CN105960243A - 藻酸盐低聚物作为血液抗凝剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在临床和非临床应用(包括体内、离体和体外环境)中用作血液抗凝剂的具有2至75个单体残基的藻酸盐低聚物，其中所述单体残基不携带硫酸盐基团。本发明还提供所述藻酸盐低聚物在制备产品或装置中的应用，所述产品或装置具有降低的促进血液凝集能力，其中，所述藻酸盐低聚物设置在所述产品或装置的表面处或其表面上。所述产品或装置形成本发明的另一方面。

Description

藻酸盐低聚物作为血液抗凝剂的应用

本发明涉及藻酸盐低聚物作为血液抗凝剂的应用，血液抗凝剂是能够预防或抑制在全血或血浆中形成纤维蛋白凝块的试剂。因此，本发明提供一种用于预防或抑制血液凝集并从而调节血液凝集的方法。在临床和非临床情况中均需要对血液凝结的调节或控制。因此本发明的方法可应用于与不需要的血液凝集(血栓形成)相关的疾病和病症的治疗和手术管理，也可应用于处理全血、血浆或包含全血、血浆的组合物，以及用于处理在使用时与血液或血液衍生产物接触的材料、产物或装置、或其部分。还提供了含有和/或涂覆有藻酸盐低聚物的用于所述应用的产物和装置。

血液凝集(或血液凝结，这些术语在本文可互换地使用)是脊椎动物进化出的抵消和修复循环系统损伤的生理机制。简而言之，血液凝集过程导致产生细胞和蛋白质基质的聚集团，其物理性塞住由损伤引起的破坏循环系统完整性的破损处。

更具体地，体内凝集过程是一个复杂的分两支的蛋白水解级联反应，所述反应最终通过可溶的纤维蛋白原变为不溶的纤维蛋白的转化导致液体血液转化为固体凝胶。所述纤维蛋白原向纤维蛋白的转化产生包住血细胞及其它血液成分的蛋白质细丝基质。不论所得到的实体的确切组成如何，该实体被称为血凝块或在临床上称为血栓。

所述体内凝集过程是分两支的，其中所认识到的两个不同起始点在因子X点处交汇，因子X是将凝血酶原转化成凝血酶的蛋白，凝血酶进而催化纤维蛋白原向纤维蛋白的转化。其中一支的凝集通路被称为“内源性通路”或由于最初观察到所述通路在血液与人造表面接触时被激活而被称为“接触激活通路”。这个过程中的基本介质都存在于血液中，因此将其定义为“内源性”。另一支凝集通路被称为“外源性通路”或由于需要外来细胞表面介质“组织因子”的引发而称为“组织因子通路”。组织损伤后立即发生组织因子的暴露，因此外源性通路被视为体内主要的通路。

尽管血液凝集是脊椎动物抵御损伤的基本防御机制，但在临床环境中不需要的或不适当的凝集会引起血栓性疾病，其中血液凝块会在血管或心脏中引起阻塞。所述事件经常导致下游组织缺氧，甚至是梗塞。可接着发生组织或器官损伤，而且取决于缺血的位置，血栓形成或导致的组织损伤可以表现为诸如高血压、低血氧合、脑卒中、心肌梗塞、肺栓塞和心绞痛等病症。

不依赖于基于组织的介质的接触激活通路的存在意味着在体外可观察到全血的凝集。此外，含全血凝血因子的产品(例如血浆)可以表现出凝集，甚至在所述产品缺乏细胞和/或血小板时也可以表现出凝集。在这些实施方式中，会形成不溶的纤维蛋白网络，尽管在缺少血细胞时所述凝块的整体外现与在全血中形成的不同。因此血液凝集通路在体外处理血液和血液产物的情况下也是重要的。

治疗或预防血栓性疾病的药物干预是存在的，但其在数量上有限，并且具有毒性、药物相互作用和给药和递送途径限制等问题。需要具有更好的安全性、更易于给药且在施用途径上具有较少限制的替代性抗凝剂。此外，已知的是，提供在使用时与血液或血液衍生产物接触的材料、产品或装置、或其部分，所述产品或装置或其部分的表面(例如，表面涂层)包含设计为使所述表面上的血液凝集最小化的血液相容性化合物。需要替代性的(优选为改进的)血液相容性化合物，以用作或用于这样的表面涂层。在体外抵消凝集的添加剂也是存在的，不过总是需要替代性产品，特别是可安全用于打算施用于人或非人类动物受试者的血液产品的替代性产品。

藻酸盐是天然存在的多糖，已发现其在临床(例如在伤口敷料中、作为药物载质、和在抗胃烧灼制剂中)和非临床(例如在食品制剂中)中具有许多应用。它们是(1-4)连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和/或其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)的直链聚合物。藻酸盐的一级结构可以变化很大。M和G残基可组织为连续M或G残基的均聚嵌段，组织为交替的M和G残基的嵌段并且可发现单个M或G残基间隔了这些嵌段结构。藻酸盐分子可以包括某些或者全部上述结构，并且这种结构可在整个聚合物中不均匀地分布。在极端的情况下，存在古洛糖醛酸的均聚物(聚古洛糖醛酸盐)或甘露糖醛酸的均聚物(聚甘露糖醛酸盐)。

藻酸盐分离自海洋褐藻(例如，丛梗藻(Durvillea)、巨藻(Lessonia)和昆布(Laminaria)的某些种属)和诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)等细菌。其它假单胞菌(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)保留产生藻酸盐的遗传能力，但在野生条件下，它们不产生可检测水平的藻酸盐。通过突变，可以诱导这些不产生藻酸盐的假单胞菌稳定产生大量的藻酸盐。

藻酸盐被合成为聚甘露糖醛酸盐，且通过差向异构酶(特别是C-5差向异构酶)对所述聚合物中M残基的的作用形成G残基。对于从藻类中提取的藻酸盐，所述G残基主要组织为G嵌段，因为在藻类的藻酸盐生物合成中涉及的酶优选在另一个G相邻位置引入G，从而将M残基段转化为为G-嵌段。这些生物合成系统的阐明使得可以产生具有特定的一级结构的藻酸盐(WO 94/09124，Gimmestad,M等,Journal ofBacteriology,2003,Vol 185(12)3515-3523和WO 2004/011628)。

藻酸盐通常从天然来源中作为大的高分子量聚合物(例如平均分子量为300,000至500,000道尔顿)分离。然而，已知这种大的藻酸盐聚合物可被降解或分解，例如通过化学或酶水解产生低分子量的藻酸盐结构。工业上使用的藻酸盐通常具有100,000至300,000道尔顿的平均分子量(这样的藻酸盐仍然被认为是大聚合物)，不过在药学中已经使用平均分子量为约35,000道尔顿的藻酸盐。

最近已经提出将更小尺寸(分子量)的藻酸盐低聚物用于临床应用，最值得注意的是用于降低粘液的粘度，特别是包括例如发生在囊性纤维化和其它呼吸系统疾病的患者中的高粘粘液的粘度(参见WO 2007/039754和WO 2008/125828)，或用于抗微生物、抗生物膜(WO 2009/068841)和多药耐药菌(WO 2010/13957)。

现已出乎意料地发现，藻酸盐低聚物、特别是2至75个单体的非硫酸盐藻酸盐低聚物可抑制甚至预防血液的凝集，从而调节和控制血液凝集，因此提出将所述藻酸盐低聚物在预防或抑制人或动物体任何外部或内部情境中的全血或包含血液凝集因子的组合物(例如血液产品)的血液凝集的方法中用作血液抗凝剂。所述情境可包括在使用时与血液或血液衍生产物接触(在人或动物体的外部或内部)的任何材料、产品或装置上或在其中抑制或预防血液凝集。在这些方面，藻酸盐低聚物可设置在所述材料、产品或装置的表面处或表面上(即，以被固定的形式)。藻酸盐低聚物易于以这样的形式提供。所述情境也包括利用藻酸盐低聚物在人或动物体中作为抗凝治疗剂的抗凝作用，其可以以非固定形式提供。藻酸盐低聚物无毒，易于管理和给药，且已知不显示药物相互作用，因此，这些化合物解决了某些或全部的上述各种缺陷。

因此，本发明的第一方面提供一种用于预防或抑制血液凝集的方法，所述方法包括使含有血浆(优选全血)的组合物、或与所述组合物接触或可接触的材料与2至75个单体残基的藻酸盐低聚物接触，其中所述单体残基不携带硫酸盐基团。

术语“接触”包括直接或间接地将藻酸盐低聚物递送至包含血浆的组合物(或使组合物接触藻酸盐低聚物)的任何方式。藻酸盐可以以游离和/或固定的形式提供，例如携带或包含在使用时可与包含血浆的组合物接触的表面。藻酸盐低聚物可施涂到或结合到形成表面的材料中，或可用所述低聚物浸渍所述材料，例如可在所述材料的表面上涂覆藻酸盐低聚物，或作为表面涂层的一部分提供。这可发生在表面形成之前、期间或之后，并且可以通过共价或非共价相互作用(例如离子或静电相互作用)来进行，或更一般而言，通过任何方式的吸附进行。特别是，合适的单体组合物的藻酸盐低聚物可设置表面上作为阳离子引发的凝胶或其部分。

本发明中的藻酸盐低聚物当设置在材料表面处或表面上时，使该材料更具有血液相容性，因此在某些实施方式中可被认为是血液相容的层或涂层。

在另一些实施方式中，藻酸盐低聚物被设置或包含在含有一种或多种其他血液相容性化合物的血液相容性涂层中，所述一种或多种其他血液相容性化合物例如为肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、聚乙二醇或葡聚糖、或实际上具有抗凝活性或性质的任何生物活性剂或有助于减少凝集的任何试剂或材料，例如，减少血小板活化和/或结合凝集所需的血液成分(例如蛋白质)的任何试剂或材料。

其它实施方式中的藻酸盐低聚物不以固定形式使用。通常在这种实施方式中，藻酸盐低聚物以其天然形式或作为组合物(例如药学上可接受的制剂)的一部分施用。

特别是，使所述组合物接触藻酸盐低聚物的步骤可包括将藻酸盐低聚物施用于受试者，特别是需要这种治疗的受试者(例如，有血栓形成风险的受试者、或其正在发生或已经发生或者疑似正在发生或已经发生血栓形成(即，血栓正在形成或已经形成或者疑似正在形成或已经形成)的受试者。

