴露、有限的氮营养素利用度、有限的磷营养素利用度或避荫。优选地，用本发明的组合物对这些植物和栽培品种的处理额外增加了总体植物健康(参见上文)。
还可根据本发明进行处理的植物和植物栽培种是以增强的产率特性为特征的植物，即在此特征方面表现出提高的植物健康的植物。在所述植物中增加产率可以是以下因素的结果：例如，改良的植物生理机能、生长和发育，如用水效率、持水效率、改善的氮的利用、增强的碳同化作用、改善的光合作用、提高的发芽率和加速的成熟。
产率还可受到改进的植物构造的影响(在胁迫和非胁迫条件下)，包括但不限于：提早开花、对杂交种种子生产的开花控制、幼苗活力、植株大小、节间数和节间距、根系生长、种子大小、果实大小、荚果大小、荚果数或穗数、每个荚果或穗的种子数量、种子质量、提高的种子饱满度、减少的种子散布、减少的荚裂开以及倒伏抗性。其他的产率特征包括种子组成，如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量和组成、营养价值、抗营养化合物减少、改善的可加工性能和更好的贮存稳定性。优选用本发明的组合物对这些植物和栽培品种的处理额外增加了总体植物健康(参见上文)。
可根据本发明进行处理的植物为已经表达出杂交特性或杂种活力的杂交植物，所述杂交特性或杂种活力通常带来更高的产率、更高的活力、植物更加健康和对生物和非生物胁迫因素的更好的抗性。这种植物通常是将一种自交雄性不育亲系(母本)与另一种自交雄性能育亲系(父本)杂交产生。杂交种子通常收获自雄性不育植物并出售给种植者。雄性不育植物有时(例如在玉米中)可以通过去雄(即机械地移去雄性生殖器官(或雄花))产生，但是，更通常地，雄性不育性是由植物基因组中遗传决定因子产生的。在这种情况下，特别是当种子是待从杂交植物上收获的所需产品时，通常有用的是确保杂交植物的雄性能育性充分恢复。这可以通过确保父本具有合适的育性恢复基因而完成，该基因能够恢复含有负责雄性不育性的遗传决定因子的杂交植物的雄性能育性。负责雄性不育性的遗传决定因子可以位于细胞质中。例如，细胞质雄性不育性(CMS)的实例在芸苔属种中有过描述。然而，负责雄性不育性的遗传决定因子也可位于细胞核基因组中。雄性不育植物也可通过植物生物技术方法如基因工程获得。一种获取雄性不育植物的特别有用的方法描述于WO 89/10396中，其中，例如，一种核糖核酸酶例如芽孢杆菌RNA酶在雄蕊中的绒毡层细胞中选择性表达。随后可以通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制剂如芽孢杆菌RNA酶抑制因子来恢复能育性。
可根据本发明处理的植物或植物栽培品种(通过植物生物技术方法如遗传工程而获得)是除草剂耐受性植物，即对一种或多种给定的除草剂耐受的植物。这种植物可以通过遗传转化或通过选择含有赋予所述除草剂耐受性的突变的植物而获得。
实施例
实施例1：多种活性成分的结合物的功效公式
当活性成分结合物的活性超过活性成分单独施用时的总活性时，存在活性成分的协同效应。两种活性成分的给定结合物的预期活性可以如下计算(参见Colby，S.R.，“Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of HerbicideCombinations，”Weeds，1967，15，20-22)：
如果
X为活性成分A在施用率为m ppm(或g/ha)时的功效，
Y为活性成分B在施用率为n ppm(或g/ha)时的功效，
E为活性成分A和B分别在施用率m ppm和n ppm(或g/ha)时的功效，
则
如果实际活性超过了计算值，则结合物的活性是超加和的，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效必须大于由上述公式计算得到的预期功效(E)。
例如，所述公式和分析可用于评估植物生长促进。这种试验在施用至植物几天后进行评估。100％表示对应于未处理的对照植物的植物重量。在这种情况下功效是指与未处理的对照相比额外的植物重量％。例如，与未处理的对照植物相比实现植物重量是120％的处理的功效是20％。如果结合物的植物生长促进效应(即观察到的用结合物处理的植物的植物重量％的功效)超过计算值，则结合物的活性是超加和的，即存在协同效应。
所述公式和分析还可用于评估病害防治试验中的协同作用。记录以％表示的功效的程度。0％表示对应于对照的功效，而100％的功效表示没有观察到病害。
如果实际的杀昆虫或杀真菌活性超过了计算值，则结合物的活性是超加和的，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效必须大于由上述公式计算得到的预期功效(E)。
证明协同效应的另一方法是Tammes法(参见“Isoboles，A GraphicRepresentation of Synergism in Pesticides”in Neth.J.Plant Path.，1964，70，73-80)。
实施例2：使用氟吡呋喃酮和重组苏云金芽孢杆菌细胞的植物生长促进
进行分析氟吡呋喃酮和表达磷脂酶C的重组苏云金芽孢杆菌细胞(“BEPC”)的发酵产品的结合物的功效的实验。在25-28℃下，在50％的湿度下，在植物生长室中，在光架上的三英寸平方的小盆中，将玉米种子种在合成基质和砂的无菌混合物中持续生长约14天。每个盆里种两个种子。在种植时，用下述处理浸渍每个盆中的生长基质。14天后，测量植物的全株植物生物量。在下表中，UTC是指未处理的对照。“计算的”是指使用上述Colby等式计算的预期效应，“功效”是指观察到的实际效应。
产品，含有氟吡呋喃酮作为其活性成分(17.09％氟吡呋喃酮)，在50mL水中稀释，稀释的溶液用于浸渍生长基质。下文示出的施用率是指施加至生长基质的活性成分(即氟吡呋喃酮)的量。
在其外生孢子(BEPC)上表达磷脂酶的重组蜡状芽孢杆菌家族成员(苏云金芽孢杆菌BT013A)如下产生。为了产生表达蜡状芽孢杆菌家族成员中的融合蛋白的质粒，产生编码BclA启动子(SEQ ID NO：85)、甲硫氨酸起始密码子和BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1)的PCR片段，之后产生在框架中融合至苏云金芽孢杆菌BT013A磷脂酶(SEQ ID NO：108)的六个丙氨酸接头序列。这些PCR片段用XhoI消化，并连接至pSUPER质粒的SalI位点，以产生质粒pSUPER-BclA 20-35-磷脂酶。通过融合pUC57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒)和芽孢杆菌的pBC16-1质粒(含有四环素抗性)产生pSUPER质粒。所述5.5kbp质粒可以在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制。pSUPER-BclA 20-35-磷脂酶质粒在dam甲基化酶阴性大肠杆菌菌株中被转化和增殖，并最终转化成苏云金芽孢杆菌BT013A。
为了获得BEPC的完全发酵液培养物，用BEPC接种15mL含有脑心浸液培养基(BHI)的锥形瓶，并在约30℃下在300rpm振动筛下生长7-8小时。第二天，将250μL来自每个烧瓶中的等分物接种至含有50mL基于酵母提取物的培养基的250mL烧瓶中，在约30℃下生长。接种约2天后，当完成至少95％的孢子形成后，收集培养液并计算集落形成单位。在50mL水中将发酵液稀释至5％，将以下集落形成单位施用至每个盆。
表3
结果表明当将氟吡呋喃酮和BEPC组合时的超加和的植物产量效果。
实施例3：使用噻虫胺和重组苏云金芽孢杆菌细胞的植物生长促进
在20℃和70％的湿度下，在温室中，将玉米种子种植到壤质砂土中持续约11天。从处理时间起约11天后，将土壤以上的幼苗切除并测定鲜重。
以约50μg/粒施加如上制备的表达由SEQ ID NO：107编码的内切葡聚糖酶或由SEQID NO：108编码的磷脂酶C的重组苏云金芽孢杆菌细胞。还以约250μg/粒施加噻虫胺。
预期用重组苏云金芽孢杆菌与噻虫胺组合处理的玉米植物将具有超过基于用两种活性成分单独处理的玉米植物的％嫩枝重量的计算值的％嫩枝重量，即将观察到协同效应。
序列表
<110> 拜耳作物科学有限合伙公司
<120> 包含重组芽孢杆菌细胞和杀虫剂的组合物
<130> BCS149059 WO
<150> US 62/051,919
<151> 2014-09-17
<160> 109
<170> PatentIn版本3.5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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ggatccatgc taccaaaagc c 21
