CN114507653A

CN114507653A - 一种磷酸二酯酶bsp、生物制剂及其应用

Info

Publication number: CN114507653A
Application number: CN202210139703.7A
Authority: CN
Inventors: 陈红歌; 王明道; 夏国庆; 林晖; 楚梦晓; 朱华楠
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114507653B

Abstract

本发明提供了一种磷酸二酯酶BSP、生物制剂及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种新型的磷酸二酯酶BSP，具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性，经实验显示，所述磷酸二酯酶BSP处理金黄色葡萄球菌的抑菌率达到67.63％，处理耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌率达到53.20％。同时，将所述磷酸二酯酶BSP与氯化锌和红霉素联用，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌率达到95.2％，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌和杀菌功能。

Description

一种磷酸二酯酶BSP、生物制剂及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种磷酸二酯酶BSP、生物制剂及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的革兰氏阳性致病菌，可以引起人和动物多种疾病。在畜牧养殖中，金黄色葡萄球菌感染可引起动物脓性皮炎、肺炎、乳房炎及全身性菌血症等，造成养殖业产量和效益的巨大损失。金黄色葡萄球菌感染类疾病的防治更为棘手的是金黄色葡萄球菌耐药菌株的大量出现。自1961年英国学者Jevons首次分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)后，MRSA开始在世界范围内广泛被发现。MRSA具有多重耐药性，不仅对β-内酰胺类抗生素耐药，也对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类以及磺胺类抗生素有较强的耐药性，成为“超级细菌”，引起人畜相当高的发病率和死亡率。

解决MRSA感染一方面是不断发现新型的针对MRSA的抗生素，另一方面，通过抗生素辅助剂的使用，恢复MRSA的药敏性，如采用D-酪氨酸(姚泽明,等.2017)、丁香油(邱敏,等.2019)、地榆醇提物(Chen,etal.2015)等与β-内酰胺类抗生素联用可以对MRSA产生一定程度的抑制作用。然而，目前仍十分缺乏有效的化学或生物制剂强化抗生素作用以控制MRSA。

磷壁酸是革兰氏阳性细菌细胞壁的特有成分，它是由带有取代基的甘油磷酸或者核糖醇磷酸为单体通过磷酸二酯键连接而成的线性多聚体，其质量占细胞壁干重的50％。磷壁酸在革兰氏阳性致病菌的宿主定殖、肽聚糖合成及细胞分裂中发挥着重要作用(Atilano,etal.2010；Campbell,etal.2011)。新近的研究发现，磷壁酸还与MRSA菌株对抗生素的耐药性有关。而一些磷酸二酯酶类可以作用于革兰氏阳性菌磷壁酸骨架中的磷酸二酯键，产生游离的磷酸、甘油或者核糖醇，将磷壁酸的骨架结构破坏，具有这种作用的酶也被称为磷壁酸酶。2015年，第一个磷壁酸酶基因被鉴定(Myers,etal.2015)，该磷壁酸酶基因为枯草杆菌噬菌体φ29基因组中的GP12基因，GP12蛋白作为噬菌体φ29的一种附属蛋白，被证实可以降解磷壁酸。然而，目前能够降解磷壁酸的酶蛋白和基因的相关信息还很少，阻碍了细菌学的研究进展，缺少对由革兰氏阳性细菌引起的外伤感染的治疗和食入性疾病的防范的生物试剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种磷酸二酯酶BSP，具有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性，对金黄色葡萄球菌的生长具有明显的抑制作用。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种磷酸二酯酶BSP，所述磷酸二酯酶BSP的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

