KR101229055B1 - 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용한 알긴산 올리고머 제조방법 - Google Patents
알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용한 알긴산 올리고머 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속(Methylobacterium sp.) 균주, 상기 선별된 메틸로박테리움 속 균주로부터 제조한 알긴산 분해능을 갖는 생촉매 및 상기 생촉매를 이용하여 알긴산 올리고머을 제조하는 방법에 관한 것으로, 특히 상기 메틸로박테리움 속 균주는 기존 보고된 알긴산 분해능을 갖는 미생물에 비하여 현저하게 우수한 알긴산 분해능이 인정되므로, 알긴산으로부터 제조된 알긴산 올리고머가 이용되는 식품, 화장품 및 의약품과 관련된 산업분야 또는 해조류를 이용한 바이오에너지 생산 등과 관련된 다양한 산업에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속(Methylobacterium sp.) 균주 및 상기 메틸로박테리움 속 균주를 이용하여 알긴산 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
알긴산(alginic acid)은 주로 갈조류의 세포벽을 구성하고 있어, 갈조류로부터 추출할 수 있다. 알긴산은 α-L-글루론산(guluronate)과 C5 에피머(epimer)인 β-D-만뉴론산(1,4’-β-D-mannuronate)이 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류로, pG block, pM block 및 pM/G stretch 형식으로 결합된 복잡한 당중합체이다.
상기 알긴산은 독특한 물리적 성질 때문에 예로부터 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들어, 식품산업, 인쇄산업 및 제약산업을 포함한 다양한 산업분야에서 안정제, 점질제 또는 겔화제로 사용되고, 미립구, 비드, 마이크로캡슐 또는 정제 등과 같은 약물전달시스템의 원료로 사용되며, 조직공학에서 매트릭스 담체 등으로 사용되어 왔다. 또한, 알긴산은 비만 억제, 장의 연동운동 촉진을 통한 변비 치유, 항콜레스테롤 억제, 체내의 중금속 흡수와 제거 또는 유해물질의 독성 억제와 같은 다양한 생리활성이 보고되어, 기존 용도에 추가로 기능성 식품소재로 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
또한, 상처를 보호하는 창상피복재 및 지혈 등의 생리활성효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 최근 알긴산 유래 올리고당의 항균/항암 작용, 면역 증강, 항콜레스테롤 효과, 항응고 효과 등 다양한 생체조절 기능에 대해 보고되었다. 이러한 다양한 기능성으로 인해 알긴산 자체뿐만 아니라 알긴산을 이용한 올리고당 제조에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다.
기존 알긴산을 제조하는 방법은 갈조류와 같은 해조류에서 알긴산 또는 알긴산 유래 올리고당 등과 같은 유효성분을 추출하는 방법들이 제시되어 있다. 일 예로, 고압처리, 고온고압처리 또는 방사선처리를 통해 해조류를 연화시킨 뒤 추출하는 방법 또는 산 알칼리 처리를 이용한 방법 등이 보고되고 있다. 그러나, 기존의 방법은 해조류 유래의 탄수화물 대부분이 산이나 알칼리에 비교적 안정하기 때문에 알긴산의 추출에 다소 어려움이 있어 추출효율이 낮다는 문제점이 있다.
따라서, 최근에는 기능성 해조 올리고당을 생산하기 위해, 해조 유래 다당류를 화학적으로 분해하는 화학적 분해방법 보다는 효소를 이용한 효소적 분해방법에 대한 관심이 증대되고 있다.
알긴산을 분해하는 분해효소인 알지네이트 분해효소(alginate lyase)는 그 분해 기전이 명확하게 밝혀져 있지는 아니하나, β-elimination 반응에 의한 알긴산 분해반응을 수행하는 것으로 알려져 있다. 알지네이트 분해효소는 pM-block(polymannuronate block) 또는 pG-block(polyguluronate block)에 작용하여 주로 어떤 위치를 분해하느냐에 따라 분류되며, 한 종류는 만뉴로네이트(mannuronate)와 만뉴로네이트(mannuronate) 사이의 β-1,4 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.3, β-D-mannuronan lyase)이고, 다른 한 종류는 글루로네이트(guluronate)와 글루로네이트(guluronate) 사이의 α-1,4 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.11, α-D-guluronan lyase)이다.
다양한 용도로 산업적 이용이 가능한 알긴산 올리고당의 효율적 생산을 위해서는 알긴산 분해효소가 필요하므로, 이를 위해서 알긴산 분해효소를 분비하는 미생물의 탐색을 위한 연구가 필요하다.
최근 화석연료에 의한 환경오염과 원유 등 자원고갈과 같은 사회 문제로 인해 재생 가능한 에너지에 대한 관심이 고조되고 있으며, 자연계의 생물량을 이용한 바이오에너지 생산 관련 연구들이 주목받고 있다. 특히 옥수수 등 식량자원을 이용한 바이오에너지 생산의 문제점을 극복하기 위한 대안으로 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산과 관련된 연구가 주목을 받고 있으며, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산을 위해서는 해조류의 세포벽을 구성하는 알긴산을 분해할 수 있는 분해능이 우수한 분해효소에 대한 개발이 요구된다.
