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BR112017005381B1 - Composição, semente revestida e método de tratamento de uma planta - Google Patents

Composição, semente revestida e método de tratamento de uma planta Download PDF

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BR112017005381B1
BR112017005381B1 BR112017005381-0A BR112017005381A BR112017005381B1 BR 112017005381 B1 BR112017005381 B1 BR 112017005381B1 BR 112017005381 A BR112017005381 A BR 112017005381A BR 112017005381 B1 BR112017005381 B1 BR 112017005381B1
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BR
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plant
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BR112017005381-0A
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Damian CURTIS
Brian Thompson
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Basf Corporation
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Publication date
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Abstract

COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM CÉLULAS RECOMBINANTES DE BACILLUS E UM INSETICIDA. A presente invenção se refere a uma composição que compreende a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz. Além disso, a presente invenção se refere ao uso dessa composição bem como um método para acentuação de crescimento vegetal, promoção de saúde da planta e/ou redução de dano geral de plantas e partes da planta.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0010] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido de Patente Provisório US n° de série 62/051.919, depositado em 17 de setembro de 2014, cujo conteúdo é incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[0011] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente através da EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo com o nome de “BCS149059WO_ST25.txt” criado em 14 de setembro de 2015, e que tem um tamanho de 152 quilobytes, e é depositada concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES Campo da Invenção
[0012] A presente invenção se refere a uma composição que compreende (i) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (x) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal; e (y) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e (ii) pelo menos um inseticida selecionado a partir dos inseticidas particulares revelados no presente documento que exibe a capacidade de aprimorar a saúde e/ou o crescimento vegetal e/ou a atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos em quantidades sinergicamente eficazes. Além disso, a presente invenção se refere ao uso dessa composição bem como um método para acentuação de crescimento vegetal, promoção de saúde da planta e/ou redução de dano geral de plantas e partes da planta.
Antecedentes da Invenção
[0013] Em proteção de cultivos, há uma necessidade contínua por aplicações que aprimorar a saúde e/ou o cresimento de plantas. As plantas mais saudáveis resultam, em geral, em produtividades superiores e/ou melhor qualidade de uma planta ou seus produtos.
[0014] A fim de promover a saúde da planta, fertilizantes são empregados em todo o mundo, com base tanto em substâncias inorgânicas quanto em substâncias orgânicas. Um fertilizante pode ser uma única substância ou uma composição, e é usado para proporcionar nutrientes para as plantas. Um progresso principal na aplicação de fertilizantes foi o desenvolvimento de fertilizante à base de nitrogênio por Justus von Liebig por volta de 1840. Os fertilizantes, entretanto, podem levar à acidificação do solo e à desestabilização de equilíbrio de nutriente no solo, incluindo depleção de minerais e enriquecimento de sal e metais pesados. Além disso, o uso excessivo de fertilizante pode levar à alteração de fauna do solo bem como contaminar a água da superfície e a água do solo. Adicionalmente, substâncias não saudáveis como nitrato podem se tornar enriquecidas em plantas e frutas.
[0015] Além disso, os inseticidas e fungicidas são empregados em todo o mundo para controlar pragas. Os inseticidas ou fungicidas sintéticos são, muitas vezes, não específicos e, portanto, atuam em organismos diferentes dos organismos-alvo, incluindo outros organismos benéficos de ocorrência natural. Por causa de sua natureza química, os mesmos também podem tóxicos e não biodegradáveis. Os consumidores por todo o mundo estão cada vez mais conscientes sobre os problemas potenciais ambientais e de saúde associados aos resíduos de produtos químicos, particularmente, em produtos alimentícios. Isso tem resultado em pressão crescente do consumidor em reduzir o uso ou pelo menos a quantidade de pesticidas químicos (isto é, sintéticos). Dessa forma, há uma necessidade de gerenciar os requisitos da cadeia alimentícia enquanto ainda se permite o controle de praga eficaz.
[0016] Um problema adicional que surge com o uso de inseticidas ou fungicidas sintéticos é que a aplicação repetida e exclusiva de um inseticida ou fungicidas leva, muitas vezes, à seleção de pragas ou micro-organismos de animal resistentes. Normalmente, tais cepas também possuem resistência cruzada a outros ingredientes ativos que têm o mesmo modo de ação. Um controle eficaz dos patógenos com os ditos compostos ativos já não é, então, possível. Entretanto, os ingredientes ativos que têm novos mecanismos de ação são difíceis e dispendiosos de desenvolver.
[0017] O uso de agentes de controle biológico (BCAs), que agem como agentes de proteção de plantas e/ou de acentuação de saúde de plantas, é uma alternativa para fertilizantes e pesticidas sintéticos. Em alguns casos, a eficácia de BCAs não está no mesmo nível que para os inseticidas e fungicidas convencionais, especialmente no caso de pressão de infecção grave. Consequentemente, em algumas circunstâncias, os agentes de controle biológico, seus mutantes e metabólitos produzidos pelos mesmos não são, em particular, em baixas taxas de aplicação, inteiramente satisfatórios. Dessa forma, há uma necessidade constante pelo desenvolvimento de novas composições de proteção de plantas e/ou de acentuação de saúde de plantas, incluindo agentes de controle biológico usados em conjunto com fungicidas e inseticidas sintéticos, para se empenhar em cumprir os requisitos mencionados acima.
SUMÁRIO
[0018] Em vista disso, foi, em particular, um objetivo da presente invenção proporcionar composições que têm uma capacidade acentuada de aprimorar o crescimento vegetal e/ou para acentuar a saúde da planta ou que exibem atividade acentuada contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos.
[0019] Consequentemente, foi concluído que esses objetivos são alcançados com as composições de acordo com a invenção conforme definido a seguir. Ao aplicar a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou uma praga; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, um que seja capaz de acentuar, de preferência, de uma maneira superaditiva (i) crescimento vegetal, produtividade de planta e/ou saúde da planta e/ou (ii) a atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos.
[0020] As referências no presente documento às sequências de endereçamento, proteínas de exósporo, fragmentos de proteína de exósporo, proteínas de fusão e células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam tais proteínas de fusão não devem ser consideradas como modalidades autônomas. Em vez disso, por todo o presente pedido, as referências às sequências de endereçamento, proteínas de exósporo, fragmentos de proteína de exósporo, proteínas de fusão e células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam tais proteínas de fusão devem ser consideradas como reveladas e reivindicadas apenas em combinação (e, de preferência, em uma combinação sinérgica) com um ou mais dos fungicidas particulares descritos no presente documento. Além disso, referências ao “inseticida particular revelado no presente documento” são pretendidas que abranjam inseticidas descritos a seguir nos parágrafos.
[0021] A presente invenção se refere a uma composição que compreende em quantidades sinergicamente eficazes: a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida selecionado a partir do grupo que consiste em acetamiprida, aldicarbe, amitraz, beta-ciflutrina, carbarila, clotianidina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina, endossulfan, etion, etiprol, etoprofós, fenamifós, fenobucarb, fentiona, fipronil, flubendiamida, flupiradifurona, fluopiram, formetanato, heptanofós, imidacloprida, metamidofós, metiocarbe, metomila, niclosamida, oxidemeton-metila, fosalona, silafluofeno, espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate, tiacloprida, tiodicarbe, tralometrina, triazofós, triflumuron, vamidotion, 1-{2-fluoro-4-metil-5- [(R)-(2,2,2- trifluoroetil)sulfinil]fenil}-3-(trifluorometil)-1H-1,2,4- triazol-5-amina, 1-(3-cloropiridin-2-il)-N- [4-ciano-2- metil-6-(metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5-(trifluorometil)-2H- tetrazol-2-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida e misturas de terpeno pesticida que compreendem os três terpenos a- terpineno, p-cimeno e limoneno.
[0022] Em algumas modalidades, a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; uma sequência de endereçamento que compreende os aminoácidos 135 da SEQ ID NO: 1; uma sequência de endereçamento que compreende os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; uma sequência de endereçamento que compreende os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; uma sequência de endereçamento que compreende os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; uma sequência de endereçamento que compreende os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; uma sequência de endereçamento que compreende SEQ ID NO: 1; ou uma proteína de exósporo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85 % de identidade com SEQ ID NO: 2.
[0023] Em algumas modalidades, as células de Bacillus que produzem exósporo são células de um membro da família de Bacillus cereus. As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem ser qualquer uma de Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstefensis, Bacillus toyoiensis e combinações dos mesmos. Em uma modalidade adicional, as células recombinantes de Bacillus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0024] Em certos aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em acetoína redutase, uma indol-3-acetamida hidrolase, uma triptofano mono-oxigenase, uma acetolactato sintetase, uma a-acetolactato descarboxilase, uma piruvato descarboxilase, uma diacetil redutase, uma butanodiol desidrogenase, uma aminotransferase, uma triptofano descarboxilase, uma amina oxidase, uma indol-3-piruvato descarboxilase, uma indol-3- acetaldeído desidrogenase, uma triptofano oxidase de cadeia lateral, uma nitrila hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma adenosina fosfato isopenteniltransferase, uma fosfatase, uma adenosina quinase, uma adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, uma 5’ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma zeatina cis-trans isomerase, uma zeatina O-glicosiltransferase, uma ß-glicosidase, uma cis- hidroxilase, uma CK cis-hidroxilase, uma CK N- glicosiltransferase, uma 2,5-ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina nucleosídeo fosforilase, uma zeatina redutase, uma hidroxilamina redutase, uma 2-oxoglutarato dioxigenase, uma hidrolase 2B/3B giberélica, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, uma quitosanase, uma quitinase, uma ß-1,3- glucanase, uma ß-1,4-glucanase, uma ß-1,6-glucanase, uma ácido aminociclopropano-1-carboxílico desaminase e uma enzima envolvida na produção de um fator nod.
[0025] Em outros aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano selecionada a partir do grupo que consiste em uma celulase, uma lipase, uma lignina oxidase, uma protease, uma glicosídeo hidrolase, uma fosfatase, uma nitrogenase, uma nuclease, uma amidase, uma nitrato redutase, uma nitrito redutase, uma amilase, uma amônia oxidase, uma ligninase, uma glicosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease, uma xilanase, e um sideróforo.
[0026] Em ainda outros aspectos, a proteína de fusão compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno e a proteína ou peptídeo tem atividade inseticida, atividade helminticida, suprime a predação de insetos e vermes, ou uma combinação dos mesmos. Tal proteína pode compreender uma toxina bacteriana inseticida, uma endotoxina, uma toxina Cry, uma proteína ou peptídeo inibidor de protease, uma cisteína protease, ou uma quitinase. A proteína ou peptídeo pode compreender uma toxina inseticida de VIP, um inibidor de tripsina, um inibidor de protease de erva frecha, uma toxina Cry (por exemplo, uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis).
[0027] Em certas modalidades, o inseticida é selecionado a partir do grupo que consiste em acetamiprida, aldicarbe, amitraz, beta-ciflutrina, carbarila, clotianidina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina, endossulfan, etion, etiprol, etoprofós, fenamifós, fenobucarb, fentiona, fipronil, flubendiamida, flupiradifurona, fluopiram, formetanato, heptanofós, imidacloprida, metamidofós, metiocarbe, metomila, niclosamida, oxidemeton-metila, fosalona, silafluofeno, espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate, tiacloprida, tiodicarbe, tralometrina, triazofós, triflumuron, vamidotion, 1-{2-fluoro-4-metil-5- [(R)-(2,2,2-trifluoroetil)sulfinil]fenil}-3- (trifluorometil)-1H-1,2,4-triazol-5-amina, 1-(3- cloropiridin-2-il)-N- [4-ciano-2-metil-6- (metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5-(trifluorometil)-2H-tetrazol- 2-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida e misturas de terpeno pesticida que compreendem os três terpenos a-terpineno, p- cimeno e limoneno.
[0028] Em outras modalidades, o inseticida é selecionado a partir do grupo que consiste em clotianidina, cipermetrina, etiprol, fipronil, fluopiram, flupiradifurona, imidacloprida, metiocarbe, e tiodicarbe.
[0029] Em algumas modalidades, a composição da presente invenção compreende a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal e uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida selecionado a partir do grupo que consiste em clotianidina, cipermetrina, etiprol, fipronil, fluopiram, flupiradifurona, imidacloprida, metiocarbe, e tiodicarbe em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0030] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é clotianidina; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0031] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é cipermetrina; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0032] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é etiprol; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0033] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é fipronil; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0034] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é fluopiram; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0035] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é flupiradifurona; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0036] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é imidacloprida; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0037] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é metiocarbe; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0038] Em um aspecto particular das modalidades acima (i) o pelo menos um inseticida é tiodicarbe; (ii) a sequência de endereçamento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %; (iii) a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreende endoglucanase, fosfolipase ou quitosinase, de preferência, com pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107, 108 e 109, respectivamente; e (iv) as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus compreendem células de Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides. Em ainda uma outra modalidade particular, as células recombinantes do membro da família de Bacillus cereus são células de Bacillus thuringiensis BT013A.
[0039] Em ainda outras modalidades, a composição compreende ainda pelo menos um fungicida. O pelo menos um fungicida pode ser sintético.
[0040] Em alguns aspectos, a composição compreende adicionalmente pelo menos um auxiliar selecionado a partir do grupo que consiste em extensores, solventes, promotores de espontaneidade, veículos, emulsificantes, dispersantes, protetores contra congelamento, espessantes e adjuvantes.
[0041] Em outros aspectos, a invenção se refere a uma semente tratada com qualquer uma das composições reveladas no presente documento.
[0042] Além disso, a presente invenção se refere ao uso das composições reveladas como um inseticida e/ou fungicida. Em certos aspectos, as composições reveladas são usadas para reduzir o dano geral de plantes e partes da planta bem como perdas em frutas ou vegetais colhidos por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos. Em outros aspectos, as composições reveladas são usadas para acentuação de crescimento vegetal e/ou promoção de saúde da planta.
[0043] Adicionalmente, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma planta, uma parte da planta, como uma semente, raiz, rizoma, cormo, bulbo, ou tubérculo, e/ou um locus no qual ou próximo ao qual a planta ou as partes da planta crescem, como o solo, para acentuar o crescimento vegetal e/ou promover a saúde da planta que compreende a etapa de aplicar simultânea ou sequencialmente a uma planta, uma parte da planta e/ou loci de planta: a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida selecionado a partir de inseticidas particulares revelados no presente documento que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0044] Em uma outra modalidade, a presente invenção é um método para reduzir o dano geral de plantas e partes da planta bem como perdas em frutas ou vegetais colhidos ocasionadas por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos que compreende a etapa de aplicar simultânea ou sequencialmente a uma planta, uma parte da planta, como uma semente, raiz, rizoma, cormo, bulbo ou tubérculo, e/ou um locus no qual ou próximo ao qual a planta ou as partes da planta crescem, como o solo: a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida selecionado a partir dos inseticidas particulares revelados no presente documento que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0045] Nos parágrafos acima, o termo “compreender” ou qualquer derivado do mesmo (por exemplo, que compreende, compreende) pode ser substituído por “consiste em” ou o derivado correspondente aplicável do mesmo.
[0046] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0047] A Figura 1 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da porção amino-terminal da cepa Sterne BclA de Bacillus anthracis e com a região correspondente de várias proteínas de exósporo dos membros da família de Bacillus cereus.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0048] Em geral, “pesticida” significa a capacidade de uma substância em aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de pragas de planta. O termo é usado no presente documento para descrever a propriedade de uma substância para exibir atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos. No sentido da presente invenção, o termo “pragas” inclui insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos.
[0049] NRRL é a abreviação para o Agricultural Research Service Culture Collection, que tem o endereço National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA.
[0050] ATCC é a abreviação para o American Type Culture Collection, que tem o endereço ATCC Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10110, EUA.
[0051] Todas as cepas descritas no presente documento e que têm um número de acesso no qual o prefixo é NRRL ou ATCC foram depositadas com a respectiva instituição depositante descrita acima de acordo com o Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Propósitos de Procedimento de Patente.
[0052] Uma “enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal” inclui qualquer enzima que catalisa qualquer etapa em uma via de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura da planta, ou qualquer enzima que catalisa a conversão de um derivado inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto. Tais compostos incluem, por exemplo, mas não são limitados a, hormônios de planta de molécula pequena como auxinas e citoquininas, peptídeos bioativos e moléculas pequenas estimulantes de crescimento vegetal sintetizadas por bactérias ou fungos na rizosfera (por exemplo, 2,3-butanodiol).
[0053] Uma “proteína ou peptídeo acentuadora de sistema imunológico da planta” como usado no presente documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que tem um efeito benéfico no sistema imunológico de uma planta.
[0054] O termo “proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal” como usado no presente documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que aumenta o crescimento vegetal em uma planta exposta à proteína ou peptídeo.
[0055] Os termos “promover o crescimento vegetal” e “estimular o crescimento vegetal” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem à capacidade de acentuar ou aumentar pelo menos um dentre altura, peso, tamanho de folha, tamanho de raiz ou tamanho de caule da planta, para aumentar a produtividade da proteína da planta ou para aumentar a produtividade de grão da planta.
[0056] Uma “proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno” como usado no presente documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna uma planta exposta à proteína ou peptídeo menos suscetível à infecção com um patógeno.
[0057] Uma “proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta” como usado no presente documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna uma planta exposta à proteína ou peptídeo mais resistente ao estresse.
[0058] O termo “proteína ou peptídeo de ligação à planta” se refere a qualquer peptídeo ou proteína com capacidade de se ligar específica ou não especificamente a qualquer parte de uma planta (por exemplo, raízes ou porções aéreas de uma planta como folhagem, troncos, flores ou frutas) ou à matéria vegetal.
[0059] O termo “sequência de endereçamento” como usado no presente documento se refere a uma sequência de polipeptídeos que resulta na localização de um polipeptídeo mais longo ou a proteína para o exósporo de um membro da família de Bacillus cereus.
[0060] Células Recombinantes de Bacillus que Produzem Exósporo que Expressam Proteínas de Fusão
[0061] As proteínas de fusão contêm uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo que tem como alvo a proteína de fusão para o exósporo de um membro da família de Bacillus cereus e: (a) uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal; (b) uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno; (c) uma proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse de uma planta; (d) uma proteína ou peptídeo de ligação à planta; ou (e) uma proteína ou peptídeo acentuadora de sistema imunológico de planta. Quando expressas em bactérias do membro da família de Bacillus cereus, essas proteínas de fusão são tidas como alvo para a camada de exósporo do esporo e são fisicamente orientadas de modo que a proteína ou peptídeo seja exibida no exterior do esporo.
[0062] Esse sistema de exibição de exósporo de Bacillus (BEMD) pode ser usado para entregar peptídeos, enzimas e outras proteínas a plantas (por exemplo, à folhagem da planta, frutas, flores, troncos ou raízes) ou a um meio de crescimento vegetal como o solo. Os peptídeos, enzimas e proteínas entregues ao solo ou a um outro meio de crescimento vegetal dessa maneira persistem e exibem atividade no solo por períodos de tempo prolongados. A introdução de células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam as proteínas de fusão descritas no presente documento no solo ou na rizosfera de uma planta leva a um enriquecimento benéfico de crescimento vegetal em muitas condições de solo diferentes. O uso do BEMD para criar essas enzimas as permite continuar a exercer seus resultados benéficos para a planta e a rizosfera ao longo dos primeiros meses de uma vida da planta.
