CN111876400B

CN111876400B - 一种常温裂解酶Sly和编码此酶的多核苷酸

Info

Publication number: CN111876400B
Application number: CN202010780549.2A
Authority: CN
Inventors: 林连兵; 张瑶; 陆瑶; 张棋麟; 王峰
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111876400A

Abstract

本发明公开了一种常温裂解酶和编码这种酶的多核苷酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；该裂解酶能够抑制部分革兰氏阳性和阴性细菌的生长，其在20℃~50℃范围内具有催化活性，在30℃~45℃之间催化活性较高，其核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株。

Description

一种常温裂解酶Sly和编码此酶的多核苷酸

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种常温裂解酶Sly以及编码此酶的核苷酸序列。

背景技术

近年来，由于抗生素的不合理使用，引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题，严重威胁人类及动物的健康。人们迫切需要研究新型的抗菌试剂，而细菌的天敌噬菌体给人们抵抗细菌入侵提供了新的思路，越来越多的人开始尝试用噬菌体裂解酶治疗细菌感染。

噬菌体裂解酶（以下简称裂解酶）是噬菌体浸染宿主末期表达的一类肽聚糖水解酶，可以快速的降解宿主菌细胞壁上的肽聚糖，使感染的细菌裂解并且释放出子代噬菌体颗粒。根据作用于肽聚糖共价键位点的不同，可将噬菌体裂解酶分为葡糖苷酶、酰胺酶、内肽酶和转糖基酶。此外，裂解酶具有典型的模块化结构，包括N端催化域结构（CatalyticDomain，CD）和C端细胞壁结合域结构（Cell-wall binding domain，CBD）。催化域结构具有催化活性，能够特异地切断细菌细胞壁上肽聚糖的化学键；结合域结构可以与宿主细菌细胞壁上的特异性底物结合，介导催化域结构与作用靶点的有效结合与切割。此外，据Rehman推算地球上大概有10³²个噬菌体存在，这个数据大概是细菌数量的10倍。可以说，凡是有细菌分布的地方，就会有噬菌体存在。因此，裂解酶作为来源广泛的抗生素替代物吸引了众多研究人员的目光。

相关研究表明，裂解酶有许多优势。首先，裂解酶的特异性相较于抗生素更好，相较于噬菌体，裂解谱又扩大了。研究发现，对青霉素耐药的肺炎链球菌菌株可以被裂解酶杀死，同时对人体的正常菌群没有影响，而抗生素在杀死病原菌的同时，也损伤了部分正常菌群。其次，裂解酶的作用高效迅速，裂解酶在体外与细菌接触的瞬间迅速破裂细菌细胞，可使细菌浊度迅速下降。Schuch等将2个单位(2μg)的炭疽芽胞杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG加入1.0×10⁴耐链霉素的蜡样芽孢杆菌RSVF1中，10s内就能使细菌裂解。最后，无论是裂解酶之间或裂解酶与抗生素之间，都具有协同效应。Jado等发现低浓度Dp-1和低浓度Cpl-1共同使用时，可以使小鼠全部存活，而Dp-1或Cpl-1单独使用时，因严重的菌血症小鼠全部死亡。Djurkovic等发现将裂解酶Cpl-1与庆大霉素联用，可降低青霉素对肺炎链球菌的最小抑菌浓度。当Cpl-1与青霉素联用时，亦可以协同杀死对青霉素耐药的菌株。

广泛的研究表明，裂解酶具有高效性、高稳定性、潜在广泛杀菌性和安全性，能特异性的杀灭细菌而且不容易使细菌产生耐药性；裂解酶在抗菌方面具有较大的开发价值，有望成为抗生素的替代品，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种常温裂解酶Sly，该裂解酶能够抑制部分革兰氏阳性和阴性细菌的生长，其在20℃~50℃范围内具有催化活性，其来源于噬菌体SP26。该常温裂解酶Sly的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少90％的相同性的多肽、类似物或衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码常温裂解酶Sly的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示，或其互补序列，或具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少80％相同性的多核苷酸及其互补序列。

本发明的有益效果：

本发明所述裂解酶在20℃~50℃范围内具有催化活性，在37℃催化活性最高，pH值在6~10之间酶活较高，Mg²⁺、Na⁺、K⁺这三种离子对酶有激活作用，本发明常温裂解酶能高效裂解细菌，使其有望取代传统的抗生素治疗，也可作为抑菌剂用于环境的杀菌；其核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株。