优选的，所述磷酸二酯酶BSP来源于枯草芽孢杆菌BGSC3A28菌株。

本发明提供了编码上述磷酸二酯酶BSP的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

本发明还提供了上述的磷酸二酯酶BSP在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

优选的，所述金黄色葡萄球菌包括耐药性金黄色葡萄球菌和非耐药性金黄色葡萄球菌。

更优选的，所述应用包括用于金黄色葡萄球菌引起的动物表皮感染和用于抑制金黄色葡萄球菌肠道感染的饲料添加剂。

本发明还提供了一种具有抑菌作用的生物制剂，所述生物制剂包括上述的磷酸二酯酶BSP，或还包括联用试剂。

优选的，所述联用试剂包括氯化锌和/或抗生素。

更优选的，所述抗生素包括氨苄青霉素、新霉素和红霉素中的任意一种。

本发明还提供了上述的生物制剂在抑制或灭杀金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明提供了一种新型的磷酸二酯酶BSP，具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性，可通过水解金黄色葡萄球菌细胞壁中磷壁酸的结构而引起细菌生长的抑制，没有产生对BSP耐药性的机制。经实验显示，本发明所述磷酸二酯酶BSP处理金黄色葡萄球菌的抑菌率达到67.63％，处理耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌率达到53.20％，适用于金黄色葡萄球菌和耐药性金黄色葡萄球菌引起的动物表皮感染，或者可用于饲料添加剂抑制金黄色葡萄球菌肠道感染。同时，将本发明所述磷酸二酯酶BSP与氯化锌或红霉素联用，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌率达到95.2％，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌和杀菌功能，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染产生的健康威胁提供了新的解决方案。

附图说明

图1为BSP蛋白在大肠杆菌中的表达情况；其中，M为蛋白marker，1为全细胞组分，2为细胞破碎后上清，3为细胞破碎后沉淀。

图2为BSP蛋白的自裂解位点。

图3为纯化的BSP蛋白；其中，M为蛋白marker，1为纯化的BSP。

图4为BSP最适作用温度及最适作用pH的测定；其中，a)BSP最适作用温度的测定，b)BSP最适作用pH的测定。

图5为金属离子对BSP催化活性的影响。

图6为BSP对金黄色葡萄球菌(Sa)生长的影响。

图7为BSP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长的影响。

图8为不同浓度的BSP作用下金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值。

图9为不同金属离子与BSP联用处理金黄色葡萄菌球的OD₆₀₀值。

图10为BSP蛋白与氨苄青霉素联用处理MRSA不同时间后的OD₆₀₀值。

图11为BSP蛋白与新霉素联用处理MRSA不同时间后的OD₆₀₀值。

图12为BSP蛋白与红霉素联用处理MRSA不同时间后的OD₆₀₀值。

图13为BSP联用氯化锌及红霉素处理时MRSA培养物颜色发生改变；其中，1、2、3管为无BSP添加培养24h培养液；4、5、6管为BSP添加培养24h培养液。

具体实施方式

本发明中，编码所述磷酸二酯酶BSP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述磷酸二酯酶BSP来源于枯草芽孢杆菌BGSC3A28菌株(Bacillus subtilisBGSC3A28)，具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性。本发明所述BSP与已知的磷酸二酯酶没有显著的同源性，与GP12蛋白的同源性仅有39.29％，是一个新型的磷酸二酯酶。本发明所述磷酸二酯酶BSP以可溶形式表达，所述BSP蛋白在674-675位点间发生了切割。成熟的BSP蛋白包含674个氨基酸残基，蛋白的分子量为71.4kDa。

本发明中，所述金黄色葡萄球菌包括耐药性金黄色葡萄球菌和非耐药性金黄色葡萄球菌。在本发明的具体实施例中，所述耐药性金黄色葡萄球菌优选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，记作MRSA)，所述非耐药性金黄色葡萄球菌优选为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，记作Sa)。本发明中，所述应用包括用于金黄色葡萄球菌引起的动物表皮感染和用于抑制金黄色葡萄球菌肠道感染的饲料添加剂。本发明对所述应用的具体方法并没有特殊限定，针对不同的应用对象，选取本领域常规的应用方法即可。

本发明中，所述联用试剂优选为氯化锌和/或抗生素；所述抗生素优选为氨苄青霉素、新霉素和红霉素中的任意一种，更优选为红霉素。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1BSP蛋白的制备

在NCBI中查找BSP蛋白WP_032721605.1的基因序列(NCBI收录号为NZ_FODG01000008.1)，经密码子优化后得到编码BSP蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中，所述编码基因的5'端和3'端分别添加NdeI和XhoI的酶切位点。所述基因编码得到的BSP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将所述SEQ ID NO.2基因序列交由苏州金唯智公司进行基因合成，并将其构建至pET-21a(+)载体。将构建得到的重组pET-21a(+)载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得测序正确的大肠杆菌转化子。