상기와 같은 필요성에 따라, 본 발명은 알긴산 분해능이 우수한 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 필요성에 따라, 알긴산 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 이용한 알긴산 올리고머의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주(Methylobacterium sp.)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 메틸로박테리움 속 균주(Methylobacterium sp.), 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알긴산 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 알긴산 분해능을 갖는 생촉매를 해조류와 반응시키는 단계를 포함하는 알긴산 올리고머의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 해조류를 식이하는 해양 동물의 내장으로부터 분리한 신규한 메틸로박테리움속 균주(Methylobacterium sp.)인 메틸로박테리움 속 HJM27(Methylobacterium sp. HJM27)이 우수한 알긴산 분해능을 갖는다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 알긴산(alginic acid)은 주로 갈조류와 같은 해조류의 세포벽을 구성하는 다당류로, α-L-글루론산(guluronate)과 C5 에피머(epimer)인 β-D-만뉴론산(1,4’-β-D-mannuronate)이 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류이다. 상기 알긴산은 알지네이트 또는 해초산이라고도 하며, 상기 알긴산은 폴리글루론산 블록(polyguluronate block, pG block), 폴리만뉴론산 블록(polymannuronate block, pM block) 및 폴리글루론산-폴리만뉴론산 블록(polyguluronate-mannuronate block, pM/G block 또는 pG/M block)으로 결합된 복잡한 당중합체이다.
본 발명에 있어서, 알긴산을 분해하는 분해효소인 알지네이트 분해효소는 알지네이즈(alginase) 또는 알지네이트 디폴리머레이즈(alginate depolymerase)라고 하며, 그 분해에 대한 완전한 기전은 아직까지 밝혀지지 않았으나 β-elimination 반응을 통해 알긴산을 분해할 수 있는 분해능을 가진 효소이다. 상기 알긴산은 알긴산의 β-1,4-glycosidic 결합을 분해하여 4,5-unsaturated nonreducing 말단을 갖는 산물을 만들 수 있다. 상기 알긴산 분해효소는 만뉴론산(mannuronate)과 만뉴론산(mannuronate) 사이의 β-1,4 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(poly(M) lyase, (1→4)-β-D-mannuronan lyase, EC 4.2.2.3)와 글루론산(guluronate)과 글루론산(guluronate) 사이의 α-1,4 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(poly(G) lyase, (1→4)-α-L-guluronan lyase, EC 4.2.2.11)가 있다.
본 발명에 있어서, 생촉매(biocatalyst)란 여러 가지 화학반응 또는 생화학반응에서 촉매의 역할을 하는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 포함하는 것일 수 있고, 일 예로 화학반응 또는 생화학반응을 촉매하는 미생물, 미생물 배양액 및 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배지(culture medium)란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 포함하거나, 특수한 목적을 위하여 상기 주성분 외에 추가적인 물질을 더욱 포함하는 것을 의미하며, 배양배지, 배양기 또는 배양액이라고도 한다. 상기 배지는 천연배지, 합성배지 또는 선택배지가 있고, 성상에 따라 고체배지 또는 액체배지가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주에 관한 것이다. 상기 메틸로박테리움 속 균주는 메틸로박테리움 속 HJM27(Methylobacterium sp. HJM27)일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 본 발명에 따른 알긴산 분해능을 갖는 균주 탐색은 2단계로 진행되었다. 상세하게는, 상기 균주 탐색은 1차로 해조류를 식이하는 해양 동물, 구체적으로 전복(Haliotis discus hannai), 소라(Batillus cornutus), 해삼(Stichopus japonicus), 멍게(Halocynthia roretzi) 및 개불(Urechis unicinctus)의 내장에서 얻은 시료로부터 알긴산 분해능이 있는 균주를 분리하고, 2차로 1차로 선별된 균주의 알긴산 분해능을 검토하여 가장 분해능이 우수한 균주를 선별하는 방법으로 수행하였다.
상기의 탐색과정을 통하여, 알긴산 분해능이 우수한 것으로 선별된 균주는 동정 결과 메틸로박테리움 속인 것으로 확인되었다. 상세하게는, 상기 선별된 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과, 본 발명의 선별된 균주인 HJM27은 도 2에 나타낸 바와 같이, 알파프로테오 박테리아(alphaproteobacteria)인 메틸로박테리움 속(Methylobacterium sp.) 세균과 가장 높은 유사성(99%)을 나타내는 것으로 확인되어, 메틸로박테리움 속 HJM27(Methylobacterium sp. HJM27)로 명명하였다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27을 대한민국 대전광역시 유성구에 위치한 생물자원센터에 2010년 4월 13일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11680BP를 부여받았다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 알긴산 분해 활성이 우수한 것으로 확인된 알긴산 분해효소 생성균주이고, 배지 내 NaCl 농도가 2.5%일 때에 비해 3.0%일 때 성장속도가 급격히 저하되었으므로, 내염성 균주(halotolerant stain)로 확인되었다. 상기 확인된 결과에 의하면, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 배지 내 NaCl 함량은 전체 조성물의 부피 대비 NaCl의 중량에 관한 농도로 표현(NaCl의 함량(w)/전체 배지 부피(v))될 수 있고, 상기 NaCl의 함량은 0.75%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 바람직하게는 0.75%(w/v) 내지 1.25%(w/v) 또는 2.25%(w/v) 내지 2.75%(w/v)인 조건에서 배양할 수 있다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 통상의 배지, 일 예로 질소원이 포함된 통상의 배지에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 효모 추출물(Yeast Extracct) 및 펩톤(peptone)이 포함된 배지에서 배양할 수 있다. 상기 효모 추출물은 천연첨가물로, 효모 세포의 성분인 아미노산(amino acids), 펩타이드(peptides), 탄수화물(carbohydrates) 및 염류와 같은 수용성 성분으로 이루어져 있다. 상기 효모 추출물은 식용 효모에 식용이 가능한 효소류을 첨가하여, 식용 효모의 폴리펩타이드를 가수분해하는 방법으로 만들며, 제조 과정에서 추가로 염류를 첨가할 수 있다. 상기 펩톤은 산 · 알칼리 또는 단백질분해효소나 펩티다아제에 의해 분해된 분해산물인 유도단백질로, 단백질의 펩신에 의한 분해산물을 포함한다. 상기 펩톤은 단백질 분해산물 중 프로테오스보다 저분자로, 수용성이며 열에 응고되지 않는다.