附图说明

图1是本发明常温裂解酶Sly基因PCR产物电泳示意图，其中泳道1代表Marker；泳道2为阴性对照；泳道3为Sly基因PCR产物；

图2是本发明中重组质粒pET28a-Sly双酶切图谱示意图，其中泳道1代表Marker，泳道2为未经双酶切的重组质粒pET28a-Sly条带；泳道3为双酶切后重组质粒pET28a-Sly产生的两个条带；

图3是本发明中常温裂解酶Sly的蛋白表达检测示意图，其中泳道1为GenStarM221-01蛋白Marker；泳道2为pET28a-Sly/Rosetta未诱导全蛋白；泳道3为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导6h全蛋白；泳道4为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导6h上清；泳道5为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导8h全蛋白；泳道6为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导8h上清；泳道7为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150 rpm、乳糖（1 g/L）诱导10h全蛋白；泳道8为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导10h上清；泳道9为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导12h全蛋白；泳道10为pET28a-Sly/Rosetta于37℃、150rpm、乳糖（1g/L）诱导12h上清；

图4是本发明常温裂解酶Sly蛋白的纯化结果检测示意图，其中1为GenStar M221-01蛋白Marker，2为上柱后500 mM的咪唑缓冲液过柱后第二管；

图5是本发明中不同温度对常温裂解酶Sly活性的影响结果示意图；

图6是本发明中不同pH值对常温裂解酶Sly活性的影响结果示意图；

图7是本发明中不同金属离子对常温裂解酶Sly活性的影响结果示意图；

图8是本发明常温裂解酶Sly作用于大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538的结晶紫染色结果示意图。其中A为灭活后的裂解酶作用的大肠杆菌CMCC(B)44102菌体形态；B为裂解酶作用的大肠杆菌CMCC(B)44102菌体形态；C为灭活后的裂解酶作用的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌体形态；D为裂解酶作用的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌体形态；

图9是随着时间变化本发明常温裂解酶Sly对大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538、沙门氏菌CMC(B)50094、志贺氏菌DS26菌株生长的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的均采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：常温裂解酶Sly的克隆和表达

1、裂解酶Sly基因的扩增（以噬菌体SP26的基因组DNA为模板）

（1）常温裂解酶Sly基因的扩增所用引物序列如下：

正向引物：5’- CATGCCATGGCAATGGCTATTAGCAAAAACATGAAG -3’

反向引物：5’- CGGAATTCTGCCACAGCTCCGCCAGCCTCTTTA -3’

酶切位点：Nco I和EcoR I

（2）扩增体系如下：

表1 扩增体系组分

；

（3）扩增条件如下：

将反应体系混匀，先在94℃预变性10 min，然后在94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10 min。扩增完后取产物5μL，在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳分析（见图1），PCR产物大小为465 bp。

2、裂解酶Sly基因PCR产物胶回收

（1）在电泳仪中灌制1.2％琼脂糖凝胶；

（2）将待分离纯化的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳；

（3）在紫外灯下切下含有目的基因片段的凝胶，转移到1.5mL的EP管中；

（4）用StarPrep快速DNA胶回收试剂盒进行目的基因片段回收，回收方法按说明书进行。

3、重组质粒的构建

为了把目的基因片段连接到质粒pET28a上，就需要使目的基因片段、质粒pET28a都带有粘性末端，即带有酶切位点。

（1）提取质粒pET28a

① 菌种活化：无菌接种环蘸取-80℃冻存的质粒pET28a的菌种保存液，连续化线法接种于含有卡那霉素（终浓度50µg/mL）的LB固体平板，37℃培养12~16h；