因此本发明可用于在人或动物体外的任何环境中抑制或预防血液凝集，特别是在体外或离体使用时与血液或血液衍生产物接触的任何材料、产品或装置之上或其中抑制或预防血液凝集，但在其它方面，藻酸盐低聚物的抗凝作用在人或动物体环境中被利用，例如，作为治疗剂或作为可植入或留置医疗装置的工程化表面的一部分。因此可以理解，包括了医学和非医学方法，例如，包括了体外和离体方法也包括了体内方法。如以下更详细地描述，明确包括在本发明范围内的是：不在人或非人动物体内或之上进行的方法，或与之相关的全部或部分包含在人或非人脊椎动物体内或其上的装置或材料。

因此，本发明提供一种用作治疗性血液抗凝剂的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。换言之，本发明提供一种用作抗血栓形成剂的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

本发明进一步提供一种用于抗凝(或抗血栓)治疗的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。更具体地，本发明提供一种藻酸盐低聚物，该藻酸盐低聚物用于治疗或预防血栓形成、或与血液凝集(或血栓形成)相关的疾病和病症的方法，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

另一方面，本发明提供一种用于生产用以抗血液凝集(或抗血栓)治疗的药物的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。更具体地，本发明提供一种用于制造药物的藻酸盐低聚物，所述药物用于治疗或预防血栓形成、或与血液凝集(或血栓形成)相关的疾病和病症，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

因此，本发明也提供一种抗凝(或抗血栓)治疗的方法，所述方法包括给需要所述治疗的人或非人脊椎动物受试者施用藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

因此，本发明也提供用于治疗或预防血栓形成、或与血液凝集(或血栓形成)相关的疾病和病症的方法，所述方法包括给需要所述治疗的人或非人脊椎动物受试者施用藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

在所述治疗性实施方式中，以有效抑制或预防血液凝集(例如，治疗或预防与血液凝集有关的靶标疾病或病况)的量施用藻酸盐低聚物。

本发明的治疗方法之前可具有如下步骤：受试者被鉴定或诊断为具有血栓形成风险的受试者、或血栓正在或已经形成或者疑似血栓正在或已经形成的受试者，例如，患有、或疑似患有与血液凝集相关的疾病或病况、或具有与血液凝集相关的疾病或病况的风险的受试者。

在其它实施方式中，本发明的治疗方法之后可具有下述步骤：对受试者监测对血栓形成的效果、和/或病症或临床状态的变化。例如，对受试者监测血凝块的形成、或血凝块的数量，和/或检测已存在的血凝块的尺寸变化、形状和/或完整性的变化，例如使用下文详述的技术进行监测。在其它实施方式中，该额外的步骤可以是对受试者监测与血液凝集相关的疾病或病况的发病、或预先存在的与血液凝集相关的疾病或病况的变化的步骤。在其它实施方式中，该额外的步骤可以是测定受试者的血液以评估(例如使用下文详述的凝集测试)其凝集能力的步骤。

如上所述，藻酸盐通常作为平均分子量为至少35,000道尔顿的聚合物存在，即约175至约190个单体残基，不过通常更高，且根据本发明的藻酸盐低聚物可被定义为通过将藻酸盐聚合物(通常是天然存在的藻酸盐)片段化(即尺寸减小)得到的材料。更特别的是，根据本发明使用的藻酸盐低聚物含有2至75个，优选为2至50个，更优选为2至40个、2至35个或2至30个残基。因此，根据本发明使用的藻酸盐低聚物通常平均分子量为350至15,000道尔顿，优选为350至10,000道尔顿，更优选为350至8000道尔顿、350至7000道尔顿，或350至6,000道尔顿。

作为另一个选择，所述藻酸盐低聚物的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为2至75，优选为2至50，更优选为2至40、2至35、2至30、2至28、2至25、2至22、2至20、2至18、2至17、2至15或2至12。

其它代表性的范围(无论是残基的数量、DP或DP_n)包括3、4、5、6、7、8、9、10或11中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12中的任何一个。

其它代表性的范围(无论是残基的数量、DP或DP_n)包括8、9、10、11、12、13、14或15中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17或16中的任何一个。

其它代表性的范围(无论是残基的数量、DP或DP_n)包括11、12、13、14、15、16、17或18中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19中的任何一个。

如上所述，藻酸盐低聚物可含有(或包括)古洛糖醛酸盐或古洛糖醛酸(G)和/或甘露糖醛酸盐和甘露糖醛酸(M)残基或单元。根据本发明的藻酸盐低聚物将优选仅由、或基本上仅由(即基本上由)糖醛酸盐/糖醛酸残基组成，更特别的是仅由或基本上仅由G和/或M残基组成。作为另一种表达方式，在本发明中使用的藻酸盐低聚物中，至少80％，更特别地至少85％、90％、95％或99％的单体残基可以是糖醛酸盐/糖醛酸残基，或者，更特别的是G和/或M残基。换句话说，所述藻酸盐低聚物优选将不包含其它残基或单元(例如，其它的糖残基，或者更特别的是其它糖醛酸盐/糖醛酸残基)。

所述藻酸盐低聚物优选为直链低聚物。

更特别地是，在优选的实施方式中，藻酸盐低聚物的至少30％的单体残基是G残基(即古洛糖醛酸盐或古洛糖醛酸)。换句话说，所述藻酸盐低聚物将包含至少30％的古洛糖醛酸盐(或古洛糖醛酸)残基。因此，具体的实施方式包括具有(例如包含)30％-70％的G(古洛糖醛酸盐)残基或70％-100％的G(古洛糖醛酸盐)残基的藻酸盐低聚物。因此，根据本发明使用的代表性藻酸盐低聚物可包含至少70％的G残基(即，藻酸盐低聚物的至少70％的单体残基是G残基)。

优选地，至少50％或60％，更特别地是至少70％或75％，甚至更特别地是至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的单体残基为古洛糖醛酸盐。在一个实施方式中，藻酸盐低聚物可以是低聚古洛糖醛酸盐(即G的均低聚体或100％的G)。

在进一步优选的实施方式中，上述本发明的藻酸盐具有其中大部分G残基在所谓的G-嵌段中的一级结构。优选为G残基的至少50％、更优选为至少70％或75％、及最优选为至少80％、85％、90％、92％或95％在G-嵌段中。G嵌段为至少两个G残基的连续序列，优选为至少3个连续的G残基，更优选为至少4个或5个连续的G残基，最优选为至少7个连续的G残基。

特别是至少90％的G残基1-4连接到另一个G残基。更特别地是至少95％、更优选为至少98％、最优选藻酸盐的至少99％的G残基1-4连接到另一个G残基。

本发明中使用的藻酸盐低聚物优选为3-mer至35-mer，更优选为3-mer至28-mer，特别是4-mer至25-mer，例如5-mer至20-mer，尤其是6-mer至22-mer，特别是8-mer至20-mer，尤其是10-mer至15-mer，例如，所述藻酸盐低聚物的分子量为350至6400道尔顿或350至6000道尔顿，优选为550至5500道尔顿，优选为750至5000道尔顿，尤其是750至4500道尔顿或2000至3000道尔顿或900至3500道尔顿。如上所述，其它代表性的藻酸盐低聚物包括具有5、6、7、8、9、10、11或12至50、45、40、35、28、25、22或20个残基的低聚物。

它可以是单一化合物，或者可以是例如在一定聚合度范围内的化合物的混合物。如上所述，藻酸盐低聚物中的单体残基可以是相同的或不同的，并且不是均需携带带电基团，不过优选大部分(例如，至少60％，优选为至少80％，更优选为至少90％)携带带电基团。优选绝大多数例如至少80％、更优选为至少90％的带电基团具有相同的极性。在所述藻酸盐低聚物中，羟基与带电基团的比率优选为至少2：1，更特别为至少3：1。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为3-28、4-25、6-22、8-20或10-15、或5-18或7-15或8-12，特别是10。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为5-50、5-40、5-35、5-30、5-28、5-25、5-22、5-20、5-18、5-16、5-15或5-14。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为8-50、8-40、8-35、8-30、8-28、8-25、8-22、8-20、8-18、8-16、8-15或8-14。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为9-50、9-40、9-35、9-30、9-28、9-25、9-22、9-20、9-18、9-16、9-15或9-14。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为10-50、10-40、10-35、10-30、10-28、10-25、10-22、10-20、10-18、10-16、10-15或10-14。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度DP_n)可为12-50、12-40、12-35、12-30、12-28、12-25、12-22、12-20、12-18、12-16、12-15或12-14。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)可为15-50、15-40、15-35、15-30、15-28、15-25、15-22、15-20、15-18或15-16。

本发明的藻酸盐低聚物具有的聚合度(DP)、或数均聚合度(DP_n)为18-50、18-40、18-35、18-30、18-28、18-25、18-22或18-20。

本发明的藻酸盐低聚物优选基本上不含、优选为实质上不含本文公开的聚合度范围之外的藻酸盐低聚物。这可以表示为本发明的藻酸盐低聚物的分子量分布，例如DP在相关范围之外的根据本发明使用的藻酸盐低聚物的每摩尔百分数。分子量分布优选的是，不超过10％、优选不超过9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％摩尔的DP比DP_n相关上限大3、2或1。同样，优选的是，不超过10％、优选为不超过9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％摩尔的DP比DP_n相关下限小3、2或1。

适合的藻酸盐低聚物在WO2007/039754、WO2007/039760、WO 2008/125828和WO2009/068841中描述，其公开内容以其整体通过参考明确并入本文。

代表性的适合的藻酸盐低聚物具有5至30的DP_n、至少0.80的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.20的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的DP不超过25。

其他适合的藻酸盐低聚物具有7至15(优选为8至12)的数均聚合度、至少0.85(优选至少0.90)的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.15(优选不超过0.10)的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于17(优选小于14)。

其他适合的藻酸盐低聚物具有5至18(特别是7至15)的数均聚合度、至少0.80(优选至少0.85，甚至至少0.92)的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.20(优选不超过0.15，甚至不超过0.08)的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于20(优选小于17)。

其他适合的藻酸盐低聚物具有5至18的数均聚合度、至少为0.92的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.08的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于20。

其他适合的藻酸盐低聚物具有5至18(优选为7至15，更优选为8至12，特别是约10)的数均聚合度、至少0.80(优选为至少0.85，更优选为至少0.90，特别是至少0.92，最特别是至少0.95)的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.20(优选为不超过0.15，更优选为不超过0.10，特别是不超过0.08，最特别是不超过0.05)的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于20(优选为小于17，更优选为小于14)。

其他适合的藻酸盐低聚物具有7至15(优选为8至12)的数均聚合度、至少0.92(优选至少0.95)的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.08(优选不超过0.05)的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于17(优选为小于14)。

其他适合的藻酸盐低聚物具有5至18的数均聚合度、至少0.80的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.20的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于20。

其他适合的藻酸盐低聚物具有7至15的数均聚合度、至少0.85的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛盐分数(F_G)、不超过0.15的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于17。