또한, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 알긴산이 첨가되지 않은 배지 또는 알긴산이 첨가된 배지에서 배양할 수 있다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 알긴산 분해효소를 생산할 수 있다. 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP) 또는 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)가 생성한 분해효소의 최적반응 온도는 25℃이고, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP) 또는 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)가 생성한 분해효소의 최적반응 pH는 pH 9.0이며, 중성과 약알카리성 범위에서 높은 활성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP) 또는 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)가 생성한 분해효소의 최적반응 NaCl의 농도는 1.25%(w/v) 내지 1.75%(w/v), 바람직하게는 1.4%(w/v) 내지 1.6%(w/v)일 수 있다.
또한, 본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)에 관한 것이다.
상기 알긴산 분해능을 갖는 생촉매는 상기 메틸로박테리움 속 균주, 바람직하게는 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP), 상기 균주의 배양물 및 상기 배양물의 농축물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 균주의 배양물이란 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)을 배양하여 얻어진 배양배지를 의미하며, 상기 균주가 포함되어 있는 배양배지 또는 상기 균체를 제거한(cell-free) 무세포 배양배지일 수 있다. 상기 균주의 배양물이란 액상의 배양배지에 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)을 배양한 후, 얻어진 배양배지일 수 있으나, 상기 배양물의 성상이 액체 또는 고체로 한정되는 것은 아니다.
상기 배양배지는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위한 통상의 배지일 수 있으며, 바람직하게는 효모 추출물(Yeast Extracct) 및 펩톤(peptone)으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상이 더욱 포함된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 효모 추출물(Yeast Extracct) 및 펩톤(peptone)이 포함된 것일 수 있다.
또한, 상기 배양배지에는 알긴산이 첨가될 수 있으며, 상기 알긴산의 함량은 전체 배지 부피 대비 알긴산의 함량을 기준으로 0.4%(w/v) 내지 1.25%(w/v), 바람직하게는 0.85%(w/v) 내지 1.15%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.9%(w/v) 내지 1.1%(w/v)일 수 있다.
또한, 상기 배양배지의 NaCl 함량은 전체 배지 부피 대비 NaCl의 함량을 기준으로 0.75%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 바람직하게는 0.75%(w/v) 내지 1.75%(w/v) 또는 2.25%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 더욱 바람직하게는 1.25%(w/v) 내지 1.75%(w/v), 더더욱 바람직하게는 1.4%(w/v) 내지 1.6%(w/v)일 수 있다.
상기 배양물의 농축물이란 상기 균주의 배양물을 통상적인 방법으로 하여 농축한 것을 의미한다. 상기 배양물의 농축물은 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)을 배양한 액상의 배양배지를 통상의 방법으로 농축한 농축액일 수 있으나, 상기 배양물의 성상이 액체로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 알긴산 분해능을 갖는 생촉매를 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 생촉매 제조방법은 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)을 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 생촉매 제조방법은 상기 효모 추출물 및 상기 펩톤이 포함된 배지에서 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)을 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 효모 추출물 및 상기 펩톤이 포함된 배지의 NaCl 함량은 0.75%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 바람직하게는 0.75%(w/v) 내지 1.75%(w/v) 또는 2.25%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 더욱 바람직하게는 1.25%(w/v) 내지 1.75%(w/v), 더더욱 바람직하게는 1.4%(w/v) 내지 1.6%(w/v)일 수 있다.
상기 배지의 알긴산 함량은 전제 배지 부피 대비 알긴산 중량을 기준으로 0.4%(w/v) 내지 1.25%(w/v), 바람직하게는 0.85%(w/v) 내지 1.15%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.9%(w/v) 내지 1.1%(w/v)일 수 있다.
상기 배양배지에서 상기 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)를 배양하는 단계는 36시간 내지 60시간, 바람직하게는 42시간 내지 54시간 더욱 바람직하게는 45시간 내지 51시간 동안 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 알긴산 분해능을 갖는 생촉매를 이용하여 알긴산 올리고머를 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 상기 알긴산 분해능을 갖는 생촉매를 해조류 및 알긴산으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 해조류(sea algae)는 바다에서 나는 조류를 통틀어 이르는 말로 통상의 조류를 포함한다. 상기 해조류는 녹조류(green algae), 갈조류(brown algae) 및 홍조류(red algae)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것으로, 바람직하게는 갈조류일 수 있다. 상기 갈조류는 일 예로 톳, 미역, 다시마, 대황 또는 모자반일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 알긴산 올리고머는 알긴산이 분해된 통상의 알긴산 올리고머일 수 있으며, 일 예로 폴리글루론산 블록, 폴리만뉴론산 블록, 폴리글루론산-폴리만뉴론산 블록 또는 상기 폴리글루론산 블록, 폴리만뉴론산 블록 및 폴리글루론산-폴리만뉴론산 블록으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상이 결합된 당중합체일 수 있다.