将重组大肠杆菌接种至100mL LB培养基中，37℃，250rpm培养2.5h至OD₆₀₀值达到0.8-0.9时，添加0.1mM IPTG，16℃、180rpm诱导20h。离心收集菌体，用20mL平衡缓冲液(NaCl 8.766g，咪唑0.340g，三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21g溶于400mL去离子水中，盐酸调节pH至7.4，定容至500mL)洗涤菌体2次，将洗涤后的菌体用10mL裂解缓冲液重悬于50mL离心管中，冰水浴条件下超声处理20min(6mm变幅杆，功率200W，工作3s，暂停5s)裂解菌体。超声后4℃、12000×g下离心10min，取上清作为可溶蛋白组份，SDS-PAGE检测BSP蛋白的表达，结果如图1所示。

可以看出，BSP以可溶形式表达，但表达蛋白的分子量却明显低于BSP的理论分子量92.0kDa，约为70kDa。通过对BSP氨基酸序列的分析可知，BSP中含有一个自裂解结构域(Peptidase_G2(pfam11962)，氨基酸残基618-847可能发挥了自裂解功能。

采用Ni-NTA柱纯化带有(His)6标签序列的BSP的N端部分和BSP的C端部分，将上述超声破碎后离心的上清液上样至Ni-NTA柱，用平衡缓冲液冲洗柱子后，用洗脱缓冲液(NaCl8.766g，咪唑10.212g，三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21g溶于400mL去离子水中，盐酸调节pH至7.4，定容至500mL)以0.5ml/min的流速洗脱带有(His)6标签的BSP蛋白，根据SDS-PAGE判断其纯度，对SDS-PAGE均一纯的BSP蛋白送样至上海生工公司进行质谱分析BSP的自切割位点。结果如图2所示。将纯化后的BSP蛋白进行电泳，得到结果如图3所示。

由图2和图3可以看出，BSP蛋白在674-675位点间确实发生了切割，成熟BSP蛋白包含1-674氨基酸残基，理论分子量为71.4kDa，纯化得到的BSP蛋白的大小与成熟BSP蛋白的理论值相符。

实施例2 BSP的磷酸酯酶活性

1.分别以双-对硝基酚基-磷酸钠(bis-pNPP)、对硝基酚基-磷酸二钠(pNPP)为底物，检测BSP是否具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性。

测定酶活性的反应体系如下：在100μL的终反应体系中，含有40mM的Tris-HCl、1mM的CaCl₂、10mM的bis-pNPP(或pNPP)、1.8μM的BSP蛋白(对照管在加入Na₂CO₃溶液终止反应后补加等量的BSP)，将反应管和对照管置于37℃保温反应30min，然后加入200μL 2M的Na₂CO₃溶液终止反应，补加2.9mL去离子水后，测定OD₄₀₀值，换算出释放的对硝基酚的量(对硝基酚的消光系数为：1.74×10⁴mol^-1·cm^-1·L)。

酶活力单位定义：在上述条件下，1min内催化bis-pNPP(或pNPP)产生μmol对硝基酚的酶量为1个酶活力单位(IU)。

测定结果表明，无论是以bis-pNPP为底物还是以pNPP为底物，BSP均产生了对硝基酚，分别对应着BSP具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性。BSP的磷酸二酯酶活性为1.40IU/mg，磷酸单酯酶活性为0.92IU/mg。

2.以bis-pNPP为底物，在反应体系pH为7.2，反应时间为15min的条件下，测定BSP的最适作用温度。同时，在结果反应体系温度为37℃，反应时间为15min的条件下，测定BSP的最适作用pH。结果如图4所示。

可以看出，本发明的新型BSP酶具有磷酸二酯酶活性和磷酸单酯酶活性。以bis-pNPP为底物，BSP催化bis-pNPP水解的最适催化温度为85℃，最适催化pH为8.5。