其他适合的藻酸盐低聚物具有7至15的数均聚合度、至少0.92的古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.08的甘露糖醛酸盐分数(F_M)，且至少95％摩尔的聚合度小于17。

其他适合的藻酸盐低聚物具有5至20的数均聚合度、至少0.85的古洛糖醛酸盐分数(F_G)、不超过0.15的甘露糖醛酸盐分数(F_M)。

因此，可以看出，根据本发明有利的特定种类的藻酸盐低聚物是定义为所谓的“高G”或“G-嵌段”低聚物的藻酸盐低聚物，即，其具有高含量的G残基或G-嵌段(例如，其中，至少70％的单体残基为G，优选排列在G-嵌段内)。然而，也可使用其它类型的藻酸盐低聚物，特别是包括“高M”或“M-嵌段”的低聚物或MG-嵌段的低聚物，其在下文进一步描述。因此，特别优选的低聚物是具有高比例单一单体类型的藻酸盐低聚物，并且该类型的所述单体主要存在于所述单体类型的连续序列中，例如低聚物中至少70％的单体残基是1-4连接到另一个G残基的G残基，或更优选低聚物中至少75％，最优选至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的单体残基是1-4连接到另一个G残基的G残基。两个G残基间的这种1-4连接还可以表达为结合到相邻古洛糖醛单元的古洛糖醛单元。

在其他实施方式中，藻酸盐低聚物的至少50％、更特别是超过50％的单体残基可以是M残基(即甘露糖醛酸盐或甘露糖醛酸)。换句话说，所述藻酸盐低聚物将包含至少50％或者超过50％的甘露糖醛酸盐(或甘露糖醛酸)残基。具体的实施方式因此包括具有(例如包含)50％至70％的M(甘露糖醛酸盐)、或例如70％至100％的M(甘露糖醛酸盐)残基的藻酸盐低聚物。其他具体实施方式还包括含有71％至85％的M残基或85％至100％M残基的低聚物。因此，根据本发明的此实施方式使用的代表性的藻酸盐低聚物将包含超过70％的M残基(即，藻酸盐低聚物中超过70％的单体残基将为M残基)。

在其它实施方式中，至少50％或60％，更特别的至少70％或75％，甚至更特别的至少80％、85％、90％、95％或99％的单体残基为甘露糖醛酸盐。在一个实施方式中，藻酸盐低聚物可以是低聚甘露糖醛酸盐(即，M的均聚低聚物或100％M)。

在其他实施方式中，本发明的上述藻酸盐的一级结构中，大部分的M残基在所谓的M-嵌段中。在此实施方式中，优选为至少50％，更优选为至少70％或75％，及最优选为至少80％、85％、90％或95％的M残基在M-嵌段中。M嵌段为至少两个M残基的连续序列，优选为至少3个连续的M残基，更优选为至少4个或5个连续的M残基，最优选为至少7个连续的M残基。

特别是，至少90％的M残基1-4连接到另一个M残基。更特别地是，藻酸盐中至少95％，更优选为至少98％，最优选为至少99％的M残基1-4连接到另一个M残基。

其它优选的低聚物为这样的藻酸盐低聚物：该低聚物中至少70％的单体残基是1-4连接到另一个M残基的M残基，或者更优选低聚物中至少75％，最优选为至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的单体残基是1-4连接到另一个M残基的M残基。两个M残基间的这种1-4连接还可以表达为甘露糖醛单元连接到相邻的甘露糖醛单元。

在其他实施方式中，本发明的藻酸盐低聚物包含M和G残基交替的序列。至少三个，优选为至少四个交替的M和G残基的序列代表MG嵌段。本发明的藻酸盐低聚物优选包含MG嵌段。更具体而言，MG嵌段为至少三个由G和M残基组成的连续残基的序列，其中，在该连续序列中每个非末端(内部)G残基与M残基1-4和4-1连接，且该连续序列中每个非末端(内部)M残基与G残基1-4和4-1连接。所述MG嵌段优选为至少5个或6个连续的残基，更优选为至少7个或8个连续的残基。

在其他实施方式中，发现藻酸盐低聚物中的少数糖醛酸盐(即，甘露糖醛酸盐或古洛糖醛酸盐)主要在MG嵌段中。在该实施方式中，MG嵌段藻酸盐低聚物中优选至少50％，更优选至少70％或75％，及最优选至少80％、85％、90％或95％的少数糖醛酸盐出现在MG嵌段中。在另一个实施方式中，藻酸盐低聚物被排列为使得所述低聚物中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％(例如，100％)的G和M残基排列在MG嵌段内。

以最宽泛的形式而言，本发明延伸到下述实施方式：其中，低聚物的至少1％但小于100％的单体残基是G残基(即古洛糖醛酸盐或古洛糖醛酸)，但更特别地是，如以下进一步限定的，至少30％的单体残基是G残基。因此，包含MG嵌段的藻酸盐低聚物的最广泛的范围可包含至少1％，但小于100％的古洛糖醛酸盐(或古洛糖醛酸)残基，但通常所述包含MG嵌段的藻酸盐低聚物会包含至少30％(或至少35％、40％或45％或50％的G)但小于100％的G。因此具体的实施方式包括具有1％至30％的G(古洛糖醛酸盐)残基、30％至70％的G(古洛糖醛酸盐)残基或70％至99％的G(古洛糖醛酸盐)残基的包含MG嵌段的藻酸盐低聚物。因此，根据本发明使用的代表性的包含MG嵌段的藻酸盐低聚物可包含超过30％但小于70％的G残基(即，MG嵌段藻酸盐低聚物中超过30％，但小于70％的单体残基是G残基)。

包含MG嵌段的藻酸盐低聚物中优选超过30％，更特别为超过35％或40％，甚至更特别为超过45％、50％、55％、60％或65％，但在各种情况下都小于70％的单体残基是古洛糖醛酸盐。作为另一种选择，包含MG嵌段的藻酸盐低聚物中小于70％，更优选小于65％或60％，甚至更优选小于55％、50％、45％、40％或35％，但在每种情况下均超过30％的单体残基是古洛糖醛酸盐。可选择由所述数值的任何组合形成的范围。因此，例如包含MG嵌段的藻酸盐低聚物可具有例如35％至65％、40％至60％或45％至55％的G残基。

在另一个实施方式中，包含MG嵌段的藻酸盐低聚物可具有近似相等量的G和M残基(例如，65％G/35％M至35％G/65％M的比例，例如60％G/40％M至40％G/60％M的比例；55％G/45％M至45％G/55％M；53％G/47％M至47％G/53％M；51％G/49％M至49％G/51％M；例如约50％G至约50％M)，而这些残基主要、优选全部、或尽可能完全地以交替的MG的模式排列(例如，至少50％或至少60％、70％、80％、85％、90％或95％或100％的M和G残基为交替的MG序列)。

所实现的抗凝水平或量可根据精确环境情况而变化，例如使用藻酸盐低聚物的方式和环境，使用藻酸盐低聚物的条件和所述藻酸盐低聚物的组成。如实施例中所示，不同尺寸、G和M的含量以及单体排列的藻酸盐低聚物显示不同水平的抗凝作用。因此，本发明为本领域技术人员提供了根据本发明选择藻酸盐低聚物的手段，所选藻酸盐低聚物的结构所具有的抗凝性质(例如作用的强度和持续时间)可以在本领域技术人员的工作情境中(例如，所关注的患者或者血液样品的凝血性质)最好或较好地满足其需求。因此，在给定的所关注系统中可具有不同抗凝作用的不同藻酸盐低聚物的可得性开启了为所研究的系统定制藻酸盐低聚物抗凝剂性质的可能性。不同尺寸、G和M的含量、和单体排列的藻酸盐低聚物的组合可一起使用，以产生甚至更精确定制的抗凝效果。在其它实施方式中，本发明藻酸盐低聚物可具有单体含量和结构不同的区域，其共同导致了整体定制的抗凝效果。当然，可进一步选择所述低聚物的结构或其部分，以有利于在材料和表面之上或其内配制和/或固定。

在某些实施方式中，本发明的低聚物的末端糖醛酸残基不具有双键，尤其是不具有位于C₄和C₅原子之间的双键。这种低聚物可被描述为具有饱和末端糖醛酸残基。因此，在其它实施方式中，本发明的藻酸盐低聚物具有不饱和末端糖醛酸残基。本领域技术人员将能够无需过度劳动而制备具有饱和末端糖醛酸残基的低聚物。这可以通过使用产生这种低聚物的生产技术，或通过转化(饱和化)由产生具有不饱和末端糖醛酸残基的低聚物的方法产生的低聚物。

所述藻酸盐低聚物通常携带电荷，因此藻酸盐低聚物的抗衡离子可以是任何生理上可接受的离子，特别是那些通常用于带电药物基质的离子，例如钠、钾、铵、氯、甲磺酸根、葡甲胺等。也使用促进藻酸盐凝胶化的离子(例如第2族金属离子)。

虽然藻酸盐低聚物可以是由适当数量的古洛糖醛酸盐和甘露糖醛酸盐残基的聚合产生的合成材料，本发明中使用的藻酸盐低聚物可从上述天然来源(即，天然藻酸盐源材料)中方便地获得、产生或衍生。

产生可根据本发明使用的藻酸盐低聚物的多糖到寡糖的裂解可使用诸如酶消化和酸水解等传统的多糖裂解技术进行。在一个有利的实施方式中，使用酸水解来制备本发明的藻酸盐低聚物。在其它实施方式中，使用酶消化，并采用额外处理步骤将低聚物的末端糖醛酸饱和化。

然后可使用离子交换树脂层析或通过分级沉淀或溶解或过滤将低聚物与多糖分解产物分离。US 6,121,441和WO 2008/125828(此处通过援引以其整体明确并入本文)描述了一种适用于制备本发明中使用的藻酸盐低聚物的方法。其他信息和讨论可参见例如“Handbooks of Hydrocolloids”，Phillips和Williams编著，CRC，Boca Raton，Florida，USA，2000，此处通过援引将该教科书内容以其整体明确并入本文。

所述藻酸盐低聚物也可被化学改性，包括但不限于添加带电基团(诸如羧基化或羧甲基化的聚糖)的改性，以及改性藻酸盐低聚物以改变其柔性(例如，通过高碘酸盐氧化)。

适用于本发明的藻酸盐低聚物(例如低聚古洛糖醛酸)可通过下述步骤方便地产生：酸水解来自但不限于北方海带(Laminaria hyperbora)和淡黑巨海藻(Lessonianigrescens)的藻酸，在中性pH下溶解，加入无机酸使pH降低至3.4以沉淀所述藻酸盐低聚物(低聚古洛糖醛酸)，用弱酸冲洗，在中性pH中重悬浮和冷冻干燥。