상기 제조방법은 23℃ 내지 27℃, 바람직하게는 24℃ 내지 26℃할 수 있고, 더욱 바람직하게는 25℃에서 수행할 수 있으며, 상기 제조방법은 pH 7.5 내지 pH 11, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 10, 더욱 바람직하게는 pH 8.5 내지 pH 9.5에서 수행할 수 있다.
상기 해조류의 함량은 반응액 전체 부피 대비 해조류에 포함된 알긴산의 중량을 기준으로 0.15%(w/v) 내지 1.25%(w/v), 바람직하게는 0.35%(w/v) 내지 1.15%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.5%(w/v) 내지 1.0%(w/v)일 수 있고, 상기 알긴산의 함량은 반응액 전체 부피 대비 알긴산의 중량을 기준으로 0.15%(w/v) 내지 1.25%(w/v), 바람직하게는 0.35%(w/v) 내지 1.15%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.5%(w/v) 내지 1.0%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 기존 보고된 알긴산 분해능을 가진 다른 미생물에 비하여 현저하게 우수한 활성을 나타내고, 특정 배양 조건 및 특정 반응 조건에 따라 최적의 반응 수율을 얻을 수 있으므로 새로운 생촉매로서 유용하게 사용되어질 것으로 예상되고, 특히 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업에 크게 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27(KCTC 11680BP)은 기존 보고된 알긴산 분해능을 갖는 다른 미생물에 비하여 현저하게 우수한 알긴산 분해능이 인정되어, 알긴산을 분해하여 인류의 건강 및 질병 치료 등과 관련된 다양한 기능성을 가진 고부가가치 상품인 다양한 알긴산 올리고머을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산과 관련하여, 해조류의 세포벽의 주요성분을 분해함으로써 바이오에너지 생산 효율의 증대가 가능하다는 점에서 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업을 포함한 다양한 산업에서 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27(Methylobacterium sp. HJM27)의 16S rDNA의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내는 도이다. 상기 도 2의 균주 종에 관한 기재 옆에 있는 <>안에 기재된 번호는 NCBI 데이터베이스(NCBI database)의 기탁번호(accession number)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 질소원에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장(Cell growth) 정도 및 균체 당 알긴산 분해능(relative activity)을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(펩톤(peptone) 첨가군)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 펩톤 및 효모 추출물 첨가에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장 정도 및 균체 당 알긴산 분해능을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(펩톤 및 효모 추출물 첨가군, PSY medium)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다. 백색 막대 및 백색 직선 그래프는 펩톤을 첨가한 군(PS medium)을 나타내고, 흑색 막대 및 흑색 직선 그래프는 펩톤 및 효모 추출물을 첨가한 군(PSY medium)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알긴산 첨가량에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장 정도 및 균체 당 알긴산 분해능을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(알긴산 첨가량이 1.0%(w/v)인 첨가군)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 생촉매의 온도에 따른 알긴산 분해능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 생촉매의 pH에 따른 알긴산 분해능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내는 도이다. 상기 도 2의 균주 종에 관한 기재 옆에 있는 <>안에 기재된 번호는 NCBI 데이터베이스(NCBI database)의 기탁번호(accession number)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 질소원에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장(Cell growth) 정도 및 균체 당 알긴산 분해능(relative activity)을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(펩톤(peptone) 첨가군)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 펩톤 및 효모 추출물 첨가에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장 정도 및 균체 당 알긴산 분해능을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(펩톤 및 효모 추출물 첨가군, PSY medium)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다. 백색 막대 및 백색 직선 그래프는 펩톤을 첨가한 군(PS medium)을 나타내고, 흑색 막대 및 흑색 직선 그래프는 펩톤 및 효모 추출물을 첨가한 군(PSY medium)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알긴산 첨가량에 따른 메틸로박테리움 속 HJM27의 균체 생장 정도 및 균체 당 알긴산 분해능을 나타내는 그래프이다. 상기 균체 생장 정도는 직선 그래프(line)로 표시되고, OD600을 표시한 우측 수치를 기준으로 나타내며, 상기 당 알긴산 분해능은 막대그래프(bar)로 표시되고, 최적 활성을 나타낸 군(알긴산 첨가량이 1.0%(w/v)인 첨가군)을 기준으로 한 상대 활성을 표시하는 좌측 수치로 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 생촉매의 온도에 따른 알긴산 분해능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 생촉매의 pH에 따른 알긴산 분해능을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 알긴산 분해능을 갖는 해양 미생물의 탐색 및 분리
알긴산 분해능을 갖는 미생물의 분리를 위한 시료는 2009년 5월에 대한민국 부산광역시 기장군 기장읍 대변항과 경상남도 통영에서 구입한 해양 동물인 전복(Haliotis discus hannai), 소라(Batillus cornutus), 해삼(Stichopus japonicus), 멍게(Halocynthia roretzi) 및 개불(Urechis unicinctus)를 이용하여 제조하였다. 보다 구체적으로, 상기 시료는 상기 해양 동물의 내장을 분리한 후, 상기 분리된 내장을 잘게 잘라서 멸균된 희석액(NaCl 2.5 g, KH2PO4 0.1 g, FeSO4·7H2O 0.05 g, KCl 0.05 g, NH4Cl 0.1 g, 증류수 1L, pH 7)을 이용하여 연속 희석하는 방법으로 1,000배 희석하여 제조하였다.