3.为确定金属离子对BSP活性的影响，测定不同金属离子对BSP活性的影响，具体测定方法步骤如下：在1中所述的反应体系中(以bis-pNPP为底物)，分别加入终浓度为1mM的EDTA和各种金属离子氯化物，以与1同样的方法测定BSP的磷酸二酯酶活性，以不加EDTA或金属离子的BSP的酶活性为100％，计算EDTA和各种金属离子存在下BSP的相对酶活力，检测得到的结果如图5所示。

可以看出，在EDTA存在的条件下，BSP依然具有水解活性。多数二价离子都对BSP的催化活性有促进效果，其中Mn²⁺和Co²⁺的促进效果最为明显，分别提高了414％、331％，而Fe³ ⁺的存在明显降低了BSP的催化活性。

进一步采用Eadie-Hofstee作图法测定了BSP作用于bis-pNPP的动力学参数：在1中所述的反应体系中，将底物bis-pNPP的浓度分别设为0.5、1.0、2.0、5.0、10、30mM，将反应管和对照管置于37℃保温反应10min，其余同1中所述反应体系，测定不同底物浓度下的反应初速率。绘制反应初速率对反应初速率与底物浓度比值(v/[S])的曲线，即Eadie-Hofstee曲线，计算V_max和K_m以及K_cat。结果如下表1所示。

表1 BSP的动力学参数

可以看出，BSP催化bis-pNPP水解的转换数k_cat为6.99min^-1。

实施例3

1.BSP对金黄色葡萄球菌(Sa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长的抑制作用

取3mL的LB液体培养基，按终浓度为50ug/mL(培养液终体积3.5mL)的量加入纯化的BSP，分别加入100uL提前活化的金黄色葡萄球菌(Sa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌种，再以灭菌处理的pH7.5的50mMTris缓冲液补足至3.5mL。以加入等量的灭活BSP为对照，处理组和对照组各设置三个重复。将各培养管于220rpm、37℃恒温震荡培养箱培养，分别于24h、48h取100uL菌液，进行梯度稀释后涂布到固体LB平板进行活菌计数，结果如图6和图7所示。

结果表明，对Sa来说，BSP处理24h和48h时，抑菌率分别为53.33％和67.63％；对MRSA来说，BSP处理24h和48h时，抑菌率分别为53.20％和49.08％，显示BSP具有明显的抑制金黄色葡萄球菌和耐药性金黄色葡萄球菌生长的能力。

2.BSP对金黄色葡萄球菌抑菌的最低作用浓度

用无菌PBS缓冲液对实施例1中亲和层析纯化出的BSP原酶液进行1：1的稀释，将稀释后的酶液依次进行1：1的稀释，最终得到4个BSP浓度，按实施例2中的培养体系分别加入BSP原酶液及稀释酶液，使BSP在培养液中的终浓度分别为50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL和6.25ug/mL，置于37℃摇床，220rpm培养24h时，快速测定培养液的OD₆₀₀值，结果如图8所示。

根据OD₆₀₀值分析BSP对金黄色葡萄球菌生长的抑制情况可知，随着BSP浓度的降低，其对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用也在逐步降低，尽管BSP在12.5ug/mL和6.25ug/mL浓度时仍有一定的抑菌作用，考虑到最低的用酶量下仍有最佳的抑菌效果，因此选取25ug/mL的BSP浓度作为其最适的添加浓度。

实施例4生物制剂的作用

1.BSP的二价金属离子联用剂

选择3种对BSP酶活性有促进作用且本身无色的金属离子：钙、锰、锌，将它们以氯化物溶液的形态直接加入到培养液中，使其终浓度均为1mM，BSP终浓度为25ug/mL，考察3种金属离子能否促进BSP对金黄色葡萄球菌的生长产生更大的抑制作用。为消除金属离子本身对细菌生长的影响，本实施例还设置了单加金属离子处理组。在不同的培养时间下取样测定培养液的OD₆₀₀值，结果如图9所示。其中，图9中每组的第1柱为BSP酶处理的金黄色葡萄球菌即对照组，之后的每2柱为一组，分别为单加金属离子和酶加金属离子，金属离子的顺序为钙、锰、锌。

