KR100784261B1

KR100784261B1 - 탄저균의 포자외막 단백질을 이용한 목적단백질의 미생물표면발현방법

Info

Publication number: KR100784261B1
Application number: KR1020060000187A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정; 허남수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2006-01-02
Filing date: 2006-01-02
Publication date: 2007-12-11
Anticipated expiration: 2026-01-02
Also published as: DE112006003608T5; KR20070072831A; WO2007078127A1; US20090298706A1; CN101426919B; WO2007078127B1; US8883692B2; CN101426919A

Abstract

본 발명은 탄저균의 포자외막 단백질을 이용한 목적단백질의 미생물 표면발현방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 세포 표면발현 모체(cell surface anchoring motif)로서 탄저균(Bacillus anthracis) 포자외막(exosporium) 단백질(BclA)을 코딩하는 bclA 유전자 또는 bclA 유전자의 일부를 포함하고, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포 내에서 발현될 경우, 목적단백질이 BclA 또는 그 일부와 융합된 형태로 세포 표면에 발현될 수 있도록 구성된 발현벡터 및 이를 이용한 목적단백질의 미생물 표면발현방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 발현벡터는 탄저균 유래 포자 외막 단백질(BclA)을 세포 표면 발현 모체로 사용하여, 목적단백질이나 펩타이드를 세포 표면에 효율적으로 발현시킬 수 있고, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 안정적으로 다량 발현시킬 수 있어, 재조합 생백신, 전세포 흡착제, 전세포 생물전환 등의 다양한 목적에 유용하게 사용할 수 있다.

탄저균, 세포 표면발현, BclA, 목적단백질

Description

탄저균의 포자외막 단백질을 이용한 목적단백질의 미생물 표면발현방법 {Method for Cell Surface Displaying of Target Proteins Using Bacillus anthracis Exosporium}

도 1은 탄저균 포자 외막 단백질인 BclA를 이용한 세포 표면 발현에 위한 특징적 구조를 나타내는 모식도이다.

도 2a 내지 도 2c는 각각 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 및 pTJ1-BAF의 유전자 지도이다.

도 3a 내지 도 3c는 각각 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA의 유전자 지도이다.

도 4는 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1으로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 분획한 세포 외막 단백질을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 5는 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA로 형질전환된 재조합 대장균을 유세포분석기로 분석한 결과이다.

도 6은 발현벡터 pTJ1-BAF-EGFP로 형질전환된 재조합 대장균을 유세포분석기와 공초점현미경을 이용하여 분석한 결과이다.

지금까지 생물공학의 발전에 있어서 박테리아는 중요한 위치를 차지하고 있다. 특히, 왓슨과 크릭에 의해 DNA 이중 나선 구조가 밝혀진 이후, 미생물의 DNA 조작 기술을 이용하여 여러 유용 물질의 생산에 응용되어 왔다. 이 DNA 조작 기술은 미생물의 폭넓은 산업적 이용을 가능하게 하였고, 이에 따라 여러 유용 물질을 보다 효율적으로 생산하기 위한 기술도 함께 발전하여 왔으며, 단순한 단백질 생산에서 시작된 생물공학 기술은 현재 매우 다양한 분야에서 유용하게 그 응용범위가 넓어지게 되었다.

이러한 생물공학 관련 기술의 괄목한 만한 성장을 토대로 최근 새롭게 등장 한 기술 중에 하나가 분자 생물학의 기본 지식과 단백질의 분비 발현기술을 토대로 한 세포 표면발현(cell surface display) 기술이다. 세포 표면발현은 단백질이나 펩타이드 등을 적절한 표면발현 모체와 융합시켜서 그람 음성 및 양성균, 곰팡이, 효모, 동물세포의 표면에 발현시키는 기술을 말한다(Lee, S.Y. et al., Trend. Biotechnol, 21:4552, 2003). 최초의 세포 표면발현 기술은 1980년대 중반 조지 스미스(George P. Smith)가 펩타이드나 작은 단백질을 필라멘터스 파아지(filamentous phage)의 pIII와 융합발현시켜 이를 표면발현 시스템(surface-expression system)이라고 언급한 후, 미생물의 분비 기작에 대한 연구가 활발히 진행되면서 원하는 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 세표 표면발현이라는 새로운 분야가 등장했다.

종래에는, 파아지의 표면이 박테리아보다 단순하기 때문에, 파아지 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 진행되어 졌다. 그러나, 파아지를 이용한 세포 표면발현은 항체의 스크리닝이나, epitope, high-affinity ligand 등의 스크리닝에 사용되었으나, 파아지의 표면에 발현될 수 있는 단백질의 크기가 상대적으로 제한되어 있어서 한계점을 드러내게 되었다(Georgiou, G., et al, Nature Biotechnol., 15:29-34, 1997). 따라서, 그 대안으로, 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 이용한 목적단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 세포 표면발현방법이 개발되었다.

한편, 그램 음성 박테리아의 경우, 세포 내막, 주변 세포질, 세포 외막으로 이루어진 매우 복잡하고 독특한 막구조를 가지고 있다. 이러한 막구조를 가지고 있는 대장균과 같은 박테리아에서 세포 표면발현을 하기 위해서는, 우선 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면발현 모체의 사용이 필요하다. 박테리아의 표면 단백질을 이용하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는, 적당한 표면 단백질과 외래 단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합 단백질이 생합성되도록 하고, 이들이 안정하게 세포 내막을 통과하여 세포 표면에 부착하여 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 성질을 가지는 표면 단백질을 선정하여 표면발현의 모체로 사용해야 한다.

먼저, 외래 단백질을 세포 표면까지 보내기 위해 세포 내막을 통과할 수 있도록 도와주는 매우 효율적인 분비신호 서열이 있고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 갖추며, 동시에 큰 크기의 외래 단백질의 전달이 가능하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 한다. 지금까지 대장균에서 사용된 표면발현 모체는 LamB, PhoE(Agterberg, M., et al., Gene 88:37, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였다.

그러나, 상기 단백질을 이용하는 경우 외래 단백질을 세포 표면에 돌출한 루프(loop)에 삽입시켜 성공적으로 표면에 발현시킬 수 있다는 장점은 있었으나, 삽입할 수 있는 외래 단백질의 크기가 구조적으로 제한되어 있다는 문제점이 있었다(Georgiou, G., et al, Nature Biotechnol., 15:29, 1997).