用于产生本发明的藻酸盐低聚物的藻酸盐也可从适合的细菌来源(例如铜绿假单胞菌或棕色固氮菌)直接获得。

在一级结构要求大部分G残基以G-嵌段排列而不是作为单个残基的藻酸盐低聚物排列的实施方式中，海藻来源被视为是最适合的，因为事实上在这些生物体中产生的藻酸盐趋向于具有上述结构。对获得不同结构的藻酸盐低聚物，细菌来源可能更加适合。

涉及荧光假单胞菌和棕色固氮菌中藻酸盐生物合成的分子器件已经被克隆和表征(WO 94/09124；H.,等，Metabolic Engineering,1999,Vol 1,262-269；WO2004/011628；Gimmestad,M.等(同上)；Remminghorst和Rehm,Biotechnology Letters,2006,Vol 28,1701-1712；Gimmestad,M.等,Journal of Bacteriology,2006,Vol 188(15),5551-5560)，且通过操作这些系统可容易获得具有定制的一级结构的藻酸盐。

可通过差向异构化提高藻酸盐(例如藻源材料)的G含量，例如用来自棕色固氮菌的甘露糖醛酸C-5差向异构酶或其它差向异构酶来差向异构化。因此，例如可使用来自假单胞菌属或固氮菌分离的差向异构酶在体外进行差向异构化，所述差向异构酶例如来自荧光假单胞菌或棕色固氮菌的AlgG或来自棕色固氮菌的AlgE酶(AlgE1至AlgE7)。也特别考虑使用来自具有产生藻酸盐能力的其它生物体、特别是藻类的差向异构酶。以棕色固氮菌AlgE差向异构酶对低G藻酸盐的体外差向异构化详细描述在等(同上)和Strugala等(Gums and Stabilisers for the Food Industry,2004,12,TheRoyal Society of Chemistry,84-94)中。

为了获得包含G-嵌段的藻酸盐或藻酸盐低聚物，优选用除AlgE4之外的一种或多种棕色固氮菌AlgE差向异构酶作为可以产生G嵌段结构的酶。另一方面，可以使用AlgE4差向异构酶产生具有M/G序列交替段的藻酸盐或藻酸盐低聚物，或一级结构包含单个G残基的藻酸盐或藻酸盐低聚物，因为发现所述酶似乎优选地差向异构化单个M残基以产生连接到M残基的单个G残基而不是产生G嵌段。使用所述酶的不同组合可以获得特殊的一级结构。

还具体考虑使用这些酶的突变型或来自其它生物体的同源物。WO 94/09124描述重组或修饰的甘露糖醛酸C-5差向异构酶(AlgE酶)，其例如由差向异构酶序列编码，所述差向异构酶序列中编码差向异构酶的不同结构域或模块的DNA序列被改组或缺失和重组。作为另一种选择，可以使用天然存在的差向异构酶(AlgG或AlgE)的突变体，例如通过AlgG或AlgE基因定点突变或随机突变获得的突变体。

另一种方法是产生某些或全部差向异构酶基因发生突变的假单胞菌和固氮菌生物体，从而使所述突变体产生用于后续藻酸盐低聚物生产的所需结构的藻酸盐，或甚至所需结构和大小(或分子量)的藻酸盐低聚物。具有突变AlgG基因的大量荧光假单胞菌生物体的产生在WO 2004/011628和Gimmestad,M.等,2003(同上)中详细描述。具有突变AlgE基因的大量棕色固氮菌生物体的产生公开在Gimmestad,M.等，2006(同上)中。本领域技术人员将无需过度劳动就能够利用此教导产生新的突变体，所述突变体可用于产生本发明的藻酸盐低聚物。

其他方法是使来自固氮菌或假单胞菌生物体的内源性差向异构酶基因缺失或失活，然后引入一种或多种外源性差向异构酶基因，所述外源性差向异构酶基因可以具有或不具有突变(即，可以是野生型或经修饰)且其表达可受到控制，例如通过使用诱导型或其它“可控启动子”。通过选择合适的基因组合，可产生预定一级结构的藻酸盐。

另一种方法是将假单胞菌和/或固氮菌的某些或全部的藻酸盐生物合成机构引入不产生藻酸盐的生物体(例如E.coli)并且诱导所述基因修饰的生物体产生藻酸盐。

当使用这些基于培养物的系统时，藻酸盐或藻酸盐低聚物产物的一级结构可受培养条件影响。本领域技术人员完全有能力通过调整诸如温度、渗透压、营养水平/源和大气参数等培养参数来操控由特定生物体产生的藻酸盐。

提到“G残基/G”和“M残基/M”或提到古洛糖醛酸或甘露糖醛酸，或古洛糖醛酸盐或甘露糖醛酸盐，可互换地解读为提到了古洛糖醛酸/古洛糖醛酸盐和甘露糖醛酸/甘露糖醛酸盐(特别是α-L-古洛糖醛酸/古洛糖醛酸盐和β-D-甘露糖醛酸/甘露糖醛酸盐)，并且还包括它们的衍生物，所述衍生物中一个或多个可用的侧链或基团被修饰，所述修饰不会导致抑制或预防血液凝结的能力基本上低于未修饰的低聚物。常见的糖修饰基团包括乙酰基、硫酸盐基、氨基、脱氧基、醇、醛、酮、酯和酐基。除了硫酸盐基之外，可使用所述基团中的任意一个修饰根据本发明的藻酸盐低聚物；根据本发明的藻酸盐低聚物的特征是不携带硫酸盐基团。所述藻酸盐低聚物也可进行化学修饰来添加带电基团(如羧基化或羧甲基化聚糖)，及改变其柔性(例如，通过高碘酸氧化)。本领域技术人员知道可对低聚糖的单糖亚基进行的其他化学修饰，且这些修饰可应用于本发明的藻酸盐低聚物。

本发明包括使用单个藻酸盐低聚物或不同(多重/多个)藻酸盐低聚物的混合物。因此，例如可使用不同的藻酸盐低聚物(例如，两个以上)的组合。在这点上，如上所述，可选择共同提供抗凝血特性的有利特征的藻酸盐低聚物的组合。其可以是不同低聚物尺寸、不同G和M含量和/或不同单体排列的组合。

“血液凝集”是指从液体血液中形成纤维蛋白丝的不溶性基质的自然过程。其包括上述的组织因子通路和接触通路。根据本发明，“血液凝集”外延至可在血浆(即，从全血中移除血细胞后保留全部凝血因子而获得的产物)中被观察到的过程。同样地，所述术语外延为可在包含血液凝结因子的人工混合物中观察到的过程，所述人工混合物包括足够完整以便能够在诱导条件下形成纤维蛋白凝块的凝血因子。

“血浆”是指全血的液体成分。该溶液含有大量的蛋白质和其它大分子、电解质和糖。特别是，其包含参与凝血的全部凝血因子。

根据本发明，术语“包含血浆的组合物”不仅包括全血或已经移除一种或多种血液细胞类型(例如红细胞或白细胞)的血，也包括化学组成与血浆基本等同的组合物和包括在诱导条件下足以完成纤维蛋白凝块形成的血液凝结因子的组合物(例如，包含因子XII、XI、X、IX、VIII、V、凝血酶原和纤维蛋白原和可选的因子XIII的组合物，或者包含因子VII、III、X、V、凝血酶原和纤维蛋白原和可选的因子XIII的组合物)。也可包含功能上等效的衍生物和同系物。在某些实施方式中，所述组合物可以不是来源于全血，或者可以仅部分地来源于全血。包含血浆的组合物可以是保留一些或全部血小板的血浆。

因此术语“血液衍生产物”应当以类似的方式来解读为是或者来源于血液，特别是包括血液或血液产物的部分，特别是保留形成凝块(即凝结)能力的部分或产物的任何产物。因此血液衍生的产物可包括含有足以形成凝块的凝血因子的任何产物，其包括血浆或任何等效的产物或部分。

所述组合物优选为液体组合物。所述组合物优选为无菌的组合物。所述血浆优选为人血浆或存在于包含人血浆的组合物中的凝血因子为人源的凝血因子，但是可以存在功能上等效的非人源同系物。所述包含血浆的组合物优选是全血或包含全血的组合物。在某些实施方式中，全血可以包含或不包含对宿主生物体是异源的蛋白质。优选地，所述全血是新鲜收集的，例如在与藻酸盐低聚物接触前小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1分钟内收集。在其它实施方式中，组合物是不完全凝集的，例如部分凝集或优选为基本上未凝集。

本文广泛使用的“预防或抑制血液凝集”既包括绝对预防血液凝集，也包括对于血液凝集发生的任何负面作用或包含血浆的组合物(例如受试者的循环血或循环系统)中预先存在的凝块或凝块数量的任何负面作用。例如，其可以是延迟凝集过程开始，或减慢所述过程的一个或多个步骤或整个过程。这也可以见于，血凝块尺寸和/或密度的减少，或预先存在的或生长中的凝块尺寸和/或密度增加的速率的降低。还可以见于，预先存在的或生长的凝块的物理完整性降低，或任何类型的结构破坏，不过在某些实施方式中，所述术语不包括对已经形成的或预先存在的凝块的血栓溶解或溶栓作用。还可以见于，包含血浆的组合物(例如受试者的循环血液或循环系统)中凝块数量的减少，凝块数量增长速率的降低。其还可以被看作是凝块对受试者健康或幸福造成损害的能力的下降。本文使用的“抗凝”应当理解为与上文一致。可以看出本文所限定的藻酸盐低聚物的这些令人惊讶的效果可以因此用于调节或控制的血液凝集。

凝集的任何延迟(例如凝集速率的降低)和/或凝集程度的下降可以作为根据本发明的抗凝剂活性或效果的指示。因此，例如，抗凝剂的效果可以表示为：与没有藻酸盐低聚物时的凝集相比，凝集减少至少10％、15％、20％、25％或30％。

血液或包含血浆的组合物的凝集程度可以在简单的体外测试(例如，如以下实施例中所描述)中容易地确定。因此，血液样品出现凝集所经历的时间可以用作抗凝剂效果的量度，与对照(例如，没有藻酸盐低聚物时的凝集时间，例如未处理的对照，或阳性对照物质)相比，在存在藻酸盐低聚物时凝集时间的增加可作为抗凝剂效果的指示。