[0063] Sequências de Endereçamento, Proteínas de Exósporo e Fragmentos de Proteína de Exósporo
[0064] Para facilidade de referência, os SEQ ID NOs. para as sequências de peptídeos e proteínas referidas no presente documento são listados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Sequências de Peptídeos e Proteínas
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AA = aminoácidos 1 BclA de cepa Sterne de B. anthracis tem 100 % de identidade de sequência com BclA de B. thuringiensis. Dessa forma, os SEQ ID NOs: 1, 2, e 59 também representam aminoácidos 1-41 de BclA de B. thuringiensis, BclA de comprimento completo de B. thuringiensis, e aminoácidos 1196 de BclA de B. thuringiensis, respectivamente. De modo semelhante, SEQ ID NO: 60 também representa um resíduo de metionina mais aminoácidos 20-35 de BclA de B. thuringiensis. 2 * A proteína hipotética TIGR03720 de B. mycoides tem 100 % de identidade de sequência com a proteína hipotética WP003189234 de B. mycoides. Dessa forma, os SEQ ID NOs: 57 e 58 também representam aminoácidos 1-136 de proteína hipotética WP003189234 de B. mycoides e de proteína hipotética WP003189234 de comprimento completo de B. mycoides, respectivamente.
[0065] O Bacillus é um gênero de bactéria em formato de bastão. A família de Bacillus cereus de bactérias inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus toyoiensis e Bacillus weihenstephensis. Sob condições ambientais estressantes, as bactérias da família de Bacillus cereus são submetidas à esporulação e formam endósporos ovais que podem permanecer inativos por períodos de tempo prolongados. A camada mais externa dos endósporos é conhecida como o exósporo e compreende uma camada basal circundada por uma área de contato externa de projeções capilares. Os filamentos na área de contato capilar são predominantemente formados pela glicoproteína BclA semelhante a colágeno, enquanto a camada basal é compreendida de inúmeras proteínas diferentes. Uma outra proteína relacionada a colágeno, BclB, está também presente no exósporo e exposta em endósporos de membros da família de Bacillus cereus.
[0066] A BclA, o principal constituinte da área de contato de superfície, demonstrou ser fixado ao exósporo com seu amino-terminal (N-terminal) posicionado na camada basal e seu carboxi-terminal (C- terminal) se estendendo para fora do esporo.
[0067] Foi anteriormente concluído que certas sequências das regiões de N-terminal de BclA e BclB poderiam ser usadas para endereçar um peptídeo ou proteína para o exósporo de um endósporo de Bacillus cereus (consulte a Publicação de Patente US n° 2010/0233124 e n° 2011/0281316, e Thompson, et al., “Targeting of the BclA and BclB Proteins to the Bacillus anthracis Spore Surface”, Molecular Microbiology, 70(2):421-34 (2008), cuja totalidade é incorporada no presente documento a título de referência). Foi também concluído que a proteína BetA/BAS3290 de Bacillus anthracis foi localizada para o exósporo.
[0068] Em particular, os aminoácidos 20-35 de BclA da cepa Sterne de Bacillus anthracis foram concluídos como sendo suficientes para o endereçamento para o exósporo. Um alinhamento de sequência de aminoácidos 1-41 de BclA (SEQ ID NO: 1) com as regiões de N-terminal correspondentes de várias outras proteínas de exósporo da família de Bacillus cereus e proteínas da família de Bacillus cereus que têm sequências relacionadas é mostrado na Figura 1. Como pode ser visto nas Figuras 1, há uma região de alta homologia dentre todas as proteínas na região que corresponde aos aminoácidos 20-41 de BclA. Entretanto, nessas sequências, os aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 36-41 de BclA contêm estrutura secundária e não são necessários para localização de proteína de fusão para o exósporo. A região de sequência de endereçamento conservada de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1) é mostrada em negrito na Figura 1 e corresponde à sequência de endereçamento mínima necessária para a localização para o exósporo. Uma região mais altamente conservada que abrange os aminoácidos 25-35 de BclA dentro da sequência de endereçamento é sublinhada nas sequências na Figura 1, e é a sequência de reconhecimento para ExsFA/BxpB/ExsFB e homólogos, que direcionam e se parecem com as proteínas descritas na superfície do exósporo. As sequências de aminoácidos dos SEQ ID NOs: 3, 5, e 7 na Figura 1 são aminoácidos 1-33 de BetA/BAS3290 de cepa Sterne de Bacillus anthracis, uma metionina seguida pelos aminoácidos 2-43 de BAS4623 de cepa Sterne de Bacillus anthracis, e aminoácidos 1-34 de BclB de cepa Sterne de Bacillus anthracis, respectivamente. (Para BAS4623, foi concluído que a substituição da valina presente na posição 1 na proteína nativa por uma metionina resultou em melhor expressão.) Como pode ser visto nas Figuras 1, cada uma dessas sequências contém uma região conservada que corresponde aos aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1; mostrado em negrito), e uma região mais altamente conservada que corresponde a aminoácidos 20-35 de BclA (sublinhado).
[0069] Proteínas adicionais de membros da família de Bacillus cereus também contêm a região de endereçamento conservada. Em particular, na Figura 1 ou SEQ ID NO: 9 é aminoácidos 1-30 de BAS1882 de cepa Sterne de Bacillus anthracis, SEQ ID NO: 11 é aminoácidos 1-39 do produto gênico 2280 de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 13 é aminoácidos 1-39 do produto gênico 3572 de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 15 é aminoácidos 1-49 de peptídeo líder de exósporo de VD200 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 17 é aminoácidos 1-33 de peptídeo líder de exósporo de VD166 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 19 é aminoácidos 1-39 de proteína hipotética IKG_04663 de VD200 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 21 é aminoácidos 1-39 de proteína de propulsor ß YVTN de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 23 é aminoácidos 1-30 de proteína hipotética bcerkbab4_2363 de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 25 é aminoácidos 1-30 de proteína hipotética bcerkbab4_2131 de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 27 é aminoácidos 1-36 de colágeno que contém repetição de hélice tripla de KBAB4 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 29 é aminoácidos 1-39 de proteína hipotética bmyco0001_21660 de 2048 de Bacillus mycoides, SEQ ID NO: 31 é aminoácidos 1-30 de proteína hipotética bmyc0001_22540 de 2048 de Bacillus mycoides, SEQ ID NO: 33 é aminoácidos 1-21 de proteína hipotética bmyc0001_21510 de 2048 de Bacillus mycoides, SEQ ID NO: 35 é aminoácidos 1-22 de proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de 35646 de Bacillus thuringiensis, SEQ ID NO: 43 é aminoácidos 1-35 de proteína hipotética WP_69652 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 45 é aminoácidos 141 de líder de exósporo WP016117717 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 47 é aminoácidos 1-49 de peptídeo de exósporo WP002105192 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 49 é aminoácidos 1-38 de proteína hipotética WP87353 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 51 é aminoácidos 1-39 de peptídeo de exósporo 02112369 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 53 é aminoácidos 139 de proteína de exósporo WP016099770 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 55 é aminoácidos 1-36 de proteína hipotética YP006612525 de Bacillus thuringiensis, e SEQ ID NO: 57 é aminoácidos 1-136 de proteína hipotética TIGR03720 de Bacillus mycoides. Como mostrado na Figura 1, cada uma das regiões de N-terminal dessas proteínas contém uma região que é conservada com os aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1), e uma região mais altamente conservada que corresponde aos aminoácidos 25-35 de BclA.
[0070] Qualquer porção de BclA que inclui aminoácidos 20-35 pode ser usada como a sequência de endereçamento. Além disso, as proteínas de exósporo de comprimento completo ou fragmentos de proteína de exósporo podem ser usadas para endereçar as proteínas de fusão para o exósporo. Dessa forma, a BclA de comprimento completo ou um fragmento de BclA que inclui aminoácidos 20-35 pode ser usada para endereçar para o exósporo. Por exemplo, a BclA de comprimento completo (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento de tamanho médio de BclA que carece do carboxi-terminal como SEQ ID NO: 59 (aminoácidos 1-196 de BclA) pode ser usado para endereçar as proteínas de fusão para o exósporo. Os fragmentos de tamanho médio como o fragmento da SEQ ID NO: 59 têm menos estrutura secundária do que a BclA de comprimento completo e foi concluído que os mesmos são adequados para uso como uma sequência de endereçamento. A sequência de endereçamento pode compreender também porções muito mais curtas de BclA que incluem aminoácidos 20-35, como SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-41 de BclA), aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 60 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 20-35 de BclA). Até mesmo fragmentos mais curtos de BclA que incluem apenas alguns dos aminoácidos 20-35 também exibem a capacidade de endereçar proteínas de fusão para o exósporo. Por exemplo, a sequência de endereçamento pode compreender aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1, ou aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1.
[0071] Alternativamente, qualquer porção de BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, o produto gênico 2280 de KBAB4, o produto gênico 3572 de KBAB4, peptídeo líder de exósporo de VD200 de B. cereus, peptídeo líder de exósporo de VD166 de B. cereus, proteína hipotética IKG_04663 de VD200 de B. cereus, proteína de propulsor ß YVTN de KBAB4 de B. weihenstephensis, proteína hipotética bcerkbab4_2363 de KBAB4 de B. weihenstephensis, proteína hipotética bcerkbab4_2131 de KBAB4 de B. weihenstephensis, colágeno que contém repetição de hélice tripla de KBAB4 de B. weihenstephensis, proteína hipotética bmyco0001_21660 de 2048 de B. mycoides, proteína hipotética bmyc0001_22540 de 2048 de B. mycoides, proteína hipotética bmyc0001_21510 de 2048 de B. mycoides, proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de 35646 de B. thuringiensis, proteína hipotética WP_69652 de B. cereus, líder de exósporo WP016117717 de B. cereus, peptídeo de exósporo WP002105192 de B. cereus, proteína hipotética WP87353 de B. cereus, peptídeo de exósporo 02112369 de B. cereus, proteína de exósporo WP016099770 de B. cereus, proteína hipotética YP006612525 de B. thuringiensis, ou proteína hipotética TIGR03720 de B. mycoides, que inclui os aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 20-35 de BclA podem servir como a sequência de endereçamento. Como pode ser visto nas Figuras 1, os aminoácidos 12-27 de BetA/BAS3290, os aminoácidos 23-38 de BAS4623, os aminoácidos 13-28 de BclB, os aminoácidos 9-24 de BAS1882, os aminoácidos 18-33 de produto gênico 2280 de KBAB4, os aminoácidos 18-33 de produto gênico de 3572 de KBAB4, os aminoácidos 28-43 de peptídeo líder de exósporo de VD200 de B. cereus, os aminoácidos 12-27 de peptídeo líder de exósporo de VD166 de B. cereus, os aminoácidos 18-33 de proteína hipotética IKG_04663 de VD200 de B. cereus, os aminoácidos 18-33 de proteína de propulsor ß YVTN de KBAB4 de B. weihenstephensis, os aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bcerkbab4_2363 de KBAB4 de B. weihenstephensis, os aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bcerkbab4_2131 de KBAB4 de B. weihenstephensis, os aminoácidos 15-30 de colágeno que contém repetição de hélice tripla de KBAB4 de B. weihenstephensis, os aminoácidos 18-33 de proteína hipotética bmyco0001_21660 de 2048 de B. mycoides, os aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bmyc0001_22540 de 2048 de B. mycoides, os aminoácidos 1-15 de proteína hipotética bmyc0001_21510 de 2048 de B. mycoides, os aminoácidos 1-16 de proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de 35646 de B. thuringiensis, os aminoácidos 14-29 de proteína hipotética WP_69652 de B. cereus, os aminoácidos 20-35 de líder de exósporo WP016117717 de B. cereus, os aminoácidos 28-43 de peptídeo de exósporo WP002105192 de B. cereus, os aminoácidos 17-32 de proteína hipotética WP87353 de B. cereus, os aminoácidos 18-33 de peptídeo de exósporo 02112369 de B. cereus, os aminoácidos 18-33 de proteína de exósporo WP016099770 de B. cereus, os aminoácidos 15-30 de proteína hipotética YP006612525 de B. thuringiensis e os aminoácidos 115-130 de proteína hipotética TIGR03720 de B. mycoides correspondem aos aminoácidos 20-35 de BclA. Dessa forma, qualquer porção dessas proteínas que inclui os aminoácidos correspondentes listados acima pode servir como a sequência de endereçamento.
[0072] Adicionalmente, qualquer sequência de aminoácidos que compreende os aminoácidos 20-35 de BclA, ou qualquer dos aminoácidos correspondentes listados acima, pode servir como a sequência de endereçamento.
[0073] Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 60, os aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 60. Alternativamente, a sequência de endereçamento pode consistir em aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a proteína de exósporo pode compreender BclA de comprimento completo (SEQ ID NO: 2), ou o fragmento de proteína de exósporo pode compreender um fragmento de tamanho médio de BclA que carece do carboxi- terminal, como SEQ ID NO: 59 (aminoácidos 1-196 de BclA). Alternativamente, o fragmento de proteína de exósporo pode consistir em SEQ ID NO: 59.
[0074] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 3, os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 3, ou a proteína de exósporo pode compreender BetA/BAS3290 de comprimento completo (SEQ ID NO: 4). Foi também concluído que um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12-27 de BetA/BAS3290 pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 61. A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 14-23 da SEQ ID NO: 3, os aminoácidos 14-25 da SEQ ID NO: 3 ou os aminoácidos 12-23 da SEQ ID NO: 3.
[0075] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-38 da SEQ ID NO: 5, os aminoácidos 23-38 da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS4623 de comprimento completo (SEQ ID NO: 6).
[0076] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO: 7, os aminoácidos 13-28 da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7, ou a proteína de exósporo pode compreender BclB de comprimento completo (SEQ ID NO: 8).
[0077] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 9, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 9, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS1882 de comprimento completo (SEQ ID NO: 10). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de BAS1882 também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 69.
[0078] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO:11, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 11, ou a proteína de exósporo pode compreender o produto gênico 2280 de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 12). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18-33 do produto gênico 2280 de KBAB4 de B. weihenstephensis também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 62.
[0079] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 13, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO:13, ou a proteína de exósporo pode compreender o produto gênico de 3572 de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO:14). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 1833 do produto gênico 3572 de KBAB4 de B. weihenstephensis também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 63.
[0080] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 15, os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 15, ou a proteína de exósporo pode compreender peptídeo líder de exósporo de VD200 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 16).
[0081] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-27 da SEQ ID NO: 17, os aminoácidos 12-27 da SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 17, ou a proteína de exósporo pode compreender peptídeo líder de exósporo de VD166 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 18). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 12-27 do peptídeo líder de exósporo de VD166 de B. cereus também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 64.
[0082] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 19, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 19, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética IKG_04663 de VD200 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 20).
[0083] Alternativamente, a sequência de endereçamento compreende os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 21, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 21, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína de propulsor ß YVTN de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 22). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 18-33 da proteína de propulsor ß YVTN de KBAB4 de B. weihenstephensis também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 65.
[0084] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 23, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 23, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética bcerkbab4_2363 de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 24). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bcerkbab4_2363 de KBAB4 de B. weihenstephensis também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 66.
[0085] A sequência de endereçamento compreende os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 25, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 25, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética bcerkbab4_2131 de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 26). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bcerkbab4_2131 de KBAB4 de B. weihenstephensis também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 67.
[0086] Alternativamente, a sequência de endereçamento compreende os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 27, os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 27, ou a proteína de exósporo pode compreender colágeno que contém repetição de hélice tripla de KBAB4 de B. weihenstephensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 28).
[0087] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 29, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 29, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética bmyco0001_21660 de 2048 de B. mycoides de comprimento completo (SEQ ID NO:30).
[0088] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 31, os aminoácidos 9-24 da SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO:31, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética bmyc0001_22540 de 2048 de B. mycoides de comprimento completo (SEQ ID NO:32). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de proteína hipotética bmyc0001_22540 de 2048 de B. mycoides também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 68.
[0089] Alternativamente, a sequência de endereçamento compreende os aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, ou a proteína de exósporo compreende proteína hipotética bmyc0001_21510 de 2048 de B. mycoides de comprimento completo (SEQ ID NO: 34).
[0090] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-16 da SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína de repetição de hélice tripla de colágeno de 35646 de B. thuringiensis de comprimento completo (SEQ ID NO:36).
[0091] A sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-29 da SEQ ID NO: 43, os aminoácidos 14-29 da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 43, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética WP_69652 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 44).
[0092] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 45, os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 45, ou a proteína de exósporo pode compreender líder de exósporo WP016117717 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 46). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 2035 de líder de exósporo WP016117717 de B. cereus também pode ser usado como uma sequência de endereçamento. Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender SEQ ID NO: 70.
[0093] A sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-43 da SEQ ID NO: 47, os aminoácidos 28-43 da SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 47, ou a proteína de exósporo pode compreender peptídeo de exósporo WP002105192 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 48).
[0094] A sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO: 49, os aminoácidos 17-32 da SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 49, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética WP87353 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 50).
[0095] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 51, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 51, ou a proteína de exósporo pode compreender peptídeo de exósporo 02112369 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 52).
[0096] A sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-33 da SEQ ID NO: 53, os aminoácidos 18-33 da SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 53, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína de exósporo WP016099770 de B. cereus de comprimento completo (SEQ ID NO: 54).
[0097] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender os aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 55, os aminoácidos 15-30 da SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 55, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética YP006612525 de B. thuringiensis de comprimento completo (SEQ ID NO: 56).
[0098] A sequência de endereçamento pode compreender também os aminoácidos 1-130 da SEQ ID NO: 57, os aminoácidos 115-130 da SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 57, ou a proteína de exósporo pode compreender proteína hipotética TIGR03720 de B. mycoides de comprimento completo (SEQ ID NO: 58).
[0099] Além disso, pode ser prontamente visto a partir do alinhamento de sequência na Figura 1 que embora os aminoácidos 20-35 de BclA sejam conservados e os aminoácidos 25-35 sejam mais conservados, algum grau de variação pode ocorrer nessa região sem afetar a capacidade da sequência de endereçamento para endereçar uma proteína para o exósporo. A Figura 1 lista o percentual de identidade de cada um dos aminoácidos correspondentes de cada sequência para os aminoácidos 20-35 de BclA (“20-35 % de identidade”) e para os aminoácidos 25-35 de BclA (“25-35 % de identidade”). Dessa forma, por exemplo, em comparação com os aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 81,3 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 50,0 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 43,8 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 62,5 % idênticos, os aminoácidos correspondentes do produto gênico 2280 de KBAB4 são cerca de 81,3 % idênticos e os aminoácidos correspondentes do produto gênico de 3572 de KBAB4 são cerca de 81,3 % idênticos. As identidades de sequência por essa região para as sequências remanescentes são listadas na Figura 1.
[00100] Em relação aos aminoácidos 25-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 90,9 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 72,7 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 54,5 % idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 72,7 % idênticos, os aminoácidos correspondentes do produto gênico 2280 de KBAB4 são cerca de 90,9 % idênticos e os aminoácidos correspondentes do produto gênico de 3572 de KBAB4 são cerca de 81,8 % idênticos. As identidades de sequência por essa região para as sequências remanescentes são listadas na Figura 1.
[00101] Dessa forma, a sequência de endereçamento pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 43 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 54 %.
[00102] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 63 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 50 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 63 %.
[00103] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 72 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 50 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 72 %.
[00104] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 56 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 63 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 56 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 63 %.
[00105] Alternativamente, a sequência de endereçamento pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 62 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 2535 é pelo menos de cerca de 72 %. A sequência de endereçamento também pode consistir em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 62 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 2535 da SEQ ID NO:1 é pelo menos de cerca de 72 %.