또한, 삽입된 외래 단백질의 C-말단(C-terminal)과 N-말단(N-terminal)이 입체적으로 가깝게 위치해야 하므로, 양 말단의 거리가 먼 경우에는 연결 펩타이드로 두 말단 사이를 가깝게 유전적으로 조작할 필요가 있다. 실제로 LamB나 PhoE의 경우 50 내지 60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 단백질을 삽입하면, 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못한다(Stahl, S., et al., Trends Biotechnol., 15:185, 1997).

선택된 표면발현 모체에 목적단백질을 융합시켜 세포 표면에 발현시키고자 할 경우, 지금까지 세포 표면발현에 크게 세가지의 융합 방법이 사용되어 왔다. 첫째로, 표면발현 모체의 C-말단에 발현하고자 하는 외래 단백질을 융합시키거나 C-말단 부분을 제거시키고 바로 외래 단백질을 융합(C-terminal deletion fusion)시키는 방법이다. 레반수크라아제(levansucrase)를 생물전환에 이용한 INP(Jung et al., Nat. Biotechnol., 16:576, 1998), 폴리히스티딘(poly-histidine)을 표면발현한 세포 외막단백질 C(OmpC)(Xu and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 65:5142, 1999), 리파아제에 의한 입체선택성(enantioselectivity)을 갖는 반응에 이용한 FadL(Lee et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:5074, 2004)과 OprF(Lee et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:8581, 2005) 등이 이에 해당된다.

둘째로, 상기 방법과는 반대로 표면발현 모체의 N-말단에 표면에 발현시키고자 하는 목적단백질을 융합시키는 방법이 있다. 이 경우에 해당하는 것은 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(Gunneriusson, E., et al., J. Bacteriol., 178:1341, 1996), 스타필로코커스 오레우스의 피브로넥틴 결합 단백질 B(fibronectin binding protein B)(Stasuss, A., et al., Mol. Microbiol., 21:491, 1996), 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)의 피브릴라 M 단백질(fibrillar M protein)(Pozzi, G., et al., Infect. Immun., 60:1902, 1992) 등으로서, 그람 양성세포의 경우에 해당되며 대장균과 같은 그람 음성균은 이런 시스템을 사용할 수 없다는 단점이 있다.

세 번째 방법은 샌드위치 융합(sandwich fusion) 방법으로, 이 방법은 세포 표면에 발현하고자 하는 외래 단백질을 표면발현 모체로 사용되는 단백질 사이에 융합시키는 방법이다. 대장균에서 PhoE(Agterverg, M., et al., Gene, 88:37, 1990), FimH(Pallesen, L., Microbiology, 141:2839, 1995), PapA(Steidler, L., et al., J. Bacteriol., 175:7639, 1993) 등과 같은 여러 단백질들이 이 방법을 이용하여 표면에 발현시켰다. 그러나, 세번째 방법은 외래 유전자를 융합시키기가 어렵고 발현된 외래 단백질이 활성을 잃는 경우가 많으며, 삽입시킬 수 있는 외래 단백질의 크기가 약 60 내지 70 개의 아미노산으로 제한된다는 단점을 극복하지 못했다(Georgiou, G., et al., Nature Biotechnol., 15:29, 1997; Stahl, S., et al., Trends Biotechnol., 15:185, 1997).

상기한 바와 같이, 박테리아의 분비 시스템을 응용한 세포 표면발현의 생물공학적 응용범위는 매우 넓고, 세포 표면발현의 응용범위는 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질의 종류에 따라 결정된다. 우선, 병원성 유래 항원 에피토프(epitope)를 세포 표면에 발현시켜 박테리아 백신을 제조할 경우, 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 재래식 백신보다 훨씬 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타내어 환자에게 사용할 수 있다(Nguyen, T. N., et al., Gene, 128:89, 1993). 이와 같은 재조합 생백신뿐만 아니라, 특정 Fab 혹은 단일사슬항체를 세포 표면에 발현시킬 경우 여러 펩타이드나 항체의 선별(screening)을 쉽고 간단하게 수행할 수 있다(Francisco, J. A. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 91:10444, 1993). 그 밖에도, 특정 항원을 발현하는 박테리아를 동물에 투여하여 항체를 생산하거나(Charbit, A., et al., Gene, 70:181, 1988), 세포 표면에 금속 흡착 단백질을 발현시켜 중금속 제거 및 폐수 처리에 응용하는 전세포 흡착제(Sousa, C., et al., J. Bacteriol., 180:2280, 1998), 생물학적 전환에 이용되는 효소를 세포 표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물 전환(Richins, R., et al., Nat. Biotechnol., 15:984, 1997) 등 그 응용 가치가 매우 높다고 할 수 있다.

이에, 당업계에서는 상술한 바와 같이, 다양한 생물공학 분야에서 유용하게 이용되어지는 세포 표면발현 기술의 개발 및 발전이 시급하며, 특히, 목적단백질을 세균의 표면에 효과적으로 발현시키고, 세균의 표면에 목적단백질을 안정적으로 다량 발현시킬 수 있는 방법, 새로운 표현발현 모체 및 이를 이용한 표현발현 벡터의 개발이 절실히 요구되어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 미생물에서 세포 표면에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있고, 발현된 단백질을 세포 표면까지 운반할 수 있으며, 사이즈가 큰 외래 단백질도 안정적으로 과발현 시킬 수 있는 표면발현의 모체 및 그를 이용한 벡터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 새로운 표면발현 모체로서, 탄저균에서 유래한 포자외막 단백질(BclA)을 이용하여, 재조합 발현벡터를 제조한 경우, 외래 단백질이 효율적으로 형질전환체의 세포 표면에 과발현됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 세포 표면발현 모체로서 탄저균에서 유래한 포자외막 단백질(BclA)을 이용하여, 목적단백질을 세포 표면에 안정적으로 다량 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 표면발현된 목적단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법, 항체의 제조방법 및 생물전환방법 및 세포 표면에서 스트렙타비딘을 발현하는 형질전환체를 바이오틴과의 상호작용에 의한 전세포 바이오센서 매개체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 표면발현 모체(cell surface anchoring motif)로서 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 탄저균(Bacillus anthracis) 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 bclA 유전자 단편을 함유하고, 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포 내에서 발현될 경우, 상기 목적단백질이 상기 BclA의 단편과 융합된 형태로 세포 표면에 발현되도록 구성된 발현벡터를 제공한다.