② 富集菌液：用接种环挑取单菌落于5mL含有卡那霉素（终浓度50µg/mL）的LB液体试管中，37℃、150rpm培养12~16h；

③ 提取质粒pET28a：用StarPrep快速质粒小提试剂盒提取质粒pET28a，提取方法按说明书进行。

（2）目的基因片段及质粒pET28a的双酶切

① 酶切体系如下：

表2 酶切体系组分

② 反应条件：37℃金属浴中酶切3h，回收酶切后的目的基因片段及质粒pET28a。

（3）重组质粒的构建

将带有粘性末端的目的基因片段和质粒pET28a，通过连接转化构建出重组质粒；

① 连接体系如下：

表3 连接体系组分

② 反应条件：16℃金属浴中连接12h，回收重组质粒。

4、重组质粒的表达

（1）重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中

①将10μL的重组质粒转入100μL体系的感受态细胞；

②冰浴30min之后，42℃热击90s，再冰浴30min；

③加入890μL LB液体培养基，37℃，100 rpm摇床培养1h；

④将培养后的液体培养基放入离心机中，10,000 rpm，离心10min；

⑤弃上清，留100μL左右将沉淀轻轻吹打混匀，涂布于含有卡那霉素（终浓度50µg/mL）的LB固体平板，37℃培养12~16h；

⑥观察上述平板的单菌落，用接种环随机挑取单菌落于5mL含有卡那霉素（终浓度50 µg/mL）的LB液体试管中，37℃、150 rpm培养12h。

（2）双酶切验证

①用StarPrep快速质粒小提试剂盒提取重组质粒，提取方法按说明书进行；

②将提取出的重组质粒进行双酶切验证，双酶切体系如下：

表4 双酶切体系组分

反应条件：37℃金属浴中酶切3h，回收酶切后的重组质粒并进行电泳验证（见图2）。

（3）重组质粒转化至E. coli Rosetta菌株

将验证正确的重组质粒转入E. coli Rosetta菌株中，方法同上；即可得到表达菌株pET28a-Sly/Rosetta。

5、重组蛋白的诱导表达及纯化

①将表达菌株pET28a-Sly/Rosetta接种至5mL含有卡那霉素（终浓度50µg/mL）的LB液体试管中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀值为0.6~0.8；

②按1%比例接种上述菌液至600mL含有卡那霉素（终浓度50µg/mL）的LB液体试管中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀值为1.0~1.2；再加入诱导剂乳糖（终浓度1g/L）至表达菌株的菌液中，放置于37℃、150rpm分别诱导6、8、10、12 h；

③诱导后的菌液于4℃、9000rpm离心8min后留沉淀，加适量ddH₂O吹打混匀后于4℃，9000rpm离心10min后留沉淀，按100:1的比例用PBS缓冲液吹打混匀后进行超声波破碎；

④超声波破碎：功率为35%，工作3s，停4s，每管60~90min，破碎至透光，取80µL全蛋白于已灭菌的EP管内。剩余全蛋白于13,000 rpm，离心10min取上清，上清分装于已灭菌的EP管内；

⑤SDS-PAGE电泳检测表达结果（见图3），目的蛋白在37℃、150rpm，1g/L乳糖诱导12 h条件下，表达效果最好；因此诱导最佳条件为37℃，150rpm，1g/L乳糖诱导12h；

⑥最佳条件诱导后使用AKTA prime蛋白质纯化系统进行纯化，纯化后进行SDS-PAGE电泳检测纯化结果（见图4）；结果说明裂解酶Sly的洗脱条带单一且表达量较高，说明纯化成功。

实施例2：常温裂解酶Sly的酶学性质及酶活性实验

1、裂解酶Sly蛋白的浓度及酶活力测定

（1）采用BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白浓度检测法测定蛋白浓度

在碱性条件下，利用Cu²⁺可以被蛋白质还原成Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂结合形成紫色的络合物的特性，通过测定样品在590 nm波长下的OD值，并同蛋白标准曲线对比，即可计算出待测样品的蛋白浓度。

按照BCA蛋白质定量试剂盒说明书中的“微量法”进行，用酶标仪测定590nm波长处的OD值。以蛋白浓度为横坐标，OD₅₉₀值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线方程为：y= 0.0009x+0.006（R² = 0.9914）。

（2）采用福林酚法测定酶活力

在碱性条件下，福林酚试剂可被酚类化合物还原，生成蓝色化合物。而蛋白酶在最适作用温度和最适作用pH值的条件下，水解酪蛋白底物，会产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等）。因此可利用此原理测定酶活力。

酶活力单位定义：在一定温度和pH值条件下，酶液在1min内水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U表示。

①试剂及溶液

福林酚试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L三氯乙酸溶液、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液、2%酪蛋白溶液、100μg/mL酪氨酸溶液。

②标准曲线的绘制

按表5配制不同浓度的酪氨酸溶液

表5 不同浓度酪氨酸溶液的配制方法

测定步骤：分别吸取上表中不同浓度的酪氨酸溶液1mL，各加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，再加入福林酚试剂1mL；摇匀后放置于40℃水浴锅中，保温发色20min，酶标仪测量OD₆₈₀值并记录。以酪氨酸质量为横坐标，OD₆₈₀值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线方程：y=0.003x+0.0099（R²=0.9959）。