由图9可知，单加金属离子的情况下，即每组的2、4、6柱，钙离子和锰离子对金葡菌的生长影响并不如锌离子，并且两者在与酶联用条件下对金葡菌生长的影响并没有太大促进作用(每组的3、5柱)，而锌离子却能在本身抑制金葡菌生长(每组的第6柱)的基础上与BSP蛋白共同作用，使抑制金葡菌生长的效果最明显(每组第7柱)。因此，锌离子可以作为BSP蛋白的金属离子联用剂，增强BSP抑制金黄色葡萄球菌生长的效果。

2.BSP联用抗生素对MRSA菌株药敏性恢复的作用

以MRSA菌株ATCC43300为试验对象，根据MRSA菌株ATCC43300的耐药谱，选取4种不同作用类型的抗生素：氨苄青霉素(β-内酰胺类，标准工作浓度100ug/mL)、盐酸四环素(四环素类，标准工作浓度5ug/mL)、新霉素(氨基糖苷类，标准工作浓度20ug/mL)和红霉素(大环内酯类，标准工作浓度100ug/mL)，分别以2×标准工作浓度、1×标准工作浓度、0.5×标准工作浓度添加到MRSA菌株培养液中，以无抗生素添加的MRSA菌株培养液为对照，培养24h后测定培养液的OD₆₀₀值。

结果表明，MRSA菌株ATCC43300对氨苄青霉素、红霉素和新霉素完全耐药，对盐酸四环素敏感。因此后续BSP联用抗生素试验选用氨苄青霉素、新霉素和红霉素，以考察BSP联用抗生素是否对MRSA具有药敏性恢复的作用。

3.以MRSA ATCC43300为试验菌株，分别加入氨苄青霉素100ug/mL、新霉素20ug/mL、红霉素100ug/mL作为对照，在此基础上加入BSP蛋白，BSP蛋白的终浓度为25ug/mL，培养基pH7.0，以PBS缓冲液作为BSP蛋白的空白对照，37℃摇床，220rpm培养不同时间取样测定OD₆₀₀值，结果如图10-12所示。

可以看出，在培养24h时，BSP联用上述3种抗生素均使得MRSA耐药菌的药敏性得到恢复，试验组相较于未加BSP的对照组，菌液浓度降低，说明BSP联用抗生素能够使对抗生素具抗性的MRSA菌株产生抑制，其中，抑制幅度最大、效果最显著的是红霉素。

实施例5 BSP联用氯化锌和红霉素对MRSA生长的抑制情况

以MRSA作为试验菌株，培养基pH为7.0，氯化锌添加终浓度为1mM，红霉素终浓度100ug/mL，BSP终浓度为25ug/mL，同时以未加BSP蛋白(以等体积PBS缓冲液替代)的培养液为对照，培养24h后以活菌计数法进行分析，结果如图13所示。

可以看出，在BSP联用氯化锌和红霉素的条件下，MRSA培养液的颜色发生了明显改变，比浊法测定菌浓度已经不适用。因此，继续对3组对照管和3组试验管进行活菌计数分析可知，对照管活菌数为(191.9±17.7)×10⁹cfu/mL，试验管活菌数为(9.2±1.8)×10⁹cfu/mL，BSP联用氯化锌和红霉素处理对MRSA的抑菌率达到95.2％，证明了BSP联用氯化锌和红霉素对耐药MRSA菌株产生了显著的抑制作用。分析原因，除了BSP对金黄色葡萄球菌直接的影响外，还有可能BSP导致的细菌细胞壁及整个生理状态的改变引起细菌药敏性的恢复，使得抗生素可以有效作用于细菌，总体上表现为BSP联用氯化锌和红霉素对耐药菌MRSA的抑制和杀灭作用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种磷酸二酯酶BSP、生物制剂及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 851

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Phe Lys Tyr Tyr Asp Lys Asn Thr Gly Ser Tyr Val Pro Met