삭제

서열번호 1: 5'-ATGCACCACCACCACCACCACGCATTTGACCCTAATCTTGTAGGACCTACATTACCACCGATACCACCATTTACCCTTCCTAC-3'

서열번호 2: 5'-ATGCACCACCACCACCACCACTCAAATAATAATTATTCAAATGGATTAAACCCCGATGAATCTTTATCAGCTAGTGCATTTGACCCTAATCTTGTAGGACCTACATTACCACCGATACCACCATTTACCCTTCCTACCGGGCCATCCGGACTAGGACTTCCAGCAGGACTATATGCATTTAACTCCGGTGGGATTTCTTTAGATTTAGGAATTAATGATCCAGTACCATTTAATACTGTTGGATCTCAGTTTGGTACAGCAATTTCTCAATTAGATGCTGATACTTTCGTAATTAGTGAAACTGGATTCTATAAAATTACTGTTATCGCTAATACTGCAACAGCAAGTGTATTAGGAGGTCTTACAATCCAAGTGAATGGAGTACCTGTACCAGGTACTGGATCAAGTTTGATTTCACTCGGAGCACCTATCGTTATTCAAGCAATTACGCAAATTACGACAACTCCATCATTAGTTGAAGTAATTGTTACAGGGCTTGGACTATCACTAGCTCTTGGCACGAGTGCATCCATTATTATTGAAAAAGTTGCT-3'

서열번호 3:

5'-ATGCACCACCACCACCACCACTCAAATAATAATTATTCAAATGGATTAAACCCCGATGAATCTTTATCAGCTAGTGCATTTGACCCTAATCTTGTAGGACCTACATTACCACCGATACCACCATTTACCCTTCCTACCGGACCAACTGGGCCGACTGGACCGACTGGGCCGACTGGGCCAACTGGACCAACTGGGCCGACTGGGCCAACTGGACCAACTGGACCAACTGGGCCAACTGGACCAACTGGGCCAACTGGGCCAACTGGAGACACTGGTACTACTGGACCAACTGGGCCAACTGGACCAACTGGACCAACTGGGCCAACTGGTGCTACCGGACTGACTGGACCGACTGGACCGACTGGGCCATCCGGACTAGGACTTC CAGCAGGACTATATGCATTTAACTCCGGTGGGATTTCTTTAGATTTAGGAATTAATGATCCAGTACCATTTAATACTGTTGGATCTCAGTTTGGTACAGCAATTTCTCAATTAGATGCTGATACTTTCGTAATTAGTGAAACTGGATTCTATAAAATTACTGTTATCGCTAATACTGCAACAGCAAGTGTATTAGGAGGTCTTACAATCCAAGTGAATGGAGTACCTGTACCAGGTACTGGATCAAGTTTGATTTCACTCGGAGCACCTATCGTTATTCAAGCAATTACGCAAATTACGACAACTCCATCATTAGTTGAAGTAATTGTTACAGGGCTTGGACTATCACTAGCTCTTGGCACGAGTGCATCCATTATTATTGAAAAAGTTGCT-3'

상기, bclA 유전자의 일부가 N-말단인 발현벡터는 pTJ1-BAN라 명명했고, bclA 유전자의 일부가 bclA 유전자의 N-말단과 C-말단인 발현벡터는 pTJ1-BANC라 명명했으며, bclA 유전자의 일부가 서열번호 3인 발현벡터는 pTJ1-BAF라 명명했다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 tac 프로모터 또는 다른 유도가능한 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 목적단백질은 표면발현에 유리하도록 목적단백질의 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 발현벡터를 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팜이로 구성된 군에서 선택된 세포로 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물. 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환에 사용된 미생물은 목적단백질의 세포 표면발현에 유리하도록, 발현된 목적단백질을 분해하는데 관련된 세포 내 또는 세포 외의 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것임을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 발현하는 단계 및 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포 표면발현방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달 단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 일부분, 단일사슬항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 목적단백질은 스트렙타비딘인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 효소는 리파아제인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 효소활성을 갖는 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물전환 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 기질 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 항원이 표면에 발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의 해 생성된 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 척추동물에서 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 리파제를 이용하여 라세믹 에스터 화합물로부터 키랄성 에스터, 키랄성 유기산 또는 키랄성 알코올로 광학분할하는 키랄 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 방법에 의하여 제조된 세포 표면에 발현된 리파아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 탄저균(Bacillus anthracis) 유래 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 bclA 유전자 단편 및 스트렙타비딘을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 전세포 바이오센서 매개체를 제공하며, 본 발명에 있어서, 상기 미생물 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있다

본 발명은 또한, (a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 목적단백질의 변이체와 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 탄저균 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 bclA 유전자 단편을 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 세포 표면에 발현하는 단계; 및 (e) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성, 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 개량방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 성공적인 세포 표면발현을 위해서는 표면발현 모체는 매우 효율적인 분비 신호 서열이 있고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 갖추며, 동시에 큰 크기의 목적단백질도 전달이 가능하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있는, 탄저균에서 유래한 포자외막 단백질(BclA)를 표면발현 모체의 대상으로 하였다. 또한, 본 발명의 BclA는 탄저균의 단위 포자를 완전히 둘러쌀 정도로 과발현되는 단백질이므로, 세포 표면발현에 효과적이다.

도 1은 탄저균 포자 외막 단백질 BclA를 이용한 세포 표면 발현에 위한 특징적 구조를 나타내는 모식도이다(Ptac; tac 프로모터, BA-N; BclA의 N-말단, BA-RD; GXX 아미노산의 반복 구간, BA-C; BclA의 C-말단, Protein; 재조합 외래 단백질). 즉, 탄저균의 포자외막 단백질(exosporium)인 BclA의 경우, 도 1에 나타난 바와 같이, 특이하게도 N-말단과 C-말단이 탄저균 종류에 상관없이 동일한 아미노산 서열을 보존하고 있으며 단백질 중앙에 3개의 아미노산((GPT)_1-8GDTGTT)이 반복적으로 나타나고, 그 다음 연속적으로 6개의 아미노산이 뒤를 잇는 구조로 되어 있는데, 이것이 탄저균 종류에 따라 1회에서 최대 8회까지 반복적으로 나타난다(Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169, 2002; Sylvestre et al., J. Bacteriol., 185:1555, 2003).