[00106] A sequência de endereçamento pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 68 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 81 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos 68 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 81 %.
[00107] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 75 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 72 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 75 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é pelo menos de cerca de 72 %.
[00108] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 75 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 81 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 75 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é pelo menos de cerca de 81 %.
[00109] A sequência de endereçamento pode compreender também uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 81 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 81 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 81 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 81 %.
[00110] A sequência de endereçamento pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 81 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 90 %. Alternativamente, a sequência de endereçamento consiste em uma sequência de aminoácidos que consiste em 16 aminoácidos e que tem pelo menos cerca de 81 % de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com os aminoácidos 25-35 é pelo menos de cerca de 90 %.
[00111] O elemento versado na técnica reconhecerá que as variantes das sequências acima também podem ser usadas como sequências de endereçamento, desde que a sequência de endereçamento compreenda aminoácidos 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, o produto gênico 2280 de KBAB4, ou o produto gênico 3572 de KBAB ou uma sequência que compreende qualquer uma das identidades de sequência mencionadas acima com os aminoácidos 20-35 e 25-35 de BclA esteja presente.
[00112] Foi adicionalmente concluído que certas proteínas de exósporo da família de Bacillus cereus que carecem de regiões que têm homologia aos aminoácidos 25-35 de BclA também podem ser usadas para endereçar um peptídeo ou proteína para o exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Em particular, as proteínas de fusão podem compreender uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 71 (InhA de B. mycoides), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 72 (BAS1141 (ExsY) de Sterne de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 73 (BAS1144 (BxpB/ExsFA) de Sterne de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 74 (BAS1145 (CotY)de Sterne de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 75 (BAS1140 de Sterne de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 76 (ExsFB de H9401 de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 77 (InhA1 de HD74 de B. thuringiensis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 78 (ExsJ de 10876 de ATCC de B. cereus), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 79 (ExsH de B. cereus), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 80 (YjcA de Ames de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 81 (YjcB de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 82 (BclC de Sterne de B. anthracis), uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 83 (fosfatase ácida de cepa serovar konkukian 97-27 de Bacillus thuringiensis), ou uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 84 (InhA2 de HD74 de B. thuringiensis). A inclusão de uma proteína de exósporo que compreende SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ou 84 nas proteínas de fusão descritas no presente documento resultará no endereçamento para o exósporo de um membro da família de B. cereus.
[00113] Além disso, as proteínas de exósporo que têm um alto grau de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas de exósporo de comprimento completo ou os fragmentos de proteína de exósporo descritos acima podem também ser usadas para endereçar um peptídeo ou proteína para o exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Dessa forma, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exósporo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85 % de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exósporo que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84.
[00114] Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85 % de identidade com SEQ ID NO: 59. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade com SEQ ID NO: 59.
[00115] Em qualquer uma das sequências de endereçamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteína de exósporo descritos no presente documento, a sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo pode compreender a sequência de aminoácidos GXT em seu terminal carboxi, em que X é qualquer aminoácido.
[00116] Em qualquer uma das sequências de endereçamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteína de exósporo descritos no presente documento, a sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo pode compreender um resíduo de alanina na posição da sequência de endereçamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.
[00117] Proteínas de Fusão
[00118] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal. A proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal pode compreender um hormônio de peptídeo, um peptídeo de não hormônio, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano. A sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo pode ser qualquer um dentre sequências de endereçamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteína de exósporo descritos acima.
[00119] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo pode ser qualquer um dentre sequências de endereçamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteína de exósporo descritos acima.
[00120] A proteína de fusão pode ser feita com o uso de métodos de biologia molecular e clonagem padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal) pode ser amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e ligado à codificação de DNA para qualquer uma das sequências de endereçamento descritas acima para formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. O vetor compreende adequadamente um sítio de múltipla clonagem no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibiótico, de modo que as bactérias transformadas, transfectadas ou casadas com o vetor possam ser prontamente identificadas e isoladas. Onde o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo também compreende adequadamente uma origem de replicação. O DNA que codifica a proteína de fusão está adequadamente sob o controle de um promotor de esporulação que ocasionará a expressão da proteína de fusão no exósporo de um endósporo do membro da família B. cereus (por exemplo, um promotor de bclA nativo de um membro da família de B. cereus). Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado no DNA cromossômico do hospedeiro do membro da família B. cereus.
[00121] A proteína de fusão pode compreender também sequências de polipeptídeos adicionais que não são parte da sequência de endereçamento, da proteína de exósporo, do fragmento de proteína de exósporo, ou da proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal, da proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, da proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta, ou da proteína ou peptídeo que se liga à planta. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir identificadores ou marcadores para facilitar a purificação ou a visualização da proteína de fusão (por exemplo, um identificador de poli-histidina ou uma proteína fluorescente como GFP ou YFP) ou a visualização de esporos de células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam a proteína de fusão.
[00122] A expressão de proteínas de fusão no exósporo com o uso das sequências de endereçamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteína de exósporo descritos no presente documento é acentuada devido a uma carência de estrutura secundária nos amino-terminais dessas sequências, o que permite a flexão nativa das proteínas fundidas e a retenção de atividade. A flexão pode ser adicionalmente acentuada pela inclusão de um ligante de aminoácido curto entre a sequência de endereçamento, a proteína de exósporo, o fragmento de proteína de exósporo e a proteína parceira de fusão.
[00123] Dessa forma, qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode compreender um ligante de aminoácido entre a sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo e a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta, ou a proteína ou peptídeo que se liga à planta.
[00124] O ligante pode compreender um ligante de polialanina ou um ligante de poliglicina. Um ligante que compreende uma mistura tanto de resíduos de alanina quanto de resíduos de glicina também pode ser usado. Por exemplo, onde a sequência de endereçamento compreender SEQ ID NO: 1, uma proteína de fusão pode ter uma das seguintes estruturas:
[00125] Nenhum ligante: SEQ ID NO: 1 - proteína parceira de fusão
[00126] Ligante de Alanina: SEQ ID NO: 1-An-Proteína Parceira de Fusão
[00127] Ligante de Glicina: SEQ ID NO: 1-Gn-Proteína Parceira de Fusão
[00128] Ligante de Alanina e Glicina Misturado: SEQ ID NO: 1 - (A/G)n - Proteína Parceira de Fusão
[00129] onde An, Gn e (A/G)n são qualquer número de alaninas, qualquer número de glicinas ou qualquer número de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente. Por exemplo, n pode ser 1 a 25, e é, de preferência, 6 a 10. Onde o ligante compreender uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. Nas estruturas acima, “proteína parceira de fusão” representa a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo que se liga à planta.
[00130] Alternativa ou adicionalmente, o ligante pode compreender um sítio de reconhecimento de protease. A inclusão de um sítio de reconhecimento de protease permite a remoção endereçada, mediante exposição a uma protease que reconhece o sítio de reconhecimento de protease, da proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal, da proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, da proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta ou da proteína ou peptídeo que se liga à planta.
[00131] Proteínas e Peptídeos Estimulantes de Crescimento Vegetal
[00132] Como observado acima, as proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal. Por exemplo, a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal pode compreender um hormônio de peptídeo, um peptídeo de não hormônio, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano.
[00133] Por exemplo, onde a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreender um hormônio de peptídeo, o hormônio de peptídeo pode compreender uma fitossulfoquina (por exemplo, fitossulfoquina-a), clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF ou um SCR/SP11.
[00134] Onde a proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal compreender um peptídeo de não hormônio, o peptídeo de não hormônio pode compreender um RKN 16D10, Hg-Syv46, um eNOD40 peptídeo, melitina, mastoparano, Mas7, RHPP, POLARIS ou inibidor de tripsina Kunitz (KTI).
[00135] A proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal pode compreender uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal. A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal pode ser qualquer enzima que catalisa qualquer etapa em uma via de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura da planta, ou qualquer enzima que catalisa a conversão de um derivado inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto.
[00136] O composto estimulante de crescimento vegetal pode compreender um composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera, por exemplo, 2,3-butanodiol.
[00137] Alternativamente, o composto estimulante de crescimento vegetal pode compreender um hormônio de crescimento vegetal, por exemplo, uma citoquinina ou um derivado de citoquinina, etileno, uma auxina ou um derivado de auxina, um ácido giberélico ou um derivado de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivado de ácido abscísico, ou um ácido jasmônico ou um derivado de ácido jasmônico.
[00138] Onde o composto estimulante de crescimento vegetal compreende uma citoquinina ou um derivado de citoquinina, a citoquinina ou o derivado de citoquinina pode compreender quinetina, cis-zeatina, trans-zeatina, 6- benzilaminopurina, di-hidroxizeatina, N6-(D2-isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2- metiltio-cis-ribosilzeatina, cis-ribosilzeatina, trans- ribosilzeatina, 2-metiltio-trans-ribosilzeatina, ribosilzeatin-5-monosfosfato, N6-metilaminopurina, N6- dimetilaminopurina, 2’-desoxizeatina ribosídeo, 4-hidroxi- 3-metil-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta- topolina, benziladenina, orto-metiltopolina, meta- metiltopolina ou uma combinação dos mesmos.
[00139] Onde o composto estimulante de crescimento vegetal compreende uma auxina ou um derivado de auxina, a auxina ou o derivado de auxina pode compreender uma auxina ativa, uma auxina inativa, uma auxina conjugada, uma auxina de ocorrência natural ou uma auxina sintética, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a auxina ou derivado de auxina pode compreender ácido indol-3-acético, ácido indol- 3- pirúvico, indol-3-acetaldoxima, indol-3-acetamida, indol-3-acetonitrila, indol-3-etanol, indol-3-piruvato, indol-3-acetaldoxima, ácido indol-3-butírico, um ácido fenilacético, ácido 4- cloroindol-3-acético, uma auxina conjugada com glicose, ou uma combinação dos mesmos.
[00140] A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal pode compreender uma acetoína redutase, uma indol-3-acetamida hidrolase, uma triptofano mono-oxigenase, uma acetolactato sintetase, uma a-acetolactato descarboxilase, uma piruvato descarboxilase, uma diacetil redutase, uma butanodiol desidrogenase, uma aminotransferase (por exemplo, triptofano aminotransferase), uma triptofano descarboxilase, uma amina oxidase, uma indol-3- piruvato descarboxilase, uma indol-3-acetaldeído desidrogenase, uma triptofano oxidase de cadeia lateral, uma nitrila hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma adenosina fosfato isopenteniltransferase, uma fosfatase, uma adenosina quinase, uma adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, uma 5’ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma zeatina cis trans isomerase, uma zeatina O-glicosiltransferase, uma ß- glicosidase, uma cis-hidroxilase, uma CK cis-hidroxilase, uma CK N-glicosiltransferase, uma 2,5-ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina nucleosídeo fosforilase, uma zeatina redutase, uma hidroxilamina redutase, uma 2-oxoglutarato disoxigenase, uma hidrolase 2B/3B giberélica, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, um quitosinase, uma quitinase, uma ß-1,3-glucanase, uma ß-1,4-glucanase, uma ß-1,6- glucanase, uma ácido aminociclopropano-1-carboxílico desaminase, ou uma enzima envolvida na produção de um fator nod (por exemplo, nodA, nodB ou nodI).
[00141] Onde a enzima compreende uma protease ou peptidase, a protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas, ou pré-pró-proteínas para criar um peptídeo bioativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica.
[00142] Os exemplos de peptídeos bioativos incluem RKN 16D10 e RHPP.
[00143] A protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas ou pré-pró-proteínas para criar um peptídeo bioativo pode compreender subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaína, pepsina, tripsina, pronase, uma carboxilase, uma protease de serina, uma protease glutâmica, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, uma protease de treonina ou um metaloprotease.
[00144] A protease ou peptidase pode clivar proteínas em uma refeição rica em proteína (por exemplo, refeição de fava de soja ou extrato de levedura).
[00145] A proteína estimulante de crescimento vegetal pode compreender também uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano. Tais enzimas incluem celulases, lipases, lignina oxidases, proteases, glicosídeo hidrolases, fosfatases, nitrogenases, nucleases, amidases, nitrato redutases, nitrito redutases, amilases, amônia oxidases, ligninases, glicosidases, fosfolipases, fitases, pectinases, glucanases, sulfatases, ureases, xilanases e sideróforos. Quando introduzidas em um meio de crescimento vegetal ou aplicadas a uma planta, a semente ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, as proteínas de fusão que compreendem enzimas que degradam ou modificam uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano podem auxiliar no processamento de nutrientes na proximidade da planta e resultam em absorção acentuada de nutrientes pela planta ou por bactérias ou fungos benéficos na proximidade da planta.
[00146] As celulases adequadas incluem endocelulases (por exemplo, uma endogluconase como uma endoglucanase de Bacillus subtilis, uma endoglucanase de Bacillus thuringiensis, uma endoglucanase de Bacillus cereus ou uma endoglucanase de Bacillus clausii), exocelulases (por exemplo, uma exocelulase de Trichoderma reesei) e ß-glicosidases (por exemplo, uma ß-glicosidase de Bacillus subtilis, uma ß-glicosidase de Bacillus thuringiensis, uma ß-glicosidase de Bacillus cereus ou uma ß-glicosidase de Bacillus clausii).
[00147] A lipase pode compreender uma lipase de Bacillus subtilis, uma lipase de Bacillus thuringiensis, uma lipase de Bacillus cereus ou uma lipase de Bacillus clausii.
[00148] Em uma modalidade, a lipase compreende uma lipase de Bacillus subtilis. A lipase de Bacillus subtilis pode ser amplificada por PCR com o uso dos seguintes iniciadores: ggatccatggctgaacacaatcc (direto, SEQ ID NO: 37) e ggatccttaattcgtattctggcc (reverso, SEQ ID NO: 38).
[00149] Em uma outra modalidade, a celulase é uma endoglucanase de Bacillus subtilis. A endoglucanase de Bacillus subtilis pode ser amplificada por PCR com o uso dos seguintes iniciadores: ggatccatgaaacggtcaatc (direto, SEQ ID NO: 39) e ggatccttactaatttggttctgt (reverso, SEQ ID NO: 40).
[00150] Ainda em uma outra modalidade, a proteína de fusão compreende uma protease PtrB de E. coli. A protease PtrB de E. coli pode ser amplificada por PCR com o uso dos seguintes iniciadores: ggatccatgctaccaaaagcc (direto, SEQ ID NO: 41) e ggatccttagtccgcaggcgtagc (reverso, SEQ ID NO: 42).
[00151] Em certas modalidades, a proteína de fusão contém uma endoglucanase que deriva da sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO: 104.
[00152] A sequência de aminoácidos para uma endoglucanase exemplificativa que pode ser fundida à sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e, opcionalmente, uma sequência de ligantes, como um ligante poli-A, é a proteína de fusão proporcionada como SEQ ID NO: 107.
[00153] Em outras modalidades, a proteína de fusão contém uma fosfolipase que deriva da sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 105.
[00154] A sequência de aminoácidos para uma fosfolipase exemplificativa que pode ser fundida à sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e, opcionalmente, uma sequência de ligantes, como um ligante poli-A, é a proteína de fusão proporcionada como SEQ ID NO: 108.
[00155] Ainda em outras modalidades, a proteína de fusão contém uma quitosanase que deriva da sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 106. A sequência de aminoácidos para uma quitosanase exemplificativa que pode ser fundida à sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e, opcionalmente, uma sequência de ligantes, como um ligante poli-A, é a proteína de fusão proporcionada como SEQ ID NO: 109.
[00156] Para criar construtos de fusão, os genes podem ser fundidos ao promotor de bclA nativo de DNA de Bacillus thuringiensis que codifica os primeiros 35 aminoácidos de BclA (aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1) com o uso de emenda por técnica de extensão por sobreposição (SOE). Os amplicons corretos são clonados formando o vetor bifuncional pHP13 de E. coli/Bacillus, e os clones corretos triados pelo sequenciamento de DNA. Os clones corretos são eletroporados formando (Cry-, plasmídeo-) de Bacillus thuringiensis e triados em relação à resistência a cloranfenicol. Os transformantes corretos são desenvolvidos em caldo de infusão de cérebro-coração de um dia para o outro a 30 °C, plaqueados sobre placas de ágar de nutrientes e incubados a 30 °C por 3 dias. Os esporos que expressam o construto de fusão (esporos BEMD) podem ser coletados das placas pela lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e purificados por centrifugação e lavagens adicionais em PBS.
[00157] Em tais proteínas de fusão, a endoglucanase, a fosfolipase ou a quitosinase pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85 % de identidade com SEQ ID NO: 107, 108 ou 109, respectivamente.
[00158] Em tais proteínas de fusão, a endoglucanase, a fosfolipase ou a quitosinase pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 107, 108 ou 109, respectivamente.
[00159] Em tais proteínas de fusão, a endoglucanase, a fosfolipase ou a quitosinase pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 % de identidade com SEQ ID NO: 107, 108 ou 109, respectivamente.
[00160] Em tais proteínas de fusão, a endoglucanase, a fosfolipase ou a quitosinase pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 98 % de identidade com SEQ ID NO: 107, 108 ou 109, respectivamente.
[00161] Em tais proteínas de fusão, a endoglucanase, a fosfolipase ou a quitosinase pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 99 % de identidade com SEQ ID NO: 107, 108 ou 109, respectivamente.
[00162] As lignina oxidases adequadas compreendem lignina peroxidases, lacases, glioxal oxidases, ligninases e manganês peroxidases.
[00163] A protease pode compreender uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma protease de serina, uma protease glutâmica, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, uma protease de treonina ou uma metaloprotease.
[00164] A fosfatase pode compreender uma monoéster fosfórico hidrolase, uma fosfomonoesterase (por exemplo, PhoA4), uma diéster fosfórico hidrolase, uma fosfodiesterase, uma monoéster trifosfórico hidrolase, uma anidrido de fosforila hidrolase, uma pirofosfatase, uma fitase (por exemplo, fitase de EE148 de Bacillus subtilis ou fitase de Bacillus thuringiensis BT013A), uma trimetafosfatase ou uma trifosfatase.
[00165] A nitrogenase pode compreender uma nitrogenase da família Nif (por exemplo, NifBDEHKNXV de PaeniBacillus massiliensis).
[00166] Proteínas e Peptídeos que Protegem Plantas contra Patógenos
[00167] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno.
[00168] A proteína ou peptídeo pode compreender uma proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imunológica da planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imunológica da planta pode compreender uma proteína ou peptídeo acentuadora de sistema imunológico de planta. A proteína ou peptídeo acentuadora de sistema imunológico da planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que tem um efeito benéfico no sistema imunológico de uma planta. As proteínas e peptídeos acentuadoras de sistema imunológico da planta incluem grampos, a-elastina, ß-elastina, sisteminas, fenilalanina amônia-liase, elicitina, defensina, criptogeína, proteínas de flagelina e peptídeos de flagelina (por exemplo, flg22).
[00169] Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno pode ser uma proteína ou peptídeo que tem atividade antibacteriana, atividade antifúngica ou tanto atividade antibacteriana quando antifúngica. Os exemplos de tais proteínas e peptídeos incluem bacteriocinas, lisozimas, peptídeos lisozima (por exemplo, LysM), sideróforos, peptídeos ativos não ribossômicos, conalbuminas, albuminas, lactoferrinas, peptídeos de lactoferrina (por exemplo, LfcinB), TasA e estreptavidina.