1 5 10 15

Ser Ile Glu Leu Leu Lys Ser Asp Gly Val Ser Tyr Thr Ala Pro Ser

20 25 30

Ile Lys Gln Thr Phe Glu Asp Ile Leu Lys Gln Val Ser Ser Val Ser

35 40 45

Ser Ser Val Thr Glu Lys Val Asp Gly Leu Ser Asn Gln Ile Gly Asn

50 55 60

Ile Asp Asp Phe His Ile Thr Gly Thr Asn Leu Val Glu Lys Ile Leu

65 70 75 80

Asn Ala Leu Ile Gln Arg Arg Val Ser Val Thr Asp Phe Gly Ala Lys

85 90 95

Gly Asp Gly Val Thr Asp Asp Thr Ala Ala Phe Asn Lys Ala Phe Glu

100 105 110

Met Gly Asn Ala Glu Val Phe Val Pro Ala Gly Thr Tyr Met Val Lys

115 120 125

Gly Leu Lys Val Pro Ser Tyr Thr Arg Leu Tyr Gly Thr Gly Lys Leu

130 135 140

Ser Val Ile Lys Leu His Lys Asp Ala Pro Ala Tyr Ser His Val Ile

145 150 155 160

Thr Thr Val Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Ile Phe Glu Asn Leu Leu Leu

165 170 175

Asp Trp Asn Leu Gln Lys Thr Asn Asn Ser Ile Ser Ser Gly Pro Asn

180 185 190

Ser Ser Cys Leu Asn Ile Thr Asn Ser Gln Phe Val Trp Val Asn Asn

195 200 205

Val His Ala Lys Asp Ala Gly Leu His Gly Phe Asp Val Thr Ser Pro

210 215 220

Ser Tyr Asn Ser Leu Thr Asp Thr Glu Asp Val Tyr Gln Pro Gly Gly

225 230 235 240

Ser Lys Tyr Val Trp Ile Asn Asn Cys Thr Ala Thr Asn Phe Gly Asp

245 250 255

Asp Gly Phe Thr Thr His Phe Ser Glu Tyr Val Phe Ile Thr Asn Cys

260 265 270

Tyr Ser Tyr Asp Gly Asn Gly Ser Ala His Thr Ser Gly Ala Ser Asn

275 280 285

Thr Asn Gly Phe Glu Ile Asp Asp Gly Ser Met Lys Val Trp Leu Ile

290 295 300

Asn Cys Val Ser Lys Asn Asn Cys Arg Gly Phe Glu Ala Lys Ala His

305 310 315 320

Glu His Ala Pro Ala Ala Gln Asn Val Thr Phe Leu Asn Cys Val Ser

325 330 335

Glu Asn Asp Ile Arg Ser Phe Asp Phe Arg His Ile Gly Phe His Lys

340 345 350

Ala Ser Asp Pro Glu Ser Lys Thr Ala Arg Asn Ile Met Ala Ser Asn

355 360 365

Cys Thr Ala Ile Lys Pro Ile Phe Asn Asp Arg Leu Tyr Ala Gly Met

370 375 380

Thr Pro Arg Ala Leu Val Ile Ser Ala Tyr Lys Asn Val Asn Ile Ser

385 390 395 400

Asn Phe Thr Ala Ile Gly Asp Pro Ser Tyr Asp Tyr Lys Gly Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ala Thr Gln Tyr Lys Ser Arg Asn Ile Thr Phe Asn Asn Val

420 425 430

Ser Ser Ser Gly Phe Lys Thr Ala Gly Ala Asp Ile Tyr Ile Tyr Gly

435 440 445

Gly Ser Gln Lys Ser Asp Phe Val Ser Leu Ser Asn Ile Asn Val Leu

450 455 460

Glu Ser Ala Leu Ile Gly Ile Arg Ile Gly Ser Ala Ile Lys Asn Ala

465 470 475 480

Ser Val Asn Gln Ala Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Glu Gly Ser Ile

485 490 495

Gly Leu Tyr Cys Thr Asn Ser Gln Val Asp Ile Asn Ala Val Asn Cys

500 505 510

Asp Lys Tyr Ala Ile Pro Ser Lys Ile Ala Gly Lys Ala Tyr Thr Ser

515 520 525

Phe Val Pro Lys Asn Ile Lys Gly Gly Thr Arg Ile Ala Thr Thr Ser

530 535 540

Gly Tyr Ala Ala Lys Asn Thr Ser Leu Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly

545 550 555 560

Gly Gln Ala Thr Gly Thr Ala Ser Ala Val Ile Ala Thr Thr Gly Gly

565 570 575

Ser Lys Ala Asp Gly Pro Arg Asn Val Val Ile Ala Ser Ser Gly Gly

580 585 590

Ser Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Arg Ser Met Val Ala Ala Ser Asn

595 600 605

Asn Ser Ser Ile Glu Gly Thr Gly Ser Ser Arg Met Val Ile Ala Ser

610 615 620

Gln Gly Val Ala Asn Lys Thr Gly Tyr Thr Val Ala Leu Gly Tyr Ala

625 630 635 640

Ala Thr Gly Ala Pro Ser Thr Ala Asn Thr Lys Ile Gln Leu Asp Ala

645 650 655

Lys Asn Gly Asn Ile Asn Leu Thr Gly Gln Val Lys Gly Ala Ser Thr

660 665 670

Phe Ser Asp Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala Ile

675 680 685

Pro Ser Gly Tyr Phe Val Thr Leu Glu Gly Asp Lys Ile Arg Lys Ala

690 695 700

Asn Ala Gly Asp Lys Val Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Ala Gly Val

705 710 715 720

Val Leu Gly Glu Ala Ala Phe Asn Trp Gln Gly Arg Tyr Leu Lys Asn

725 730 735

Glu Phe Gly Gly Leu Ile Tyr Glu Asp Ile Asp Val Thr Val Thr Asn

740 745 750

Glu Asp Gly Thr Gln Arg Ile Glu Thr Lys Thr Val Pro Lys Glu Asn

755 760 765

Pro Tyr Tyr Glu Pro Ser Glu Asp Tyr Ile Ala Arg Ser Asp Arg Pro

770 775 780

Glu Trp Asn Ile Val Gly Met Phe Gly Gln Ile Phe Val Arg Ile Asp

785 790 795 800

Gly Thr Val Ala Ala Gly Asp Arg Ile Ile Pro Lys Ala Gly Lys Gly

805 810 815

Ser Lys Ser Glu Asp Gly Ser Gly Tyr Tyr Val Met Arg Ile Thr Thr

820 825 830

Pro Tyr Ser Gln Glu Arg Gly Tyr Gly Val Ala Leu Cys Leu Ile Thr

835 840 845

Pro Thr Ile

850

<210> 2

<211> 2562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgggtt tcaagtatta tgacaaaaac accggcagct acgtgccgat gagcatcgag 60