상기 BclA 단백질은 40개의 아미노산이 N-말단을 구성하고, 138개의 아미노산이 C-말단을 이루며, 특히 N-말단에 특별한 분비신호 서열로 나타나는 서열구조가 없는 데에도 세포 표면발현에 효과적인 것이 특징인 콜라겐-유사 단백질이다(Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169, 2002; Sylvestre et al., J. Bacteriol., 185:1555, 2003).

이에, 본 발명자들은 탄저균에서 유래한 포자외막 단백질인 BclA의 구조를 예측하고, 포자외막 단백질 전체, 혹은 일부를 포함하는 표면발현모체를 이용하여 목적단백질을 세포 표면발현시켰다.

우선, 탄저균에서 유래한 포자외막 단백질 bclA 유전자를 확보하기 위해서, 미국의 Blue Heron Biotechnology사(Bothell, WA, USA)로부터, bclA 유전자를 드노보(De novo) 합성법에 의하여 탄저균 RA3(Bacillus anthracis RA3 : NCBI accession No. CAD56878)의 bclA 유전자(NCBI accession No. AJ516945)를 합성하였다. 이렇게 합성된 약 762bp 크기의 DNA 절편을 목적단백질 유전자를 삽입할 수 있도록 EcoRI, XbaI 부위를 멀티클로닝싸이트(multi-cloning site)와 함께 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol. Techn., 12:815, 1998)에 삽입하여, 재조합 플라스미드 pTJ1-BA를 제조하였다.

상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pTJ1-BA는 탄저균 유래 포자외막 단백질 BclA가 tac 프로모터의 유도에 의해 발현된다. 한편, 세포 표면에 발현될 모델 단백질은 포자외막 단백질의 C-말단에 존재하는 제한효소 XmaI, XhoI 절단부위에 ScFv(B형 간염 바이러스의 표면단백질에 대한 단일사슬항체)와 cSA(코어 스트렙타비딘)의 융합된 형태의 유전자를 동일 부위에 삽입시켜, 재조합 발현벡터 pTJ1-BAF-ScFv-SA를 제조하였다(도 3).

또한, 대장균 세포 표면에 표면발현모체로서 BclA의 반복적인 아미노산(GPT)_1-8GDTGTT 서열을 제외시킨 N-말단, 또는 N-말단과 C-말단의 융합된 형태도 이용될 수 있는 지를 관찰하기 위하여 위와 같은 방법으로 pTJ1-BAN-ScFv-SA와 pTJ1-BANC-ScFv-SA를 각각 제조하였다(도 3).

또한, 상기 단일사슬항체와 스트렙타비딘의 융합단백질 유전자의 제조방법과 동일한 방법으로 리파아제가 융합된 형태의 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1를 제조하였다.

상기에서 제조된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 또는 pTJ1-BAF-Lip1를 대장균 XL1-Blue 균주에 도입하고, 이 형질전환체를 배양하여, 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 세포 외막 단백질을 분획하였다. 분획한 단백질들은 SDS-PAGE(sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 젤 전기영동으로 분석한 결과, 탄저균 유래 포자외막 단백질 BclA에 이 성공적으로 삽입되어 세포 표면에 발현시켰음을 확인하였으며, 전체 세포 외막 단백질 중에서 원하는 단백질이 융합된 포자외막 단백질 BclA의 비율이 약 30 내지 45%로서 매우 높음을 알 수 있었다(도 4).

또한, 상기에서 제조된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 또는 pTJ1-BAF-ScFv-SA로 형질전환되어 성공적으로 대장균의 세포 외막에 발현된 스트렙타비딘 대상 단백질이 활성을 가지는지 여부를 바이오틴-형광비드를 이용하여 단백질-리간드 상호작용이 일어나는지를 확인하였다. BclA-ScFv-SA로 융합된 단백질을 세포 표면에 발현시킨 경우 바이오틴이 성공적으로 세포 표면의 스트렙타비딘에 결합하여 형광 정도가 높게 나타남을 도 5에서와 같이 확인하였다. 이는 세포 외막에 발현된 스트렙타비딘 대상 단백질이 모두 세포 표면에서 바깥쪽으로 발현이 되었다는 것을 의미한다. 특히, 약 40kDa의 비교적 크기가 큰 재조합 단백질이 삽입되어 성공적으로 표면에 발현되었음을 알 수 있었고, 본 발명에서 개발한 탄저균 포자외막 단백질 BclA가 매우 효율적인 표면발현 모체임을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 목적단백질을 세포 내 또는 외에 발현할 때, 목적단백질 유전자가 하나이거나 두 번 이상 반복된 것, 또는 두 번 이상 반복된 목적단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것 등이 가능하고 상기한 어떠한 조합의 경우도 가능하다.

본 발명의 방법에서 제조되는 유전자는 숙주세포 내에서 플라스미드 내에 독립적으로 또는 숙주의 염색체에 삽입되어 존재할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

한편, 목적단백질의 발현 유도는 숙주세포에서 발현이 유도될 수 있는 프로 모터에 의해 발현되거나 또는 목적단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 숙주 박테리아에서 발현가능한 적절한 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 방법은 모든 단백질에 적용될 수 있고, 예컨대, 효소, 효소저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호전달단백질, 단쇄항체, 항원, 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합단백질, 결합도메인, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 각종 조절 인자 및 그들의 일부분 등을 포함하는 단백질의 표면발현 및 개량에 이용될 수 있다.

상술한 본 발명의 발현방법에 의해 최종적으로 미생물의 세포외막에 표면발현된 단백질은 다양한 방법으로 표면에 존재함을 증명할 수 있다. 우선, 미생물의 세포외막 표면발현된 단백질에 일차항체를 결합시키고, 형광을 나타내는 화합물로 표식된 이차항체를 반응시켜 포자를 형광염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하거가 유세포 분석기로 분석할 수 있다. 물론 이차항체가 금으로 표식된 경우는 전자현미경으로 관찰할 수 있다.

두 번째 방법은 외부에서 넣어준 단백질 분해효소에 의해서 표면발현된 단백질이 분해되어 효소활성이 감소하거나 형광현미경 또는 유세포 분석기에서 그 신호가 낮아지는 지를 관찰하는 것이다.

세번째 방법은 목적단백질이 고분자 물질을 기질로 이용하는 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 때 기질이 포자 외피 구조물 사이를 통과할 수 없기 때문에, 측정된 효소활성은 모두 표면에 노출된 효소에 기인한 것으로 증명할 수 있다.