상기 해양 동물의 내장으로부터 제조된 시료를 이용한 알긴산 분해능을 갖는 미생물의 분리는 2단계로 진행되었다.
보다 상세하게는, 상기 알긴산 분해능을 갖는 미생물의 탐색은 1차로 상기 1,000배 희석한 시료액 0.1 mL를 다층평판배지 위에 도말하여 알긴산 분해능을 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 다층평판배지는 하층배지와 상층배지의 2층으로 구성되고, 상기 하층배지(pH 7)의 조성은 전체 배지 조성물 부피 대비 각 성분이 NaCl 2.5%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NH4Cl 0.1%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v)의 함량으로 구성되어있고, 상기 상층배지(pH 7)의 조성은 전체 배지 조성물 부피 대비 sodium alginate 1.0%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v)의 함량으로 구성되어 있다. 상기 1,000배 희석된 시료 0.1 mL를 상기 다층평판배지 위에 도말하고, 25℃에서 3일간 배양한 후, 형성된 세균군체(colony)들 중에서 군체 크기가 1 mm 이상인 균주를 백금이를 이용하여 채취한 후에, 새로운 다층평판배지위에 도말하는 것을 수차례 반복하여 분리하는 방법으로, 균체를 순수 분리하였다.
상기 배양 결과, 약 5 만개의 콜로니가 분리배지 위에서 성장하는 것이 확인되었고, 이 중 군체 크기가 1 mm 이상이어서 알긴산 분해능이 우수한 것으로 판단된 균주에 대해서 알긴산 분해능의 정도를 확인하였다.
상기 균주를 순수 분리하는 1단계를 수행한 후, 2차로 상기 순수 분리된 균체의 알긴산 분해능을 확인하는 방법으로 알긴산 분해능이 가장 우수한 균주를 분리하였다. 상기 알긴산 분해능이 우수한 균주의 분리를 위한 알긴산 분해능의 확인은 plate assay 법과 DNS 법으로 수행하였다.
보다 구체적으로, 우선 1단계에서 순수 분리된 균주들을 배양하였다. 상기 배양은 상기 순수 분리된 균주를 PYS 배지(peptone 0.5%(w/v), yeast extract 0.3%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), NaCl 1.5%(w/v), pH 7)에 접종하고, 25℃ 및 150 rpm의 조건으로 24시간 진탕 배양하는 방법으로 수행하였다.
상기 알긴산 분해능의 1차 확인은 plate assay 법으로 수행하였다. 상기 plate assay 법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 알긴산 분해능 확인용 PS 한천배지(peptone 0.5%(w/v), sodium alginate 0.8%(w/v), agar 1.5%(w/v))에 상기 24시간 진탕 배양한 균주 30 μL를 점적하고 25℃에서 2일간 정치 배양하였다. 이후 균주가 자란 배지에 배지가 잠길 정도로 10% CPC(cetylpyridinium chloride monohydrate)를 투여하였고, 10분 후 알긴산 분해효소의 활성을 확인하였다. 상기 방법에 의하여 약 27종의 콜로니로부터 분리한 균주가 1차 우수 균주로 선정되었다.
상기 알긴산 분해능의 2차 확인은 상기 1차 우수 균주로 선정된 균주를 대상으로 DNS법으로 수행하였다. 상기 DNS법은 환원당 생성능을 확인하는 방법으로, 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 PYS 배지(peptone 0.5%(w/v), yeast extract 0.3%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), NaCl 1.5%(w/v), pH 7)에 1차 우수 균주로 선정된 27종의 균주를 접종하고, 25℃ 및 150 rpm의 조건으로 진탕 배양하면서, 시간별로 환원당 생성능을 측정하였다. 상기 환원당 생성능의 측정을 위한 환원당 함량은 DNS법을 이용하였고, 실험방법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 상기 일정 시간동안 배양한 배양액을 14,000×g 및 4℃의 조건에서 5분간 원심분리하고, 분리된 상층액을 수득하였고, 상기 수득된 상층액을 조효소액으로 사용하였다. sodium alginate(0.8%)가 포함된 기질용액 1.0 mL에 상기 조효소액 500 μL를 혼합한 후, 30분 동안 항온조에서 150 rpm 및 25℃의 반응 조건으로 반응 시킨 후, 반응액을 14,000×g 및 4℃의 조건에서 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리하여 분리된 상층액 500 μL 에 DNS용액 2 mL을 가한 후, 10분간 가열하였고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도 결과로부터 Mannuronic acid를 이용하여 작성한 표준 검량선을 이용하여 생성된 환원당을 정량 하였고, 환원당 생성능이 알긴산 분해효소 활성에 비례하는 것으로 확인하였다.
상기 확인결과, 가장 환원당 생성능이 우수한 즉, 알긴산 분해능이 우수한 균주로 전복 내장에서 분리한 균주인 HJM27이 최종적으로 선정되었다.