ctgctgaaaa gcgatggcgt gagctatacc gccccgagca tcaagcagac ctttgaggat 120

atcctgaagc aagtgagtag cgtgagcagt agcgtgaccg aaaaggtgga tggtctgagc 180

aaccagatcg gcaacatcga tgacttccat atcaccggta ccaacctggt ggagaagatc 240

ctgaacgcac tgatccaacg tcgtgtgagt gtgaccgatt tcggtgcaaa gggtgacggc 300

gttaccgacg ataccgcagc ctttaataaa gccttcgaaa tgggcaatgc cgaggtgttt 360

gtgccggccg gtacatacat ggttaagggc ctgaaggtgc ctagctatac ccgtctgtac 420

ggcaccggca aactgagtgt gattaaactg cataaagatg cccctgccta tagccacgtg 480

atcaccaccg tgcagaatag taagtatatc atttttgaaa acctgctgtt agattggaat 540

ctgcagaaaa caaacaacag catcagcagc ggcccgaata gcagttgcct gaatatcacc 600

aatagccagt ttgtgtgggt gaacaacgtg catgcaaaag acgcaggcct gcatggtttc 660

gacgtgacaa gccctagtta caacagtctg accgacaccg aggatgtgta tcagccgggc 720

ggcagcaaat acgtttggat caacaactgc accgccacca acttcggcga cgatggcttt 780

accacccatt ttagtgagta tgtgtttatt acaaattgtt atagttatga tggtaatggt 840

agtgcacata ccagcggcgc cagcaataca aacggcttcg agatcgacga cggtagcatg 900

aaagtttggc tgattaactg tgtgagcaaa aacaattgtc gtggcttcga ggccaaagca 960

cacgaacacg ccccggcagc ccagaacgtt accttcctga attgcgtgag cgagaacgac 1020

atccgcagct ttgacttccg tcatattggc tttcataaag ccagcgaccc ggagagcaaa 1080

acagcccgca atatcatggc cagcaactgc acagccatca aaccgatctt caatgaccgt 1140

ctgtacgcag gcatgacccc gcgtgccctg gttattagcg catataaaaa tgttaacatt 1200

agcaacttca cagcaatcgg cgacccgagc tacgattaca aaggcaatcc tgccatcgca 1260

acccagtaca aaagccgtaa tattaccttt aacaatgtta gcagtagcgg cttcaagacc 1320

gccggcgcag atatctacat ttacggcggc agccagaaga gtgatttcgt tagcctgagt 1380

aatatcaacg tgctggagag cgccctgatt ggcattcgta ttggcagcgc catcaaaaac 1440

gccagtgtga accaggcaag cctgattggt tacagtaaag agggcagtat cggcttatac 1500

tgtacaaata gccaggttga tattaatgca gtgaattgtg acaagtacgc catcccgagt 1560

aagatcgccg gcaaggcata taccagcttt gttccgaaga acatcaaggg cggcacacgc 1620

attgccacca caagcggtta tgcagccaaa aataccagtc tggttgccgc cagtagcggt 1680

ggtggtcaag ccacaggtac agccagcgca gtgattgcaa ccaccggtgg cagcaaagca 1740

gacggcccgc gtaacgtggt gatcgccagt agcggcggca gtaaaaccac aagtgaaggc 1800

agtcgcagca tggtggcagc cagcaacaac agcagtattg aaggcaccgg cagtagccgc 1860

atggtgatcg caagccaggg cgtggcaaac aagacaggtt acacagttgc cttaggctac 1920

gccgcaaccg gtgcaccgag caccgccaac acaaagatcc agctggatgc aaagaacggc 1980

aatattaatc tgaccggtca ggttaaaggc gccagcacct tcagcgatta cgccgagtac 2040

ttcgaaagca ttgacggcaa ggcaattccg agcggctact ttgttacctt agagggcgac 2100

aagatccgca aagcaaacgc cggtgataaa gtgctgggcg tgattagcga gacagccggc 2160

gttgttctgg gtgaagcagc attcaattgg cagggccgct atctgaagaa tgaatttggc 2220

ggtttaatct atgaggacat cgatgttacc gttaccaacg aagatggcac ccaacgcatt 2280

gaaaccaaga ccgtgccgaa agagaatccg tattacgagc cgagtgagga ctacatcgca 2340

cgtagcgatc gtcctgagtg gaatattgtg ggcatgttcg gccagatttt tgttcgtatt 2400

gacggcaccg ttgcagcagg tgatcgcatc atccctaaag ccggtaaagg cagcaaaagc 2460

gaagacggta gtggctatta tgtgatgcgc atcacaaccc cgtatagcca ggaacgcggc 2520

tatggcgtgg cactgtgcct gattaccccg acaattctcg ag 2562

Claims

1.一种磷酸二酯酶BSP，其特征在于，所述磷酸二酯酶BSP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的磷酸二酯酶BSP，其特征在于，所述磷酸二酯酶BSP来源于枯草芽孢杆菌BGSC 3A28菌株。

3.一种编码权利要求1所述磷酸二酯酶BSP的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1或2所述的磷酸二酯酶BSP在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌包括耐药性金黄色葡萄球菌和非耐药性金黄色葡萄球菌。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于金黄色葡萄球菌引起的动物表皮感染和用于抑制金黄色葡萄球菌肠道感染的饲料添加剂。

7.一种具有抑菌作用的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括权利要求1所述的磷酸二酯酶BSP，或还包括联用试剂。

8.根据权利要求7所述的生物制剂，其特征在于，所述联用试剂包括氯化锌和/或抗生素。

9.根据权利要求8所述的生物制剂，其特征在于，所述抗生素包括氨苄青霉素、新霉素和红霉素中的任意一种。

10.权利要求7-9任意一项所述的生物制剂在抑制或灭杀金黄色葡萄球菌中的应用。