한편, 단백질 어레이는 DNA 어레이 또는 DNA 칩과 같이 다양한 단백질, 특히 항체들을 고체 표면에 어레이하여 특정 세포에서의 원하는 목적단백질의 발현여부, 발현정도 등을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 단백질 어레이를 제조하기 위해서는 어레이할 단백질을 확보하고, 고체 표면에 단백질을 고정화해야 한다. 단백질 어레이를 이용한 분석과정에서는 고정화된 단백질과 결합시키고 결합하지 않는 단백질들을 세척시키기 위하여, 고온, 염농도 및 pH의 변화 등 다양한 처리가 이루어지고, 이에 이러한 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다.

그러나 많게는 수 천 내지 수 만개의 단백질 유전자를 발현벡터에 클로닝하고, 발현하여 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하는 일은 매우 많은 작업이 반복적으로 이루어져야 한다. 따라서, 상기 작업을 보다 단순하고 신속하게 할 필요가 있다.

본 발명의 단백질 어레이의 제조방법은 상기한 작업을 가장 용이하게 할 수 있는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 상기 방법에 발현된 목적단백질을 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하게 된다. 본 발명의 단백질 어레이의 제조과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 제조방법이 적용될 수 있다(WO 00/61806; WO 00/54046; US 5,807,754; EP 0818467; WO 97/42507; US 5,114,674 및 WO 96/35953). 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질과 단백질간 또는 단백질과 리간드간 및 항원과 항체간의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학 합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 고체 기판은 유리(예: 작용기가 노출된 유리), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN₄, 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론, 섬유 또는 이의 조합이다. 상기한 기판에는 단백질의 고정화를 위하여 링커 분자가 부착되기도 하고, 스팟팅이 되지 않은 나머지 부분은 블록킹되는 것이 바람직하다.

본 발명의 목적단백질 개량방법에 있어서, 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법(Stemmer, Nature, 370:389, 1994), StEP법(Zhao, H. et al., Nat. Biotechnol., 16: 258, 1998), RPR법(Shao, Z. et al., Nucleic Acids Res., 26: 681, 1998), 분자육종법(Ness, J.E. et al., Nat. Biotechnol. 17:893, 1999), ITCHY법(Lutz S. et al., Cur. Opi. Biotechnol., 11:319, 2000), 에러 유발(error-prone) PCR(Cadwell, R.C. et al., PCR Methods Appl., 2:28, 1992), 포인트 돌연변이법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)을 이용하여 야생형 목적단백질의 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 단백질 개량방법에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 측정하거나 또는 유세포 분석기(Georgiou, G., Adv Protein Chem., 55:293, 2000)를 이용하여 신속하게 실시할 수 있다. 단백질의 활성을 이용하는 경우에는 단백질이 발현되는 숙주의 성장을 측정하거나, 또는 단백질에 의해 촉매되는 발색 반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명의 포자의 내성을 이용한 단백질 개량방법에 있어서, 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 이용하거나 또는 단백질 구조의 안정성을 이용하여 신속하게 실시할 수 있다.

상술한 바와 같은 특징을 갖는 본 발명의 단백질 개량 방법을 이용하는 경우에는, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소(예: Diels-Alder 축합반응), 비자연적인 입체 선택성 또는 레지오선택성(regioselectivity) 활성을 갖는 효소, 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 그리고 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소로부터 신속하게 얻을 수 있다.

또한, 결합력이 증가한 항체의 변이체을 선별할 때 사용하는 pH의 급격한 변화나 염기농도를 조절하여 용출할 경우 박테리아는 배양 배지에 재접종을 하면 생존율이 떨어지는 경우가 발생하는 단점을, 포자 표면발현 시스템을 이용한 본 발명의 단백질 개량방법을 사용하면 해결할 수 있을 것이다.

한편, 외래단백질로서 스트렙타비딘을 발현하도록 구성된 발현벡터에 의하여 형질전환된 미생물이 바이오틴과의 상호작용으로 단백질-리간드 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명은 스트렙타비딘이 BclA와 융합된 형태로 세포 표면에 발현하도록 구성된 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 단백질-리간드 상호작용에 의한 바이오센서 매개체로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 탄저균 유래 포자 외막 단백질 BclA에 녹색형광단백질을 융합시켜서 재조합 대장균에 실제로 형광물질의 발현상태를 공초점현미경(Confocal laser microscopy)을 이용하여 관찰하였다(도 6). 그 결과 세포 내에 발현된 녹색형광단백질과 비교하여보면 BclA에 융합된 녹색형광단백질을 발현시킨 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 JM109는 성공적으로 세포 표면에 녹색형광단백질이 표면발현됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서 개발한 재조합 대장균이 단백질-리간드 상호작용을 이용한 바이오센서와 세포 표면에 발현된 단백질을 이용한 형광 센서로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 본 발명의 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 및 pTJ1-BAF는 외부 유전자로서 하기 실시예에서 기술하고 있는 스트렙타비딘 유전자 뿐만 아니라, 각종 목적단백질이나 펩타이드의 유전자를 도입하여 그의 발현에 이용될 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 그리고 pTJ1-BAF에 각종 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터 또한 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.

실시예 1: 재조합 발현벡터 pTJ1-BA의 제조

탄저균의 포자 외막 단백질 BclA 유전자를 확보하기 위하여, 탄저균(B. anthracis) RA3(NCBI accession No. CAD56878)의 BclA 유전자를 합성(NCBI accession No. AJ516945)하였고, 합성된 유전자를 표적 DNA(template DNA)로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 7분, 두 번째 변성 94℃ 1분, 교잡 55℃ 1분, 연장 72℃ 1분, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)은 하기 서열번호 4 및 서열번호 5번의 개시절편(primer)을 이용하여 수행하였다.

서열번호 4: 5'-GGAATTCATGTCAAATAATAATTATTC-3'

서열번호 5: 5'-CGTCTAGACTCGAGGCTAGCCCCGGGAGCAACTTTTTCAATAA-3'

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 770bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol.Techn., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 pTJ1-BA 재조합 플라스미드를 수득하였다.