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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<213> 蜡状芽孢杆菌
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<400> 56
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145 150 155 160
Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Gln Gly Pro Ser
165 170 175
Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Leu Thr Gly Pro
180 185 190
Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly
245 250 255
Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala
260 265 270
Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr
275 280 285
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly
290 295 300
Pro Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala
305 310 315 320
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ile Ile Ser
340 345 350
Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn Ile
355 360 365
Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val Ala
370 375 380
Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Leu Thr Ala Gly
385 390 395 400
Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala Gly
405 410 415
Thr Ile Asn Ser Pro Ala Val Ala Ala Gly Ser Phe Ser Ala Thr Ile
420 425 430
Ile Ala Asn Leu Pro Ala Gly Ala Ala Val Ser Leu Gln Leu Phe Gly
435 440 445
Val Ile Ala Leu Ala Thr Leu Ser Thr Ala Thr Pro Gly Ala Thr Leu
450 455 460
Thr Ile Ile Arg Leu Ser
465 470
<210> 57
<211> 136
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 57
Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys
1 5 10 15
Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser
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Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe
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Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala
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65 70 75 80
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Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
130 135
<210> 58
<211> 384
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 58
Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys
1 5 10 15
Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser
20 25 30
Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe
35 40 45
Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala
50 55 60
His Asn Ser Ile Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Thr Ile Asn Glu Val Tyr
65 70 75 80
Val Phe Val Thr Val Leu Leu Gln Tyr Ser Thr Leu Ile Gly Gly Ser
85 90 95
Tyr Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly
145 150 155 160
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val
165 170 175
Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr
180 185 190
Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly
195 200 205
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys
210 215 220
Asp Cys Cys Val Leu Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly
225 230 235 240
Glu Thr Val Ile Leu Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro
245 250 255
Leu Phe Phe Leu Phe Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr
260 265 270
Val Thr Asp Gly Thr Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr
275 280 285
Gly Val Gly Phe Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Val Gly Cys Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln
305 310 315 320
Leu Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn
325 330 335
Gly Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile
340 345 350
Val Leu Gly Thr Leu Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala
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370 375 380
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 59
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Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
130 135 140
Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
145 150 155 160