作为另一种选择，可以通过其它方法进行抗凝剂效果的测定，例如通过比较在存在和不存在藻酸盐低聚物时血凝块形成的程度和/或速率，例如形成的凝块尺寸和/或数量，或者每单位时间内形成的凝块尺寸和/或数量。例如，这可在测试系统中进行，例如在存在或不存在藻酸盐低聚物时，测定与血液或者包含血浆的组合物接触的人工表面或其上凝块形成的程度或速率。与不存在藻酸盐低聚物时相比，存在藻酸盐低聚物时凝块形成的程度和/或速率的降低可作为抗凝剂效果的指示。

血凝块的物理性质可以通过任何方便的方法测量，例如超声、血管造影术、CT、或简单的目视测量。在其它实施方式中，可以方便地使用血凝仪通过常规凝血测试(或血液凝结测试)测量凝集，并因此测量对其的抑制或预防，例如凝血弹性描记法、凝血酶生成测试、血栓动力学测试、局部促凝血酶原激酶时间(partial thromboplastintime，PTT)(或激活的部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastintimeaPTT或APTT))测试或凝血酶原时间测试。在优选的实施方式中，本发明的方法将导致受试者血液凝集能力或受试者血液凝集速率的临床相关的降低。在另一个可选的实施方式中，实施例中描述的过程可以用于测量凝血时间，在这种情况下，本发明的方法将导致受试者血液凝血时间的临床相关的增加。

根据本发明，当在与血液凝集相关的医学疾病或病况的治疗中使用时，“治疗”在本文中广泛用于包括任何治疗效果，即对所述疾病或病况的任何有益作用。因此，其不仅包括根除或消除所述疾病或病况，或治愈受试者的疾病或病况，也包括改善疾病或病况或受试者的总体健康。因此，例如，包括疾病或病况任何病症或迹象的改善，或疾病或病况任何临床公认的指标的改善(例如，降低循环血凝块的数量或增加血栓形成的下游的氧合)。在本发明要求保护的治疗中，可以是预先存在的血凝块得到不完全根除或新凝块的形成不完全停止，但所述治疗足以抑制这些过程达到使靶标疾病或病况完全解决的程度，或至少一定程度上得到解决，优选为受试者可接受的程度。因此治疗包括例如预先存在或诊断的疾病或病症的治愈和缓解性治疗，即保守治疗。

根据本发明，当在与血液凝集相关的医学疾病或病况的治疗中使用时，“预防”在本文中广泛用于包括任何预防效果。因此，例如，相对于预防性治疗之前所述疾病或病症或症状，它包括延缓、限制、减少或预防疾病或病症或所述疾病或病症的发作，或其一种或多种症状或指征。因此，预防明确地包括绝对预防疾病或病症或其症状或指征的发生或发展，和延迟病症或症状或指征的发作或发展，或减少或限制病症或症状或指征的发展和进程。

根据本发明，“抗凝治疗”和“抗血栓(或抗血栓形成)治疗”既包括预防性治疗也包括现有的或进行中的病症的治疗性治疗，因此这些术语应该解释为与前述一致。

在本发明的方法中，更特别地是，包含血浆的组合物将与有效量的藻酸盐低聚物接触，更特别的是，与提供血液凝集的可测量的抑制或预防的量的藻酸盐低聚物接触。药学上有效量的藻酸盐低聚物为提供与血液凝集相关的疾病和病症的可测量的治疗或预防的量的藻酸盐低聚物。基于常规剂量响应策略及方便地基于评估上述血液凝集的常规技术，本领域技术人员能够轻易地确定藻酸盐低聚物的有效/药物有效量。本领域技术人员将能在无过度负担下优化所述量并且能够确保本发明的藻酸盐低聚物的安全使用。

在治疗环境中，藻酸盐低聚物合适的剂量将因受试者不同而变化，且可根据受试者的重量、年龄和性别，病症的严重程度，施用的模式和选择的特定藻酸盐低聚物(例如根据其尺寸、G和M的含量和/或单体排布)由医师或兽医从业者决定。通常，本发明的藻酸盐低聚物将被施加到接受治疗的位置，其局部浓度至少为0.05％，优选至少为0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％或至少5％，更优选为至少6％，最优选为至少10％(重量/体积)。

与血液凝集、更具体地是不需要的或不适当的血液凝集相关的疾病和病症包括但不限于：静脉血栓形成(例如深静脉、门静脉、肾静脉、颈静脉和脑静脉窦血栓形成)、动脉血栓形成(例如冠状动脉、颈动脉和肝动脉血栓形成)、动脉粥样硬化、静脉移植物衰竭、动脉移植物衰竭、卒中、心肌梗塞、肺栓塞、和血栓形成倾向(也称为高凝集性或血栓前状态)。可使用本发明的藻酸盐低聚物治疗或预防任何和全部所述疾病和病症。治疗可涉及全身或局部施用藻酸盐低聚物。

与血液凝集相关的另一主要临床问题涉及由留置和可植入医疗、手术或假体装置诱导的血栓形成。血液和/或胞间液暴露于这些产品的人工(即非生物(例如，塑料、橡胶、硅、金属或玻璃))表面促进血栓形成。亦报道，组织移植可以引起所述血栓形成，并且如果这些血栓形成引起栓塞，则在该移植组织部位或循环系统的远端部分产生问题。

因此，本发明的藻酸盐低聚物可用于抑制或预防在所述装置或移植组织上的血栓形成。其可包括任何种类的管线(包含导管，例如中心静脉和外周静脉导管)、心脏瓣膜、血管支架、人工关节、子宫内装置、起搏器、气管造口术管、放射治疗导线和软组织植入物。这些装置包括在使用时可以部分留置的装置。移植组织可包括心脏(例如心脏瓣膜)、肺、肾脏、肝脏、胰腺、肠和角膜组织、动脉和静脉移植物和皮肤。

所述治疗可包含给已经或将要植入可植入装置或组织移植物的受试者局部或全身性施用藻酸盐低聚物。在其它实施方式中，所述可植入/留置装置或组织移植物可在可与血液接触的表面上设置例如本发明的藻酸盐低聚物的涂层(接受涂层处理)之后植入。所述处理可以在植入之前或基本与植入同时应用于可植入的表面，例如通过用包含藻酸盐低聚物液体制剂喷涂可植入装置或组织移植物的相关表面。在其它实施方式中，装置的可植入或留置表面可包含或携带(例如可以结合)或可浸渍或涂覆根据本发明的藻酸盐低聚物。在这些实施方式中，藻酸盐低聚物可被涂覆到可植入/留置表面或作为表面涂层的部分。其可以在可植入表面形成之前、期间或之后进行，且可以通过共价或非共价相互作用(例如离子或静电相互作用)进行固定。作为代表性实例，可在表面提供单体组成适合的藻酸盐低聚物作为阳离子引发的凝胶或其一部分。在其他实施方式中，所述藻酸盐低聚物可被提供或包括在血液相容性涂层中，该涂层包含一种或多种其他血液相容性的化合物，例如肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、聚乙二醇或葡聚糖、或实际上具有抗凝血活性的任何其它生物活性剂、或具有惰性血液相容性的化合物或试剂(例如血液相容性聚合物或塑料)。

与血液凝集相关的另一主要临床问题涉及在外科手术过程中引发的血栓形成。受试者组织的切口可成为血栓形成位点，其又可导致栓塞并转移到循环系统的另一部分，在此处存留并引起上述的疾病和病症。

因此本发明的藻酸盐低聚物在可以外科手术之前、期间和/或之后使用，以抑制或预防在外科手术切口部位形成血栓。所述治疗可包括对正在接受外科手术、将要接受外科手术或从外科手术中恢复的受试者全身、或更方便地局部施用藻酸盐低聚物。

具体地，本发明的藻酸盐低聚物可作为预防性治疗，例如以预防、或至少最小化血栓形成疾病(例如，上述的那些疾病)风险。一般说来，需要本发明治疗或预防的受试者将被诊断为患有或有风险具有与血液凝集相关的疾病或病症(例如，上述的那些疾病)。这些受试者包括但不限于：将是或是长期不能移动的受试者，患有动脉纤维性纤颤的受试者，患有动脉粥样硬化斑块的受试者，具有或接受可植入医疗、外科手术或假体装置的受试者，正在经历外科手术、将要经历外科手术或正在从外科手术恢复的受试者，具有先天性血栓形成倾向的受试者(例如因子V Leiden、凝血酶原G20210A、抗凝血酶III缺乏症、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、因子XIII突变、家族性血纤维蛋白原异常)，具有获取性血栓形成倾向的受试者(例如具有抗磷脂综合症、肝素诱导的血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia，HIT)、睡眠性血红蛋白尿症(nocturnal hemoglobinuria，PNH)、血液不畅相关血液病症(例如镰状细胞病、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症(过量的血小板))、癌症(特别是转移性肿瘤)、肾病综合症、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病))、肥胖和妊娠的受试者。

受试者可以是人或非人脊椎动物受试者，但更特别地可以是脊椎动物，例如选自哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类和爬行动物的脊椎动物。非人脊椎动物可以是家畜或家养动物或具有商业价值的动物，其包括实验室动物或动物园或游戏公园中的动物。因此，代表性的动物包括狗、猫、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、马、猪、绵羊、山羊、牛、鸡、火鸡、珍珠鸡、鸭、鹅、鹦鹉、虎皮鹦鹉、鸽子、鲑鱼、鳟鱼、鳕鱼、黑线鳕、海鲈鱼和鲤鱼。因此本发明覆盖兽医应用。受试者可以被视为患者。所述受试者优选是人。

在某些实施方式中，受试者不具有如细菌、真菌、原生动物、藻类或寄生虫感染等显示病理指标的感染。更特别地是，在某些实施方式中的受试者不具有生物膜感染。在其它实施方式中的受试者不具有高粘粘液或是需要降低粘液粘性。

在本发明的一个实施方式中的藻酸盐低聚物可结合或组合其他抗血凝剂(以下称“其他抗凝剂”)在本发明的方法或应用中使用。

在治疗性应用的环境下，这种抗微生物剂可以是任何临床上有用的抗凝剂，例如维生素K拮抗剂(如华法林、苊香豆醇、苯丙香豆素、裂盒蕈色素和苯茚二酮)、肝素、低分子量肝素、Xa因子的合成戊糖抑制剂(例如磺达肝癸钠和艾卓肝素)、Xa因子的直接抑制剂(例如利伐沙班和阿哌沙班)、直接的凝血酶抑制剂(例如水蛭素、来匹卢定、比伐卢定、阿加曲班、达比加群、希美加群、抗凝血酶蛋白、巴曲酶和裂纤酶)。

在本发明其他实施方式中的藻酸盐低聚物可与溶栓剂结合或组合在本发明的方法或应用中使用。溶栓剂消化或分解预先存在的血凝块且包括组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、复合纤溶酶链激酶，链激酶和尿激酶。