③酶活力测定步骤

吸取酶液的稀释液（浓度为46.67μg/mL）2mL，置于40℃水浴锅中预热2min，然后加入经同样预热后的2%酪蛋白溶液1mL，40℃水浴锅中精确保温5min。时间到后，立即加入0.4mol/L三氯乙酸溶液1mL，以终止反应，继续置于40℃水浴锅中保温20min，使残余蛋白质沉淀。吸取含有沉淀的溶液，使用0.22μm滤膜过滤溶液，然后吸取滤液1mL，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林酚试剂1mL摇匀，40℃水浴锅中保温发色20min后测量OD₆₈₀值。

测得裂解酶OD₆₈₀值为0.317，将OD₆₈₀值代入标准曲线方程：y = 0.003x + 0.0099（R² = 0.9959），计算得到酪氨酸质量为102.37μg。将酪氨酸质量代入公式：Y=（A×N）/（V×t）（Y：样品的酶活力，U；A：酪氨酸质量，μg；N：样品的稀释倍数；V：反应试剂的总体积，mL；t：反应时间，min），计算得到酶活力Y=（102.37×5）/（4×5）=25.59 U。

2、不同作用温度、pH值及金属离子对常温裂解酶Sly的影响

裂解酶可以水解肽聚糖，肽聚糖被水解后，会导致反应底物OD₆₀₀值显著下降；酶活性越高，OD₆₀₀值下降的程度则越大，因此反应底物OD₆₀₀值的变化可用于评价裂解酶的活性。

酶活（%）=[（OD_600反应前－OD_600反应后）/初始OD₆₀₀］×100

将测得的最高酶活设为100%，相对酶活（%）=（其他温度下的酶活/最高酶活）×100。

（1）制备反应底物

①用无菌接种环蘸取-80℃冻存的宿主菌DS26的菌种保存液，连续化线法接种于LB固体平板上，37℃培养12~16h；

②用无菌接种环挑取上述平板的单菌落于5mL LB液体试管中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀值为0.6~0.8，按1%比例接种菌液至600mL LB液体试管中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀值为1.0~1.2；

③将上述菌液于9000rpm离心10min后，弃上清。沉淀以10mL ddH₂O吹打混匀后，超声波破碎（功率为35%，工作3s，停4s，总时间120min），13000rpm离心10min得沉淀。将沉淀重新使用10mL ddH₂O吹打混匀；此时宿主菌DS26的细胞壁均为细胞碎片，作为以下实验的反应底物。

（2）常温裂解酶Sly的最适作用温度

将纯化后的裂解酶Sly（浓度为135.56μg/mL）加入制备好的反应底物中，然后置于不同温度反应30min，反应温度分别是4℃、20℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃。其中，反应底物的初始OD₆₀₀=0.365，根据反应前后OD₆₀₀的变化量确定其最适温度（见图5）。

由图5分析可知，该裂解酶最适作用温度为37℃，在30℃~45℃之间酶活较高。

（3）常温裂解酶Sly的最适作用pH值

将纯化后的裂解酶Sly（浓度为135.56μg/mL）加入制备好的反应底物中，在最适作用温度下，分别在不同pH值的磷酸盐缓冲液中，反应30min，测定反应前后OD₆₀₀值，其中反应底物的初始OD₆₀₀=0.295，根据反应前后OD₆₀₀的变化量确定其最适pH值（见图6）。

由图6分析可知，该裂解酶最适作用pH值为7.5，pH值在6~10之间酶活较高。

（4）不同金属离子对酶活的影响

将纯化后的裂解酶Sly（浓度为145.56μg/mL）加入制备好的反应底物中，混合液中加入不同金属离子Mn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Na⁺、K⁺，并保持离子浓度为1mmol/L，在最适作用温度和最适pH值条件下，反应30min，测定反应前后OD₆₀₀值，其中反应底物的初始OD₆₀₀=0.411，对照组使用ddH₂O代替金属离子。我们把能提高酶活的金属离子称为酶的激活剂，反之，则称酶的抑制剂（见图7）。

由图7可以看出，Mg²⁺、Na⁺、K⁺这三种离子对酶有激活作用，Zn²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺这三种离子对酶有抑制作用，而Ca²⁺对酶的影响不大。

3、常温裂解酶Sly作用于大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538的结晶紫染色结果

将大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538培养至OD₆₀₀值分别为0.531、0.519，菌液8000rpm离心10min得到菌体，以ddH₂O洗涤3次，收集菌体，用PBS进行稀释，然后100µL菌液（2.37×10³ CFU/mL）中加入900µL裂解酶Sly（浓度为141.11μg/mL），37℃反应30min，用草酸铵结晶紫染色液染色、制片后于光学显微镜下进行镜检（见图8），对照采用121℃、灭活20min的酶液；