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
165 170 175
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
180 185 190
Ser Gly Leu Gly
195
<210> 60
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
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Pro
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
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Pro
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<213> Bacillus weihenstephensis
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Pro
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<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
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Pro
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<213> 蜡状芽孢杆菌
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Pro
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<213> Bacillus weihenstephensis
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Pro
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<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 66
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Pro
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<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 67
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1 5 10 15
Pro
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<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 68
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Pro
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<213> 炭疽芽孢杆菌
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Pro
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<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 70
Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro
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Ser
<210> 71
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<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 71
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Thr Met Leu Gly Cys Thr Phe Ala Leu Gly Thr Ser Val Ala Tyr Ala
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Leu Thr Val Pro Gly Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Gly Lys Thr
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Ala Leu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Gly Leu Asp Leu Ser Gln Phe Asp
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290 295 300
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305 310 315 320
Glu Ala Gly Gly Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg
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Ser Lys Leu Ala Gln Asp Pro Val Ala Ile Glu Gly Thr Lys Ser Lys
340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Asp Leu Ser Gln Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Asp Tyr
580 585 590
Ile Thr Asp Pro Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Met Asp Asn Val
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Val Ala Thr Phe Asp Asp Ser Lys Val Tyr Ser Asn Thr Gln Ile Pro
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Gly Gln Ala Asp Asp Lys Ser Ala Gly Ala Ile Trp Ile Arg Arg
785 790 795
<210> 72
<211> 152
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 72
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1 5 10 15
Asp Val Val Lys Phe Ile Asn Glu Leu Gln Asp Cys Ser Thr Thr Thr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Val Asp Asp Asp Ser Cys Ala Val Leu
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Ser Thr Cys Ile Thr Val Asp Leu Ser Cys Phe Cys Ala Ile
130 135 140
Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150
<210> 73
<211> 167
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 73
Met Phe Ser Ser Asp Cys Glu Phe Thr Lys Ile Asp Cys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Pro Ala Ser Thr Leu Pro Ala Phe Gly Phe Ala Phe Asn Ala Ser Ala