[00170] A proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno também pode ser uma proteína ou peptídeo que tem atividade inseticida, atividade helminticida, suprimir predação de inseto ou verme, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno pode compreender uma toxina bacteriana inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida VIP), uma endotoxina, uma toxina Cry (por exemplo, uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis), uma proteína ou peptídeo inibidora de protease (por exemplo, um inibidor de tripsina ou um inibidor de protease de erva frecha), uma protease de cisteína ou uma quitinase. Onde a toxina Cry é uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis, a toxina Cry pode ser uma proteína Cry5B ou uma proteína Cry21A. A Cry5B e a Cry21A têm tanto atividade inseticida quanto nematicida.
[00171] A proteína que protege uma planta contra um patógeno pode compreender uma enzima. As enzimas adequadas incluem proteases e lactonases. As proteases e lactonases podem ser específicas para uma molécula de sinalização bacteriana (por exemplo, uma molécula de sinalização de homoserina de lactona bacteriana).
[00172] Onde a enzima for uma lactonase, a lactonase pode compreender 1,4-lactonase, 2- pirona-4,6-dicarboxilato lactonase, 3-oxoadipato enol-lactonase, actinomicina lactonase, desoxilimonato A-anel-lactonase, gluconolactonase L-ramono-1,4-lactonase, limonina-D-anel- lactonase, esteroide-lactonase, triacetato-lactonase ou xilono-1,4-lactonase.
[00173] A enzima também pode ser uma enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo. Por exemplo, a enzima pode compreender uma ß-1,3- glucanase, uma ß-1,4-glucanase, uma ß-1,6-glucanase, uma quitosinase, uma quitinase, uma enzima do tipo quitosinase, uma liticase, uma peptidase, uma proteinase, uma protease (por exemplo, uma protease alcalina, uma protease ácida ou uma protease neutra), uma mutanolisina, uma estafolisina ou uma lisozima.
[00174] Proteínas e Peptídeos que Acentuam a Resistência a Estresse em Plantas
[00175] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e pelo menos uma proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta.
[00176] Por exemplo, a proteína ou peptídeo que acentua resistência a estresse em uma planta compreende uma enzima que degrada um composto relacionado ao estresse. Os compostos relacionados ao estresse incluem, mas não são limitados a ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. As espécies reativas de oxigênio específicas incluem hidroxila, peróxido de hidrogênio, oxigênio e superóxido. A enzima que degrada um composto relacionado ao estresse pode compreender uma superóxido dismutase, uma oxidase, uma catalase, uma ácido aminociclopropano-1- carboxílico desaminase, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.
[00177] A proteína ou peptídeo que acentua a resistência a estresse em uma planta pode compreender também uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um estresse ambiental. O estresse ambiental pode compreender, por exemplo, aridez, inundação, calor, congelamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um estresse ambiental pode compreender uma proteína de nucleação em gelo, uma prolinase, uma fenilalanina amônia liase, uma isocorismato sintase, uma isocorismato piruvato liase ou uma colina desidrogenase.
[00178] Proteínas e Peptídeos que se Ligam à Planta
[00179] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de endereçamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo e pelo menos uma proteína ou peptídeo que se liga à planta. A proteína ou peptídeo que se liga à planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que tem capacidade de se ligar específica ou não especificamente a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz da planta ou uma porção aérea de uma planta como uma folha, tronco, flor ou fruto) ou à matéria vegetal. Dessa forma, por exemplo, a proteína ou peptídeo que se liga à planta pode ser uma proteína ou peptídeo que se liga à raiz ou uma proteína ou peptídeo que se liga à folha.
[00180] As proteínas e peptídeos que se ligam à planta adequadas incluem adesinas (por exemplo, ricadesina), flagelinas, omptinas, lectinas, expansinas, proteínas estruturais de biofilme (por exemplo, TasA ou YuaB), proteínas pilus, proteínas curlus, intiminas, invasinas, aglutininas e proteínas afimbriais.
[00181] Células Recombinantes de Bacillus que Expressam as Proteínas de Fusão
[00182] As proteínas de fusão descritas no presente documento podem ser expressas por células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo. A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão discutidas acima.
[00183] As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem coexpressar duas ou mais de qualquer uma das proteínas de fusão discutidas acima. Por exemplo, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação à planta, junto com pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal, pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que acentua resistência a estresse em uma planta.
[00184] As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem compreender Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem compreender Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudomycoides ou Bacillus mycoides. Em particular, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem compreender Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.
[00185] Para gerar as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão, qualquer membro da família de Bacillus cereus pode ser conjugado, transduzido ou transformado com um vetor que codifica a proteína de fusão com o uso de métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação). As bactérias podem, então, ser triadas para identificar transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor incluir um gene de resistência a antibiótico, as bactérias podem ser triadas em relação à resistência a antibióticos. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado no DNA cromossômico de um hospedeiro do membro da família B. cereus. As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem, então, ser expostas a condições que induzirão a esporulação. As condições adequadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem ser plaqueadas sobre placas de ágar, e incubadas a uma temperatura de cerca de 30 °C por vários dias (por exemplo, 3 dias).
[00186] As cepas inativadas, as cepas não tóxicas ou as cepas geneticamente manipuladas de qualquer uma das espécies acima também podem ser adequadamente usadas. Por exemplo, um Bacillus thuringiensis que carece da toxina Cry pode ser usado. Alternativa ou adicionalmente, uma vez que os esporos da família B. cereus recombinante que expressam a proteína de fusão foram gerados, os mesmos podem ser inativados para impedir germinação adicional estando em uso. Qualquer método para inativar os esporos bacterianos que é conhecido na técnica pode ser usado. Os métodos adequados incluem, sem limitação, termotratamento, irradiação gama, irradiação de raios X, irradiação de UV-A, irradiação de UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante, ou qualquer combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, os esporos derivados de cepas não toxigênicas ou cepas genética ou fisicamente inativadas podem ser usados.
[00187] Células Recombinantes de Bacillus que Produzem Exósporo que têm Efeitos de Promoção de Crescimento Vegetal e/ou Outros Atributos Benéficos
[00188] Muitas cepas do membro da família de Bacillus cereus têm atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas cepas têm efeitos de promoção de crescimento vegetal. Qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode ser expressa em tais cepas.
[00189] Por exemplo, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal de bactérias.
[00190] A cepa de promoção de crescimento vegetal de bactérias pode compreender uma cepa de bactérias que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto fungicida (por exemplo, uma ß-1,3-glucanase, uma quitosinase, uma liticase, ou uma combinação dos mesmos), produz um composto nematicida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, se liga a raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biofilmes, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.
[00191] Por exemplo, onde as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo compreenderem uma cepa de promoção de crescimento vegetal de bactérias, a cepa de promoção de crescimento vegetal de bactérias pode compreender Bacillus mycoides BT155 (n° de NRRL B-50921), Bacillus mycoides EE118 (n° de NRRL B-50918), Bacillus mycoides EE141 (n° de NRRL B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (n° de NRRL B-50922), membro da família de Bacillus cereus EE128 (n° de NRRL B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (n° de NRRL B-50924), ou membro da família de Bacillus cereus EE349 (n° de NRRL B-50928). O Bacillus thuringiensis BT013A é também conhecido como 4Q7 de Bacillus thuringiensis. Cada uma dessas cepas foi depositada com o Agricultural Research Service (ARS) do United States Department of Agriculture (USDA), que tem o endereço de 1815 North University Street, Peoria, Illinois, EUA 61604, EUA, em 10 de março de 2014, e é identificada pelo número de depósito de NRRL proporcionado entre parênteses.
[00192] Essas cepas de promoção de crescimento vegetal foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas e foram identificadas por suas sequências de rRNA 16S, e através de ensaios bioquímicos. As cepas foram identificadas pelo menos para sua designação de gênero por meio de indicadores morfológicos e bioquímica convencionais. Os ensaios bioquímicos para cepas gram positivas confirmadas como Bacillus incluíram crescimento em meio de PEA e ágar de nutriente, exame microscópico, crescimento em meio de NaCl a 5 % e 7,5 %, crescimento com pH 5 e pH 9, crescimento a 42 °C e 50 °C, a capacidade de produzir ácido mediante fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sacarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente; hidrólise de gelatina; redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase, produção de urease e mobilidade.
[00193] Por exemplo, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que compreendem uma cepa de promoção de crescimento vegetal de bactérias podem compreender Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 ou Bacillus thuringiensis BT013A. As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem expressar qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento, por exemplo, uma proteína de fusão que compreende a sequência de endereçamento da SEQ ID NO: 60 e um peptídeo de não hormônio (por exemplo, inibidor de tripsina Kunitz (KTI)), uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal (por exemplo, uma quitosinase), uma proteína ou peptídeo de ligação à planta (por exemplo, TasA); uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno (por exemplo, TasA) ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano (por exemplo, uma fosfatase como PhoA ou fitase, ou uma endoglucanase).
[00194] Promotores
[00195] Em qualquer uma das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo descritas no presente documento, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que é nativo para a sequência de endereçamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo da proteína de fusão. Por exemplo, onde a proteína de fusão compreender uma sequência de endereçamento derivada de BclA de Sterne de B. anthracis (por exemplo, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 60) ou onde a proteína de fusão compreender BclA de comprimento completo (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento de BclA de comprimento completo (por exemplo, SEQ ID NO: 59), a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que está normalmente associado ao gene BclA no genoma de Sterne de B. anthracis (por exemplo, o promotor da SEQ ID NO: 85).
[00196] Alternativamente, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. Em alguns casos, o promotor que é nativo em relação à sequência de endereçamento, à proteína de exósporo ou ao fragmento de proteína de exósporo será um promotor de esporulação de alta expressão. Em outros casos, o promotor que é nativo em relação à sequência de endereçamento, à proteína de exósporo ou ao fragmento de proteína de exósporo não será um promotor de esporulação de alta expressão. Nos últimos casos, pode ser vantajoso substituir o promotor nativo por um promotor de esporulação de alta expressão. A expressão da proteína de fusão sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão fornece para expressão aumentada da proteína de fusão no exósporo do membro da família de Bacillus cereus.
[00197] O promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma ou mais sequências de promotor de polimerase específicas de esporulação de sigma-K.
[00198] Os promotores de esporulação de alta expressão adequados para uso na expressão das proteínas de fusão em um membro da família de Bacillus cereus incluem aqueles listados na Tabela 2 abaixo: Tabela 2. Sequências de Promotor
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[00199] Nas sequências de promotor listadas na Tabela 2 acima, as localizações das sequências de promotor de polimerase específicas de esporulação de sigma-K são indicadas em texto em negrito e sublinhado. O promotor Cry1A (HD-73 de B. thuringiensis; SEQ ID NO: 90) tem um total de quatro sequências de sigma-K, duas das quais se sobrepõem, como indicado pelo sublinhado duplo na Tabela 2.
[00200] Os promotores de esporulação de alta expressão preferenciais para uso na expressão das proteínas de fusão em um membro da família de Bacillus cereus incluem o promotor BetA (Sterne de B. anthracis; SEQ ID NO: 86), o promotor BclA (Sterne de B. anthracis; SEQ ID NO: 85), os promotores de operons de glicosil transferase de agrupamento de BclA 1 e 2 (Sterne de B. anthracis; SEQ ID NOs: 101 e 102), e o promotor de proteína de propulsor ß YVTN (KBAB 4 de B. weihenstephensis; SEQ ID NO: 89).
[00201] Em qualquer uma das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo descritas no presente documento, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade com uma sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 85-103.
[00202] Quando o promotor de esporulação compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade com uma sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 85-103, a sequência ou sequências de promotor de polimerase específica de esporulação de sigma-K de têm, de preferência, 100 % de identidade com os nucleotídeos correspondentes da SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 ou 103. Por exemplo, como ilustrado na Tabela 2 acima, o promotor BclA de Sterne de B. anthracis (SEQ ID NO: 85) tem sequências de promotor de polimerase específicas de esporulação de sigma- K nos nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137. Dessa forma, se o promotor de esporulação compreender uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 85, é preferencial que os nucleotídeos do promotor de esporulação que correspondem aos nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID NO: 85 tenham 100 % de identidade com os nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID NO: 85.
[00203] Em qualquer dos métodos descritos no presente documento para estimular o crescimento vegetal, as plantas desenvolvidas no meio de crescimento vegetal que compreende as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e pelo menos um inseticida selecionado a partir dos inseticidas particulares revelados no presente documento exibem crescimento aumentado em comparação com o crescimento de plantas no meio de crescimento vegetal idêntico que não contém as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo.
[00204] Em qualquer uma das composições e métodos descritos no presente documento para estimular o crescimento vegetal, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo podem compreender qualquer uma das cepas recombinantes de promoção de crescimento vegetal de bactérias descritas acima.
[00205] Em qualquer uma das composições ou métodos para estimular o crescimento vegetal revelado no presente documento, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de qualquer dos promotores descritos acima.
[00206] Inseticidas
[00207] “Inseticidas” bem como o termo “inseticida” se referem à capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de insetos. Como usado no presente documento, o termo “insetos” inclui todos os organismos na classe “Insecta”. O termo insetos “pré-adultos” se refere a qualquer forma de um organismo antes do estágio adulto, incluindo, por exemplo, ovos, larvas, e ninfas. Como usado no presente documento, os termos “inseticidas” e “inseticida” também abrangem “nematicidas” e “nematicida” e “acaricidas” e “acaricida.”
[00208] “Nematicidas” e “nematicida” se referem à capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de nematódeos. Em geral, o termo “nematódeo” compreende ovos, larvas, formas juvenis e maduras do dito organismo.
[00209] “Acaricida” e “acaricida” se refere à capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de ectoparasitas que pertencem à classe Arachnida, subclasse Acari.
[00210] Os ingredientes ativos especificados no presente documento pelo seu “nome comum” são conhecidos e descritos, por exemplo, no livro de texto sobre pesticidas (“The Pesticide Manual”, 16a Ed., British Crop Protection Council 2012) ou podem ser encontrados na Internet (por exemplo, http://www.alanwood.net/pesticides).
[00211] Em algumas modalidades, o inseticida é selecionado a partir do grupo que consiste em acetamiprida, aldicarbe, amitraz, beta-ciflutrina, carbarila, clotianidina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina, endossulfan, etion, etiprol, etoprofós, fenamifós, fenobucarb, fentiona, fipronil, flubendiamida, fluopiram, flupiradifurona, formetanato, heptanofós, imidacloprida, metamidofós, metiocarbe, metomila, niclosamida, oxidemeton- metila, fosalona, silafluofeno, espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate, tiacloprida, tiodicarbe, tralometrina, triazofós, triflumuron, vamidotion, 1-{2- fluoro-4-metil-5- [(R)-(2,2,2-trifluoroetil)sulfinil]fenil}- 3-(trifluorometil)-1H-1,2,4-triazol-5-amina, 1-(3- cloropiridin-2-il)-N- [4-ciano-2-metil-6- (metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5-(trifluorometil)-2H-tetrazol- 2-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida e misturas de terpeno pesticida que compreendem os três terpenos a-terpineno, p- cimeno e limoneno, e opcionalmente ingredientes de terpeno menor, incluindo pesticidas naturais simulados que compreendem uma mistura dos três terpenos, isto é, a- terpineno, p-cimeno e limoneno vendida como REQUIEM®.
[00212] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção o inseticida é selecionado a partir do grupo que consiste em clotianidina, cipermetrina, etiprol, fipronil, fluopiram, flupiradifurona, imidacloprida, metiocarbe, e tiodicarbe.
[00213] Composições de Acordo com a Presente Invenção
[00214] De acordo com a presente invenção a composição compreende a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00215] Uma “quantidade sinergicamente eficaz” de acordo com a presente invenção representa uma quantidade de uma combinação de uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo que expressa uma proteína de fusão e pelo menos um inseticida como descrito no presente documento que é mais eficaz contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos que uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo que expressam uma proteína de fusão ou o inseticida em separado. Uma “quantidade sinergicamente eficaz” de acordo com a presente invenção também representa uma quantidade de uma combinação de uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo que expressa uma proteína de fusão e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento que é mais eficaz em acentuação de crescimento vegetal e/ou promoção de saúde da planta do que uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo que expressa uma proteína de fusão ou o inseticida em separado.
[00216] A presente invenção compreende cada e toda combinação de cada um dos inseticidas particulares revelados no presente documento com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo.
[00217] Em uma modalidade altamente preferida a presente invenção se refere a um composição que compreende a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente vegetal, fúngico ou bacteriano; e uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou praga; e (ii) uma sequência de endereçamento que localiza a proteína de fusão para o exósporo das células de Bacillus; e b) pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz e o pelo menos um inseticida é selecionado a partir do grupo que consiste em acetamiprida, aldicarbe, amitraz, beta-ciflutrina, carbarila, clotianidina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina, endossulfan, etion, etiprol, etoprofós, fenamifós, fenobucarb, fentiona, fipronil, flubendiamida, fluopiram, flupiradifurona, formetanato, heptanofós, imidacloprida, metamidofós, metiocarbe, metomila, niclosamida, oxidemeton-metila, fosalona, silafluofeno, espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate, tiacloprida, tiodicarbe, tralometrina, triazofós, triflumuron, vamidotion, 1-{2-fluoro-4-metil-5- [(R)-(2,2,2- trifluoroetil)sulfinil]fenil}-3-(trifluorometil)-1H-1,2,4- triazol-5-amina, e 1-(3-cloropiridin-2-il)-N- [4-ciano-2- metil-6-(metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5-(trifluorometil)-2H- tetrazol-2-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00218] Em uma modalidade preferida, a composição de acordo com a presente invenção compreende ainda pelo menos um fungicida.
[00219] Em geral, “fungicida” significa a capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de fungos. O termo “fungo” ou “fungos” inclui uma ampla variedade de organismos que portam esporos nucleados que são desprovidos de clorofila. Exemplos de fungos incluem leveduras, mofos, míldios, ferrugens, e cogumelos.
[00220] Aditivos Adicionais
[00221] Um aspecto da presente invenção consiste em proporcionar uma composição como descrito acima que compreende adicionalmente pelo menos um auxiliar selecionado a partir do grupo que consiste em extensores, solventes, promotores de espontaneidade, veículos, emulsificantes, dispersantes, protetores contra congelamento, espessantes e adjuvantes. Essas composições são chamadas de formulações.
[00222] Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, tais formulações e formas de aplicação preparadas a partir das mesmas são proporcionadas como agentes de proteção de cultivos e/ou agentes pesticidas, como licores de aspersão, banho e gotejamento, que compreendem a composição da invenção. As formas de aplicação podem compreender adicionalmente agentes de proteção de cultivos e/ou agentes pesticidas, e/ou adjuvantes de acentuação de atividade como penetrantes, cujos exemplos são óleos vegetais como, por exemplo, óleo de semente de colza, óleo de girassol, óleos minerais como, por exemplo, parafinas líquidas, ésteres de alquila de ácidos graxos vegetais, como óleo de semente de colza ou ésteres metílicos de óleo de soja, ou alcoxilatos de alcanol, e/ou espalhadores como, por exemplo, alquilsiloxanos e/ou sais, cujos exemplos são sais orgânicos ou inorgânicos de amônio ou fosfônio, cujos exemplos são sulfato de amônio ou di-hidrogenofosfato de amônio, e/ou promotores de retenção como sulfosuccinato de dioctila ou polímeros de hidroxipropilguar e/ou umectantes como glicerol e/ou fertilizantes como fertilizantes de amônio, potássio ou fósforo, por exemplo.