在本发明的其他实施方式中的藻酸盐低聚物可与抗血小板剂结合或组合在本发明的方法或应用中使用。抗血小板剂抑制血小板聚集，并包括不可逆的环氧合酶抑制剂(例如阿司匹林)、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(如氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、噻氯匹啶)、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑)、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂(例如阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班)、腺苷重摄取抑制剂(例如双嘧达莫)、血栓素抑制剂(例如特鲁托班(terutroban))。

可用于本发明的藻酸盐低聚物和其他抗凝剂、溶栓剂或抗血小板剂可以例如在单个药物制剂或组合物中一起施用、或分开施用(即分开、连续或同时施用)。因此，本发明的藻酸盐低聚物和其他抗凝剂、溶栓剂或抗血小板剂可以组合，例如组合在药物试剂盒中或作为组合的(“组合”)产品。

因此本发明也提供产品(例如药物试剂盒或组合的(“组合”)产品)或组合物(例如药物组合物)，其中，所述产品或组合物包含如本文所限定的藻酸盐低聚物和其他抗凝剂、溶栓剂和/或抗血小板剂。这样的药物产品和药物组合物优选适用于本发明的医疗方法。

还包括本文所限定的藻酸盐低聚物在制造用于本发明医疗方法的所述药物产品和药物组合物中的应用。

本发明的藻酸盐低聚物可以以任何方便的形式或通过任何方便的手段给受试者施用，例如通过局部、口服、胃肠外、肠内、胃肠外途径或通过吸入。所述藻酸盐优选将通过局部、口服或肠胃外途径或通过吸入施用。该藻酸盐低聚物可以通过许多不同的途径施用，这比现有的抗凝剂更有优势。

本领域技术人员将能够将本发明的藻酸盐低聚物配制为适于根据任何本领域已知的和在文献中广泛描述的常规方法施用途径的药物组合物。

因此，本发明也提供一种用于任何一种上述方法或应用的药物组合物，其包括如本文限定的藻酸盐低聚物以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该组合物也可以包含如上文所述的其它治疗剂。

更具体地，本发明的藻酸盐低聚物可任选与其它活性剂、与一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂结合在一起，以产生常见的医药制剂诸如片剂、丸剂、粉末剂(例如可吸入粉末)、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(在固体或在液体介质中)、喷雾剂(例如，鼻喷雾剂)等，用于喷雾器的组合物、软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、阴道栓剂、无菌可注射溶液、无菌包装的粉末剂等。无菌吸入和无菌注射组合物是特别值得注意的。

合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、惰性藻酸盐聚合物、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、高渗盐水、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质(如硬脂肪)或其适合的混合物。值得注意的赋形剂和稀释剂为甘露醇和高渗盐水溶液(盐水)。

本发明的组合物还可包括润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、和调味剂等。在如上述与组合治疗相关的药物组合物中可以包括另外的治疗活性剂。

例如静脉注射溶液等非肠道给药的形式应该是无菌的且不含生理上不可接受的试剂，并且应具有较低的摩尔渗透压浓度以在施用时减少刺激或其它不良影响，因此溶液应当优选为等渗或稍微高渗的，例如高渗盐水溶液(盐水)。合适的载剂包括通常用于注射非肠道溶液的水性载剂，例如无菌注射用水、氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液和诸如Remington'sPharmaceutical Sciences(第15版,Easton:Mack Publishing Co.,第1405页-第1412页和第1461页-第1487页(1975))和The National Formulary XIV(第14版，华盛顿:美国药学协会(1975))等描述的其它溶液。所述溶液可以含有通常用于非肠道溶液的防腐剂、抗微生物剂、缓冲剂和抗氧化剂、赋形剂和其它添加剂与生物聚合物相容并且不会妨碍产品的制造、储存或使用。

对于局部给药，所述藻酸盐低聚物可以结合到乳膏、软膏、凝胶、透皮贴剂等中。藻酸盐低聚物的简单无菌溶液或包含藻酸盐低聚物的简单无菌液体组合物可以是在外科手术过程中和用于处理可植入装置时特别方便使用。所述藻酸盐低聚物也可以结合到医用敷料中，例如伤口敷料(如纺织(例如织物)敷料或非纺织敷料(例如凝胶或具有凝胶成分的敷料))。藻酸盐聚合物在敷料中的使用是已知的，并且这种敷料(或实际上任何敷料)可以进一步包括本发明的藻酸盐低聚物。

合适的其他局部系统是原位药物递送系统，例如凝胶，其中固体、半固体、无定形或液晶凝胶基质原位形成并且其可包含藻酸盐低聚物(其可以是如本文所限定的任何藻酸盐低聚物)。这种基质可方便地被设计成控制藻酸盐低聚物从基质中释放，例如，可以延迟释放和/或在选择的时间段内持续释放。这样的系统可仅在与生物组织或流体接触时形成凝胶。通常所述凝胶是生物粘附的。可保持或适于保持预凝胶组合物的到任何身体部位的递送可通过这样的递送技术来实现。这样的系统描述在WO2005/023176中。

本发明组合物中藻酸盐低聚物的相对含量可根据所需的剂量和后续的剂量方案而变化，且其将取决于被治疗的受试者和血栓或可能的形成位点的位置和属性。优选地，所述组合物将包含一定量的的藻酸盐低聚物，该量可提供对血液凝集的可测量的抑制或预防，和/或对血液凝集相关的靶标疾病或病症的可测量的、优选临床相关的预防或治疗。

所述组合物或产物将优选包含足够的藻酸盐低聚物，在施用于受试者或应用到局部位置时，低聚物在靶标位置处的局部浓度为至少0.05％，优选为至少0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％，最优选为至少10％(重量/体积)。本领域技术人员会知晓，如果后续有多重给药方案，则可减少藻酸盐的量，或为了最小化施用或应用次数而增加藻酸盐的量。

本发明的组合物或产物通常会包含1％至99％、5％至95％、10％至90％或25％至75％的藻酸盐低聚物，余量为其它的组分。

本发明的方法还可以在体外和离体环境中应用。血液和包括血浆的血液衍生产物通常用于多种医疗程序。例如血液和血浆输注在外科手术和创伤治疗过程中是很普遍的。更通常的是从供体中收集所述产物，而不是从给患者的施用中物理和临时去除所述产物。因此，这些产物必须在它们的使用寿命的某一阶段进行体外处理。来源于血液的血液产物显然必须通过经历一定数量的体外处理。

此外，通常从患者提取血液，以对其进行体外诊断和预后测试。

在这些区域内必须不发生血液/血液产物的凝集，并且标准做法是在血液收集时或其后不久加入诸如EDTA、柠檬酸和草酸等抗凝剂以确保凝集延迟。如果所述血液经历任何种类的处理，将维持抗凝剂的存在以便确保不在以后的时间发生凝集。

因此，本发明的藻酸盐低聚物可用于在体外组合物中抑制或预防凝集，所述组合物包含血浆、优选全血。藻酸盐低聚物的低毒性使其在本发明的情况中特别有利，因为这种处理过的组合物可施用于患者而没有导致毒性的抗凝剂。优选地，藻酸盐低聚物与包含血浆的组合物(例如，全血)基本上在收集时接触，例如在收集的10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟内，优选在收集的同时接触。在其它实施方式中，藻酸盐低聚物在储存期间与包含血浆的组合物(例如，全血)接触。该接触可在组合物的使用期限中多次发生。

因此，可将藻酸盐低聚物添加到所述包含血浆的组合物中。作为另外一种选择或作为补充，藻酸盐低聚物可以被添加到或提供至将要引入组合物的容器中，或将要存放例如血液收集管、储存袋等的容器中。实际上，对于可接触包含血浆的组合物的任何材料(例如容器或导管(线)或表面或装置)(例如，测试设备以及收集或存储设备，医疗或外科装置或设备，可植入医疗装置等)，均可提供有藻酸盐低聚物。因此，将要或可能与包括血浆的组合物接触的任何材料可接触根据本发明的应用和方法如本文限定的藻酸盐低聚物。

代表性的产物和装置包括诊断和研究测试产物和例如包含传感器的装置，和用于测试血液或血液成分的其它装置，及产品，包括其所使用的耗材，例如测试条或棒、板、小瓶或容器等。

在所述组合物是全血或已经来源于全血并在适当的时候施用于患者的实施方式中，所述组合物可以被认为是离体的。换句话说，如上所述的本发明方法在某些实施方式中不在人或动物体内或不对人或动物体实施或执行(例如，其中，使用藻酸盐低聚物的步骤不会在人或动物身体内发生或不对人或动物身体进行)。在本发明的环境中，任何不在人或动物身体内发生或不对人或动物身体进行的任何方法(例如通过治疗或手术)可视为体外方法，其可包括离体方法。然而，根据上文可明确的是，可以想到所述体外/离体方法仍然可以通过临床应用执行。

阐释体外/离体方法的一个特殊实例为血液透析。血液透析过程中经常使用抗凝剂以确保在透析机内不会形成有问题的血栓，并将透析血液转移给患者。给患者施用抗凝剂相当于体内治疗。另一方面，当血液位于患者体外及在透析设备和导管内时，向血液施用抗凝剂相当于离体/体外处理。

与透析类似的是，如本文限定的藻酸盐低聚物也作为本发明的抗凝剂任用于何方法或涉及血浆置换的方法，所述方法中从身体中移除血液，移除或处理血浆或一种或多种血浆成分，并将血细胞和/或血浆返回到体内。更为通常地，本发明藻酸盐低聚物的应用可适用于任何体外血液处理方法。

鉴于通常迫切需要在无菌条件下体外保存血液和血液产品，常规的是提供在其中已经存在有效量的抗凝剂的无菌收集容器和导管。所述藻酸盐低聚物可通过与根据本发明的相同方式使用。

因此本发明提供包含如本文限定的藻酸盐低聚物的无菌血液收集容器和导管。所述藻酸盐低聚物可以任何方便的形式提供，例如游离的(例如，作为溶液的一部分或作为固体，例如冻干固体等)或固定的形式(例如作为容器和导管内表面上的预处理剂(如涂层))。血液收集容器包括但不限于输血袋、试管或小瓶(优选真空)和注射器。