20 25 30
Pro Gln Phe Ala Ser Leu Phe Thr Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser
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Gly Asp Gly Ile Arg Ile Leu Arg Ala Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr
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Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Val Ile Gly Thr Gly Glu Val Asp Val
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Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu Asn Pro Gly Asp Leu Ile Arg
130 135 140
Ile Val Pro Val Glu Leu Ile Gly Thr Val Asp Ile Arg Ala Ala Ala
145 150 155 160
Leu Thr Val Ala Gln Ile Ser
165
<210> 74
<211> 156
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 74
Met Ser Cys Asn Cys Asn Glu Asp His His His His Asp Cys Asp Phe
1 5 10 15
Asn Cys Val Ser Asn Val Val Arg Phe Ile His Glu Leu Gln Glu Cys
20 25 30
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35 40 45
His Asn Ser Ala Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Cys Arg Ser Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Ile Asp Asp Asp Asp
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100 105 110
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Ala Arg Leu Ile Ser Thr Asn Thr Cys Leu Thr Val Asp Leu Ser Cys
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Phe Cys Ala Ile Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150 155
<210> 75
<211> 182
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 75
Met Glu Val Gly Gly Thr Ser Val Lys Asn Lys Asn Lys Ser Ser Thr
1 5 10 15
Val Gly Lys Pro Leu Leu Tyr Ile Ala Gln Val Ser Leu Glu Leu Ala
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Arg Lys Glu Glu Ser Asn Arg Asn Glu Asn Val Val Ser Ser Ala Val
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Glu Gln Gln Glu Pro Val Arg Thr Val Pro Tyr Asn Lys Ser Phe Lys
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115 120 125
Tyr Ile Pro Lys Val Arg Cys Arg Ile Lys Thr Ala Thr Ile Ser Tyr
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Pro Asn Ser Met Arg Asp Ile Arg Leu Ser Ile Glu Glu Ile Lys Ser
165 170 175
Ile Asp Met Ala Gly Phe
180
<210> 76
<211> 174
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 76
Met Lys Glu Arg Ser Glu Asn Met Arg Ser Ser Ser Arg Lys Leu Thr
1 5 10 15
Asn Phe Asn Cys Arg Ala Gln Ala Pro Ser Thr Leu Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Phe Ala Phe Asn Ala Thr Ser Pro Gln Phe Ala Thr Leu Phe Thr Pro
35 40 45
Leu Leu Leu Pro Ser Thr Gly Pro Asn Pro Asn Ile Thr Val Pro Val
50 55 60
Ile Asn Asp Thr Ile Ser Thr Gly Thr Gly Ile Arg Ile Gln Val Ala
65 70 75 80
Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Leu Asp Asn Val
85 90 95
Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala Arg Phe Phe Leu Thr Leu Asn Ser Ser
100 105 110
Thr Asn Ile Ile Ala Gly Ser Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Ile Ile
115 120 125
Gly Thr Gly Glu Val Asp Val Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu
130 135 140
Asn Pro Gly Asp Leu Ile Gln Ile Val Pro Val Glu Val Ile Gly Thr
145 150 155 160
Val Asp Ile Arg Ser Ala Ala Leu Thr Val Ala Gln Ile Arg
165 170
<210> 77
<211> 796
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 77
Met Ser Lys Lys Pro Phe Lys Val Leu Ser Ser Ile Ala Leu Thr Ala
1 5 10 15
Val Leu Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Gln Ser Ala Tyr Ala Glu
20 25 30
Thr Pro Val Asn Lys Thr Ala Thr Ser Pro Val Asp Asp His Leu Ile
35 40 45
Pro Glu Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Lys Lys Arg Gly Val Ile Asp
50 55 60
Ser Lys Ala Ser Glu Thr Glu Thr Lys Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val
65 70 75 80
Glu Asn Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ala Ala Asn Gly Asp
85 90 95
Gln Leu Thr Lys Asp Ala Ser Asp Phe Leu Lys Lys Val Lys Asp Ala
100 105 110