[00223] Os exemplos de formulações típicas incluem líquidos solúveis em água (SL), concentrados emulsificáveis (EC), emulsões em água (EW), concentrados de suspensão (SC, SE, FS, OD), grânulos dispersíveis em água (WG), grânulos (GR) e concentrados de cápsula (CS); esses e outros tipos possíveis de formulação são descritos, por exemplo, por Crop Life International and in Pesticide Specifications, Manual on Development and Use of FAO and WHO Specifications for Pesticides, FAO Plant Production and Protection Papers - 173, preparado por FAO/WHO Joint Meeting on Pesticide Specifications, 2004, ISBN: 9251048576. As formulações podem compreender compostos agroquímicos ativos além de um ou mais compostos ativos da invenção.
[00224] As formulações ou formas de aplicação em questão compreendem, de preferência, auxiliares, como extensores, solventes, promotores de espontaneidade, veículos, emulsificantes, dispersantes, protetores contra congelamento, biocidas, espessantes e/ou outros auxiliares, como adjuvantes, por exemplo. Um adjuvante nesse contexto é um componente que acentua o efeito biológico da formulação, sem o próprio componente tendo um efeito biológico. Os exemplos de adjuvantes são agentes que promovem a retenção, o espalhamento, a fixação à superfície da folha, ou a penetração.
[00225] Essas formulações são produzidas de uma maneira conhecida, por exemplo, pela mistura dos compostos ativos com auxiliares como, por exemplo, extensores, solventes e/ou veículos sólidos e/ou auxiliares adicionais, como, por exemplo, tensoativos. As formulações são preparadas em plantas adequadas ou ainda antes ou durante a aplicação.
[00226] Adequadas para uso como auxiliares são substâncias que são adequadas para conferir à formulação do composto ativo ou às formas de aplicação preparadas a partir dessas formulações (como, por exemplo, agentes de proteção de cultivos úteis, como licores de aspersão ou peliculizações de semente) propriedades particulares como certas propriedades físicas, técnicas e/ou biológicas.
[00227] Os extensores adequados são, por exemplo, água, líquidos químicos orgânicos polares e não polares, por exemplo, das classes dos hidrocarbonetos aromáticos e não aromáticos (como parafinas, alquilbenzenos, alquilnaftalenos, clorobenzenos), o álcoois e polióis (que, se apropriado, também podem ser substituídos, eterificados e/ou esterificados), as cetonas (como acetona, cicloexanona), ésteres (incluindo gorduras e óleos) e (poli)éteres, as aminas, amidas, lactamas (como N- alquilpirrolidonas) e lactonas não substituídas e substituídas, as sulfonas e sulfóxidos (como sulfóxido de dimetila).
[00228] Se o extensor usado for água, também é possível empregar, por exemplo, solventes orgânicos como solventes auxiliares. Essencialmente, os solventes líquidos adequados são: aromáticos como xileno, tolueno ou alquilnaftalenos, hidrocarbonetos aromáticos clorados e alifáticos clorados como clorobenzenos, cloroetilenos ou cloreto de metileno, hidrocarbonetos alifáticos como cicloexano ou parafinas, por exemplo, frações de petróleo, óleos minerais e vegetais, álcoois como butanol ou glicol e também seus éteres e ésteres, cetonas como acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona ou cicloexanona, solventes fortemente polares como dimetilformamida e sulfóxido de dimetila, e também água.
[00229] A princípio, é possível usar todos os solventes adequados. Os solventes adequados são, por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos, como xileno, tolueno ou alquilnaftalenos, por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos ou alifáticos clorados, como clorobenzeno, cloroetileno ou cloreto de metileno, por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos, como cicloexano, por exemplo, parafinas, frações de petróleo, óleos minerais e vegetais, álcoois, como metanol, etanol, isopropanol, butanol ou glicol, por exemplo, e também seus éteres e ésteres, cetonas como acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona ou cicloexanona, por exemplo, solventes fortemente polares, como sulfóxido de dimetila e água.
[00230] Todos os veículos adequados podem, a princípio, ser usados. Os veículos adequados são, em particular: por exemplo, sais de amônio e minerais naturais triturados como caulins, argilas, talco, giz, quartzo, atapulgita, montmorilonita ou terra diatomácea, e minerais sintéticos triturados, como sílica finamente dividida, alumina e silicatos naturais ou sintéticos, resinas, ceras e/ou fertilizantes sólidos. As misturas de tais veículos podem ser usadas de modo semelhante. Os veículos adequados para grânulos incluem os seguintes: por exemplo, minerais naturais fracionados e esmagados como calcita, mármore, pedra-pomes, sepiolita, dolomita, e também grânulos sintéticos de farelos inorgânicos e orgânicos, e também grânulos de material orgânico como serragem, papel, cascas de coco, espigas de maís e caules de tabaco.
[00231] Os extensores ou solventes gasosos liquefeitos também podem ser usados. Particularmente adequados são aqueles extensores ou veículos que, em temperatura padrão e sob pressão padrão, são gasosos, cujos exemplos são propelentes em aerossol, como hidrocarbonetos halogenados, e também butano, propano, nitrogênio e dióxido de carbono.
[00232] Os exemplos de emulsificantes e/ou formadores de espuma, dispersantes ou agentes umectantes que têm propriedades iônicas ou não iônicas, ou misturas dessas substâncias tensoativas, são sais de ácido poliacrílico, sais de ácido lignossulfônico, sais de ácido fenolsulfônico ou ácido naftalenossulfônico, policondensados de óxido de etileno com álcoois graxos ou com ácidos graxos ou com aminas graxas, com fenóis substituídos (de preferência, alquilfenóis ou arilfenóis), sais de ésteres sulfosuccínicos, derivados de taurina (de preferência, alquiltauratos), ésteres fosfóricos de álcoois ou fenóis polietoxilados, ésteres de ácido graxo de polióis, e derivados dos compostos que contêm sulfatos, sulfonatos e fosfatos, cujos exemplos são alquilaril poliglicol éteres, alquilsulfonatos, sulfatos de alquila, arilsulfonatos, hidrolisatos de proteína, licores de desperdício de sulfito de lignina e metilcelulose. A presença de uma substância tensoativa é vantajosa se um dos compostos ativos e/ou um dos veículos inertes não for solúvel em água e se a aplicação ocorrer em água.
[00233] Os auxiliares adicionais que podem estar presentes nas formulações e nas formas de aplicação derivadas das mesmas incluem corantes como pigmentos inorgânicos, cujos exemplos são óxido de ferro, óxido de titânio, azul da prússia, e corantes orgânicos, como corantes de alizarina, corantes azo e corantes de ftalocianina metálica, e nutrientes e nutrientes-traço, como sais de ferro, manganês, boro, cobre, cobalto, molibdênio e zinco.
[00234] Os estabilizantes, como estabilizantes de baixa temperatura, conservantes, antioxidantes, estabilizantes de luz ou outros agentes que aprimoram a estabilidade química e/ou física também podem estar presentes. Adicionalmente presentes podem estar os formadores de espuma ou removedores de espuma.
[00235] Adicionalmente, as formulações e as formas de aplicação derivadas das mesmas também podem compreender, como auxiliares adicionais, agentes de pegajosidade como carboximetilcelulose, polímeros naturais e sintéticos em pó, forma de grânulo ou látex, como goma arábica, álcool polivinílico, acetato de polivinila, e também fosfolipídios naturais, como cefalinas e lecitinas, e fosfolipídios sintéticos. Os auxiliares possíveis adicionais incluem óleos minerais e vegetais.
[00236] Pode haver possivelmente auxiliares adicionais presentes nas formulações e nas formas de aplicação derivadas das mesmas. Os exemplos de tais aditivos incluem fragrâncias, coloides protetores, aglutinantes, adesivos, espessantes, substâncias tixotrópicas, penetrantes, promotores de retenção, estabilizantes, sequestrantes, agentes formadores de complexo, umectantes e espalhadores. Em termos gerais, os compostos ativos podem ser combinados com qualquer aditivo sólido ou líquido comumente usado para propósitos de formulação.
[00237] Os promotores de retenção adequados incluem todas essas substâncias que reduzem a tensão superficial dinâmica, como sulfosuccinato de dioctila, ou aumentam a viscoelasticidade, como os polímeros de hidroxipropilguar, por exemplo.
[00238] Os penetrantes adequados no presente contexto incluem todas essas substâncias que são tipicamente usadas a fim de acentuar a penetração de compostos agroquímicos ativos nas plantas. Os penetrantes nesse contexto são definidos como, a partir do licor de aplicação (em geral, aquoso) e/ou a partir do revestimento por aspersão, sendo capazes de penetrar a cutícula da planta e, por meio disso, aumentam a mobilidade dos compostos ativos na cutícula. Essa propriedade pode ser determinada com o uso do método descrito na literatura (Baur, et al., 1997, Pesticide Science 51, 131-152). Os exemplos incluem alcoxilatos de álcool como etoxilato graxo de coco (10) ou etoxilato de isotridecila (12), ésteres de ácido graxo como ésteres metílicos de óleo de soja ou de semente de colza, alcoxilatos de amina graxa como etoxilato de amina de sebo (15), ou sais de amônio e/ou fosfônio como sulfato de amônio ou di-hidrogenofosfato de amônio, por exemplo.
[00239] As formulações compreendem, de preferência, entre 0,0001 %e 98 % em peso de composto ativo ou, com preferência particular, entre 0,01 % e 95 % em peso de composto ativo, com mais preferência, entre 0,5 % e 90 % em peso de composto ativo, com base no peso da formulação. O teor do composto ativo é definido como a soma das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento.
[00240] O teor do composto ativo das formas de aplicação (produtos de proteção de cultivos) preparadas a partir das formulações pode variar dentro de faixas amplas. A concentração de composto ativo das formas de aplicação pode ser situada tipicamente entre 0,0001 % e 95 % em peso de composto ativo, de preferência entre 0,0001 % e 1 % em peso, com base no peso da forma de aplicação. A aplicação ocorre de uma maneira comum adaptada às formas de aplicação.
[00241] Além disso, em um aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit de partes que compreende uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento uma quantidade sinergicamente eficaz em uma disposição espacialmente separada.
[00242] Em uma modalidade adicional da presente invenção, o kit de partes mencionado acima compreende adicionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento. O fungicida e/ou o inseticida pode estar presente no componente de células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo do kit de partes ou no componente de inseticida do kit de partes estando espacialmente separado ou estar em ambos esses componentes. Preferivelmente, o fungicida e/ou o inseticida estão presentes nas células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo componente.
[00243] Além disso, o kit de partes de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um auxiliar selecionado a partir do grupo que consiste em extensores, solventes, promotores de espontaneidade, veículos, emulsificantes, dispersantes, protetores contra congelamento, espessantes e adjuvantes como mencionado a seguir. Esse pelo menos um auxiliar pode estar presente no componente de células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo do kit de partes ou no componente de inseticida do kit de partes estando espacialmente separado ou em ambos esses componentes.
[00244] Em um outro aspecto da presente invenção, a composição como descrito acima é usada para reduzir o dano geral de plantas e partes da planta bem como perdas em frutas ou vegetais colhidos ocasionadas por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos.
[00245] Adicionalmente, em um outro aspecto da presente invenção, a composição como descrito acima aumenta a saúde da planta como um todo.
[00246] O termo “saúde da planta” em geral compreende vários tipos de aprimoramentos de plantas que não são conectados ao controle de pragas. Por exemplo, as propriedades vantajosas que podem ser mencionadas são características de cultivo aprimoradas incluindo: emergência, produtividades de cultivo, teor de proteína, teor de óleo, teor de amido, sistema de raiz mais desenvolvido, crescimento de raiz aprimorado, manutenção de tamanho de raiz aprimorada, eficácia de raiz aprimorada, tolerância a estresse aprimorada (por exemplo, contra aridez, calor, sal, UV, água, frio), etileno reduzido (produção reduzida e/ou inibição de recepção), aumento de perfilhamento, aumento em altura de planta, lâmina de folha maior, menos folhas basais mortas, perfilhadores mais fortes, cor de folha mais verde, teor de pigmento, atividade fotossintética, menos entrada necessária (como fertilizantes ou água), menos sementes necessárias, perfilhadores mais produtivos, florescimento mais rápido, maturidade de grão precoce, menos inversão de planta (acamamento), crescimento de broto aumentado, vigor de planta acentuado, permanência de planta aumentada e germinação melhor e mais rápida.
[00247] Em relação ao uso de acordo com a presente invenção, a saúde da planta aprimorada se refere, de preferência, a características de planta aprimoradas incluindo: produtividade de cultivo, sistema de raiz mais desenvolvido (crescimento de raiz aprimorado), manutenção de tamanho de raiz aprimorada, eficácia de raiz aprimorada, aumento de perfilhamento, aumento em altura de planta, lâmina de folha maior, menos folhas basais mortas, perfilhadores mais fortes, cor de folha mais verde, atividade fotossintética, perfilhadores mais produtivos, vigor de planta acentuado e permanência de planta aumentada.
[00248] Em relação à presente invenção, a saúde da planta aprimorada se refere, de preferência, especialmente a propriedades de planta aprimoradas selecionadas de produtividade de cultivo, sistema de raiz mais desenvolvido, crescimento de raiz aprimorado, manutenção de tamanho de raiz aprimorada, eficácia de raiz aprimorada, aumento de perfilhamento e aumento em altura de planta.
[00249] O efeito de uma composição de acordo com a presente invenção na saúde da planta como definido no presente documento pode ser determinado ao comparar plantas que são crescidas sob as mesmas condições ambientais, através do que uma parte das ditas plantas é tratada com uma composição de acordo com a presente invenção e uma outra parte das ditas plantas não é tratada com uma composição de acordo com a presente invenção. Em vez disso, a dita outra parte não é tratada de fato ou é tratada com um placebo (isto é, uma aplicação sem uma composição de acordo com a invenção como uma aplicação sem todos os ingredientes ativos (isto é, sem o agente de controle biológico baseado em membro recombinante da família de Bacillus cereus que produz exósporo como descrito no presente documento e sem um inseticida como descrito no presente documento), ou uma aplicação sem o agente de controle biológico baseado em membro recombinante da família de Bacillus cereus que produz exósporo como descrito no presente documento, ou uma aplicação sem um inseticida como descrito no presente documento.
[00250] A composição de acordo com a presente invenção pode ser aplicada de qualquer maneira desejada, como na forma de uma peliculização de semente, banho de solo, e/ou diretamente em sulco e/ou como uma aspersão foliar e aplicada em pré-emergência, pós- emergência ou ambos. Em outras palavras, a composição pode ser aplicada à semente, à planta ou a frutas e vegetais colhidos ou ao solo em que a planta está crescendo ou onde se deseja que a mesma cresça (locus de crescimento da planta).
[00251] A redução do dano geral de plantas e partes da planta resulta muitas vezes em plantas mais saudáveis e/ou em um aumento em vigor e produtividade de planta.
[00252] De preferência, a composição de acordo com a presente invenção é usada para tratar plantas transgênicas ou convencionais ou semente das mesmas.
[00253] A presente invenção também se refere a métodos para estimular o crescimento vegetal com o uso de qualquer uma das composições descritas acima que compreendem células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento. O método para estimular o crescimento vegetal compreende aplicar a uma planta, uma parte da planta, ao locus que circunda a planta ou no qual a planta será plantada (por exemplo, solo ou outros meios de crescimento) uma composição que compreende células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo estimulante de crescimento vegetal; e (ii) uma sequência de endereçamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos um inseticida adicional particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00254] Em um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para reduzir o dano geral de plantas e partes da planta bem como perdas em frutas ou vegetais colhidos ocasionadas por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos que compreende a etapa de aplicar simultânea ou sequencialmente as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00255] Em uma outra modalidade da presente invenção, a composição compreende pelo menos um inseticida e/ou pelo menos um inseticida além das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o inseticida particular revelado no presente documento. Em uma modalidade, o pelo menos um fungicida é um fungicida sintético.
[00256] O método da presente invenção inclui os seguintes métodos de aplicação, a saber, tanto as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo quanto o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento podem ser formulados em uma única composição estável com uma vida de prateleira agricolamente aceitável (denominada “formulação única”), ou sendo combinados antes ou no momento de uso (denominada “formulações combinadas”).
[00257] Se não mencionado de outro modo, a expressão “combinação” significa as várias combinações das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida, e opcionalmente o pelo menos um fungicida, em uma formulação única de “mistura pronta”, em uma mistura de aspersão combinada composta de formulações únicas, como uma “mistura de tanque”, e especialmente em um uso combinado dos únicos ingredientes ativos quando aplicada de uma maneira sequencial, isto é, uma após a outra dentro de um período razoavelmente curto, como um algumas horas ou dias, por exemplo, 2 horas a 7 dias. A ordem de aplicação da composição de acordo com a presente invenção não é essencial para executar a presente invenção. Consequentemente, o termo “combinação” também abrange a presença das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida sobre ou em uma planta a ser tratada ou seu espaço circundante, habitat ou espaço de armazenamento, por exemplo, após aplicar simultânea ou consecutivamente as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida a uma planta em seu espaço circundante, habitat ou espaço de armazenamento.
[00258] Se as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida forem empregados ou usados de uma maneira sequencial, é preferencial tratar as plantas ou partes da planta (o que inclui sementes e plantas que emergem da semente), frutas e vegetais colhidos de acordo com o seguinte método: Primeiramente, aplicar o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida adicional na planta ou partes da planta e, em segundo lugar, aplicar as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo à mesma planta ou partes da planta. Através dessa maneira de aplicação, a quantidade de resíduos de inseticidas/fungicidas na planta mediante a colheita é a mais baixa possível. Os períodos de tempo entre a primeira e a segunda aplicação dentro de um ciclo de crescimento (cultivo) podem variar e dependem do efeito a ser alcançado. Por exemplo, a primeira aplicação é feita para impedir uma infestação da planta ou partes da planta com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos (isso é particularmente o caso quando se trata sementes) ou para combater a infestação com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos (isso é particularmente o caso quando se trata plantas e partes da planta) e a segunda aplicação é feita para impedir ou controlar a infestação com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos e/ou para promover o crescimento vegetal. O controle nesse contexto significa que as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo não têm capacidade de exterminar completamente as pragas ou fungos fitopatogênicos, mas têm capacidade de manter a infestação em um nível aceitável.
[00259] A presente invenção também fornece métodos de acentuação da atividade de extermínio, inibição, preventiva e/ou repelente das composições da presente invenção por múltiplas aplicações. Em algumas outras modalidades, as composições da presente invenção são aplicadas a uma planta e/ou parte da planta por duas vezes, durante quaisquer estágios de desenvolvimento desejados ou sob qualquer pressão de praga predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Ainda em algumas modalidades, as composições da presente invenção são aplicadas a uma planta e/ou parte da planta para mais de duas vezes, por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais, durante quaisquer estágios de desenvolvimento desejados ou sob qualquer pressão de praga predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Os intervalos entre cada aplicação pode variar se isso for desejado. Um elemento versado na técnica terá capacidade de determinar os tempos de aplicação e a extensão do intervalo dependendo das espécies da planta, das espécies de praga de planta e de outros fatores.
[00260] Ao seguir as etapas mencionadas anteriormente, um nível muito baixo de resíduos do pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento e/ou inseticida adicional na planta, partes da planta tratadas e nas frutas e vegetais colhidos pode ser alcançado.