<
실시예
2> 알긴산 분해능을 갖는 해양 미생물
HJM27
의 동정
상기 2차 측정에서 가장 우수한 분해능을 나타내어 최종 선정된 HJM27 균주의 동정은 16S rDNA 염기서열분석법으로 수행하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위한 상기 HJM27 균주의 서열확인은 (주)마크로젠(대한민국)에 의뢰하여 수행하였다. 상기 (주)마크로젠에 의뢰결과로 확인된 HJM27 균주의 16S rDNA는 도 1에 나타낸 바와 같이, 총 1,411 base pair(bp) 염기서열이 결정되었다.
상기 결정된 HJM27 균주의 16S rDNA의 서열분석은 GenBank에 등록된 정보를 대상으로 NCBI의 Blast program(http://www. ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/Blast.cgi)에 의해 상동성 검색을 실시하고, Clustal 프로그램(Clustal X ver. 1.8)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후, neighbor-joining method와 bootstrap method(n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하여, 그 결과를 계통 발생도(Phylogenetic tree)로 작성하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 분리균주 HJM27은 알파프로박테리아(alpha-proteobacteria)에 속하는 메틸로박테리움 속 균주(NCBI accesision #; EU741082)와 99%의 유사성을 보였다. 상기 분리균주 HJM27은 메틸로박테리움 속 균주와 높은 유사성을 나타내어, HJM27은 메틸로박테리움 속 균주(Methylobacterium sp.)로 최종 동정되었으며, 메틸로박테리움 속 HJM27(Methylobacterium sp. HJM27)로 명명하였다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27은 대한민국 대전광역시 유성구에 위치한 생물자원센터에 2010년 4월 13일자로 기탁되어 기탁번호 KCTC 11680BP를 부여받았다.
<
실시예
3>
메틸로박테리움
속
HJM27
이 생산하는 알긴산 분해효소의 특성
상기 분리 및 동정된 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양 조건에 따른 생육 정도, 즉 균주 증식능 및 상기 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 알긴산 분해효소의 반응 조건에 따른 효소 활성을 확인하기 위하여, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27을 배양하였다. 상기 배양을 위한 배양배지의 조성은 기본적으로 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v) 및 agar 2.0%(w/v)의 함량으로 구성되고, 배양을 통해 확인하고자 하는 것에 따라 질소원(효모 추출물, 펩톤, NH4Cl, 요소(urea) 및 (NH4)2SO4), sodium alginate 및 NaCl의 첨가여부 또는 함량을 조절하였다.
구체적으로, 우선 상기 균주의 배양배지와 관련하여 질소원에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여, 최적 배지 조성을 확인하고, 배양시간에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여, 최적 배양 시간을 확인하였으며, 알긴산 농도 및 NaCl 농도에 따른 균주 증식능 및 효소 활성을 확인하여, 최적 알긴산 함량 및 최적 NaCl 함량을 확인하였다. 또한, 반응 온도 및 반응 pH에 따른 효소 활성을 확인하여, 최적 반응 온도 및 반응 pH를 확인하였다. 하기 실험은 모두 각각 3번씩 수행하여, 각 결과의 평균값을 이용하였다.
3-1:
배양배지의
질소원에 따른
메틸로박테리움
속
HJM27
의 균주
증식능
및 알긴산 분해능의 확인
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v) 및 KCl 0.05%(w/v)의 함량으로 구성된 기본 배지 조성에 NaCl 1.5%(w/v) 및 sodium alginate 1.0%(w/v)과 질소원이 첨가된 배지(pH 7)에 각각 접종하고 배양하였다. 상기 질소원으로 각각 효모 추출물(0.3%(w/v)), 펩톤 (0.5%(w/v)), NH4Cl(0.5%(w/v)), 요소(urea, 0.5%(w/v)) 및 (NH4)2SO4(0.5%(w/v))을 각각의 함량으로 첨가하였다. 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 2일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양을 수행한 후, 균주 증식능의 측정은 600 nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하였고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100%로 하여, 상대 활성(Relative activity(%))으로 나타내었다. 상기 측정결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 균주의 증식능은 효모 추출물이 현저하게 우수하였고, 펩톤의 경우에는 효모 추출물의 약 60% 정도에 해당하는 것으로 확인되었으며, 다른 질소원의 경우에는 균주 증식능이 미비한 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 결과로부터 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양을 위한 최적 질소원은 효모 추출물인 것으로 확인되었다. 또한, 효소 활성과 관련된 알긴산 분해능의 경우, 펩톤이 가장 우수하였고, 효모 추출물도 펩톤과 유사한 정도의 효소 활성이 확인되었으나, 다른 무기물 질소원들의 경우에는 분해활성이 매우 낮은 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27을 이용한 반응액 즉, 생촉매를 제조하는 과정에서, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 균주 증식을 위해서는 배양배지에 질소원으로 효모 추출물을 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 균주 증식 이후에 최종적인 생촉매로 이용될 배양배지에는 질소원으로 펩톤을 첨가하는 것이 바람직한 것으로 평가되었다.
3-2: 배양기간에 따른
메틸로박테리움
속
HJM27
의 균주
증식능
및 알긴산 분해능의 확인
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NaCl 1.5%(w/v) 및 sodium alginate 1.0%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에 질소원으로 펩톤(0.5%(w/v) 및 펩톤(0.5%(w/v))과 효모 추출물(0.3%(w/v))을 각각 첨가한 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 4일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양을 수행하면서, 균주 증식능의 측정은 600 nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하였고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100%로 하여, 상대 활성(Relative activity(%))로 나타내었다. 상기 측정결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 균주의 증식능 및 알긴산 분해능과 관련하여, 펩톤과 sodium alginate만을 첨가한 군(PS)에 비하여, 펩톤과 효모 추출물 모두를 첨가한 군(PSY)이 약 200% 이상 우수한 것으로 확인되어, 배지에 질소원으로 펩톤 및 효모 추출물을 함께 첨가하는 것이 바람직한 것으로 평가되었다. 이러한 결과는 미생물의 증식단계에서 효모 추출물이 첨가에 의해 미생물의 증식이 원활하게 이루어지기 때문인 것으로 해석되었다.