상기에서 제조한 pTJ1-BA 재조합 플라스미드는 세포 표면발현 모체로서 사용될 포자 외막 단백질 BclA 유전자가 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발 현될 수 있다. 상기 pTJ1-BA 재조합 플라스미드의 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에는 제한효소 XmaI과 XhoI 절단부위가 존재하는 데, 이 절단부위에 세포 표면에 발현코자 하는 목적단백질의 유전자를 삽입하게 된다.

실시예 2: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 및 pTJ1-BAF의 제조

세포 표면발현 모체로서 사용한 탄저균 유래의 포자 외막 단백질 BclA는 N-말단과 C-말단사이에 반복적인 아미노산 서열구조인(GPT)_1-8GDTGTT를 갖는다(Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169, 2002).

2-1: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN의 제조

본 발명자들은 N-말단만을 세포 표면발현 모체로 이용할 수 있음을 확인하기 위하여 각각의 세포 표면발현 모체를 목적단백질과 융합시킬 수 있도록 디자인하였다.

BclA 유전자의 N-말단을 세포 표면발현 모체로 이용하기 위한 플라스미드의 제조를 위해 중합효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 5분, 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 56℃ 30초, 연장 72℃ 30초, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 반응에 이용한 개시절편(primer)은 실시예 1에서의 서열번호 4 및 서열번호 6번이다.

서열번호 6: 5'-AGTCTAGACTCGAGGCTAGCCCCGGGGGTAGGAAGGGTAAATGG-3'

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 약 90bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol.Techn., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTJ1-BAN 재조합 플라스미드를 수득하였다.

상기에서 제조한 pTJ1-BAN 재조합 플라스미드는 세포 표면발현 모체로서 사용될 포자 외막 단백질 BclA 유전자의 N-말단이 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 상기 pTJ1-BAN 재조합 플라스미드의 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에는 제한효소 XmaI과 XhoI 절단부위가 존재하는 데, 이 절단부위에 세포 표면에 발현코자 하는 목적단백질의 유전자를 삽입하게 된다. 이렇게 수득한 재조합 발현벡터의 유전자 지도를 도 2a에 나타내었다.

2-2: 재조합 발현벡터 pTJ1-BANC의 제조

본 발명자들은 BclA의 아미노산 반복 서열인(GPT)_1-8GDTGTT를 제외한 N-말단 과 C-말단만을 세포 표면발현 모체로 이용할 수 있음을 확인하기 위하여 각각의 세포 표면발현 모체를 목적단백질과 융합시킬 수 있도록 디자인하였다.

본 발명자들은 BclA 유전자의 N-말단과 C-말단이 융합된 형태를 세포 표면발현 모체로 이용할 수 있음을 확인하기 위하여 각각의 세포 표면발현 모체를 목적단백질과 융합시킬 수 있도록 디자인하였다.

BclA 유전자의 N-말단과 C-말단을 세포 표면발현 모체로 이용하기 한 플라스미드의 제조를 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응에 이용한 개시절편은 실시예 1에서의 서열번호 4 및 서열번호 7번으로 BclA의 N-말단 유전자를 증폭하고, 서열번호 8 및 실시예 1의 서열번호 5로 BclA의 C-말단 유전자를 증폭하였다.

서열번호 7: 5'-CCTAGTCCGGATGGCCCGGTAGGAAGGGTAAATGGT-3'

서열번호 8: 5'-ACCATTTACCCTTCCTACCGGGCCATCCGGACTAGG-3'

상기와 같이 증폭된 BclA의 N-말단과 C-말단의 DNA는 각각 중복되는 염기서열을 가지고 있기 때문에, 이들을 모두 서열번호 4과 서열번호 5의 개시절편을 이용하여 다시 중합효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 5분, 두 번째 변성 94℃ 45초, 교잡 56℃ 45초, 연장 72℃ 40초, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)으로 증폭하였다.

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 약 560bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol.Techn., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTJ1-BANC 재조합 플라스미드를 수득하였다.

상기에서 제조한 pTJ1-BANC 재조합 플라스미드는 세포 표면발현 모체로서 사될 포자 외막 단백질 BclA 유전자의 N-말단과 C-말단의 융합된 유전자가 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 이 pTJ1-BANC 재조합 플라스미드의 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에는 제한효소 XmaI과 XhoI 절단부위가 존재하는 데 이 절단부위에 세포 표면에 발현코자 하는 목적단백질의 유전자를 삽입하게 된다. 이렇게 수득한 재조합 발현벡터의 유전자 지도를 도 2b에 나타내었다.

2-3: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAF의 제조

본 발명자들은 BclA의 N-말단, 아미노산 반복 서열인(GPT)₁ _-8GDTGTT, 그리고 C-말단을 포함하여 세포 표면발현 모체로 이용할 수 있음을 확인하기 위하여 각각의 세포 표면발현 모체를 목적단백질과 융합시킬 수 있도록 디자인하였다.

본 발명자들은 BclA 유전자를 세포 표면발현 모체로 이용할 수 있음을 확인 하기 위하여 각각의 세포 표면발현 모체를 목적단백질과 융합시킬 수 있도록 디자인하였다.

BclA 유전자를 세포 표면발현 모체로 이용하기 한 플라스미드의 제조를 위해 중합효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 5분, 두 번째 변성 94℃ 45초, 교잡 56℃ 45초, 연장 72℃ 1분, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 반응에 이용한 개시절편은 실시예 1에서의 서열번호 4과 서열번호 5로 BclA 유전자를 증폭하였다.

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 약 780 bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol.Techn., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTJ1-BAF 재조합 플라스미드를 수득하였다.

상기에서 제조한 pTJ1-BAF 재조합 플라스미드는 세포 표면발현 모체로서 사될 포자 외막 단백질 BclA 유전자가 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 이 pTJ1-BAF 재조합 플라스미드의 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에는 제한효소 XmaI과 XhoI 절단부위가 존재하는 데 이 절단부위에 세포 표면 에 발현코자 하는 목적단백질의 유전자를 삽입하게 된다. 이렇게 수득한 재조합 발현벡터의 유전자 지도를 도 2c에 나타내었다.

실시예 3: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA, 그리고 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1의 제조

세포 표면에 발현시킬 모델 단백질로, 단일사슬항체와 스트렙타비딘의 융합단백질과 리파아제(lipase)를 사용하여, 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA, 그리고 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1를 제조하였다.

3-1: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA의 제조

단일사슬항체와 스트렙타비딘의 융합단백질 유전자를 얻기 위해 중합효소 연쇄반응(첫 번째 변성 94℃ 5분, 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 56℃ 30초, 연장 72℃ 1분 10초, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응에 이용된 개시절편은 하기한 서열번호 9 및 10이다.