本发明还提供透析或血浆置换的耗材、设备和机器，包括一次性导管接受器和过滤器，其包含本文所限定的藻酸盐低聚物或表面经本文所限定的藻酸盐低聚物预处理，例如涂覆。

“预处理”的意思是指在接触包含血浆的组合物前，所述表面接触藻酸盐低聚物，从而使所述藻酸盐低聚物在表面上存留一段足够长的时间以预防或抑制在处理过的表面处或表面上的血液凝集。优选地，藻酸盐低聚物将存留基本上为表面的使用寿命的时间，例如，所述预处理导致藻酸盐低聚物的基本上永久的涂层。然而，永久的抗凝效果不是必需的，可能有用的是提供抗凝作用持续时间更有限(例如，几天、几周或几个月)的产物或装置。因此，预处理的表面/产品是其上施用并保持了藻酸盐低聚物的表面/产品。这种产品/表面可以是经涂覆和/或浸渍的产品/表面。在某些实施方式中，涂层将包括多个(即，至少两个)层的藻酸盐低聚物。在其它实施方式中，藻酸盐低聚物可提供为单个层，并且在另外的其它实施方式中，藻酸盐低聚物可以末端连接，使得所述藻酸盐低聚物更自由地与含血浆的组合物接触。

预处理可以通过任何方便的方式获得，例如任何将藻酸盐低聚物施加到所述表面的形式，值得注意的是涂覆所述表面，例如用包含藻酸盐低聚物的聚合物进行喷雾干燥、涂覆聚合物。作为另一种方式，所述藻酸盐低聚物可以结合或浸渍到材料中，利用所述材料可制造物体或其敏感部件。这种方法适合于由诸如塑料和聚硅氧烷等聚合物制造的物体或组成部分。因此包括的血液收集和储存产品以及透析/血浆置换的产品具有：包含藻酸盐低聚物涂层或涂层组合物的，或结合或浸渍藻酸盐低聚物的无生命表面。

因此，本发明的体外/离体方法可包括制备促进血液凝集的能力降低的产物或设备。术语“促进血液凝集的能力降低”可以与上文给出的“预防或抑制血液凝集”定义进行类似解释。如前所述，人工表面倾向于引起凝集，大多数合成塑料、聚合物和金属表面引起血栓形成。藻酸盐低聚物可以根据本发明使用以减少所述倾向或能力。更特别地，所述藻酸盐低聚物在与包含血浆组合物(例如血液或血液衍生产物)接触放置(包括当产品或装置原位放置在人或非人动物体内)时降低由所述产物或装置引起的凝集(或凝块的形成)的程度。

由医疗装置引起的凝集代表了严重的问题，并且如上所述凝集速度和/或程度的任何降低是有益的(即使其很小)(例如，至少5％或10％的降低)。

人工表面可以是任何无生命的表面，特别是用于与包含血浆的组合物接触的装置的产品表面。在一个特定的实施方式中，其为医疗装置的表面或其中的表面。它可以是任何合成的表面，例如聚合物、塑料、橡胶、硅树脂、金属或玻璃等。

促进凝集的能力降低的产品或装置的制备可以包括以下步骤：在所述产品或装置表面或其上、特别是在人工表面或其上提供藻酸盐低聚物。如上所述，藻酸盐低聚物可以结合或浸渍到制造或形成表面的材料中，或可施加至表面，最值得注意的是通过涂覆。

所述藻酸盐低聚物可以以自身施涂(例如涂覆)，或与一种或多种其它材料或组分组合施涂(例如涂覆)。因此所述藻酸盐低聚物可以被直接连接或固定到表面(通过共价或非共价连接，例如吸附)或者它可以结合到或包含在(例如包埋在，或连接到)被施涂(例如，涂覆)到产品或装置上的材料中，其材料本身可以是共价或非共价连接的。因此，例如，所述藻酸盐低聚物可以被包埋在施加到表面的聚合物或涂层中，或者其可以共价连接到用于制备聚合物涂层的基质聚合物。所述聚合物涂层可被设计成提供藻酸盐低聚物的延迟释放，例如通过将其结合(例如包埋)在不同的聚合物层中。该延迟释放可以在不同的时间周期发生，例如从几天到几个月。

医疗装置等的许多不同涂覆技术是已知的，例如来自SurModics的技术，并且可以使用的任何这样的技术。事实上，如上所述，已知可提供具有血液相容性涂层的医疗装置和产品以尽量减少凝集。本文限定的“血液相容性”表示所讨论的表面/材料/产品/设备/涂层或化合物等在与血液或包含血浆的组合物接触放置时不引起任何负面反应，或任何这样的负面反应被降低或抑制(例如最小化)。负面反应可以是凝集、血小板激活等，特别是可以导致或增加凝集的任何反应。

血液相容性材料或涂层可以是“主动的”，即它可以包含抑制或预防凝集的生物活性剂，例如通过抑制凝血酶生成(例如肝素)，或者它可以是“被动的”，其可以提供抗凝剂或血液相容性效果(通过例如将表面与血液屏蔽)，或降低其引起凝集的能力(例如通过减少血液中的蛋白质在表面上的吸附)，和/或降低血小板活化。被动涂层可以被视为“伪装”或“掩盖”表面，使其不在血液中被识别为外来物。多种不同的主动的和被动的血液相容性涂层是本领域已知的。藻酸盐低聚物可以与这些涂层结合使用，并可以用来赋予主动和/或被动效果。

因此，可以将藻酸盐低聚物提供作为血液相容性涂层的一部分或者包括在血液相容性涂层中，并且可与上述的一种或多种血液相容性化合物组合使用，所述血液相容性化合物包括具有抗凝剂作用的生物活性剂(例如肝素、透明质酸、右旋糖酐等)以及具有被动的血液相容性效果的聚合物和/或塑料。

血液相容性化合物的其他实例为可释放一氧化氮(NO)的分子，已知其预防血小板活化。NO-释放性聚合物已被开发出来。

本发明将参照以下非限制性实施例进一步描述。

实施例

实施例1.G-嵌段藻酸盐低聚物对人全血凝集时间的影响

材料和方法

测试材料和对照

测试的藻酸盐低聚物为OligoG CF-5/20，其为G-嵌段藻酸盐低聚物(DP为5至20，平均分子量2600，G残基90％-95％)。OligoG由AlgiPharma AS(挪威)提供。阳性对照为Fuller’s Earth，筛孔尺寸8-16(Sigma-Aldrich A/S)。

OligoG制剂

OligoG的称重样品以少量缓慢洒入电磁搅拌的无菌蒸馏水中(Fresenius KabiAG，德国)。当样品全部添加后再继续搅拌50分钟，并添加额外的无菌水以得到适当的最终总体积。所述制剂迅速阻塞Sartorius MiniSart过滤器(0.2μm孔径)，所以将其在室温放置过夜，然后再进行一小时的电磁搅拌。仍然无法过滤所述制剂，因此其在测试中不进行过滤而使用。

所述OligoG制剂的终浓度为200mg/ml，其以干物质含量(在提供的OligoG样品中为95.2％)计。

凝集测试过程

200mg/ml的等分试样(53μl和111μl)的OligoG制剂放置在单独的试管中。Fuller’s Earth(约100mg/管)放置在阳性对照管中。还准备了空管作为阴性(未处理)对照。

通过对4名健康成年人进行静脉穿刺获得新鲜的血液样品。使用Liquidraw管(普通塑料)从每个供体中收集血液样品。当收集了各血液样品后，将收集几秒钟内的等分试样(1ml)加入到各管中以覆盖测试物和对照物。OligoG制剂与血液以5％和10％(v/v)混合，因此在混合物中OligoG的最终浓度为10mg/ml和20mg/ml(以OligoG干物质含量计)。用来自每个供体的血液对一个包含各浓度OligoG的管和一个具有各对照的管进行测试。所述管立即放置在大约37℃的水浴中，并摇动直到发生凝集。对非凝集样品连续进行约20-30分钟的温和摇动，然后每约5-10分钟温和摇动，然后不那么频繁地温和摇动。记录每个管中血液等份的收集和完全凝集之间耗费的时间。

结果

表1：4种不同人血液样品在存在10mg/ml或20mg/ml OligoG时的凝集时间

表1注释：

％对照 平均凝集时间占平均阴性对照时间的百分比

S.D. 标准差

阴性对照 未处理

阳性对照 用Fuller’s Earth处理

OligoG 用OligoG CF-5/20处理

a 保持未凝集的混合物

b 在所述两个观察点之间的某个时间凝集的混合物

用Fuller’s Earth进行的阳性对照引起平均凝集时间大幅减少至平均阴性对照值的38％，证明了所述测试的有效性和敏感性。

4个未处理的血液样品的平均凝集时间为546秒。用10mg/ml的OligoG处理使来自一个供体的血液的凝集时间增加超过9.31倍。在3986和6671秒的观察之间发生凝集。包含10mg/ml测试物的其它3个供体的混合物和包含20mg/ml测试物的全部4个供体的混合物在制备后超过5个小时(>18000秒)保持未凝集，没有再进行所述混合物的进一步观察。

结论

由此得出结论为，OligoG CF-5/20、且一般性地外延至藻酸盐低聚物能够显著抑制(如果不是预防的话)人全血的凝集。这表明，可提出藻酸盐低聚物在体外(例如在处理血液和血液产物中)和体内(例如在抗凝剂治疗中)作为抗凝剂的应用。

实施例2.M-嵌段和MG-嵌段藻酸盐低聚物对人全血凝集时间的影响

材料和方法

测试材料和对照

测试的藻酸盐低聚物为M-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n10，100％M残基)和MG-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n15，基本上完全是交替的M和G残基序列)。藻酸盐低聚物由AlgiPharma AS(挪威)提供。阳性对照为Fuller’s Earth，筛孔尺寸8-16(Sigma-AldrichA/S)。参照物为肝素(LEO 5000IE/ml，LEO Pharma A/S)。

测试材料和对照的制剂

每个低聚物称重样品(200mg的M-嵌段DP_n10和200.1mg的MG-嵌段DP_n15)以少量缓慢洒入电磁搅拌的无菌蒸馏水中(880μl，Fresenius Kabi AG，德国)。当每个测试物全部添加后继续再搅拌92分钟-95分钟，直至每个测试物溶解。每个测试物制剂的终浓度为200mg/ml(以供应的测试物样品计)，假设测试物的溶胀为0.6ml/g。随后所述测试物制剂保存在室温中，直至在第二天的凝集测试中使用。

在进行凝集测试的当天在无菌蒸馏水中(Fresenius Kabi AG，德国)制备参照物的稀释液，使得肝素终浓度为200IU/ml、20IU/ml和2IU/ml。

凝集测试过程

200mg/ml的等分试样(53μl和111μl)的每个藻酸盐低聚物制剂放置在单独的试管中。200IU/ml、20IU/ml和2IU/ml的等分试样(53μl)的参照物制剂放置在单独的试管中。Fuller’s Earth(约100mg/管)放置在阳性对照管中。还准备空管作为阴性(未处理)对照。