또한, 배양기간과 관련하여, 균주의 증식은 접종 후 2일까지는 현저하게 상승하였으나, 3일째에는 다소 감소하는 것으로 확인되어, 최적 배양기간은 2일인 것으로 확인되었다. 또한, 알긴산 분해능과 관련하여, 2일째에 최고의 활성을 나타내었고, 2일이 경과한 시점에서 현저하게 활성이 감소하였다. 또한, 펩톤만을 첨가한 군에서는 배양 1일째에 비하여 배양 2일째 균체수는 감소하였으나, 활성은 현저하게 상승되는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 기존 보고된 다른 균주의 경우 알긴산 분해 활성의 최대치가 144시간 배양한 시점이었던 반면에, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27는 짧은 시간 배양한 경우에도 균체 증식 및 알긴산 분해능의 향상이 이루어져, 다양한 산업분야에 응용할 수 있을 것으로 예상되었다.
또한, 상기 결과로부터 균체 증식율 및 알긴산 분해능의 측면에서 펩톤과 효모 추출물 모두를 첨가한 군(PSY)에서 2일까지 배양하는 것이 가장 바람직할 것으로 예상되었다.
3-3: 알긴산 함량에 따른
메틸로박테리움
속
HJM27
의 균주
증식능
및 알긴산 분해능의 확인
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NaCl 1.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모 추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에 sodium alginate의 함량을 조절하여 첨가한 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 2일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양을 수행한 후, 균주 증식능의 측정은 600 nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하였고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능을 측정한 후, 최적 조건의 활성을 100%로 하여, 상대 활성(Relative activity(%))로 나타내었다. 상기 측정결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 균체의 증식능 및 알긴산 분해능과 관련하여, 알긴산(sodium alginate) 농도가 0.5%(w/v) 이상인 경우에 균체 증식이 원활한 것으로 확인되었다. 또한, 알긴산 분해능과 관련하여, 알긴산 농도가 1.0%(w/v)인 경우에까지 점진적으로 증가하여, 알긴산 농도가 1.0%(w/v)인 것이 최적인 것으로 확인되었고, 알긴산 농도가 1.5%(w/v) 이상인 경우에는 오히려 활성이 감소되는 것으로 확인되었다. 또한, 알긴산이 전혀 첨가되지 않은 경우에도 일정 정도의 활성을 보여, 알긴산이 첨가되지 않은 배지에서 상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 배양하는 경우에도 일정 정도의 알긴산 분해효소는 발현되는 것으로 확인되었다. 또한, 효소 활성을 균체성장 정도로 나누어 단위 균체당 효소 활성을 비교한 경우에도 상기 알긴산 농도가 1.0%(w/v)인 경우에 효소 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
3-4:
NaCl
함량에 따른
메틸로박테리움
속
HJM27
의 균주
증식능
및 알긴산 분해능의 확인
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모 추출물0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지 조성에 NaCl의 함량을 0%(w/v)에서 3%(w/v)까지 조절하여 첨가한 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다.
상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 2일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양 후, 균주 증식능의 측정은 600 nm에서 O.D.값을 측정하는 방법으로 수행하였고, 알긴산 분해능은 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였다. 또한, 균체당 알긴산 분해능을 확인하기 위하여, 상기 측정된 환원당 생성량을 OD600값으로 나누었다. 상기 측정결과 및 계산결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| NaCl 함량(%, w/v) | Biomass(OD600) | 환원당 농도(g/L) | Reduced sugar per Biomass(g/L/OD600) |
| 0.0 | 5.322 | 0.781 | 0.147 |
| 0.5 | 5.762 | 0.993 | 0.172 |
| 1.0 | 6.432 | 0.792 | 0.123 |
| 1.5 | 6.092 | 1.217 | 0.200 |
| 2.0 | 6.162 | 1.064 | 0.173 |
| 2.5 | 6.572 | 0.245 | 0.037 |
| 3.0 | 3.782 | 0.250 | 0.066 |
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 균체의 증식능과 관련하여, NaCl 함량이 2.5%(w/v)일 때 최적인 것으로 확인되었고, 1.0(w/v)일 때도 우수한 것으로 확인되었다. 이와 같이 성장의 쌍고점을 나타내는 것은 균주가 성장하면서 floc을 형성하기 때문인 것으로 예상되었다. 한편, 상기 NaCl 함량이 3.0%(w/v)일 때 성장이 급격히 저하되었으므로, 이로부터 상기 메틸로박테리움 속 HJM27은 호염성이 아닌 내염성(halotolerant) 균주인 것으로 판단되었다.
또한, 알긴산 분해능과 관련하여, NaCl 함량이 1.5%(w/v)인 경우에 생성된 환원당 량 및 단위 균체당 효소 활성(Reduced sugar per Biomass)이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양을 통한 생촉매의 제조를 위한 최적 NaCl함량은 1.5%(w/v)인 것으로 확인되었다.