由图8可以看出，裂解酶Sly作用的大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538的部分菌体形态不能被结晶紫染色液染色，说明这部分已被裂解酶Sly裂解；而灭活后的酶液作用的大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538的菌体形态无明显变化。

4、随着时间变化常温裂解酶Sly对大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538、志贺氏菌DS26、沙门氏菌CMC(B)50094菌株生长的影响

按1%接种量，接种大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌ATCC6538、志贺氏菌DS26、沙门氏菌CMC(B)50094的菌液到LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀值分别为0.506、0.522、0.537、0.525。将酶液（浓度为252.22μg/mL）用已灭菌0.22μm滤膜过滤后，加入Mg²⁺、Na⁺、K⁺（终浓度均为1mmol/L），吸取270μL酶液分别与30μL大肠杆菌CMCC(B)44102菌液（1.12×10³ CFU/mL）、金黄色葡萄球菌ATCC6538菌液（1.43×10³ CFU/mL）、志贺氏菌DS26菌液（1.08×10³ CFU/mL）、沙门氏菌CMC(B)50094菌液（1.67×10³ CFU/mL）混合，混合液于37℃恒温培养箱反应0、10、20、30、40、50、60min后，取50μL反应后的混合液涂布平板，对照采用121℃、灭活20min的酶液；涂布之后放置于37℃恒温培养箱过夜培养，统计实验组与对照组的活细胞数，计算抗菌活性。（注：每组各3个平行）抗菌活性定义为对数相对失活单位log₁₀(N0/Ni)，N0为灭活酶液处理的活细胞数(对照组)，Ni为酶液处理后的活细胞数(实验组)；

由图9可知：在酶浓度和菌浓度一定的情况下，随着时间变化，裂解酶Sly对菌株的杀伤作用随之变化。当作用时间为10 min时，大肠杆菌CMCC(B)44102的活细胞数减少最多，志贺氏菌DS26、沙门氏菌CMC(B)50094活细胞数减少次之，对金黄色葡萄球菌ATCC6538的活细胞数减少相对较少。总之，此裂解酶对革兰氏阳性和阴性细菌均具有一定的杀灭作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种常温裂解酶Sly和编码此酶的多核苷酸

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 噬菌体SP26(Phage SP26)

<400> 1

Met Ala Ile Ser Lys Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Met Leu Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Glu Gly Thr Asp Asn Gly Arg Gln Lys Thr Asn Asn His Gly Tyr

20 25 30

Asp Val Ile Val Gly Gly Ser Leu Phe Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro

35 40 45

Arg Lys Leu Ile Ser Leu Pro Lys Leu Gly Ile Lys Ser Thr Ala Ala

50 55 60

Gly Arg Tyr Gln Val Leu Ala Lys Phe Tyr Asp Ala Tyr Lys Lys Gln

65 70 75 80

Leu Arg Leu Pro Asp Phe Ser Pro Thr Ser Gln Asp Ala Ile Ala Met

85 90 95

Gln Leu Ile Arg Glu Cys Lys Ala Thr Ala Asp Ile Glu Ala Gly Arg

100 105 110

Ile Ala Asp Ala Ile His Lys Cys Arg Ser Arg Trp Ala Ser Leu Pro

115 120 125

Gly Ala Gly Tyr Gly Gln His Glu Gln Lys Leu Asp Lys Leu Ile Gln

130 135 140

Val Tyr Lys Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala

145 150

<210> 2

<211> 465

<212> DNA

<213> 噬菌体SP26(Phage SP26)

<400> 2

atggctatta gcaaaaacat gaaggcgttt ctggatatgc tggcgtacag cgagggcacg 60

gataacgggc ggcagaaaac caataatcat ggctatgatg tgattgttgg tggctcactg 120

tttaccgact attccgacca cccgcgcaaa ctgattagcc tgcctaagct gggcatcaaa 180

tccaccgccg ccgggcgata tcaggtgctg gctaagtttt atgatgcgta caaaaagcag 240

ttgcgtttgc cggacttctc cccaacatcg caggacgcta ttgcaatgca gctaatccgt 300

gaatgcaagg ccaccgccga tattgaagct ggtcgcattg ctgatgctat tcataaatgc 360

cgctcccgct gggcttcatt gccgggtgct ggttatggtc agcacgaaca gaaactggat 420

aagctgattc aggtatataa agaggctggc ggagctgtgg catga 465

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

catgccatgg caatggctat tagcaaaaac atgaag 36

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

cggaattctg ccacagctcc gccagcctct tta 33

Claims

1.一种常温裂解酶Sly，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述常温裂解酶Sly的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。