通过对4名健康成年人进行静脉穿刺获得新鲜的血液样品。使用Liquidraw管(普通塑料)从每个供体中收集血液样品。当收集了各血液样品后，将收集几秒钟内的等分试样(1ml)加入到各管中以覆盖测试藻酸盐低聚物、参照物和对照。藻酸盐低聚物制剂与血液以5％和10％(v/v)混合，因此在混合物中每种藻酸盐低聚物的最终浓度为10mg/ml和20mg/ml(以接受的藻酸盐低聚物样品计)。参照物的每个稀释样与血液以5％v/v混合，因此在混合物中参照物(肝素)的最终浓度为10IU/ml、1IU/ml和0.1IU/ml。用来自每个供体的血液对一个包含各浓度的各测试低聚物的管、一个包含各浓度的参照物的管和一个具有各对照的管进行测试。所述管立即放置在大约37℃的水浴中，定期摇动直到发生凝集。记录每个管中收集血液等分试样到完全凝集之间耗费的时间。弃去在开始处理后超过6个或7个小时仍然保持未凝集的样品，并且不进行进一步观察。

结果

表2-4种不同人血液样品在存在10mg/ml或20mg/ml M-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n10)和MG-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n15)、10IU/ml、1IU/ml和0.1IU/ml肝素和Fuller’searth时的凝集时间。

表2注释：

％对照 平均凝集时间占平均阴性对照时间的百分比

S.D. 标准差

a 排除未凝集样品的所有平均值+S.D.

b 保持未凝集的混合物

阴性对照 未处理

阳性对照 用Fuller’s Earth处理

测验物A M-嵌段藻酸盐低聚物DP_n10

测验物B MG-嵌段藻酸盐低聚物DP_n15

用Fuller’s Earth处理阳性对照引起平均凝集时间大幅减少至平均阴性对照值的27％，证明了所述测试的有效性和灵敏性。

用M-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n10)处理在测试的浓度和来自4个受试者的血液样品中均延迟了凝集。在10mg/ml时，显示平均凝集时间增加至平均阴性对照值的229％。在20mg/ml时，显示3个供体的平均凝集时间增加至平均阴性对照值的611％，而来自第4个供体的血液样品在开始处理后超过6个小时仍然保持未凝集。

用MG-嵌段藻酸盐低聚物(DP_n15)处理在测试的浓度和全部4个受体的血液样品中均延迟了凝集。其效果大于M-嵌段藻酸盐低聚物：在10mg/ml时，MG嵌段藻酸盐低聚物增加平均凝集时间至平均阴性对照值的703％。在20mg/ml时，来自全部4个供体的血液样品在开始处理后超过6个或7个小时仍然保持未凝集。其效果小于G-嵌段藻酸盐低聚物，其中在10mg/ml或20mg/ml的G-嵌段藻酸盐低聚物处理时，除了一个供体外的全部血液在5小时后保持未凝集。

参照物肝素在全部3个测试的浓度和所有4个受体的血液样品中延迟了凝集。在0.1IU/ml时，平均凝集时间增加至平均阴性对照值的170％。在1IU/ml和10IU/ml时，来自全部4个供体的血液样品在开始处理后超过6个或7个小时仍然保持未凝集。因此，M-嵌段和MG-嵌段藻酸盐低聚物在10mg/ml时对凝集时间的效果与肝素在0.1IU/ml和1IU/ml之间时的效果相等。

结论

由此得出的结论为，M-嵌段藻酸盐低聚物和MG-嵌段藻酸盐低聚物均可以引起全部4个供体的血液的凝集时间的显著增加。M-嵌段藻酸盐低聚物和MG-嵌段藻酸盐低聚物在10mg/ml时的效果与肝素在0.1IU/ml和1IU/ml之间时的效果相等。

MG-嵌段藻酸盐低聚物的效果大于M-嵌段藻酸盐低聚物的效果，但是小于实施例1中的G-嵌段藻酸盐低聚物。因此，不同的糖醛酸单体序列和/或不同的低聚物长度可具有不同程度的抗凝剂效果，因此适当的藻酸盐低聚物选择可在特定情况下获得特定程度的抗凝。例如，可选择更大量的G个残基和/或更长的G嵌段长度，以得到更有效的抗凝效果。

Claims (31)

1.一种用于预防或抑制血液凝集的体外或离体方法，所述方法包括：使包含血浆的组合物、或与所述组合物接触或可接触的材料接触具有2至75个单体残基的藻酸盐低聚物，其中，所述单体残基不携带硫酸盐基团。

2.如权利要求1所述的体外或离体方法，其中，所述包含血浆的组合物是全血。

3.如权利要求1或2所述的体外或离体方法，其中，所述包含血浆的组合物是无菌的。

4.如权利要求1-3中任一项所述的体外或离体方法，其中，所述材料是使用时与血液或血液衍生产物接触的产品或装置或者是该产品或装置的一部分。

5.如权利要求1-4中任一项所述的体外或离体方法，其中，所述方法用于制备具有降低的促进血液凝集能力的产品或装置，所述方法包括在所述产品或装置的表面处或表面上提供所述藻酸盐低聚物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的体外或离体方法，其中，所述藻酸盐低聚物结合或浸渍到所述材料中，或施涂到与所述组合物接触的材料的表面。

7.如权利要求1-6中任一项所述的体外或离体方法，其中，所述藻酸盐低聚物涂覆到所述材料的表面上，或者作为表面涂层的一部分提供。

8.如权利要求7所述的体外或离体方法，其中，所述藻酸盐低聚物被设置或包含在含有一种或多种其他血液相容性化合物的血液相容性涂层中，优选其中所述其他血液相容性化合物选自肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、聚乙二醇或葡聚糖。

9.如权利要求1-8中任一项所述的体外或离体方法，其中，所述材料选自：

(i)无菌血液收集容器或导管，

(ii)透析或血浆置换耗材、或者透析或血浆置换设备或仪器的部件，

(iii)可植入的医疗、外科手术或假体装置，

(iv)移植组织，或

(v)诊断产品或装置，或其一部分。

10.一种用作治疗性血液抗凝剂的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

11.如权利要求10所述的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物用于治疗或预防血栓形成或者与血液凝集相关的疾病或病症的方法。

12.如权利要求11所述的藻酸盐低聚物，其中，所述疾病或病症是静脉血栓形成、动脉血栓形成、动脉粥样硬化、静脉移植物衰竭、动脉移植物衰竭、卒中、心肌梗塞、肺栓塞或血栓形成倾向。

13.如权利要求10-12中任一项所述的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物施用于选自下列受试者的受试者

(i)即将长期无法移动或是长期无法移动，

(ii)患有心房纤颤，

(iii)具有动脉粥样硬化斑块，

(iv)携带或正接受可植入医疗、外科手术或假体装置，

(v)正在经历外科手术、将要经历外科手术或正在从外科手术恢复，

(vi)具有先天性或获得性血栓形成倾向。

14.如权利要求10-13中任一项所述的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物用于抑制或预防在材料的表面上形成血栓的方法，所述材料选自：可植入或留置的医疗、外科手术或假体装置；移植组织；透析或血浆置换耗材或者透析或血浆置换设备或仪器的部件。

15.如权利要求9所述的体外或离体方法或如权利要求14所述的藻酸盐低聚物，其中，

(i)所述可植入的医疗、外科手术或假体装置为导管、心脏瓣膜、血管支架、人工关节、子宫内装置、起搏器、气管造口管、放射治疗线或软组织植入物，

(ii)所述移植组织为心脏、优选心脏瓣膜、肺、肾脏、肝脏、胰腺、肠或角膜组织、动脉或静脉移植物、或皮肤，及

(iii)所述透析或血浆置换耗材、或者透析或血浆置换设备或仪器的部件为透析或血浆置换导管、容器或滤器。

16.如权利要求9或15所述的体外或离体方法或者如权利要求14或15所述的藻酸盐低聚物，其中，所述材料在可与包含血浆的组合物接触的表面处或表面上包含或携带藻酸盐低聚物，可选其中所述表面还包含或携带一种或多种其他血液相容性化合物，优选其中所述其他血液相容性化合物选自肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、聚乙二醇或葡聚糖。

17.如权利要求10或11所述的藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物在外科手术程序之前、期间和/或之后使用，以抑制或预防在外科手术切口部位的血栓形成。

18.一种无菌血液收集容器或导管，其中，所述容器或导管在可与血液接触的表面处或表面上包含或携带藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

19.如权利要求18所述的无菌血液收集容器或导管，其中，所述容器或导管是输血袋、血液收集管或小瓶、或注射器。

20.一种透析或血浆置换耗材、或者透析或血浆置换设备或仪器的部件，其中，所述耗材、设备或仪器的部件在可与血液接触的表面处或表面上包含或携带藻酸盐低聚物，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

21.如权利要求20所述的透析或血浆置换耗材、或者透析或血浆置换设备或仪器的部件，其中，所述耗材、设备或仪器为透析或血浆置换的导管、容器或者滤器。

22.如权利要求18-21中任一项所述的无菌血液收集容器或导管、或透析或血浆置换耗材、或者透析或血浆置换设备或仪器的部件，其中，所述表面包含或携带其他血液相容性化合物，所述其他血液相容性化合物优选选自肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、聚乙二醇或葡聚糖。

23.藻酸盐低聚物作为离体或体外抗凝剂的应用，其中，所述藻酸盐低聚物包含2至75个单体残基，且所述单体残基不携带硫酸盐基团。

24.如权利要求23所述的应用，其中，所述藻酸盐低聚物设置在使用时与血液或血液衍生产物接触的装置或产品的表面处或表面上。

25.如权利要求1-25中任一项所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述藻酸盐低聚物的数均聚合度为2至50、2至35、2至30、2至25或2至20。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述藻酸盐低聚物是2-mer至35-mer、2-mer至30-mer、3-mer至35-mer、3-mer至28-mer、4-mer至25-mer、5-mer至20-mer、6-mer至22-mer、8-mer至20-mer、10-mer至15-mer。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述藻酸盐低聚物具有至少70％的G，至少80％、至少85％或至少90％的G残基，优选为至少95％的G残基。

28.如权利要求27所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述G残基中的至少80％排列在G-嵌段内。

29.如权利要求1-26中任一项所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述藻酸盐低聚物具有至少70％的M残基，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的M残基，优选为100％的M残基。

30.如权利要求29所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述M残基中的至少80％排列在M-嵌段内。

31.如权利要求1-26中任一项所述的方法、藻酸盐低聚物、无菌血液收集容器或导管、透析或血浆置换耗材、或透析或血浆置换设备或仪器的部件、或应用，其中，所述低聚物的G和M残基中的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％排列在MG嵌段内。