3-5:
메틸로박테리움
속
HJM27
이 생산하는 알긴산 분해효소의 온도에 따른 알긴산 분해능 측정
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), NaCl 0.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모 추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다. 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 2일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양 후, 상기 반응온도를 20℃ 내지 40℃로 조절하면서 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였다. 상기 측정결과는 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 생촉매액의 알긴산 분해능은 25℃에서 최고치를 나타냈으며, 20℃에서 최고치의 상대치로 나타낸 알긴산 분해능 즉, 상대활성이 약 25%이고, 30℃ 이상에서 거의 활성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27을 이용하여 제조한 생촉매의 최적 반응온도는 25℃인 것으로 확인되었다.
3-6:
메틸로박테리움
속
HJM27
이 생산하는 알긴산 분해효소의
pH
에 따른 알긴산 분해능 측정
상기 메틸로박테리움 속 HJM27를 KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), NaCl 0.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 효모 추출물 0.3%(w/v)의 함량으로 구성된 배지(pH 7)에 접종하여 배양하였다. 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양은 항온조를 이용하여 150 rpm 및 25℃의 조건에서 2일간 진탕배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 배양 후, 상기 반응pH를 pH 3 내지 pH 11로 조절하면서 상기 실시예 1의 DNS법으로 각 환원당 생성능(g/L)을 측정하였다. 상기 측정결과는 도 7에 나타내었다.
구체적으로, 상기 pH의 조절은 상기 반응액에 200 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 3 내지 pH 6), 40 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액(pH 6 내지 pH 8) 및 100 mM glycine-NaOH 완충용액(pH 8 내지 pH 11)을 이용하였다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 pH에 따른 알긴산 분해능은 알카리성 영역인 pH 9.0에서 최고치를 나타내어 상기 메틸로박테리움 속 HJM27이 생산하는 알긴산 분해효소의 최적 pH는 9.0인 것으로 확인되었다. 완충용액 종류에 따른 오차를 확인하기 위해, 재차 300 mM GTA 완충용액(3,3-dimehtylglutarid acid, Tris(hydrosymethyl) aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, pH 3 내지 pH 10)을 이용하여 측정한 결과에서도 동일한 결과가 확인되었다. 최적 pH인 pH 9를 기준으로 이보다 산성 또는 알카리성인 조건에서는 산성 또는 알카리성이 강해질수록 알긴산 분해능이 저하되는 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27을 이용하여 제조한 생촉매의 최적 반응pH는 pH 9인 것으로 확인되었다. 추가적으로, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27의 배양액으로부터 제조된 생촉매액(배양액에서 균체를 제거한 상징액)을 이용하여, 전분, 카라기난, 펙틴 및 한천 등의 다당류에 대한 분해활성을 측정한 결과, 다른 다당류에 대해서는 분해활성이 나타나지 않고, 알긴산에 대해서만 분해활성이 나타나, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27가 생산하는 효소는 알긴산 분해효소인 것이 확인되었다.
상기와 같은 결과에 의할 때, 본 발명인 메틸로박테리움 속 HJM27은 알긴산을 분해하여 알긴산올로고머를 생산할 수 있는 알긴산 분해효소를 제조할 수 있으며, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27로부터 알긴산 분해효소를 생산하는 최적 조건 및 상기 알긴산 분해효소의 반응 최적 조건이 확인되었으므로, 상기 메틸로박테리움 속 HJM27은 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업 및 바이오에너지 관련 산업을 포함한 다양한 산업분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (4)
- 알긴산 분해능을 갖고, 최적 알긴산 분해온도가 25℃이며, 최적 성장 NaCl 농도가 2.5%(W/V)이고, 내염성 균주인 메틸로박테리움 속 균주(Methylobacterium sp., KCTC 11680BP).
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알긴산 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst).
- 효모 추출물(Yeast Extract) 및 펩톤(Peptone)이 포함되고, 배지 내 NaCl 함량이 1.5%(w/v)인 배양배지에서 메틸로박테리움 속 균주(Methylobacterium sp., KCTC 11680BP)를 접종하는 단계; 및 상기 배양배지에 접종된 균주를 45시간 내지 51시간 동안 배양하는 단계
를 포함하는 제2항의 생촉매 제조방법. - 제2항의 생촉매를 해조류 및 알긴산으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상과 25℃의 온도조건 및 pH 9의 pH 조건에서 반응시키는 단계를 포함하는 알긴산 올리고머 제조방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020100053583A KR101229055B1 (ko) | 2010-06-07 | 2010-06-07 | 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용한 알긴산 올리고머 제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20020013801A (ko) * | 2000-08-12 | 2002-02-21 | 이길환 | 마이크로파를 이용한 활성탄의 제조 및 폐활성탄의 재생방법 |
| KR20170035004A (ko) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | 신라대학교 산학협력단 | 알긴산 올리고당의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 포함하는 비만치료 또는 예방용 조성물 |
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| PARK, H.H., Distribution of Alginate Degrading Bacteria in Korean Pickled Hairtail Guts, 2010 한국생물공학회 춘계학술발표대회 및 국제심포지움 초록. (2010.04.15-16.) * |
| PARK, H.H., Distribution of Alginate Degrading Bacteria in Korean Pickled Hairtail Guts, 2010 한국생물공학회 춘계학술발표대회 및 국제심포지움 초록. (2010.04.15-16.)* |
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