Lys Ala Asp Thr Lys Glu Lys Leu Asn Gln Pro Ala Thr Gly Thr Pro
115 120 125
Ala Ala Thr Gly Pro Val Lys Gly Gly Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr
130 135 140
Ser Pro Ala Lys Gln Lys Asp Tyr Asn Gly Glu Val Arg Lys Asp Lys
145 150 155 160
Val Leu Val Leu Leu Val Glu Tyr Ala Asp Phe Lys His Asn Asn Ile
165 170 175
Asp Lys Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Asn Asp Phe Asn Lys Glu His
180 185 190
Tyr Glu Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe Thr Leu Asp Asp Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Lys Trp Leu Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Pro Gly Gly Gly His Asp Asn
245 250 255
Lys Gly Pro Lys Gly Pro Arg Asp Leu Val Lys Asp Ala Leu Lys Ala
260 265 270
Ala Val Asp Ser Gly Ile Asp Leu Ser Glu Phe Asp Gln Phe Asp Gln
275 280 285
Tyr Asp Val Asn Gly Asp Gly Asn Lys Asn Gln Pro Asp Gly Leu Ile
290 295 300
Asp His Leu Met Ile Ile His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly
305 310 315 320
Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Val Gly
325 330 335
Pro Lys Pro Phe Pro Ile Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Pro Tyr Trp
340 345 350
Gly Gly Lys Met Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly
355 360 365
Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro
370 375 380
Asp Glu Tyr Asp Thr Gln Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Ile Glu Ala
385 390 395 400
Trp Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr
405 410 415
Thr Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Thr
420 425 430
Ile Gly Gly Asn Trp Ala Asn Ile Val Glu Val Asp Tyr Glu Lys Leu
435 440 445
Asn Lys Gly Ile Gly Leu Ala Thr Tyr Leu Asp Gln Ser Val Thr Lys
450 455 460
Ser Ala Arg Pro Gly Met Ile Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Val
465 470 475 480
Lys Thr Ile Glu Pro Ala Phe Gly Lys Gln Tyr Tyr Tyr Ser Thr Lys
485 490 495
Gly Asp Asp Leu His Thr Lys Met Glu Thr Pro Leu Phe Asp Leu Thr
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Lys Leu Asp Gly Phe Val Val Ser Asn Gly Thr Glu Lys Lys Lys His
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<213> Bacillus weihenstephensis
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tgaagtatct agagctaatt tacgcaaagg aatctcagga caacactttc gcaacaccta 60
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atgcagaaaa ctaagtatgg tattattctt aaattgttta gcaccttcta atattacaga 120
tagaatccgt cattttcaac agtgaacatg gatttcttct gaacacaact ctttttcttt 180
ccttatttcc aaaaagaaaa gcagcccatt ttaaaatacg gctgcttgta atgtacatta 240
<210> 100
<211> 267
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 100
tatcacataa ctctttattt ttaatatttc gacataaagt gaaactttaa tcagtggggg 60
ctttgttcat ccccccactg attattaatt gaaccaaggg ataaaaagat agagggtctg 120
accagaaaac tggagggcat gattctataa caaaaagctt aatgtttata gaattatgtc 180
tttttatata gggagggtag taaacagaga tttggacaaa aatgcaccga tttatctgaa 240
ttttaagttt tataaagggg agaaatg 267
<210> 101
<211> 124
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 101
attttttact tagcagtaaa actgatatca gttttactgc tttttcattt ttaaattcaa 60
tcattaaatc ttccttttct acatagtcat aatgttgtat gacattccgt aggaggcact 120
tata 124
<210> 102
<211> 170
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 102
acataaattc acctccataa agcgttcatt atatagtaga tgcaaaaccg aaagaaaatg 60
acacggacat ttgaattatt gaaaagaaat cttaaactac ttgaacaatt taaaaaaatg 120
gaaagtttag tatatgtata acatatgatt gatttggaag agggtgatta 170
<210> 103
<211> 212
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 103
ttctattttc caacataaca tgctacgatt aaatggtttt ttgcaaatgc cttcttggga 60
agaaggatta gagcgttttt ttatagaaac caaaagtcat taacaatttt aagttaatga 120
cttttttgtt tgcctttaag aggttttatg ttactataat tatagtatca ggtactaata 180
acaagtataa gtatttctgg gaggatatat ca 212
<210> 104
<211> 1500
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 104