서열번호 9: 5'-TTTACCCGGGTCGACTGAGGAGTCTGGA-3'

서열번호 10: 5'-CTAGCTAGCCTCGAGTTACGGCTTCACCTTGGT-3'

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 약 1120bp 크기의 DNA 절편을 분리한다. 상기 단일사슬항체와 스트렙타비딘의 융합단백질 유전자의 5'-말단에는 제한효소 XmaI 사이트가 존재하며, 3'-말단에는 XhoI과 NheI 사이트가 존재하므로, 상기 DNA 단편을 XmaI과 XhoI 제한효소로 절단하였다. 상기 절단된 DNA 단편을 실시예 2에서 제조된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC, pTJ1-BAF의 동일한 위치에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 삽입하였고, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 JM109에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA, pTJ1-BAF-ScFv-SA 재조합 발현벡터를 수득하였다.

3-2: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1의 제조

리파아제의 경우도 상기 3-1의 단일사슬항체와 스트렙타비딘의 융합단백질 유전자의 제조방법과 동일한 방법을 이용하여 제조하였다.

본 발명자들은 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1을 제조하였고, 상기 중합효소 연쇄반응 방법에 사용된 개시절편은 하기 서열번호 11 및 12이다.

서열번호 11: 5'-ATAGCTAGCGCGGCTTCGCGAGCCAAT-3'

서열번호 12: 5'-TAACAAGCTTTTAAGGCCGCAAACTCGC-3'

아가로즈 젤 전기 영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 약1170bp 크기의 DNA 절편을 분리한 다음, 상기 DNA 단편을 NheI과 HindIII 제한효소로 절단하였다. 상기 절단된 DNA 단편을 실시예 2에서 제조된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN, pTJ1-BANC, pTJ1-BAF의 동일한 위치에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 삽입하였고, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 리파아제 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1, pTJ1-BAF-Lip1를 수득하였다.

실시예 4: BclA 융합 단백질의 발현

실시예 3에서의 방법으로 제작된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1, 그리고 pTJ1-BAF-Lip1로 형질전환된 대장균(E. coli) XL1-Blue(SupE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lac F'(proAB+ lacIq lacZM15 Tn10(tetr)))에서 모델 단백질인 고초균(Bacillus) 유래의 리파아제(lipase)와 융합된 탄저균 포자 외막 단백질 BclA의 발현을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 확인하였다.

즉, BclA-Lip1 융합 단백질의 발현을 확인하기 위하여 재조합 대장균들을 LB 액체 배지 50mL가 담긴 250mL 삼각 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 이들 재조합 발현벡터는 tac 프로모터를 가지고 있어, IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도(induction)는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.6일 때 1mM 의 IPTG를 첨가함으로써 수행하였다.

유도 발현 후 4시간 후에 배양액 3mL씩을 채취하여 세포 외막 단백질을 다음과 같은 방법으로 분획하였다. 즉, 배양액 3mL를 4℃에서 10,000rpm으로 2분동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 1mL Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 한번 세척한 다음, 다시 4℃에서 13,000rpm으로 2분 동안 원심분리하고, 이를 Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액 0.2mL에 현탁하였다. 현탁한 용액은 초음파 처리(sonication)를 하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄한 후, 실온에서 10,000rpm으로 2분동안 원심분리하여 세포 파편(debris)이 제거된 상층액을 얻었다. 세포막 단백질 분획은 이 상층액을 실온에서 13,000rpm으로 30분동안 원심분리한 후, 0.5mL 0.5%(w/v) sarcosyl/10mM Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액에 현탁하여 얻었다. 상기 세포막 단백질 용액을 37℃에서 30분동안 반응시킨 후에 4℃에서 13,000rpm으로 30분동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획을 10mM Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 세척한 후에 50㎕ PBS(0.274M NaCl, 0.041M Na2HPO4, 0.047M KH2PO4, 0.005M KCl, pH 7.4) 용액에 현탁하여 세포 외막 단백질 분획 시료 용액을 얻었다(Puenete, J.L., et al., Gene, 156:1, 1995).

상기와 같은 방법으로 얻어진 단백질들을 40㎕씩 취하여 SDS-PAGE 시료 완충용액(Tris-HCl 60mM: 25% 글리세롤: 2% SDS: 2-머캡토에탄올 14.4mM: 0.1% 브로모페놀 블루) 10㎕와 혼합하고 10분간 끓는 물에 중탕 반응시킨 후, 이를 12% 분리젤에서 SDS-PAGE 젤 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤은 염색 용액 (coomassie brilliant blue R 0.25g/L: 메탄올 40%, 아세트산 10%)에 2시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액(메탄올 40%: 아세트산 7%)에 2시간 이상씩 두 번 담가두어 탈색하였다(도 4).

도 4에서 레인 SM(size marker)은 단백질 표준 분자량(250kDa, 150kDa, 100kDa, 75kDa, 50kDa 및 37kDa)을 나타내는 크기 대조군이고; 첫 번째 레인은 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue의 세포 외막 단백질 분획(BclA-Lip1 융합단백질이 발현되지 않음)을 나타내며, 두 번째 레인에서 네 번째 레인까지는 유도발현 후 4시간이 경과한 다음에 pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 및 pTJ1-BAF-Lip1 발현벡터로 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 세포 외막 단백질 분획을 각각 나타낸다.

전기 영동 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 각각 BAN-Lip1은 약 45kDa, BANC-Lip1은 약 61kDa, 그리고 BAF-Lip1은 약 66kDa의 분자량을 갖는 융합단백질이 대장균의 세포 외막에 발현됨을 알 수 있었고, 이와 같은 결과를 통해, 세포 외막 단백질에 약 43kDa의 리파아제(Lip1)가 성공적으로 포자외막 단백질 BclA에 삽입되어 대장균의 세포 외막에 발현되었음을 알 수 있었다.

또한, 상기 SDS-PAGE 젤 전기영동 결과는 덴시토메터를 이용한 단백질의 정량에 이용하여, 세포 외막 단백질 중에서 Lip1 단백질이 삽입된 세포 외막 단백질의 비율을 결정하였는바, 그 비율은 약 30 내지 45%정도로 발현비율이 매우 높음을 알 수 있었다.