[00261] Se não mencionado de outro modo, o tratamento de plantas ou partes da planta (que inclui sementes e plantas que emergem da semente), frutas e vegetais colhidos com a composição de acordo com a invenção é executado diretamente ou por ação em seus ambientes circundantes, habitat ou espaço de armazenamento com o uso de métodos de tratamento comuns, por exemplo, gotejamento, aspersão, atomização, irrigação, evaporação, polvilhamento, nebulização, difusão, formação de espuma, pintura, espalhamento, molhagem (banho), irrigação por gotejamento. É adicionalmente possível aplicar as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo, o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida formulação única ou formulações combinadas pelo método de volume ultrabaixo, ou injetar a composição de acordo com a presente invenção como uma composição ou como formulações únicas no solo (em sulco).
[00262] O termo “planta a ser tratada” abrange toda parte de uma planta incluindo seu sistema de raiz e o material - por exemplo, solo ou meio de nutrição - que está em um raio de pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do caule ou fuste de uma planta a ser tratada ou que está pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do sistema de raiz da dita planta a ser tratada, respectivamente.
[00263] A quantidade das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo que é usada ou empregada em combinação com pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida, depende da formulação final bem como do tamanho ou do tipo da planta, partes da planta, sementes, frutas e vegetais colhidos a serem tratados. Usualmente, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo a serem empregadas ou usadas de acordo com a invenção estão presentes em cerca de 1 % a cerca de 80 % (p/p), de preferência, em cerca de 1 % a cerca de 60 % (p/p), mais preferivelmente cerca de 10 % a cerca de 50 % (p/p) de sua formulação única ou formulação combinada com o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o fungicida.
[00264] Também a quantidade do pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento que é usado ou empregado em combinação com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo, opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida, depende da formulação final bem como do tamanho ou do tipo da planta, partes da planta, sementes, fruta ou vegetal colhido a ser tratado. Usualmente, as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo a serem empregadas ou usadas de acordo com a invenção estão presentes em cerca de 0,1 % a cerca de 80 % (p/p), de preferência, 1 % a cerca de 60 % (p/p), mais preferivelmente cerca de 10 % a cerca de 50 % (p/p) de sua formulação única ou formulação combinada com o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida.
[00265] A aplicação das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo pode ser efetuada como uma aspersão foliar, como um tratamento de solo e/ou como um tratamento/peliculização de semente. Quando usadas como um tratamento foliar, em uma modalidade, cerca de 1/16 a cerca de 5 galões de caldo integral são aplicados por acre. Quando usadas como um tratamento de solo, em uma modalidade, cerca de 1 a cerca de 5 galões de caldo integral são aplicados por acre. Quando usadas para tratamento de semente, cerca de 1/32 a cerca de 1/4 galões de caldo integral são aplicados por acre. Para tratamento de semente, a formulação de uso final contém 1 x 104, pelo menos 1 x 105, pelo menos 1 x 106, 1 x 107, pelo menos 1 x 108, pelo menos 1 x 109, ou pelo menos 1 x 1010 unidades formadoras de colônia por grama.
[00266] As células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e se presente preferivelmente também o fungicida usados ou empregados em uma razão de peso sinérgica. O elemento versado na técnica tem capacidade de descobrir as razões de peso sinérgicas para a presente invenção por métodos rotineiros. O elemento versado na técnica compreenderá que essas razões se referem à razão dentro de uma formulação combinada bem como à razão de cálculo das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo descritas no presente documento e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento ambos os componentes são aplicados como monoformulações a uma planta a ser tratada. O elemento versado na técnica pode calcular essa razão por matemática simples, uma vez que o volume e a quantidade das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, respectivamente, em uma monoformulação são conhecidos pelo elemento versado na técnica.
[00267] A razão pode ser calculada com base na quantidade do pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, no momento da aplicação do dito componente de uma combinação de acordo com a invenção a uma planta ou parte da planta e a quantidade de células recombinantes de Bacillus que produz exósporo logo antes (por exemplo, 48 h, 24 h, 12 h, 6 h, 2 h, 1 h) ou no momento da aplicação do dito componente de uma combinação de acordo com a invenção a uma planta ou parte da planta.
[00268] A aplicação das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento a uma planta ou uma parte de planta pode ocorrer simultaneamente ou em diferentes tempos desde que ambos os componentes estejam presentes sobre ou na planta após a(s) aplicação(ões). Em casos em que as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e inseticida são aplicados em diferentes tempos e o inseticida é aplicado de forma notável antes das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo, o elemento versado na técnica pode determinar a concentração de inseticida sobre/em uma planta por análise química conhecida na técnica, no momento ou logo antes do momento de aplicação das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo. De modo contrário, quando as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo são aplicadas a uma planta primeiramente, a concentração das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo pode ser determinada com o uso de testes que são também conhecidos na técnica, no momento ou logo antes do momento de aplicação do inseticida.
[00269] Em particular, em uma modalidade a razão em peso sinergística das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento se situa na faixa de 1:1000 a 1000:1, de preferência, na faixa de 1:500 a 500:1, mais preferivelmente na faixa de 1:300 a 500:1. Razões especialmente preferidas estão entre 20:1 e 1:20, tal como 10:1, 5:1 ou 2:1. Tem que ser notado que estas faixas de razões se referem ao agente de controle biológico com base no membro da família recombinante de Bacillus cereus (a ser combinado com pelo menos um inseticida particular ou uma preparação de pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento). Por exemplo, uma razão de 100:1 significa 100 partes em peso de uma preparação de esporos do agente de controle biológico recombinante com base em Bacillus que produzem exósporo e 1 parte em peso de inseticida são combinadas (como uma formulação única, uma formulação combinada ou por aplicações separadas a plantas de modo que a combinação é formada na planta). Em um aspecto desta modalidade, a preparação de esporos das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo é uma preparação de esporos seca contendo pelo menos cerca de 1 x 104 ufc/g, pelo menos cerca de 1 x 105 ufc/g, pelo menos cerca de 1 x 106 ufc/g pelo menos cerca de 1 x 107 ufc/g, pelo menos cerca de 1 x 108 ufc/g, pelo menos cerca de 1 x 109 ufc/g, pelo menos cerca de 1 x 1010 ufc/g, ou pelo menos cerca de 1 x 1011 ufc/g.
[00270] Em uma outra modalidade, a razão em peso sinergística das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento está na faixa de 1:100 a 20,000:1, de preferência, na faixa de 1:50 a 10,000:1 ou mesmo na faixa de 1:50 a 1000:1.
[00271] Em uma modalidade da presente invenção, a concentração das células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo após a dispersão é de pelo menos 50 g/ha, tal como 50 - 7500 g/ha, 50 — 2500 g/ha, 50 — 1500 g/ha; pelo menos 250 g/ha (hectare), pelo menos 500 g/ha ou pelo menos 800 g/ha.
[00272] A taxa de aplicação de composição a ser empregada ou usada de acordo com a presente invenção pode variar. O elemento versado na técnica tem capacidade de encontrar a taxa de aplicação apropriada por meio de experimentos de rotina.
[00273] Em um outro aspecto da presente invenção, uma semente tratada com a composição como descrito acima é proporcionada.
[00274] O controle de insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos pelo tratamento da semente de plantas é conhecido por bastante tempo e é um objeto de aprimoramentos contínuos. Todavia, o tratamento de semente confere uma série de problemas que não podem sempre ser resolvidos de uma maneira satisfatória. Dessa forma, é desejável desenvolver métodos para proteger a semente e a planta em germinação que removem a necessidade de, ou reduzem pelo menos significativamente, entrega adicional de composições de proteção de cultivos no curso de armazenamento, após a semeadura ou após a emergência das plantas. É desejável, adicionalmente, otimizar a quantidade de ingrediente ativo empregado de modo que forneça a melhor proteção possível para a semente e a planta em germinação contra ataque por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos, mas sem ocasionar dano à própria planta pelo ingrediente ativo empregado. Em particular, os métodos para tratamento de semente também buscam levar em consideração as propriedades intrínsecas inseticidas e/ou nematicidas de plantas transgênicas resistentes à praga ou tolerantes à praga, a fim de alcançar proteção ideal da semente e da planta em germinação com um uso mínimo de composições de proteção de cultivos.
[00275] Portanto, a presente invenção também se refere em particular, a um método para proteger a semente e as plantas em germinação contra o ataque por pragas, pelo tratamento da semente com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo como definido acima e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz. O método da invenção para proteger semente e plantas em germinação contra o ataque por pragas abrange um método no qual a semente é tratada simultaneamente em uma operação com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida. Isso também abrange um método no qual a semente é tratada em diferentes momentos com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida.
[00276] De modo semelhante, a invenção se refere ao uso da composição da invenção para tratar a semente para o propósito de proteger a semente e a planta resultante contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos.
[00277] A invenção também se refere à semente que ao mesmo tempo foi tratada com uma célula recombinante de Bacillus que produz exósporo e pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida. A invenção se refere adicionalmente a semente que foi tratada em diferentes momentos com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida. No caso de semente que foi tratada em diferentes momentos com as células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo e o pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida, os ingredientes ativos individuais na composição da invenção podem estar presentes em diferentes camadas na semente.
[00278] Além disso, a invenção se refere à semente que, após o tratamento com a composição da invenção, é submetida a um processo de revestimento de filme a fim de impedir a abrasão de poeira da semente.
[00279] Uma das vantagens da presente invenção é que, em relação às propriedades sistêmicas particulares das composições da invenção, o tratamento da semente com essas composições fornece proteção contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos não apenas para a própria semente, mas também para as plantas que originam da semente, após terem sido emergidas. Desse modo, pode não ser necessário tratar a cultivo diretamente no momento de semeadura ou logo após isso.
[00280] Uma vantagem adicional deve ser vista no fato de que, através do tratamento da semente com a composição da invenção, a germinação e a emergência da semente tratada podem ser promovidas.
[00281] De modo semelhante, considera-se vantajoso que a composição da invenção também possa ser usada, em particular, em semente transgênica.
[00282] Estabelece-se também que a composição da invenção pode ser usada em combinação com agentes da tecnologia de sinalização, como um resultado disso, por exemplo, a colonização com simbióticos é aprimorada, como rizóbios, micorrizas e/ou bactérias endofíticas, por exemplo, é acentuada, e/ou fixação de nitrogênio é otimizada.
[00283] As composições da invenção são adequadas para proteger a semente de qualquer variedade de planta que é usada em agricultura, em estufas, em florestamento ou em horticultura. Mais particularmente, a semente em questão é a de cereais (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e milhete), maís, algodão, sojas, arroz, batatas, girassol, café, tabaco, canola, colza com semente oleosa, beterrabas (por exemplo, batata-doce e beterraba forrageira), amendoins, vegetais (por exemplo, tomate, pepino, feijão, brássicas, cebolas e alface), plantas frutíferas, gramas e ornamentais. Particularmente importante é o tratamento da semente de cereais (como trigo, cevada, centeio e aveias) maís, sojas, algodão, canola, colza com semente oleosa e arroz.
[00284] Como já mencionado acima, o tratamento de semente transgênica com a composição da invenção é particularmente importante. A semente em questão aqui é a de plantas que, em geral, contêm pelo menos um gene heterólogo que controla a expressão de um polipeptídeo que tem, em particular, propriedades inseticidas e/ou nematicidas. Esses genes heterólogos em semente transgênica podem ser originados de micro-organismos como Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Clavibacter, Glomus ou Gliocladium. A presente invenção é particularmente adequada para o tratamento de semente transgênica que contém pelo menos um gene heterólogo de Bacillus sp. Em referência particular, o gene heterólogo em questão se origina de Bacillus thuringiensis.
[00285] Para os propósitos da presente invenção, a composição da invenção é aplicada sozinha ou em uma formulação adequada à semente. A semente é, de preferência, tratada em uma condição na qual sua estabilidade é tal que nenhum dano ocorra no curso do tratamento. Em termos gerais, a semente pode ser tratada em qualquer momento entre a colheita e a semeadura. Tipicamente, é usada a semente que foi separada da planta e teve espigas, cascas, troncos, folhelhos, pelo ou polpa removidos. Dessa forma, por exemplo, pode ser usada a semente que foi colhida, limpa e seca para um teor de umidade menor que 15 % em peso. Alternativamente, pode ser usada a semente também que, após a secagem, foi tratada com água, por exemplo, e, então, seca novamente.
[00286] Quando se trata a semente, é necessário, em termos gerais, assegurar que a quantidade da composição da invenção e/ou de outros aditivos, que é aplicada à semente seja selecionada de modo que a germinação da semente não seja adversamente afetada, e/ou que a planta que emerge da semente não seja danificada. Isso é o caso, em particular, com os ingredientes ativos que podem exibir efeitos fitotóxicos em certas taxas de aplicação.
[00287] As composições da invenção podem ser aplicadas diretamente, em outras palavras, sem compreender componentes adicionais e sem tem sido diluída. Como uma regra geral, é preferencial aplicar as composições na forma de uma formulação adequada à semente. As formulações e métodos adequados para o tratamento de semente são conhecidos pelos elementos versados na técnica e são descritos, por exemplo, nos seguintes documentos: Patentes US nos 4.272.417 A; 4.245.432 A; 4.808.430 A; 5.876.739 A; Publicação de Patente US n° 2003/0176428 A1; WO 2002/080675 A1; WO 2002/028186 A2.
[00288] As combinações que podem ser usadas de acordo com a invenção podem ser convertidas nas formulações de peliculização de semente comuns, como soluções, emulsões, suspensões, pós, espumas, pastas aquosas ou outras composições de revestimento para semente, e também formulações de ULV.
[00289] Essas formulações são preparadas de uma maneira conhecida, pela mistura da composição com adjuvantes comuns, como, por exemplo, extensores comuns e também solventes ou diluentes, corantes, umectantes, dispersantes, emulsificantes, agentes antiformação de espuma, conservantes, espessantes secundários, agentes de pegajosidade, giberelinas e também água.
[00290] Os corantes que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usados de acordo com a invenção incluem todos os corantes que são comuns para tais propósitos. Nesse contexto, é possível usar não apenas pigmentos, que são de baixa solubilidade em água, mas também corantes solúveis em água. Os exemplos incluem os corantes conhecidos sob as designações Rodamina B, C.I. Pigment Red 112 e C.I. Solvent Red 1.
[00291] Os umectantes que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todas as substâncias que promovem o umedecimento e que são comuns na formulação de ingredientes agroquímicos ativos. Pode ser feito uso, de preferência, de alquilnaftalenossulfonatos, como di-isopropil ou di-isobutil-naftalenossulfonatos.
[00292] Os dispersantes e/ou emulsificantes que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todos os dispersantes não iônicos, aniônicos e catiônicos que são comuns na formulação de ingredientes agroquímicos ativos. Pode ser feito uso, de preferência, de dispersantes não iônicos ou aniônicos ou de misturas de dispersantes não iônicos ou aniônicos. Os dispersantes não iônicos adequados são, em particular, polímeros em bloco de óxido de etileno- óxido de propileno, alquilfenol poliglicol éteres e também tristririlfenol poliglicol éteres e os derivados fosfatados ou sulfatados desses. Os dispersantes aniônicos adequados são, em particular, lignossulfonatos, sais de ácido poliacrílico e condensados de arilsulfonato-formaldeído.
[00293] Os agentes antiformação de espuma que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todos os inibidores de espuma que são comuns na formulação de ingredientes agroquímicos ativos. Pode ser feito uso, de preferência, de agentes antiformação de espuma de silicone e estearato de magnésio.
[00294] Os conservantes que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todas as substâncias que podem ser empregadas para tais propósitos em composições agroquímicas. Os exemplos incluem diclorofeno e hemiformal de álcool benzílico.
[00295] Os espessantes secundários que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todas as substâncias que podem ser usadas para tais propósitos em composições agroquímicas. Aqueles contemplados incluem, de preferência, derivados de celulose, derivados de ácido acrílico, xantana, argilas modificadas e sílica altamente dispersa.
[00296] Os agentes de pegajosidade que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todos os aglutinantes comuns que podem ser usados em produtos de peliculização de semente. Pode ser feita menção preferencialmente a polivinilpirrolidona, acetato de polivinila, álcool polivinílico e tilose.
[00297] As giberelinas que podem estar presentes nas formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem, de preferência, as giberelinas A1, A3 (= ácido giberélico), A4 e A7, sendo o ácido giberélico usado com preferência particular. As giberelinas são conhecidas (consulte R. Wegler, “Chemie der Pflanzenschutz-und Schadlingsbekampfungsmittel”, Volume 2, Springer Verlag, 1970, páginas 401 a 412).
[00298] As formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção podem ser usadas, diretamente ou após a diluição anterior com água, para tratar a semente de qualquer um dentre uma ampla variedade de tipos. Consequentemente, os concentrados ou as preparações obteníveis a partir dos mesmos por diluição com água podem ser empregados para peliculizar a semente de cereais, como trigo, cevada, centeio, aveias e triticale, e também a semente de maís, arroz, colza com semente oleosa, ervilhas, feijões, algodão, girassóis e beterrabas, ou ainda a semente de qualquer um dentre uma variedade muito ampla de vegetais. As formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção, ou suas preparações diluídas, também podem ser usadas para peliculizar a semente de plantas transgênicas. Nesse caso, os efeitos sinérgicos adicionais podem ocorrer na interação com as substâncias formadas através de expressão.
[00299] Para o tratamento de semente com as formulações de peliculização de semente que podem ser usadas de acordo com a invenção, ou com as preparações produzidas a partir das mesmas por adição de água, o equipamento de mistura adequado inclui todos os tais equipamentos que podem ser tipicamente empregados para peliculização de semente. Mais particularmente, o procedimento ao executar a peliculização de semente consiste em colocar a semente em um misturador, adicionar a quantidade desejada particular de formulações de peliculização de semente, como tal ou após a diluição com água antecipadamente, e executar a mistura até que a distribuição da formulação na semente seja uniforme. Isso pode ser seguido por uma operação de secagem.
[00300] A taxa de aplicação das formulações de peliculização de semente que pode ser usada de acordo com a invenção pode ser variada dentro de uma faixa relativamente ampla. Isso é guiado pela quantidade particular do agente de controle biológico baseado em membro recombinante da família de Bacillus cereus que produz exósporo e do pelo menos um inseticida particular revelado no presente documento nas formulações, e pela semente. As taxas de aplicação no caso da composição estão situadas em geral entre 0,001 e 50 g por quilograma de semente, de preferência, entre 0,01 e 15 g por quilograma de semente.
[00301] As composições de acordo com a invenção, no caso de exibirem atividade inseticida e acaricida e/ou nematicida, em combinação com boa tolerância das plantas e toxicidade favorável para os animais de sangue quente e sendo bem toleradas pelo ambiente, são adequadas para a proteção de plantas e órgãos da planta, para aumentar os rendimentos de colheita, para a melhoria da qualidade do material colhido e para o combate de parasitas animais, em especial insetos, ácaros, aracnídeos, helmintos, nematódeos e moluscos, os quais são encontrados na agricultura, na horticultura, na criação de animais, em florestas, em jardins e nas instalações de lazer, na proteção dos produtos armazenados e dos materiais e no setor da higiene. Podem ser preferivelmente empregados como agentes de proteção de plantas. Em particular, a presente invenção se refere ao uso da composição de acordo com a invenção como inseticida e/ou fungicida.