atgaaacggt caatctcgat ttttattacg tgtttattga ttacgttatt gacaatgggc 60
ggcatgatag cttcgccggc atcagcagca gggacaaaaa cgccagtagc caagaatggc 120
cagcttagca taaaaggtac acagctcgtt aaccgagacg gtaaagcggt acagctgaag 180
gggatcagtt cacacggatt gcaatggtat ggagaatatg tcaataaaga cagcttaaaa 240
tggctgagag atgattgggg tatcaccgtt ttccgtgcag cgatgtatac ggcagatggc 300
ggttatattg acaacccgtc cgtgaaaaat aaagtaaaag aagcggttga agcggcaaaa 360
gagcttggga tatatgtcat cattgactgg catatcttaa atgacggtaa tccaaaccaa 420
aataaagaga aggcaaaaga attcttcaag gaaatgtcaa gcctttacgg aaacacgcca 480
aacgtcattt atgaaattgc aaacgaacca aacggtgatg tgaactggaa gcgtgatatt 540
aaaccatatg cggaagaagt gatttcagtt atccgcaaaa atgatccaga caacatcatc 600
attgtcggaa ccggtacatg gagccaggat gtgaatgatg ctgccgatga ccagctaaaa 660
gatgcaaacg ttatgtacgc acttcatttt tatgccggca cacacggcca atttttacgg 720
gataaagcaa actatgcact cagcaaagga gcacctattt ttgtgacaga gtggggaaca 780
agcgacgcgt ctggcaatgg cggtgtattc cttgatcaat cgagggaatg gctgaaatat 840
ctcgacagca agaccattag ctgggtgaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 900
tcagctttaa agccgggggc atctaaaaca ggcggctggc ggttgtcaga tttatctgct 960
tcaggaacat tcgttagaga aaacattctc ggcaccaaag attcgacgaa ggacattcct 1020
gaaacgccat caaaagataa acccacacag gaaaatggta tttctgtaca gtacagagca 1080
ggggatggga gtatgaacag caaccaaatc cgtccgcagc ttcaaataaa aaataacggc 1140
aataccacgg ttgatttaaa agatgtcact gcccgttact ggtataaagc gaaaaacaaa 1200
ggccaaaact ttgactgtga ctacgcgcag attggatgcg gcaatgtgac acacaagttt 1260
gtgacgttgc ataaaccaaa gcaaggtgca gatacctatc tggaacttgg atttaaaaac 1320
ggaacgttgg caccgggagc aagcacaggg aatattcagc tccgtcttca caatgatgac 1380
tggagcaatt atgcacaaag cggcgattat tcctttttca aatcaaatac gtttaaaaca 1440
acgaaaaaaa tcacattata tgatcaagga aaactgattt ggggaacaga accaaattag 1500
<210> 105
<211> 852
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 105
atgaaaaaga aagtacttgc tttagcggca gctattacat tggttgctcc attacaaagt 60
gttgcatttg ctcatgaaaa tgatggggga cagagatttg gagttattcc gcgctggtct 120
gctgaagata aacataaaga aggcgtgaat tctcatttat ggattgtaaa tcgtgcaatt 180
gatattatgt ctcgtaatac aacacttgta aaacaagatc gagttgcact attaaatgaa 240
tggcgtactg agttagagaa cggtatttat gctgctgact atgaaaatcc ttattatgat 300
aatagcacat ttgcttcaca tttctatgac cctgacaatg ggaaaactta tattccgtat 360
gcaaagcagg caaaggaaac tggagctaaa tattttaaat tagctggtga gtcttacaaa 420
aataaagata tgcaacaagc attcttctat ttaggattat ctcttcatta tctaggggat 480
gtaaaccaac cgatgcatgc agcaaacttt acaaaccttt cgtatccaca agggttccat 540
tctaaatatg aaaactttgt agatacgata aaagataact ataaagtaac ggatggaaat 600
ggatattgga actggaaagg tacgaatcca gaagattgga ttcatggagc ggcagtagtt 660
gcgaaacaag attacgctgg cattgtaaat gataatacga aagattggtt cgtgagagct 720
gctgtatcac aagaatatgc agataaatgg cgcgctgaag ttacaccaat gacaggtaag 780
cgtttaatgg atgcacaacg tgttactgct ggatatattc agctttggtt tgatacgtac 840
ggagatcgtt aa 852
<210> 106
<211> 729
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 106
gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60
ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
tgcggacggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180
acaaaggcag ttccgaataa caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
cctgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgac gatctgatga atccggccaa tcatgacacc 600
cgtgacgaat ggagagaatc agttgcccgt gtggacgtgc ttcgctctat cgccaaggag 660
aacaactata atctaaacgg accgattcat gttcgttcaa acgagtacgg taattttgta 720
atcaaataa 729
<210> 107
<211> 499
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 107
Met Lys Arg Ser Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu
1 5 10 15
Leu Thr Met Gly Gly Met Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr
20 25 30
Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln
35 40 45
Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser
50 55 60
His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys
65 70 75 80
Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr
85 90 95
Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val
100 105 110
Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile
115 120 125
Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys
130 135 140
Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro
145 150 155 160
Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp
165 170 175
Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg
180 185 190
Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser
195 200 205
Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val
210 215 220
Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg
225 230 235 240
Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr
245 250 255
Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp
260 265 270
Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp
275 280 285
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys
290 295 300
Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr
325 330 335
Lys Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn
340 345 350
Gly Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn
355 360 365
Gln Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val
370 375 380
Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys
385 390 395 400
Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Val
405 410 415
Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr
420 425 430
Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser
435 440 445
Thr Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr
450 455 460
Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr
465 470 475 480
Thr Lys Lys Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr
485 490 495
Glu Pro Asn
<210> 108
<211> 283
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 108
Met Lys Lys Lys Val Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Thr Leu Val Ala
1 5 10 15
Pro Leu Gln Ser Val Ala Phe Ala His Glu Asn Asp Gly Gly Gln Arg
20 25 30
Phe Gly Val Ile Pro Arg Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly
35 40 45
Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser
50 55 60
Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Leu Leu Asn Glu
65 70 75 80
Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn
85 90 95
Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp
100 105 110
Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Tyr Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly
115 120 125
Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met
130 135 140
Gln Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp
145 150 155 160
Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro
165 170 175
Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp
180 185 190
Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr
195 200 205
Asn Pro Glu Asp Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp
210 215 220
Tyr Ala Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Arg Ala
225 230 235 240
Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro
245 250 255
Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr
260 265 270
Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg
275 280
<210> 109
<211> 244
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 109
Leu Glu Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val
20 25 30
Glu Arg Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys
50 55 60
Ala Val Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala
85 90 95
Ser Ala Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln
100 105 110
Asp Lys Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser
115 120 125
Asp Asn Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp
130 135 140
Thr Val Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Leu Ile Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly
165 170 175
Ile Asp Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp
180 185 190
Asp Leu Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu
195 200 205
Ser Val Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn
210 215 220
Tyr Asn Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Phe Val Ile Lys

Claims (27)

1.一种组合物，其包含协同有效量的：
a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含
(i)至少一种蛋白或肽，其选自植物生长刺激蛋白或肽和具有杀昆虫活性的蛋白或肽，和
(ii)靶向序列、外生孢子蛋白、或外生孢子蛋白片段；以及
b)至少一种杀虫剂，其选自啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫双酰胺、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、砜吸磷、伏杀硫磷、灭虫硅醚、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺、和1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺。
2.权利要求1的组合物，其中至少一种蛋白或肽为植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶和降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶。
3.权利要求1的组合物，其中产生外生孢子的芽孢杆菌细胞为蜡状芽孢杆菌家族成员的细胞。
4.权利要求3的组合物，其中蜡状芽孢杆菌家族成员选自炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、Bacillus samanii、Bacillusgaemokensis、Bacillus weihenstephensis、Bacillus toyoiensis及其组合。
5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中靶向序列或外生孢子蛋白包括：
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-33的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的靶向序列；或
包含与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列的外生孢子蛋白。
6.权利要求2至5中任一项的组合物，其中参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶选自乙偶姻还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶、腈水解酶、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5’核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺反异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡萄糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2，5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-I，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、以及参与产生结瘤因子的酶。
7.权利要求6的组合物，其中参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶为脱乙酰壳多糖酶。
8.权利要求7的组合物，其中融合蛋白包含SEQ ID NO：109。
9.权利要求2至5中任一项的组合物，其中降解或修饰细菌、真菌或植物营养来源的酶选自纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡萄糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体。
10.权利要求9的组合物，其中所述酶为选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的纤维素酶。
11.权利要求10的组合物，其中融合蛋白包括枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶。
12.权利要求11的组合物，其中融合蛋白包含SEQ ID NO：107。
13.权利要求12的组合物，其中重组芽孢杆菌细胞来自苏云金芽孢杆菌BT013A。
14.权利要求9的组合物，其中所述酶为磷脂酶。
15.权利要求14的组合物，其中融合蛋白包含SEQ ID NO：108。
16.权利要求1至15中任一项的组合物，其中融合蛋白在对融合蛋白的靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段为天然的孢子形成启动子的控制下表达。
17.权利要求1至16中任一项的组合物，其中融合蛋白在高表达孢子形成启动子的控制下表达。
18.权利要求17的组合物，其中高表达孢子形成启动子包括σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。
19.权利要求16至18中任一项的组合物，其中孢子形成启动子包含与SEQ ID NO：85-103中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
20.权利要求1至19中任一项的组合物，其中至少一种杀虫剂选自噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡呋喃酮和甲硫威。
21.权利要求20的组合物，其中所述杀虫剂为氟吡呋喃酮。
22.权利要求1至19中任一项的组合物，其中所述杀虫剂为噻虫胺。
23.用权利要求1至22中任一项的组合物处理的种子。
24.权利要求1至23中任一项的组合物用于增强植物生长和/或促进植物健康的用途。
25.权利要求24的用途，用于处理传统植物或转基因植物或它们的种子。
26.一种处理植物、植物部位或植物周围的位置以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：
同时或按顺序施用协同有效量的：
a)表达融合蛋白的产生外生孢子的重组芽孢杆菌细胞，所述融合蛋白包含
(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和
(ii)靶向序列、外生孢子蛋白或外生孢子蛋白片段；以及
b)至少一种杀虫剂，其选自：啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫双酰胺、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、砜吸磷、伏杀硫磷、灭虫硅醚、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺和1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺。
27.权利要求26的方法，其中靶向序列或外生孢子蛋白包含：
与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸22-33的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸20-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO：1的靶向序列；或
包含与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列的外生孢子蛋白。
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