실시예 5: 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA, pTJ1-BAF-ScFv-SA을 가지는 재조합 대장균의 세포 표면발현

실시예 3에서 제조된 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA및 pTJ1-BAF-ScFv-SA을 가지는 재조합 대장균을 이용하여 BclA에 융합된 목적단백질이 세포 표면에 제대로 발현되는 지를 확인하기 위해서, 도 5에서 보는 바와 같이 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

실시예 4와 동일한 조건으로, 재조합 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA 및 pTJ1-BAF-ScFv-SA으로 형질전환된 세포를 배양하였다. 발현 유도후, 4시간이 경과하면 배양액 1mL를 4℃에서 6000rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 PBS 버퍼 용액으로 두 번 씻은 후에, 다시 PBS 버퍼 용액에 현탁하였다. 세포-비드 혼합액은 바이오틴이 형광물질에 결합되어 있는 용액을 처리하여 37℃에서 한시간 동안 반응하였다. 이 반응액을 상온에서 10,000rpm으로 2분동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 PBS 버퍼 용액으로 세 번 씻은 후에 다시 PBS 버퍼 용액에 현탁하여 유세포 분석기(Fluorescent-activated Cell Sorter; FACS, Beckton Dickinson, Fullerton, CA, USA)로 관찰하였다(도 5). 시료는 543nm 헬륨/네온 레이저에 의해서 여기 되었고, 이미지는 580nm 필터에 의해 걸러졌다.

도 5a는 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue 대조군의 분석결과이고, 도 5b는 발현벡터 pTJ1-BAN-ScFv-SA가 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 분석결과이며, 도 5c는 발현벡터 pTJ1-BANC-ScFv-SA가 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 분석결과이고, 도 5d는 발현벡터 pTJ1-BAF-ScFv-SA가 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 분석결과이 다.

도 5에 나타난 바와 같이, BclA의 세가지 형태에 융합된 단백질 모두가 대장균의 세포 외막에 발현되어 유세포 분석기의 형광정도가 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 탄저균 포자외막 단백질 BclA에 융합된 목적단백질이 대장균의 세포 외막에 성공적으로 발현되었음을 의미하는 것이다.

상기 실험으로부터, 단일사슬항체와 스트렙타비딘이 BclA에 융합된 형태로 대장균의 세포 외막에 성공적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 재조합 발현벡터 pTJ1-BA-EGFP를 가지는 재조합 대장균의 실시간 관찰

실시예 1의 재조합 발현벡터 pTJ1-BA에 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)라는 형광단백질을 결합시켜, pTJ1-BA-EGFP를 가지는 재조합 대장균 JM109(F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm(DE3))에서 발현되는 녹색형광단백질이 실제로 세포 표면에 발현되는 지를 확인하기 위해서 공초점 현미경(laser scanning confocal microscopy; Carl Zeiss LSM 410, Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다(도 6).

실시예 4와 동일한 조건으로, 세포를 배양하여 유도 발현한 후, 4시간이 경과하면 세포를 원심분리기로 모아서 LB 배지로 세척한 후 IPTG가 없는 새로운 LB 배지로 옮긴 후 다시 4시간 동안 배양하였다. 이는 세포 내에 발현되면서 남아있는 녹색형광현미경을 모두 세포 표면으로 보내기 위한 것이었다. 그 결과, 도 6에 서 나타내는 바와 같이 BclA와 융합시키지 않고 세포 내에서 발현되는 녹색형광단백질의 위치가 BclA와 융합되어 세포 외막에 발현되는 녹색형광단백질의 형광 위치와 다름을 유세포 분석기와 공초점 현미경 사진을 통해 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 탄저균에서 유래한 포자 외막 단백질(BclA)을 세포 표면 발현 모체로 사용하여, 목적단백질이나 펩타이드를 세포 표면에 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 안정적으로 다량 발현시키는 방법을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 신규 개발된 표면 발현벡터를 이용하여 세포 표면에 외래 단백질을 발현시키면, 삽입되는 외래 유전자에 따라 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 재래식 백신보다 훨씬 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타내어 줄 수 있는 재조합 생백신, 여러 펩타이드나 항체의 선별, 중금속 제거 또는 폐수 처리에 응용할 수 있는 전세포 흡착제, 생물학적 전환에 이용되는 효소를 세포 표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물전환 등의 목적에 유용하게 사용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

세포 표면발현 모체(cell surface anchoring motif)로서 탄저균(Bacillus anthracis) 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 bclA 유전자 단편을 함유하고, 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포 내에서 발현될 경우, 상기 목적단백질이 상기 BclA의 단편과 융합된 형태로 세포 표면에 발현되도록 구성된 발현벡터.
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제1항에 있어서, 상기 프로모터는 tac 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
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제1항 또는 제5항의 발현벡터를 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물.
제7항에 있어서, 형질전환에 사용된 미생물은 목적단백질의 세포 표면발현에 유리하도록, 발현된 목적단백질을 분해하는데 관련된 세포 내 또는 세포 외의 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제8항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제7항의 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 발현하는 단계 및 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포 표면발현방법.
제10항에 있어서, 상기 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달 단백질, 항체, 단일사슬항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 목적단백질은 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 효소는 리파아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항의 방법에 의하여 제조되고, 효소활성을 갖는 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물전환 방법.
제11항의 방법에 의하여 제조되고, 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 기질 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법.
제11항의 방법에 의하여 제조되고, 항원이 표면에 발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의해 생성된 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 척추동물에서 항체를 제조하는 방법.
리파제를 이용하여 라세믹 에스터 화합물로부터 키랄성 에스터, 키랄성 유기산 또는 키랄성 알코올로 광학분할하는 키랄 화합물의 제조방법에 있어서, 제13항의 방법에 의하여 제조된 세포 표면에 발현된 리파아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
탄저균(Bacillus anthracis) 유래 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 bclA 유전자 단편 및 스트렙타비딘을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 전세포 바이오센서 매개체.
제18항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 전세포 바이오센서 매개체.
다음의 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법:

(a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계;

(b) 상기 목적단백질의 변이체와 탄저균 포자외막 단백질(BclA)의 단편을 코딩하는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 bclA 유전자 단편을 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계;

(c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 숙주세포를 형질전환하는 단계;

(d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 세포 표면에 발현하는 단계; 및

(e) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 세포를 스크리닝하는 단계.
제20항에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성, 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 개량방법.