[00302] São ativos contra espécies normalmente sensíveis e resistentes e contra todos ou alguns estágios de desenvolvimento. As pragas mencionadas acima incluem:
[00303] pragas do filo Arthropoda, especialmente da classe Arachnida, por exemplo, Acarus spp., Aceria sheldoni, Aculops spp., Aculus spp., Amblyomma spp., Amphitetranychus viennensis, Argas spp., Boophilus spp., Brevipalpus spp., Bryobia graminum, Bryobia praetiosa, Centruroides spp., Chorioptes spp., Dermanyssus gallinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Dermacentor spp., Eotetranychus spp., Epitrimerus piri, Eutetranychus spp., Eriophyes spp., Glycyphagus domesticus, Halotydeus destructor, Hemitarsonemus spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Latrodectus spp., Loxosceles spp., Metatetranychus spp., Neutrombicula autumnalis, Nuphersa spp., Oligonychus spp., Ornithodorus spp., Ornithonyssus spp., Panonychus spp., Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Rhizoglyphus spp., Sarcoptes spp., Scorpio maurus, Steneotarsonemus spp., Steneotarsonemus spinki, Tarsonemus spp., Tetranychus spp., Trombicula alfreddugesi, Vaejovis spp., Vasates lycopersici;
[00304] em particular ácaro trevo, ácaro marrom, ácaro de avelã aranha, ácaro aspargos, ácaro de trigo marrom, ácaro da leguminosa, ácaro oxalis, ácaro buxo, ácaro de cítrico do Texas, ácaro vermelho Oriental, ácaro vermelho de cítrico, ácaro vermelho europeu, ácaro-aranha amarelo, ácaro-aranha fig, ácaro-aranha de Lewis, ácaro-aranha de seis manchas, ácaro de Willamette ácaro-aranha de Yuma, ácaro de fiação de teia, ácaro de abacaxi, ácaro verde de cítrico, ácaro-aranha de gafanhoto, ácaro-aranha vermelho de chá, ácaro vermelho do sul, ácaro marrom do abacate, ácaro-aranha de espruce, ácaro vermelho do abacate, ácaro de grama Banks, ácaro-aranha carmim, ácaro-aranha do deserto, ácaro-aranha dos vegetais, ácaro-aranha túmido, ácaro-aranha do morango, ácaro-aranha de duas manchas, ácaro de McDaniel, ácaro-aranha do Pacífico, ácaro-aranha de pilriteiro, ácaro-aranha de quatro manchas, ácaro-aranha de Schoenei, ácaro-aranha falso-chileno, ácaro plano de cítrico, ácaro-privado, ácaro escarlate plano, ácaro de cauda branca, ácaro tarsonemida de abacaxi, ácaro de cana- de-açúcar do Oeste da Índia, ácaro de bráctea de bulbo, ácaro de cíclame, ácaro branco, ácaro de cereais de inverno, ácaro de terra de patas vermelhas, ácaro da avelã, ácaro da erinose da uva, ácaro da sementeira de pêra, ácaro da vesícula da folha da maçã, ácaro do vetor do mosaico do pêssego, ácaro da vesícula da folha de nogueira, ácaro da vesícula da folha de noz-pecã, ácaro do broto de fig, ácaro do broto da oliva, ácaro do broto de cítrico, ácaro da erinose da lichia, ácaro curvo do trigo, ácaro da noz e flor de coco, ácaro de blister de cana-de-açúcar, ácaro de erva-de-bisonte, ácaro de erva-de-bermuda, ácaro do broto da cenoura, ácaro do broto da batata-doce, ácaro da fasciação da batata-doce, ácaro da folha frisada de romã, ácaro da galha de cinza de lantejoula, ácaro da vesícula do bordo, ácaro da erinose do amieiro, ácaro do azevinho, ácaro da bolha do algodão, ácaro do broto do mirtilo, ácaro cor-de-rosa do chá, ácaro estriado do chá, ácaro cinzento de cítrico, ácaro da ferrugem da batata doce, ácaro da ferrugem da castanha brava, ácaro da ferrugem de cítrico, ácaro da ferrugem da maçã, ácaro da ferrugem da uva, ácaro da ferrugem da pêra, ácaro do pinheiro de bainha em forma de agulha plana, ácaro da fruta e broto de rosa selvagem, ácaro da frambuesa, ácaro da ferrugem da manga, ácaro da ferrugem da azalea, ácaro da ferrugem da ameixa, ácaro do pêssego prateado, ácaro da ferrugem da maçã, ácaro da ferrugem do tomate, ácaro da ferrugem de cítrico rosa, ácaro da ferrugem do cereal, ácaro da ferrugem do arroz;
[00305] da classe Chilopoda, por exemplo, Geophilus spp., Scutigera spp.;
[00306] da ordem ou da classe Collembola, por exemplo, Onychiurus armatus;
[00307] da classe Diplopoda, por exemplo, Blaniulus guttulatus;
[00308] da classe Insecta, por exemplo, da ordem Blattodea, por exemplo, Blattella asahinai, Blattella germanica, Blatta orientalis, Leucophaea maderae, Panclora spp., Parcoblatta spp., Periplaneta spp., Supella longipalpa;
[00309] da ordem Coleoptera, por exemplo, Acalymma vittatum, Acanthoscelides obtectus, Adoretus spp., Agelastica alni, Agriotes spp., Alphitobius diaperinus, Amphimallon solstitialis, Anobium punctatum, Anoplophora spp., Anthonomus spp., Anthrenus spp., Apion spp., Apogonia spp., Atomaria spp., Attagenus spp., Bruchidius obtectus, Bruchus spp., Cassida spp., Cerotoma trifurcata, Ceutorrhynchus spp., Chaetocnema spp., Cleonus mendicus, Conoderus spp., Cosmopolites spp., Costelytra zealandica, Ctenicera spp., Curculio spp., Cryptolestes ferrugineus, Cryptorhynchus lapathi, Cylindrocopturus spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Dichocrocis spp., Dicladispa armigera, Diloboderus spp., Epilachna spp., Epitrix spp., Faustinus spp., Gibbium psylloides, Gnathocerus cornutus, Hellula undalis, Heteronychus arator, Heteronyx spp., Hylamorpha elegans, Hylotrupes bajulus, Hypera postica, Hypomeces squamosus, Hypothenemus spp., Lachnosterna consanguinea, Lasioderma serricorne, Latheticus oryzae, Lathridius spp., Lema spp., Leptinotarsa decemlineata, Leucoptera spp., Lissorhoptrus oryzophilus, Lixus spp., Luperodes spp., Lyctus spp., Megascelis spp., Melanotus spp., Meligethes aeneus, Melolontha spp., Migdolus spp., Monochamus spp., Naupactus xanthographus, Necrobia spp., Niptus hololeucus, Oryctes rhinoceros, Oryzaephilus surinamensis, Oryzaphagus oryzae, Otiorrhynchus spp., Oxycetonia jucunda, Phaedon cochleariae, Phyllophaga spp., Phyllophaga helleri, Phyllotreta spp., Popillia japonica, Premnotrypes spp., Prostephanus truncatus, Psylliodes spp., Ptinus spp., Rhizobius ventralis, Rhizopertha dominica, Sitophilus spp., Sitophilus oryzae, Sphenophorus spp., Stegobium paniceum, Sternechus spp., Symphyletes spp., Tanymecus spp., Tenebrio molitor, Tenebrioides mauretanicus, Tribolium spp., Trogoderma spp., Tychius spp., Xylotrechus spp., Zabrus spp;
[00310] preferivelmente de besouro do pepino bandado (Diabrotica balteata), verme da raiz do milho do norte (Diabrotica Barberi), verme da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi), besouro do pepino ocidental (Diabrotica tenella undecimpunctata), besouro do pepino manchado ocidental (Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata), verme da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera), verme da raiz do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae);
[00311] da ordem Diptera, por exemplo, Aedes spp., Agromyza spp., Anastrepha spp., Anopheles spp., Asphondylia spp., Bactrocera spp., Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Chrysozona pluvialis, Cochliomyia spp., Contarinia spp., Cordylobia anthropophaga, Cricotopus sylvestris, Culex spp., Culicoides spp., Culiseta spp., Cuterebra spp., Dacus oleae, Dasyneura spp., Delia spp., Dermatobia hominis, Drosophila spp., Echinocnemus spp., Fannia spp., Gasterophilus spp., Glossina spp., Haematopota spp., Hydrellia spp., Hydrellia griseola, Hylemya spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Lutzomyia spp., Mansonia spp., Musca spp., Oestrus spp., Oscinella frit, Paratanytarsus spp., Paralauterborniella subcincta, Pegomyia spp., Phlebotomus spp., Phorbia spp., Phormia spp., Piophila casei, Prodiplosis spp., Psila rosae, Rhagoletis spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tetanops spp., Tipula spp.;
[00312] da ordem Heteroptera, por exemplo, Anasa tristis, Antestiopsis spp., Boisea spp., Blissus spp., Calocoris spp., Campylomma livida, Cavelerius spp., Cimex spp., Collaria spp., Creontiades dilutus, Dasynus piperis, Dichelops furcatus, Diconocoris hewetti, Dysdercus spp., Euschistus spp., Eurygaster spp., Heliopeltis spp., Horcias nobilellus, Leptocorisa spp., Leptocorisa varicornis, Leptoglossus phyllopus, Lygus spp., Macropes excavatus, Miridae, Monalonion atratum, Nezara spp., Oebalus spp., Pentomidae, Piesma quadrata, Piezodorus spp., Psallus spp., Pseudacysta persea, Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scaptocoris castanea, Scotinophora spp., Stephanitis nashi, Tibraca spp., Triatoma spp.;
[00313] da ordem Homoptera, por exemplo, Acizzia acaciaebaileyanae, Acizzia dodonaeae, Acizzia uncatoides, Acrida turrita, Acyrthosipon spp., Acrogonia spp., Aeneolamia spp., Agonoscena spp., Aleyrodes proletella, Aleurolobus barodensis, Aleurothrixus floccosus, Allocaridara malayensis, Amrasca spp., Anuraphis cardui, Aonidiella spp., Aphanostigma piri, Aphis spp., Arboridia apicalis, Arytainilla spp., Aspidiella spp., Aspidiotus spp., Atanus spp., Aulacorthum solani, Bemisia tabaci, Blastopsylla occidentalis, Boreioglycaspis melaleucae, Brachycaudus helichrysi, Brachycolus spp., Brevicoryne brassicae, Cacopsylla spp., Calligypona marginata, Carneocephala fulgida, Ceratovacuna lanigera, Cercopidae, Ceroplastes spp., Chaetosiphon fragaefolii, Chionaspis tegalensis, Chlorita onukii, Chondracris rosea, Chromaphis juglandicola, Chrysomphalus ficus, Cicadulina mbila, Coccomytilus halli, Coccus spp., Cryptomyzus ribis, Cryptoneossa spp., Ctenarytaina spp., Dalbulus spp., Dialeurodes citri, Diaphorina citri, Diaspis spp., Drosicha spp., Dysaphis spp., Dysmicoccus spp., Empoasca spp., Eriosoma spp., Erythroneura spp., Eucalyptolyma spp., Euphyllura spp., Euscelis bilobatus, Ferrisia spp., Geococcus coffeae, Glycaspis spp., Heteropsylla cubana, Heteropsylla spinulosa, Homalodisca coagulata, Hyalopterus arundinis, Icerya spp., Idiocerus spp., Idioscopus spp., Laodelphax striatellus, Lecanium spp., Lepidosaphes spp., Lipaphis erysimi, Macrosiphum spp., Macrosteles facifrons, Mahanarva spp., Melanaphis sacchari, Metcalfiella spp., Metopolophium dirhodum, Monellia costalis, Monelliopsis pecanis, Myzus spp., Nasonovia ribisnigri, Nephotettix spp., Nettigoniclla spectra, Nilaparvata lugens, Oncometopia spp., Orthezia praelonga, Oxya chinensis, Pachypsylla spp., Parabemisia myricae, Paratrioza spp., Parlatoria spp., Pemphigus spp., Peregrinus maidis, Phenacoccus spp., Phloeomyzus passerinii, Phorodon humuli, Phylloxera spp., Pinnaspis aspidistrae, Planococcus spp., Prosopidopsylla flava, Protopulvinaria pyriformis, Pseudaulacaspis pentagona, Pseudococcus spp., Psyllopsis spp., Psylla spp., Pteromalus spp., Pyrilla spp., Quadraspidiotus spp., Quesada gigas, Rastrococcus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus titanus, Schizaphis graminum, Selenaspidus articulatus, Sogata spp., Sogatella furcifera, Sogatodes spp., Stictocephala festina, Siphoninus phillyreae, Tenalaphara malayensis, Tetragonocephela spp., Tinocallis caryaefoliae, Tomaspis spp., Toxoptera spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza spp., Typhlocyba spp., Unaspis spp., Viteus vitifolii, Zygina spp.;
[00314] da ordem Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex spp., Athalia spp., Atta spp., Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Sirex spp., Solenopsis invicta, Tapinoma spp., Urocerus spp., Vespa spp., Xeris spp.;
[00315] da ordem Isopoda, por exemplo, Armadillidium vulgare, Oniscus asellus, Porcellio scaber;
[00316] da ordem Isoptera, por exemplo, Coptotermes spp., Cornitermes cumulans, Cryptotermes spp., Incisitermes spp., Microtermes obesi, Odontotermes spp., Reticulitermes spp.;
[00317] da ordem Lepidoptera, por exemplo, Achroia grisella, Acronicta major, Adoxophyes spp., Aedia leucomelas, Agrotis spp., Alabama spp., Amyelois transitella, Anarsia spp., Anticarsia spp., Argyroploce spp., Barathra brassicae, Borbo cinnara, Bucculatrix thurberiella, Bupalus piniarius, Busseola spp., Cacoecia spp., Caloptilia theivora, Capua reticulana, Carpocapsa pomonella, Carposina niponensis, Cheimatobia brumata, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocerus spp., Cnaphalocrocis medinalis, Cnephasia spp., Conopomorpha spp., Conotrachelus spp., Copitarsia spp., Cydia spp., Dalaca noctuides, Diaphania spp., Diatraea saccharalis, Earias spp., Ecdytolopha aurantium, Elasmopalpus lignosellus, Eldana saccharina, Ephestia spp., Epinotia spp., Epiphyas postvittana, Etiella spp., Eulia spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Galleria mellonella, Gracillaria spp., Grapholitha spp., Hedylepta spp., Helicoverpa spp., Heliothis spp., Hofmannophila pseudospretella, Homoeosoma spp., Homona spp., Hyponomeuta padella, Kakivoria flavofasciata, Laphygma spp., Laspeyresia molesta, Leucinodes orbonalis, Leucoptera spp., Lithocolletis spp., Lithophane antennata, Lobesia spp., Loxagrotis albicosta, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma neustria, Maruca testulalis, Mamstra brassicae, Melanitis leda, Mocis spp., Monopis obviella, Mythimna separata, Nemapogon cloacellus, Nymphula spp., Oiketicus spp., Oria spp., Orthaga spp., Ostrinia spp., Oulema oryzae, Panolis flammea, Parnara spp., Pectinophora spp., Perileucoptera spp., Phthorimaea spp., Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter spp., Pieris spp., Platynota stultana, Plodia interpunctella, Plusia spp., Plutella xylostella, Prays spp., Prodenia spp., Protoparce spp., Pseudaletia spp., Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Pyrausta nubilalis, Rachiplusia nu, Schoenobius spp., Scirpophaga spp., Scirpophaga innotata, Scotia segetum, Sesamia spp., Sesamia inferens, Sparganothis spp., Spodoptera spp., Spodoptera praefica, Stathmopoda spp., Stomopteryx subsecivella, Synanthedon spp., Tecia solanivora, Thermesia gemmatalis, Tinea cloacella, Tinea pellionella, Tineola bisselliella, Tortrix spp., Trichophaga tapetzella, Trichoplusia spp., Tryporyza incertulas, Tuta absoluta, Virachola spp.;
[00318] da ordem Orthoptera ou Saltatoria, por exemplo, Acheta domesticus, Dichroplus spp., Gryllotalpa spp., Hieroglyphus spp., Locusta spp., Melanoplus spp., Schistocerca gregaria;
[00319] da ordem Ftiraptera, por exemplo, Damalinia spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Ptirus pubis, Trichodectes spp.;
[00320] da ordem Psocoptera, por exemplo, Lepinatus spp., Liposcelis spp.;
[00321] da ordem Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp., Ctenocephalides spp., Pulex irritans, Tunga penetrans, Xenopsylla cheopsis;
[00322] da ordem Thysanoptera, por exemplo, Anaphothrips obscurus, Baliothrips biformis, Drepanothrips reuteri, Enneothrips flavens, Frankliniella spp., Heliothrips spp., Hercinothrips femoralis, Rhipiphorothrips cruentatus, Scirtothrips spp., Taeniothrips cardamomi, Thrips spp.;
[00323] da ordem Zygentoma (=Thysanura), por exemplo, Ctenolepisma spp., Lepisma saccharina, Lepismodes inquilinus, Thermobia domestica;
[00324] da classe Symphila, por exemplo, Scutigerella spp.;
[00325] pragas do filo Mollusca, especialmente da classe Bivalvia, por exemplo, Dreissena spp., e da classe Gastropoda, por exemplo, Arion spp., Biomphalaria spp., Bulinus spp., Deroceras spp., Galba spp., Lymnaea spp., Oncomelania spp., Pomacea spp., Succinea spp.;
[00326] pragas animais dos filos Plathelminthes e Nematoda, por exemplo, Ancylostoma duodenale, Ancylostoma ceylanicum, Acylostoma braziliensis, Ancylostoma spp., Ascaris spp., Brugia malayi, Brugia timori, Bunostomum spp., Chabertia spp., Clonorchis spp., Cooperia spp., Dicrocoelium spp., Dictyocaulus filaria, Diphyllobothrium latum, Dracunculus medinensis, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Enterobius vermicularis, Faciola spp., Haemonchus spp., Heterakis spp., Hymenolepis nana, Hyostrongulus spp., Loa Loa, Nematodirus spp., Oesophagostomum spp., Opisthorchis spp., Onchocerca volvulus, Ostertagia spp., Paragonimus spp., Schistosomen spp., Strongyloides fuelleborni, Strongyloides stercoralis, Stronyloides spp., Taenia saginata, Taenia solium, Trichinella spiralis, Trichinella nativa, Trichinella britovi, Trichinella nelsoni, Trichinella pseudopsiralis, Trichostrongulus spp., Trichuris trichuria, Wuchereria bancrofti;
[00327] pragas fitoparasitas do filo Nematoda, por exemplo, Aphelenchoides spp., Bursaphelenchus spp., Ditylenchus spp., Globodera spp., Heterodera spp., Longidorus spp., Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus spp., Trichodorus spp., Tylenchulus spp., Xiphinema spp., Helicotylenchus spp., Tylenchorhynchus spp., Scutellonema spp., Paratrichodorus spp., Meloinema spp., Paraphelenchus spp., Aglenchus spp., Belonolaimus spp., Nacobbus spp., Rotylenchulus spp., Rotylenchus spp., Neotylenchus spp., Paraphelenchus spp., Dolichodorus spp., Hoplolaimus spp., Punctodera spp., Criconemella spp., Quinisulcius spp., Hemicycliophora spp., Anguina spp., Subanguina spp., Hemicriconemoides spp., Psilenchus spp., Pseudohalenchus spp., Criconemoides spp., Cacopaurus spp., Hirschmaniella spp, Tetylenchus spp.
[00328] O fato de que a composição é bem tolerada por plantas nas concentrações requeridas para controlar as doenças e pragas de planta permite o tratamento de partes de plantas acima do solo, de estoque e sementes de propagação, e do solo.
[00329] De acordo com a invenção, todas as plantas e partes da planta podem ser tratadas. Plantas significa todas as plantas e populações de planta como plantas selvagens desejáveis e indesejáveis, cultivares e variedades de planta (se ou não protegíveis por variedade de planta ou direitos de reprodutor de planta). Os cultivares e variedades de planta podem ser plantas obtidas por métodos convencionais de propagação e reprodução que podem ser auxiliados ou suplementados por um ou mais métodos biotecnológicos como pelo uso de haploides duplos, fusão de protoplasto, mutagênese direcionada e aleatória, marcadores moleculares ou genéticos ou por métodos de bioengenharia e engenharia genética. Partes da planta significa todas as partes e órgãos acima do solo e abaixo do solo de plantas como broto, folha, flor e raiz, através do que, por exemplo, folhas, pontas, troncos, ramos, flores, corpos de frutificação, frutas e semente bem como raízes, cormos e rizomas são listados. Os cultivos e o material de propagação vegetativo e generativo, por exemplo, mudas, cormos, rizomas, canais e sementes também pertencem a partes da planta.
[00330] A composição inventiva, quando é bem tolerada por plantas, tem toxicidade homotérmica favorável e é bem tolerada pelo ambiente, é adequada para proteger plantas e órgãos da planta, para acentuação de produtividades de colheita, para aprimorar a qualidade do material colhido. A mesma pode, de preferência, ser usada como composição de proteção de cultivos. A mesma é ativa contra espécies normalmente sensíveis e resistentes e contra todos ou alguns estágios de desenvolvimento.
[00331] As plantas que podem ser tratadas de acordo com a invenção incluem as seguintes plantas de cultivo principais: maís, soja, alfafa, algodão, girassol, sementes oleosas de Brassica, como Brassica napus (por exemplo, canola, semente de colza), Brassica rapa, B. juncea (por exemplo, (campo) mostarda) e Brassica carinata, Arecaceae sp. (por exemplo, palma, coco), arroz, trigo, batata-doce, cana de açúcar, aveias, centeio, cevada, milhete e sorgo, triticale, linho, nozes, uvas e videira e várias frutas e vegetais de várias taxonômicos botânicos, por exemplo, Rosaceae sp. (por exemplo, frutas pomo como maçãs e pêras, mas também frutas com caroço como abricós, cerejas, amêndoas, ameixas e pêssegos, e frutas de baga como morangos, framboesas, passas vermelha e preta e groselha espinhosa), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp. (por exemplo, oliveira), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (por exemplo, abacate, canela, cânfora), Musaceae sp. (por exemplo, bananeiras e plantações de banana), Rubiaceae sp. (por exemplo, café), Theaceae sp. (por exemplo, chá), Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (por exemplo, limões, laranjas, mandarinas e uva); Solanaceae sp. (por exemplo, tomates, batatas, pimentas, pimenta-da- guiné, berinjelas, tabaco), Liliaceae sp., Compositae sp. (por exemplo, alface, alcachofras e chicória - incluindo raiz de chicória, endívia ou chicória comum), Umbelliferae sp. (por exemplo, cenouras, salsa, aipo e aipo-rábano), Cucurbitaceae sp. (por exemplo, pepinos - incluindo picles, abóboras, melancias, cabaças e melões), Alliaceae sp. (por exemplo, alhos-porós e cebolas), Cruciferae sp. (por exemplo, repolho branco, repolho roxo, brócolis, couve- flor, couve-de-Bruxelas, pak-choi, couve-rábano, rabanetes, rábano silvestre, agrião e repolho chinês), Leguminosae sp. (por exemplo, amendoins, ervilhas, lentilhas e feijões - por exemplo, feijões comuns e feijões grandes), Chenopodiaceae sp. (por exemplo, acelga, beterraba forrageira, espinafre, raiz da beterraba), Linaceae sp. (por exemplo, cânhamo), Cannabeacea sp. (por exemplo, cannabis), Malvaceae sp. (por exemplo, quiabo, cacau), Papaveraceae (por exemplo, papoula), Asparagaceae (por exemplo, aspargos); plantas úteis e plantas ornamentais no jardim e nas florestas incluindo turfa, grama, capim e Stevia rebaudiana; e, em cada caso, os tipos geneticamente modificados dessas plantas.
[00332] Dependendo das espécies de planta ou dos cultivares de planta, de sua localização e condições de crescimento (solos, clima, período de vegetação, dieta), que usam ou empregam a composição de acordo com a presente invenção, o tratamento de acordo com a invenção também pode resultar em efeitos superaditivos (“sinérgicos”). Dessa forma, por exemplo, pelo uso ou emprego da composição inventiva no tratamento de acordo com a invenção, taxas de aplicação reduzidas e/ou uma ampliação do espectro de atividade e/ou um aumento no crescimento vegetal com melhor atividade, tolerância aumentada a altas ou baixas temperaturas, tolerância aumentada à aridez ou à água ou ao teor de sal no solo, desempenho de florescência aumentado, colheita mais fácil, maturação acelerada, produtividades de colheita superiores, frutas maiores, altura de planta maior, cor de folha mais verde, florescimento mais rápido, qualidade superior e/ou um valor nutricional mais alto dos produtos colhidos, concentração de açúcar mais alta nas frutas, melhor capacidade de armazenamento e/ou processabilidade dos produtos colhidos são possíveis, o que excede os efeitos que eram de fato esperados.
[00333] Em certas taxas de aplicação da composição inventiva, o tratamento de acordo com a invenção pode também ter um efeito de reforço em plantas. O sistema de defesa da planta contra o ataque por fungos fitopatogênicos e/ou micro-organismos e/ou vírus indesejados é mobilizado. As substâncias de reforço de planta (indução de resistência) devem ser entendidas como significando, no presente contexto, aquelas substâncias ou combinações de substâncias que têm capacidade de estimular o sistema de defesa de plantas de modo que, quando subsequentemente inoculadas com fungos fitopatogênicos e/ou micro-organismos e/ou vírus indesejados, as plantas tratadas exibem um grau substancial de resistência a esses fungos fitopatogênicos e/ou micro-organismos e/ou vírus. Dessa forma, pelo uso ou emprego da composição de acordo com a presente invenção no tratamento de acordo com a invenção, as plantas podem ser protegidas contra o ataque pelos patógenos supracitados dentro de um certo período de tempo após o tratamento. O período de tempo dentro do qual a proteção é efetuada em geral se estende de 1 a 10 dias, de preferência, 1 a 7 dias, após o tratamento das plantas com os compostos ativos.
[00334] As plantas e cultivares de planta que também devem, de preferência, ser tratadas de acordo com a invenção são resistentes contra um ou mais estresses bióticos, isto é, as ditas plantas mostram uma defesa melhor contra animais e pragas microbianas, como contra nematódeos, insetos, ácaros, fungos fitopatogênicos, bactérias, vírus e/ou viroides.
[00335] As plantas e os cultivares de planta que também podem ser tratadas de acordo com a invenção são aquelas plantas que são resistentes a um ou mais estresses abióticos, isto é, que já exibem uma saúde da planta aumentada em relação à tolerância ao estresse. As condições de estresse abiótico podem incluir, por exemplo, aridez, exposição à temperatura fria, exposição a calor, estresse osmótico, inundação, salinidade de solo aumentada, exposição a mineral aumentada, exposição a ozônio, exposição à luz alta, disponibilidade limitada de nutrientes de nitrogênio, disponibilidade limitada de nutrientes de fósforo, evitação de sombra. De preferência, o tratamento dessas plantas e cultivares com a composição da presente invenção aumenta adicionalmente a saúde da planta em geral (consulte acima).
[00336] As plantas e cultivares de planta que também podem ser tratadas de acordo com a invenção são aquelas plantas caracterizadas por características de produtividade acentuadas, isto é, que já exibem uma saúde da planta aumentada em relação a esse recurso. A produtividade aumentada nas ditas plantas pode ser o resultado, por exemplo, de fisiologia, crescimento e desenvolvimento de planta aprimorados, como eficiência de uso de água, eficiência de retenção de água, uso de nitrogênio aprimorado, assimilação de carbono aumentada, fotossíntese aprimorada, eficiência de germinação aumentada e maturação acelerada.
[00337] A produtividade pode ser adicionalmente afetada por arquitetura de planta aprimorada (sob condições de estresse e não estresse), incluindo, mas não se limitando a, florescimento precoce, controle de florescimento para produção de semente híbrida, vigor de mudas, tamanho de planta, número e distância entre os nós, crescimento de raiz, tamanho de semente, tamanho de fruta, tamanho de vagem, número de vagem ou espiga, número de semente por vagem ou espiga, massa de semente, preenchimento de semente acentuado, dispersão de semente reduzida, deiscência de vagem reduzida e resistência a acamamento. Os tratos de produtividade adicionais incluem composição de semente, como teor de carboidrato, teor de proteína, teor e composição de óleo, valor nutricional, redução em compostos antinutricionais, processabilidade aprimorada e melhor estabilidade de armazenamento. De preferência, o tratamento dessas plantas e cultivares com a composição da presente invenção aumenta adicionalmente a saúde da planta em geral (consulte acima).
[00338] As plantas que podem ser tratadas de acordo com a invenção são plantas híbridas que já expressam a característica de heterose ou vigor híbrido que resulta, em geral, em produtividade, vigor, saúde e resistência superiores voltados para fatores de estresse biótico e abiótico. Tais plantas são tipicamente feitas pelo cruzamento de uma linhagem parental estéril macho natural (a mãe) com uma outra linhagem parental fértil macho natural (o pai). A semente híbrida é tipicamente colhida das plantas macho estéreis e vendida para cultivadores. As plantas macho estéreis podem, algumas vezes, (por exemplo, no milho) ser produzidas por remoção de pendão, isto é, a remoção mecânica dos órgãos macho reprodutores (ou flores macho), mas, mais tipicamente, a esterilidade do macho é o resultado de determinantes genéticos no genoma da planta. Nesse caso e especialmente quando a semente é o produto desejado a ser colhido das plantas híbridas, é tipicamente útil assegurar que a fertilidade do macho nas plantas híbridas seja completamente restaurada. Isso pode ser realizado ao assegurar que os parentes macho tenham genes restauradores de fertilidade de macho que têm capacidade de restaurar a fertilidade de macho em plantas híbridas que contêm os determinantes genéticos responsáveis por esterilidade de macho. Os determinantes genéticos para esterilidade de macho podem ser localizados no citoplasma. Os exemplos de esterilidade de macho citoplásmica (CMS) foram, por exemplo, descritos em espécies de Brassica. Entretanto, os determinantes genéticos para esterilidade de macho também podem ser localizados no genoma nuclear. As plantas macho estéreis podem também ser obtidas por métodos de biotecnologia de plana como engenharia genética. Um meio particularmente útil de obter plantas macho estéreis é descrito no documento WO 89/10396, no qual, por exemplo, uma ribonuclease como barnase é seletivamente expressa nas membranas celulares nos estames. A fertilidade pode, então, ser restaurada por expressão nas membranas celulares de um inibidor de ribonuclease como barstar.
[00339] As plantas ou cultivares de planta (obtido por métodos de biotecnologia de planta como engenharia genética) que podem ser tratadas de acordo com a invenção são plantas tolerantes a herbicida, isto é, plantas tornadas tolerantes a um ou mais determinados herbicidas. Tais plantas podem ser obtidas por transformação genética ou por seleção de plantas que contêm uma mutação que prejudica tal tolerância ao herbicida.
EXEMPLOS
[00340] Exemplo 1: Fórmula para a Eficácia da Combinação de Múltiplos Ingredientes Ativos
[00341] Um efeito sinérgico de ingredientes ativos está presente quando a atividade das combinações de ingrediente ativo excede o total das atividades dos ingredientes ativos quando aplicados individualmente. A atividade esperada para uma dada combinação de dois ingredientes ativos pode ser calculada da seguinte forma (consulte Colby, S.R., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, Weeds, 1967, 15, 20-22): Se
[00342] X for a eficácia quando o ingrediente ativo A é aplicado a uma taxa de aplicação de m ppm (ou g/ha),
[00343] Y for a eficácia quando o ingrediente ativo B é aplicado a uma taxa de aplicação de n ppm (ou g/ha),
[00344] E é a eficácia quando os ingredientes ativos A e B são aplicados em taxas de aplicação de m e n ppm (ou g/ha), respectivamente, e
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[00345] Se a atividade então, a atividade da combinação é superaditiva, isto é, existe um efeito sinérgico. Nesse caso, a eficácia que foi de fato observada precisa ser maior que o valor para a eficácia esperada (E) calculada a partir da fórmula mencionada acima.
[00346] Por exemplo, a fórmula e a análise podem ser aplicadas a uma avaliação de promoção de crescimento vegetal. Tal ensaio é avaliado vários dias após as aplicações a plantas. 100 % significa o peso de planta que corresponde ao da planta de controle não tratada. Eficácia significa, nesse caso, o % adicional de peso de planta em comparação com o do controle não tratado. Por exemplo, um tratamento que resultou em pesos de planta que foram 120 % em comparação com a planta de controle não tratada teria uma eficácia de 20 %. Se o efeito de promoção de crescimento vegetal para a combinação (isto é, a eficácia observada para % de pesos de planta das plantas tratadas com a combinação) exceder o valor calculado, então, a atividade da combinação é superaditiva, isto é, existe um efeito sinérgico.
[00347] A fórmula e a análise também podem ser usadas para avaliar a sinergia em ensaios de controle de doença. O grau de eficácia expresso em % é denotado. 0 % significa uma eficácia que corresponde ao do controle enquanto uma eficácia de 100 % significa que nenhuma doença é observada.
[00348] Se a atividade fungicida ou inseticida real exceder o valor calculado, então, a atividade da combinação é superaditiva, isto é, existe um efeito sinérgico. Nesse caso, a eficácia que é de fato observada precisa ser maior que o valor para a eficácia esperada (E) calculada a partir da fórmula mencionada acima.
[00349] Uma maneira adicional de demonstrar um efeito sinérgico é o método de Tammes (consulte “Isoboles, A Graphic Representation of Synergism in Pesticides”, em Neth. J. Plant Path., 1964, 70, 73-80).
[00350] Exemplo 2: Promoção de Crescimento Vegetal com Flupiradifurona e Células Recombinantes de Bacillus thuringiensis
[00351] Os experimentos foram conduzidos para analisar a eficácia de uma combinação de flupiradifurona e um produto de fermentação de células recombinantes de Bacillus thuringiensis que expressam fosfolipase C (“BEPC”). As sementes de maís foram desenvolvidas em mistura estéril de meios sintéticos e areia em vasos quadrados pequenos de três polegadas em prateleiras de luz em um ambiente de crescimento vegetal entre 25 e 28 °C e 50 % de umidade por cerca de 14 dias. Duas sementes foram plantadas em cada vaso. No plantio, os meios de crescimento em cada vaso foram banhados com os tratamentos descritos abaixo. Após 14 dias, as plantas foram medidas em relação a biomassa de planta integral. Nas tabelas a seguir, UTC se refere a controle não tratado. “Calculado” se refere ao efeito esperado calculado com o uso da equação de Colby descrita acima e “eficácia” se refere ao efeito real observado. • produto SIVANTO®, que contém flupiradifurona como seu ingrediente ativo (17,09 % de flupiradifurona), foi diluído em 50 ml de água e a solução diluída foi usada para banhar os meios de crescimento. A taxa de aplicação mostrada a seguir se refere à quantidade de ingrediente ativo (isto é, flupiradifurona) aplicada aos meios de crescimento.
[00352] Um membro da família recombinante Bacillus cereus (Bacillus thuringiensis BT013A) que expressa fosfolipase C em seu exósporo (BEPC) foi gerado da seguinte forma. Para gerar os plasmídeos para expressão de proteínas de fusão em membros da família de Bacillus cereus, foram gerados os fragmentos de PCR que codificaram o promotor BclA (SEQ ID NO: 85) , um códon inicial de metionina, e aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1) seguido por uma sequência de ligantes de seis alaninas fundidas na estrutura para fosfolipase de Bacillus thuringiensis BT013A (SEQ ID NO: 108). Esses fragmentos de PCR foram digeridos com XhoI e ligados no sítio SalI do plasmídeo pSUPER para gerar os plasmídeos pSUPER-BclA 20-35-fosfolipase. O plasmídeo pSUPER foi gerado através da fusão do plasmídeo pUC57 (que contém um cassete de resistência à ampicilina) com o plasmídeo pBC16-1 de Bacillus (que contém uma resistência à tetraciclina). Esse plasmídeo de 5,5 kbp pode replicar tanto em E. coli quanto em Bacillus spp. Os plasmídeos pSUPER-BclA 20-35-fosfolipase foram transformados e propagados em cepas de E. coli dam metilase negativas e finalmente foram transformados em Bacillus thuringiensis BT013A.
[00353] Para obter as culturas de caldo integral de BEPC, meios cônicos que contêm infusão de cérebro-coração (BHI) de 15 ml foram inoculados com BEPC e desenvolvidos por 7 a 8 horas em torno de 30 °C em uma configuração de agitador de 300 rpm. No dia seguinte, cotas de 250 µl de cada frasco foram inoculadas em frascos de 250 ml que contêm 50 ml de um meio baseado em extrato de levedura e desenvolvidas a cerca de 30 °C. Após aproximadamente 2 dias de incubação, quando a esporulação foi pelo menos 95 % concluída, o caldo de cultura foi coletado e as unidades formadoras de colônia calculadas. O caldo de fermentação foi diluído para 5 % em 50 ml de água e as seguintes unidades formadoras de colônia aplicadas a cada vaso. Tabela 3
Figure img0015
[00354] Os resultados indicam um efeito superaditivo de produtividade de planta quando se combina flupiradifurona e BEPC.
[00355] Exemplo 3. Promoção de Crescimento Vegetal com Clotianidina e Células Recombinantes de Bacillus thuringiensis
[00356] As sementes de maís serão crescidas em areia argilosa na estufa a 20 °C e 70 % de umidade por cerca de 11 dias. Após cerca de 11 dias do momento do tratamento, as mudas serão cortadas acima do solo e o peso fresco será determinado.
[00357] As células recombinantes de Bacillus thuringiensis que expressam uma endoglucanase codificada por SEQ ID NO: 107 ou uma fosfolipase C codificada por SEQ ID NO: 108 e preparadas como descrito acima serão aplicadas a cerca de 50 µg/núcleo. A clotianidina também será aplicada a cerca de 250 µg/núcleo.
[00358] Espera-se que as plantas de maís tratadas com o Bacillus thuringiensis recombinante em combinação com a clotianidina terão % em pesos de broto que excedem o valor calculado com base nos % de pesos de broto das plantas de maís tratadas com os dois ingredientes ativos sozinhos, isto é, um efeito sinérgico será observado.

Claims (4)

1. Composição, caracterizada por compreender: a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo derivadas de Bacillus thuringiensis BT013A que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) uma fosfolipase tendo SEQ ID NO: 108; e (ii) uma sequência de endereçamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo compreendendo: aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 2; e b) flupiradifurona em uma quantidade sinergicamente eficaz, em que a) e b) estão presentes em uma razão de peso sinérgica na faixa de 20:1 a 1:20.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de endereçamento compreende os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1.
3. Semente revestida, caracterizada por ser revestida com a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.
4. Método de tratamento de uma planta, uma parte da planta ou o locus que circunda a planta para acentuar o crescimento vegetal e/ou promover a saúde da planta caracterizado por compreender a aplicação de: a) células recombinantes de Bacillus que produzem exósporo derivadas de Bacillus thuringiensis BT013A que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) uma fosfolipase tendo SEQ ID NO: 108; e (ii) uma sequência de endereçamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo compreendendo: aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 2; e b) flupiradifurona em uma quantidade sinergicamente eficaz, em que a) e b) estão presentes em uma razão de peso sinérgica na faixa de 20:1 a 1:20.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 17/09/2015, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS