CN104962539B - 用于adamts蛋白表达的细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白例如ADAMTS13的培养基。还提供了用于表达和纯化ADAMTS蛋白的方法。在某些实施方案中，本发明的培养基和方法对于表达具有高比活性的ADAMTS蛋白是有用的。还提供了具有高比活性的ADAMTS例如ADAMTS13的蛋白质组合物，所述蛋白质组合物根据本文中提供的方法被表达和纯化。
Description
本申请是申请日为2010年07月30日、申请号为201080042028.1(国际申请号为PCT/US2010/044020)、名称为“用于ADAMTS蛋白表达的细胞培养基”的发明专利申请的分案申请。
交叉参考相关申请
本申请要求2009年7月31日提交的第61/230,477号美国临时申请的利益，为了所有目的将该申请通过引用整体并入本文。
关于对在联邦政府资助的研究或开发下进行的发明的权利的声明
不适用
参考于光盘上提交的“序列表”、表或计算机程序列表附录
不适用
发明背景
ADAMTS(具有血小板反应蛋白I型(thrombospondin type I)模体的去整合素(disintegrin)和金属蛋白酶)蛋白是包含许多保守结构域(包括锌依赖性催化结构域、富含半胱氨酸的结构域、去整合素样结构域(disintegrin-like domain)和至少一个(在大多数情况下多个)血小板反应蛋白I型重复的金属蛋白酶家族(关于综述，参见Nicholson等人，BMC Evol Biol.2005Feb 4；5(1):11)。在进化上与金属蛋白酶的ADAM和MMP家族相关的此类蛋白(Jones GC，Curr Pharm Biotechnol.2006 Feb；7(1):25-31)是与许多疾病和病况，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)(Moake JL，Semin Hematol.2004Jan；41(1):4-14)、结缔组织障碍、癌症、炎症(Nicholson等人)和严重恶性疟原虫型疟疾(plasmodiumfalciparum malaria)(Larkin等人，PLoS Pathog.2009Mar；5(3):e1000349)关联的分泌性酶。由于这些关联性，因此ADAMTS酶已被公认为许多疾病的潜在治疗性靶(Jones GC，CurrPharm Biotechnol.2006Feb；7(1):25-31)。因此，需要产生大量具有高度特异性活性的ADAMTS蛋白的方法，所述蛋白不含污染物例如病毒、BSE和病原体如支原体(Mycoplasma)细菌。
对于细胞，特别是真核细胞，更具体地哺乳动物细胞的培养，一直需要使用提供营养物质的特殊培养基，所述营养物质是细胞的高效生长和生物制品，特别是生物药剂，例如重组蛋白质、抗体、病毒、病毒抗原、和病毒样颗粒的生产必需的。对于所述生物制品的有效生产，重要的是获得最佳细胞密度以及其本身蛋白质表达的增加以获得最大成品收率。
细胞培养基制剂补充有一系列添加剂，包括未确定的成分如胎牛血清(FCS)、若干种动物源性蛋白质和/或牛来源的蛋白水解产物以及衍生自植物或酵母的蛋白水解产物。
一般而言，血清或血清衍生物质例如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素可包含不想要的试剂，所述试剂可包含细胞培养物和其获得的生物制品。此外，必须针对所有已知病毒(包括可通过血清传播的肝炎病毒和HIV)测试人血清源性添加剂。此外，牛血清和从其衍生的制品具有BSE污染的风险。此外，所有血清源性制品可被未知物质污染。当使用血清或从细胞培养中的人或动物来源衍生的蛋白质添加剂时，存在许多问题(例如，不同批次的组合物的不同质量以及以及被支原体属、病毒或BSE污染的风险)，特别是如果细胞被用于制造用于人施用的药物或疫苗时。
因此，已作出许多努力以提供不需要血清或其它动物蛋白质化合物的有效宿主系统和培养条件。
已基于衍生自植物或酵母的蛋白质提取物开发了无血清培养基。例如，已知大豆水解物对于发酵方法是有用的并且可增强许多营养要求高的生物、酵母和真菌的生长。WO96/26266描述了大豆粉的木瓜蛋白酶消化物是碳水化合物和氮的来源并且许多成分可用于组织培养。Franek等人(Biotechnology Progress(2000)16，688-692)描述了确定的大豆和小麦水解物肽级分的生长和生产力促进效应。
WO 96/15231公开了由合成最小必需培养基和酵母提取物组成的用于脊椎动物细胞的繁殖和病毒产生过程的无血清培养基。由包含水稻的肽和酵母的提取物及其酶消化物的基础细胞培养基和/或用于动物细胞生长的植物脂质的培养基制剂公开于WO 98/15614中。用于培养重组细胞的包含纯化的大豆水解物的培养基公开于WO01/23527中。WO 00/03000公开了包含大豆水解物和酵母提取物，但也需要动物蛋白质例如生长因子的重组形式的存在的培养基。
EP-A-0 481 791描述了用于培养工程CHO细胞的生物化学成分明确的培养基，其不含从动物来源分离的蛋白质、脂质和碳水化合物，其还包含重组胰岛素或胰岛素类似物、1％至0.025％w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。WO 98/08934描述了包含水解的大豆肽(1-1000mg/L)、0.01至1mg/L腐胺和多种动物源性成分(包括白蛋白、腐胺、胎球蛋白、不同激素和其它蛋白质)的无血清真核细胞培养物。在本说明书中，应当指出，还已知腐胺以0.08mg/L的浓度包含在标准培养基如DMEM/Ham's F12中。
然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其它未知成分和污染物的成分不明确的混合物。此外，水解物的商购可得批次的质量变化极大。因此，在作为所使用的水解物的批次的函数的重组蛋白质或病毒产物的产量上存在较大的偏差(达到3倍的偏差)(“批间偏差(lot-to-lot variation)”)。该缺点影响了细胞的增殖以及各细胞的蛋白质表达。US2007/0212770描述了不同的不含动物蛋白质和不含寡肽的化学成分明确的培养基，所述培养基对于重组蛋白生物药剂的大规模生产是有用的。
一个ADAMTS家族成员ADAMTS13在残基Tyr 1605与Met1606之间切割vonWillebrand因子(vWF)，负责体内降解大vWF多聚体的功能。ADAMTS13活性的丧失与许多病况例如TTP(Moake JL，Semin Hematol.2004Jan；41(1):4-14)、急性和慢性炎症(Chauhan等人，J Exp Med.2008Sep 1；205(9):2065-74)以及最近若干种恶性疟原虫致疟疾(Larkin等人，PLoS Pathog.2009Mar；5(3):e1000349)关联。
血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是特征在于血栓性微血管病、血小板减少症和可引起不同程度的组织缺血和梗塞的微血管血栓形成。在临床上，TTP患者通过症状例如血小板减少症、裂红细胞(红细胞的碎片)和升高的乳酸脱氢酶水平(Moake J L.Thromboticmicroangiopathies.N Engl J Med.2002；347:589-600；Moake J L.von Willebrandfactor，ADAMTS13，and thrombotic thrombocytopenic purpura.Semin Hematol.2004；41:4-14；Sadler J E，Moake J L，Miyata T，George J N.Recent advances inthrombotic thrombocytopenic purpura.Hematology(Am Soc Hematol Educ Program).2004:407-423；Sadler J E.New concepts in von Willebrand disease.Annu RevMed.2005；56:173-191)来诊断。
在1982年，Moake等人在慢性复发性TTP患者的血浆中发现非常大的vonWillebrand因子(UL-vWF)多聚体(Moake J L，Rudy C K，Troll J H，Weinstein M J，Colannino N M，Azocar J，Seder R H，Hong S L，Deykin D.Unusually large plasmafactor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thromboticthrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1982；307:1432-1435)。UL-vWF与TTP之间的关联性获得Furlan等人以及Tsai和Lian的独立发现支持，所述发现是：大多 数罹患TTP的患者缺乏血浆金属蛋白酶(现称为为ADAMTS13)，所述酶切割vWF(Furlan M，Robles R，Solenthaler M，Wassmer M，Sandoz P，Laemmle B.Deficient activity of vonWillebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thromboticthrombocytopenic purpura.Blood.1997；89:3097-3103；Tsai H M，Sussman，I I，Ginsburg D，Lankhof H，Sixma J J，Nagel R L.Proteolytic cleavage of recombinanttype 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q:inhibition bydoxycycline and by monoclonal antibody VP-1.Blood.1997；89:1954-1962；Tsai H M，Lian E C.Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acutethrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1998；339:1585-1594)。
ADAMTS13蛋白酶是主要由肝产生的190kDa糖基化蛋白(Levy G G，Nichols W C，Lian E C，Foroud T，McClintick J N，McGee B M，Yang A Y，Siemieniak D R，Stark K R，Gruppo R，Sarode R，Shurin S B，Chandrasekaran V，Stabler S P，Sabio H，BouhassiraE E，Upshaw J D，Jr.，Ginsburg D，Tsai H M.Mutations in a member of the ADAMTSgene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura.Nature.2001；413:488-494；Fujikawa K，Suzuki H，McMullen B，Chung D.Purification of human vonWillebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member ofthe metalloproteinase family.Blood.2001；98:1662-1666；Zheng X，Chung D，TakayamaT K，Majerus E M，Sadler J E，Fujikawa K.Structure of von Willebrand factor-cleaving protease(ADAMTS13)，a metalloprotease involved in thromboticthrombocytopenic purpura.J Biol Chem.2001；276:41059-41063；Soejima K，Mimura N，Hirashima M，Maeda H，Hamamoto T，Nakagaki T，Nozaki C.A novel humanmetalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood:possibly，the von Willebrand factor-cleaving protease；J Biochem(Tokyo).2001；130:475-480；Gerritsen H E，Robles R，Lammle B，Furlan M.Partial amino acidsequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease.Blood.2001；98:1654-1661)。
已显示ADAMTS13基因中的突变引起TTP(Levy G G，Nichols W C，Lian E C，Foroud T，McClintick J N，McGee B M，Yang A Y，Siemieniak D R，Stark K R，Gruppo R，Sarode R，Shurin S B，Chandrasekaran V，Stabler S P，Sabio H，Bouhassira E E，Upshaw J D，Jr.，Ginsburg D，Tsai H M.Mutations in a member of the ADAMTS genefamily cause thrombotic thrombocytopenic purpura.Nature.2001；413:488-494)。通常由抑制ADAMTS-13活性的自身抗体引起的特发性TTP是在成人和年长孩子中发生的更常见的障碍，并且可在11％至36％的患者(Tsai H M，Lian E C.Antibodies to vonWillebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenicpurpura.N Engl J Med.1998；339:1585-1594；Furlan M，Lammle B.Deficiency of vonWillebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thromboticthrombocytopenic purpura.Baillieres Clin Haematol.1998；11:509-514)中定期间隔发生。
非中和抗体也可通过诱导从循环的清除来抑制ADAMTS13活性(Scheiflinger F，Knobl P，Trattner B，Plaimauer B，Mohr G，Dockal M，Dorner F，RiegerM.Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleavingprotease(ADAMTS-13)in a patient with thrombotic thrombocytopenicpurpura.Blood.2003；102:3241-3243)。健康成人的血浆ADAMTS13活性在50％至178％的范围内变化(Moake J L.Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolyticuremic syndrome.Arch Pathol Lab Med.2002；126:1430-1433)。在大多数家族性TTP或获得性TTP患者中，血浆ADAMTS13活性不存在或低于5％的正常活性。在不治疗的情况下，TTP的死亡率超过90％，但血浆疗法使死亡率降低至约20％(Moake J L.Thromboticthrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome.Arch Pathol LabMed.2002；126:1430-1433)。
巨核细胞和内皮细胞中合成的vWF分别贮存在血小板α-颗粒和Weibel-Palade小体如超大vWF(UL-vWF)中(Moake J L，Rudy C K，Troll J H，Weinstein M J，Colannino NM，Azocar J，Seder R H，Hong S L，Deykin D.Unusually large plasma factor VIII:vonWillebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenicpurpura.N Engl J Med.1982；307:1432-1435；Wagner D D，Olmsted J B，Marder VJ.Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies ofhuman endothelial cells.J Cell Biol.1982；95:355-360；Wagner D D，Bonfanti R.vonWillebrand factor and the endothelium.Mayo Clin Proc.1991；66:621-627；Sporn LA，Marder V J，Wagner D D.von Willebrand factor released from Weibel-Paladebodies binds more avidly to extracellular matrix than that secretedconstitutively.Blood.1987；69:1531-1534；Tsai H M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrandfactor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyteproteases.Biochem Biophys Res Commun.1989；158:980-985；Tsai H M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Multimeric composition of endothelial cell-derived vonWillebrand factor.Blood.1989；73:2074-2076)。一旦从内皮细胞分泌，此类UL-vWF多聚体被循环中的ADAMTS13在vWF分子中的特定切割位点上切割成一系列更小的多聚体(TsaiH M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Endothelial cell-derived high molecularweight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern bygranulocyte proteases.Biochem Biophys Res Commun.1989；158:980-985；Dent J A，Galbusera M，Ruggeri Z M.Heterogeneity of plasma von Willebrand factormultimers resulting from proteolysis of the constituent subunit.J ClinInvest.1991；88:774-782；Furlan M，Robles R，Affolter D，Meyer D，Baillod P，LammleB.Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradationof high molecular weight multimers.Proc Natl Acad Sci USA.1993；90:7503-7507)。
ADAMTS13在成熟vWF亚基的中心A2结构域中的Tyr842-Met843键上切割并且需要锌或钙来获得活性(Dent J A，Berkowitz S D，Ware J，Kasper C K，Ruggeri ZM.Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection ofmolecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor.Proc Natl Acad SciUSA.1990；87:6306-6310)。vWF存在于"纱线球(ball-of-yarn)"和丝状体(filamentousform)(如通过电子显微镜术看到的)中(Slayter H，Loscalzo J，Bockenstedt P，Handin RI.Native conformation of human von Willebrand protein.Analysis by electronmicroscopy and quasi-elastic light scattering.J Biol.Chem.1985；260:8559-8563)。此外，原子力显微镜确认了vWF在静止条件下以球形构造存在并且在暴露于剪切应力后以展开的丝状态存在(Siedlecki C A，Lestini B J，Kottke-Marchant K K，Eppell SJ，Wilson D L，Marchant R E.Shear-dependent changes in the three-dimensionalstructure of human von Willebrand factor.Blood.1996；88:2939-2950)。当vWF纤丝的一个末端被锚定于表面时，这也可在体内发生。
TTP患者的血栓由少量纤维蛋白和主要地vWF和血小板组成，这表明vWF-介导的血小板聚集为血栓形成的原因(Asada Y，Sumiyoshi A，Hayashi T，Suzumiya J，KaketaniK.Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenicpurpura，with special reference to factor VIII related antigen.ThrombRes.1985；38:469-479)。具有复发性TTP的患者在血浆中具有超大多聚体。UL-vWF多聚体随时间过去积累，因为抑制剂(抗-ADAMTS13Ab)的持续存在降低了ADAMTS13的活性。UL-vWF多聚体极度活跃并且因剪切应力而展开，从而引起血小板聚集，这导致血管内血栓形成(TsaiH M.Von Willebrand factor，ADAMTS13，and thrombotic thrombocytopenic purpura.JMol Med.2002；80:639-647；Tsai H M.Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic andthrombocytopenic purpura.J Thromb Haemost.2003；1:2038-2040；discussion 2040-2035)。
据认为因ADAMTS13缺乏而导致的反应过度UL-vWF多聚体在血浆中的存在可以与增加的患与冠状动脉心脏病相关的动脉血栓形成的风险相关。
由于ADAMTS蛋白牵涉许多疾病和病况，因此本领域存在对用于大规模生产具有高度特异性活性的重组ADAMTS蛋白的方法的需要，所述重组ADAMTS适合用于药物配制和施用。本发明提供了满足本领域内的这些和其它需要的用于ADAMTS蛋白的产生和纯化的方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供了表达具有血小板反应蛋白模体(ADAMTS)蛋白的去融合素和金属蛋白酶的方法。在某些实施方案中，本文中提供的方法有利地导致增加的表达水平和具有显著提高的活性的ADAMTS蛋白的产生。这些改善的性质在一个实例中可通过补充用于ADAMTS蛋白表达的具有升高的水平的不同成分例如钙、锌或烟酰胺(维生素B3)的培养基来实现。在优选实施方案中，ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。
在另一个方面，本发明涉及通过在分批、分批补料或连续细胞培养条件下于无动物蛋白质并且化学成分确知的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的重组细胞来增加ADAMTS蛋白的表达和/或活性水平的方法。在某些实施方案中，此类方法包括使用可以以细胞悬浮液或细胞附着方式进行的分批细胞培养、分批补料细胞培养、灌注细胞培养或恒化细胞培养(chemostat cell-cultivation)。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。
在另一个方面，本发明提供了在ADAMTS蛋白的纯化过程中减少活性损失的量的方法。在某些实施方案中，所述方法包括用额外水平的钙和/或锌补充纯化缓冲液。在具体的实施方案中，所述方法涉及在于纯化过程中所使用的超滤和/或渗滤步骤中稳定ADAMTS蛋白的活性。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。
在另一个方面，本发明涉及产生用于药物组合物的制备的具有增加的活性的ADAMTS蛋白的方法。在某些实施方案中，此类方法包括在适合于增加的具有增加的活性的ADAMTS蛋白的表达的条件下使用无动物蛋白质和/或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。
在相关方面，本发明提供了对于具有高特异性活性的ADAMTS蛋白的表达是有用的无动物蛋白质、无寡肽及化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。
附图简述
图1A和1B.在不同温度和pH条件下于无动物蛋白质培养基中培养的CHO细胞中表达的重组人ADAMTS13的容积FRETS-vWF73生产率。不同细胞培养实验的结果显示为作为培养温度和pH的函数的标准化容积ADAMTS13FRETS-VWF73生产率的(A)等值线图(contourplot)和(B)等值面图(surface plot representation)。
图2A和2B.在不同温度和pH条件下于无动物蛋白质培养基中培养的表达重组人ADAMTS 13的CHO细胞的比活性水平(FRETS-VWF73/通过ELISA测定的抗原)。不同细胞培养实验的结果显示为作为培养温度和pH的函数的比活性的(A)等值线图和(B)面图表示。
发明详述
I.引言
ADAMTS蛋白(即，ADAMTS-1至ADAMTS-20)是共有共同模块结构域组织的分泌性锌金属蛋白酶的家族(关于综述，参见，Flannery C.R.，Front Biosci.2006Jan 1；11:544-69)。所有ADAMTS蛋白共有共 同的核心结构域结构，其由如下部分组成：信号肽、紧接其后的前结构域、锌依赖性金属蛋白酶催化结构域、去整合素样结构域、血小板反应蛋白I型重复、富含半胱氨酸的结构域和间隔区结构域(Apte S.S.，J Biol Chem.2009Nov 13；284(46):31493-7)。此外，除ADAMTS-4外，它们都包含至少一个或更多个血小板反应蛋白I型重复结构域，并且许多ADAMTS蛋白包含一个或多个额外的辅助结构域。值得注意地，已报导所有ADAMTS蛋白似乎包含至少一个钙结合位点和至少一个位于金属蛋白酶催化结构域内的锌结合位点(Andreini等人，J.Proteome Res.，2005，4(3)，pp 881–888)。
已报导ADAMTS蛋白对于不同疾病和状况的生物作用，所述疾病和状况包括血管生成抑制、肾间质纤维化、骨重建、卵巢滤泡生成、动脉粥样硬化、泌尿生殖器发育和肿瘤生长/重塑(ADAMTS-1)；Ehler–Danlos综合征7C型和Bovine dermatopraxis(ADAMTS-2)；关节炎、动脉粥样硬化和肌腱病变(ADAMTS-4)；关节炎和胶质母细胞瘤(ADAMTS-5)；关节炎(ADAMTS-7)；血管生成抑制、脑恶性肿瘤、关节炎和动脉粥样硬化(ADAMTS-8)；关节炎(ADAMTS-9，-12)；血栓性血小板减少性紫癜(ADAMTS-13)；和抗血栓形成(Antithrombosis)/中风(ADAMTS18)(关于综述，参见，Lin和Liu，Open AccessRheumatology Research and Reviews 2009:1121–131)。
重组ADAMTS13(A13)先前已在哺乳动物细胞中表达，然而比活性视细胞培养条件而变化很大。已发现许多商购可得的培养基不足以用于表达具有高比活性(表示为通过FRETS-VWF73测定法测量的活性对通过ELISA测定的抗原含量的比率)的A13。在一个方面，本文中提供的方法基于几个允许具有升高的总活性和比活性水平的A13的细胞培养表达的有利发现。
本文中公开的研究显示培养基中钙的某些最小浓度，约0.5mM至约1.5mM，是活性A13表达所必需的。此外，发现通过用升高的水平的锌补充培养基，所得的表达的A13蛋白具有更高的总活性和 比活性。例如，在以2至3倍正常水平补充有额外锌的培养物中，与在标准化学成分确定的培养基例如基于DMEM/F12的培养基中发现的浓度相比较，A13的比活性显著增加。此外，可通过将烟酰胺(维生素B3)浓度从约2mg/L(如在基于标准DMEM/F12的培养基中)增加至约7mg/L来实现A13的比活性的额外增加。通过在补充有额外钙、锌和/或烟酰胺的培养基中培养重组CHO或HEK293细胞，可在重组人A13的大规模表达培养中获得至少约500mU/μg、1000mU/μg、达到约2000mU/μg的比活性。先前未曾报导重组产生的A13蛋白的这类比活性水平。有利地，在不含动物源性成分的化学成分确定的培养基中获得这类升高的A13活性水平，从而允许以适合用于生产药物配制的蛋白质的大规模一致且可重现地表达ADAMTS蛋白。此外，此类培养基甚至不含重组蛋白质例如胰岛素，从而导致可更安全用于药物施用的制剂的制品。
本公开内容还提供了在标准超滤/渗滤和其它纯化步骤过程中防止活性和比活性损失的方法。有利地，发现通过用额外的钙和锌补充用于渗滤的缓冲液，可获得A13活性损失的显著减少，如通过FRETS-VWF73测定测量的。
因此，归因于分泌的金属蛋白酶的ADAMTS家族之间共有的结构-功能关系，由本发明提供的方法允许所有ADAMTS蛋白在细胞培养物中表达和从细胞培养基回收。
II.定义
如本文中所使用的，术语“维生素B3”、“烟酰胺”、“尼克酰胺(niacinamide)”、“尼克酸”和“烟酸(nicotinic acid)”可互换使用，意指维生素B3家族的任何成员。因此，该家族的任何成员可用于补充用于本发明的方法的培养基。
如本文中所使用的，“ADAMTS蛋白”是指具有金属蛋白酶的血小板反应蛋白I型模体家族的去整合素和金属蛋白酶的多肽。该家族 的成员包括人蛋白ADAMTS1(NM_006988)、ADAMTS2(NM_014244；NM_021599)、ADAMTS3(NM_014243)、ADAMTS4(NM_005099)、ADAMTS5(NM_007038)、ADAMTS6(NM_014273)、ADAMTS7(NM_0142727)、ADAMTS8(NM_007037)、ADAMTS9(NM_182920；NM_182921；NM_020249)、ADAMTS10(NM_030957)、ADAMTS12(NM_030955)、ADAMTS13(NM_139025；NM_139026；NM_139027；NM_139028)、ADAMTS14(NM_139155；NM_080722)、ADAMTS15(NM_139055)、ADAMTS16(NM_139056)、ADAMTS17(NM_139057)、ADAMTS18(NM_199355；NM_139054)、ADAMTS19(NM_133638)和ADAMTS20(NM_025003、NM_175851)。ADAMTS蛋白包括全长蛋白质和展示至少部分生物活性，例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的由全长蛋白质显示的活性，特别是由全长蛋白质显示的蛋白酶活性。在某些情况下，在体内或体外例如通过酶促或化学方法翻译后修饰ADAMTS蛋白。应理解，本发明的ADAMTS蛋白包括选择性剪接同种型、保守修饰的蛋白质、大体上同一的蛋白质、同源物等。
在本发明的说明书中，ADAMTS蛋白包括来自例如哺乳动物例如灵长类动物、人、猴、兔、猪、啮齿类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬科动物、猫科动物的ADAMTS家族的任何成员及其生物活性衍生物。也包括具有活性的突变的和变异的ADAMTS蛋白，同样地包括ADAMTS蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本发明的ADAMTS蛋白还可包含帮助纯化、检测或两者的标签。本文中描述的ADAMTS蛋白还可用治疗性部分或适合于体外或体内成像的部分进行修饰。
如本文中所使用的，“ADAMTS13蛋白”是指具有ADAMTS13活性，特别是在VWF的残基Tyr-842与Met-843之间切割肽键的能力的任何蛋白质或多肽。在示例性实施方案中，ADAMTS13蛋白是指包含与NP_620594(ADAMTS13同种型1，前蛋白原)的氨基酸序列或 NP_620594(ADAMTS13同种型1，成熟多肽)的氨基酸75-1427高度相似的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方案中，ADAMTS13蛋白是指包含与NP_620596(ADAMTS13同种型2，前蛋白原)的氨基酸序列或NP_620594(ADAMTS13同种型2，成熟多肽)的氨基酸75至1371高度相似的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方案中，ADAMTS13蛋白包括与NP_620595(ADAMTS13同种型3，前蛋白原)的氨基酸序列或NP_620595(ADAMTS13同种型1，成熟多肽)的氨基酸75至1340高度相似的氨基酸序列的多肽。如本文中所使用的，ADAMTS13蛋白包括具有vWF切割活性的天然变体和具有vWF切割活性的人工结构。如本发明中所使用的，ADAMTS13包括保留一定基本活性的任何天然变体、可选择的序列、同种型或突变蛋白质。人群体中发现的ADAMTS13突变的实例包括但不限于R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、R1336W，已发现所述突变中的许多突变与血栓性血小板减少性紫癜(TTP)相关。ADAMTS13蛋白还包括包含翻译后修饰的多肽。例如，已显示ADAMTS13在残基614、667和1354上被N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰，已预测残基142、146、552、579、707、828和1235也可以该方式被修饰。
可通过在哺乳动物细胞培养中表达来制备具有蛋白水解活性的重组ADAMTS13，如Plaimauer等人，(2002，Blood.15；100(10):3626-32)和US 2005/0266528(为了所有目的将所述文献和专利的公开内容通过引用整体并入本文)中所描述的。表达ADAMTS13的细胞的重组培养的方法公开于Plaimauer B，Scheiflinger F中。(Semin Hematol.2004Jan；41(1):24-33，为了所有目的将其公开内容通过引用整体并入本文)。
如本文中所使用的，“一个ADAMTS活性单位”被定义为1mL混合的正常人血浆的活性的量，无论所使用的测定是什么。例如，当 ADAMTS蛋白为ADAMTS13时，一个ADAMTS13FRETS-VWF73活性单位是切割与被1mL的混合正常人血浆切割的FRETS-VWF73底物的量相同的量的FRETS-VWF73底物所需的活性的量(Kokame等人，Br J Haematol.2005Apr；129(1):93-100)。方便地，ADAMTS13活性可通过功能测定法例如利用经修饰的vonWillebrand因子肽作为ADAMTS13的底物的功能测定法来进行测定(Tripodi等人J ThrombHaemost.2008Sep；6(9):1534-41)。测定重组人ADAMTS13活性的优选方法公开于Gerritsen等人(Assay of von Willebrand factor(vWF)-cleaving protease based on decreasedcollagen binding affinity of degraded vWF:a tool for the diagnosis ofthrombotic thrombocytopenic purpura(TTP).Thromb Haemost 1999；82:1386-1389)中。在一个实施方案中，为了被认为是上文中定义的ADAMTS13蛋白，多肽或蛋白质必须具有至少1％的天然ADAMTS13的vWF切割活性。在其它实施方案中，ADAMTS13蛋白可包含至少10％的天然ADAMTS13的活性。在其它实施方案中，ADAMTS13蛋白可包含至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的天然ADAMTS13的活性。ADAMTS13蛋白的量也可通过例如使用Rieger等人(2006，Thromb Haemost.200695(2):212-20)中公开的ELISA法测量ADAMTS13抗原来进行测定。
如本文中所使用的，“μg的ADAMTS13”或“μg的ADAMTS13抗原”意指提供与1mL的混合正常人血浆所提供的水平相同的可被ELISA测定检测的蛋白质水平的ADAMTS13的量。这基于1mL正常人血浆中存在1mg ADAMTS13的公布的估计，从而是近似测量。
如本文中所使用的，术语"生物活性衍生物"，当用于ADAMTS蛋白的背景中时，还包括通过重组DNA技术获得的多肽。这可包括本领域已知的任何方法，所述方法用于(i)通过基因工程，例如通过RNA的逆转录和/或DNA的扩增产生重组DNA，(ii)通过转染，即，通过电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞，(iii)培养所述转染的细胞，例如以连续或分批式方式，(iv)表达ADAMTS蛋白， 例如组成型地或当诱导时，和(v)分离所述ADAMTS蛋白，例如从培养基或通过收获转化的细胞，以(vi)获得大体上纯化的重组ADAMTS蛋白，例如通过离子交换层析、大小排阻层析、亲和层析、疏水作用层析等。术语"生物活性衍生物"还包括嵌合分子，例如与第二多肽例如免疫球蛋白Fc结构域或白蛋白结构域组合(以改善生物学/药理学性质例如ADAMTS蛋白在哺乳动物(特别是人)的循环系统中的半衰期)的ADAMTS蛋白或其功能片段。
如本文中所使用的，术语“超滤”包括多种其中流体静力压迫使液体透过半透膜的膜过滤法。高分子量的悬浮的固体和溶质得到保留，然而水和低分子量溶质通过膜。该分离法通常用于纯化和浓缩大分子(103-106Da)溶液，特别是蛋白质溶液。取决于它们保留的分子的大小，许多超滤膜是可获得的。超滤的特征通常在于2nm至0.05μM的膜孔大小和1至10巴的操作压力，并且特别地用于将胶体样蛋白质与小分子如糖和盐分离。相反地，纳米过滤是另一种压力驱动的过滤法，特征通常在于0.5至2nm的膜孔大小和5至40巴的操作压力。纳米过滤通常用于在一个方面实现糖、其它有机分子与多价盐之间的分离以及在另一个方面单价盐与水之间的分离。通常，可以以死端式过滤模式或正切流动过滤(TFF)模式进行超滤。
如本文中所使用的，术语“渗滤”是指另一种膜过滤法，有时称为正切流动过滤(TFF)，其中沿着超滤膜的表面正切地泵动所述液体。通常，在通过膜后用渗滤缓冲液稀释渗余物液体，随后将其在返回连续流动过程中返回至膜。通常，可以以死端式过滤模式或正切流动过滤(TFF)模式进行渗滤。这样，可将单个系统用于超滤和渗滤操作例如，以首先使用超滤浓缩样品，然后通过渗滤进行缓冲液更换。
如本文中所使用的，术语"多胺"是指一组由碳、氮和氢组成并且包含两个或更多个氨基的有机化合物中的任何有机化合物。例如，所述术语包括选自尸胺、腐胺、胍丁胺、鸟氨酸、精胺和精脒的分子。
在用于ADAMTS蛋白的表达的化学成分确定的培养基(chemically definedculture medium)的某些实施方案中，存在于培养基中的多胺的浓度在约0.5mg/L至约30mg/L，或约0.5mg/L至约20mg/L、或约0.5mg/L至约10mg/L、或约1mg/L至约10mg/L、或约2mg/L至约10mg/L、或约2mg/L至约8mg/L、或约2mg/L至约5mg/L的范围内。在一个具体的实施方案中，多胺为浓度约2mg/L至约8mg/L的腐胺。
如本文中所使用的，术语“化学成分确定的培养基”是指其中所有成分的身份和浓度都是已知的合成生长培养基。化学成分确定的培养基不包含细菌、酵母、动物或植物提取物，虽然它们可以包括或不包括个别植物或动物源性成分(例如，蛋白质、多肽等)。商购可得化学成分确定的培养基的非限定性实例包括不同的培养基(SAFCBiosciences，Inc)、不同的达尔伯克改良伊格尔(DME)培养基(Sigma-Aldrich Co；SAFCBiosciences，Inc)、Ham’s营养培养基(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences，Inc)等。制备化学成分确定的培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040和2007/0212770号专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“不含寡肽的培养基”是指不包含寡肽例如衍生自蛋白质水解物的寡肽的不含蛋白质的培养基。在一个实施方案中，培养基不包含具有20或更多个氨基酸的寡肽。在本发明的一个实施方案中，培养基不包含具有15或更多个氨基酸的寡肽。在本发明的另一个实施方案中，培养基不包含具有10个或更多个氨基酸的寡肽。在一个实施方案中，培养基不包含具有7个或更多个氨基酸的寡肽。在另一个实施方案中，培养基不包含具有5个或更多个氨基酸的寡肽。在另一个实施方案中，培养基不包含具有3个或更多个氨基酸的寡肽。根据本发明的其它实施方案，培养基不包含具有2个或更多个氨基酸的寡肽。制备不含寡肽的培养基的方法在本领域中，例 如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“无血清培养基”是指未补充有动物血清的培养基。虽然许多时候无血清培养基是化学成分确定的培养基，但无血清培养基可补充有分离的动物或植物蛋白质或蛋白质级分。制备无血清培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“无动物蛋白质培养基”是指未补充有动物血清、蛋白质或蛋白质级分的培养基。虽然许多时候无动物蛋白质培养基是化学成分确定的培养基，但无动物蛋白质培养基可包含植物或酵母水解物。制备无动物蛋白质培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包括有效地连接于启动子的待转录的核酸。
当术语“异源”，当用于指核酸的部分时，表示所述核酸包含在自然界中未以相同的彼此关系被发现的两个或更多个子序列。例如，所述核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个来自无关基因的序列(它们经排列产生新型功能核酸)，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示所述蛋白质包含在自然界中未以相同的彼此关系被发现的两个或更多个子序列(例如，融 合蛋白)。
“启动子”被定义为一系列指导核酸转录的核酸控制序列。如本文中所使用的，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于远离转录起始位点多达数千碱基对。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“有效连接的”是指核酸表达控制序列(例如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。
如本文中所使用的，术语"约"是指与指定值相差正或负10％的大致范围。例如，语言"约20％"包括18-22％的范围。
III.ADAMTS蛋白表达
在一个方面，本发明提供了表达具有高比活性的具有血小板反应蛋白模体(ADAMTS)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在补充有至少一种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞。在具体的实施方案中，在补充有至少两种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中表达ADAMTS蛋白。在另一个实施方案中，所述培养基补充有钙、锌和烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的培养基可包括无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。
在一个方面，提供了用于产生ADAMTS蛋白的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在补充有锌、钙和烟酰胺的至少一种的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞；从培养物中取出一部分上清液；进行离心或过滤步骤以除去任何残留细胞；进行超滤步骤以浓缩ADAMTS蛋白；和利用包含至少钙或锌的缓冲 液进行渗滤步骤。在某些实施方案中，钙的浓度可以为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或超过5mM钙。在其它实施方案中，锌的浓度可以为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或超过10μM的锌。在某些实施方案中，收获物，无细胞上清液或渗滤缓冲液包含上述浓度的钙和锌的组合。在某些实施方案中，超滤和/或渗滤膜的截断值可以为例如约150kD或125kD或100kD或75kD或50kD或30kD或10kD或小于10kD。在某些实施方案中，ADAMTS蛋白为ADAMTS13或其生物活性衍生物。在具体的实施方案中，ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物。在某些实施方案中，用于所述方法的培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。
在一个实施方案，所述方法还包括选自离子交换层析、大小排阻层析、亲和层析和疏水相互作用层析的纯化步骤。
在另一个实施方案中，锌的补充可通过添加含锌蛋白质或多肽制剂来提供。例如，常用胰岛素制剂以使利用约1mg/L至约10mg/L胰岛素的培养基补充也可导致约0.03μM至约1.5μM的锌的补充(如根据关于Novolin N InnoLet SubQ，重组人胰岛素的详细专题论文计算的，这可见Medscape服务器)的浓度包含锌。因此，在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的培养基可补充含锌胰岛素制剂。
被选择用于培养宿主细胞系的本文中公开的补充有锌、钙和/或烟酸(维生素B3)的基础培养基对于本发明不是至关重要的并且可以是本领域已知的适合用于培养哺乳动物细胞的那些培养基之任一或组合。培养基例如达尔伯克改良伊格尔培养基、Ham's F-12培养基、伊格尔最低必需培养基和RPMI-1640培养基等是商购可得的。生长因子例如重组胰岛素的添加是任选的。
在一个实施方案中，用于培养表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的细胞的基础培养基可包含一种或多种商购可得的化学 成分确定的培养基例如达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)和Ham's F-12培养基的混合物，所述培养基补充有除锌、钙和烟酰胺(维生素B3)外的一种或多种成分。可用于补充商购可得的培养基的成分的非限定性实例包括必需氨基酸(例如，谷氨酰胺)、非离子型表面活性剂(例如，Synperonic)、伯胺(例如，乙醇胺)、聚胺(例如，腐胺)、痕量金属(例如，铁)和缓冲剂(例如，碳酸氢钠)。在具体实施方案中，所述培养基是表1提供的BCS培养基。在另一个具体实施方案中，所述培养基是BACD培养基，例如BACD-A13培养基。
表1.细胞培养基BCS的组成.
| 成分 | 浓度[g/kg] |
| DMEM/HAM’S F12 | 11.75 |
| L-谷氨酰胺 | 0.9 |
| Synperonic | 1.00 |
| 乙醇胺 | 0.00153 |
| 腐胺.2HCl | 0.0036 |
| FeSO4.7H2O | 0.0006 |
| NaHCO3 | 2.0 |
历史上，已将动物细胞培养在含有动物血清的培养基中。然而，此类培养基是成分不完全明确的并且具有感染的风险。然而，因此本领域技术人员设计了完全不含任何蛋白质或至少不含任何非重组产生的蛋白质的“无蛋白质”培养基。人血清白蛋白通常用作用于产生重组蛋白质的无血清培养补充剂。优选培养基包括第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布中公开的那些培养基。
任选地，可向培养基中加入非离子型表面活性剂例如聚丙二醇(例如F-61、F-68、F-71、F-108或)作为消泡剂。该试剂通常用于保护细胞免受充气(“喷雾”)的负面影响。非离子型表面活性剂的量可在0.05与10g/L之间，优选在0.1至5g/L之间变化。
US 6936441的培养基特别适合于培养CHO细胞，但同样也可与其它细胞一起使用。其它适当的培养基是第2007/0212770号美国专利申请(Baxter International Inc.，Baxter Healthcare S.A.)中公开的无寡肽培养基。
表2.可用于补充在表达ADAMTS蛋白中有用的培养基的锌、钙和烟酰胺(维生素B3)浓度的示例性浓度。
*Var.＝变化
在一个实施方案中，本发明提供了用于表达具有血小板反应蛋白 模体(ADAMTS)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含浓度为至少约2μM的锌或浓度为至少约0.5mM的钙的至少一种的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS1。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS2。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS3。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS4。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS5。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS6。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS7。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS8。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS9。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS10。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS11。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS12。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS14。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS15。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS16。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS17。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS18。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS19。在另一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS20。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13。
在一个实施方案中，所述培养基包含至少约2μM锌。在另一个实施方案中，所述培养基包含约2μM至约12μM的锌。在另一个实施方案中，所述培养基包含至少约5μM的锌。在一个实施方案中，所述培养基包含约5μM至约12μM的锌。在另一个实施方案中，所述培养基包含至少约0.5mM的钙。在另一个实施方案中，所述培养基包含约0.5mM至约1.5mM的钙。在一个实施方案中，所述培养基包含至少约2μM锌和至少约0.5mM的钙。
在其它实施方案中，已发现烟酰胺(维生素B3)的添加在细胞培养中进一步增强ADAMTS蛋白的表达和比活性。在一个实施方案中，所述培养基还包含至少约2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，所述培养基还包含至少约7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，所述培养基包含约2mg/L至约10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。
在某些实施方案中，培养基是无动物蛋白质培养基。在另一个实施方案中，培养基是化学成分确定的培养基。在某些实施方案中，培养基可包含一种或多种多胺。在具体实施方案中，多胺是例如浓度为至少0.5mg/L的腐胺。在具体实施方案，培养基包含约2mg/L至约8mg/L腐胺。
在某些实施方案中，用于培养的细胞或细胞系是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞。在具体实施方案中，所述细胞系是人细胞系、仓鼠细胞系或鼠细胞系。在更具体的实施方案中，所述细胞系是CHO、BHK或HEK细胞系。在优选实施方案中，所述细胞系是CHO细胞系。
在某些实施方案中，编码ADAMTS的核酸包含有效地连接于编码ADAMTS蛋白的核苷酸序列的控制序列。在一个实施方案中，控制序列是启动子。在某些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在其它实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。
在某些实施方案中，本文中提供的方法包括使用连续细胞培养系统(即，连续细胞培养(continuous cell-cultivation))。在一个实施方案中，连续细胞培养系统是恒化培养系统(即，恒化细胞培养)。在另一个实施方案中，连续培养系统是恒浊培养系统(turbidostat culture system)(即，恒浊细胞培养)。在另一个实施方案中，所述连续培养系统是灌注培养系统(即，灌注细胞培养)。在某些实施方案中，可在悬浮模式下运行连续培养系统。在其它实施方案，可在附着模式下运行 连续培养系统。在某些实施方案中，附着模式包括使用微载体，例如，多孔微载体。
在某些实施方案中，本文中提供的方法包括使用分批细胞培养系统(即，分批细胞培养)。在一个实施方案中，分批培养系统是单批培养系统(即，单批细胞培养)。在另一个实施方案中，所述分批培养系统是分批补料培养系统(即，分批补料细胞培养)。在另一个实施方案中，所述分批培养是重复分批培养系统(即，重复分批细胞培养)。在某些实施方案中，可在悬浮模式下运行分批培养系统。在其它实施方案，可在附着模式下运行分批培养系统。在某些实施方案中，附着模式包括使用微载体，例如多孔微载体。
在某些实施方案中，可将培养物维持在约35℃至约37℃的温度下。在其它实施方案中，可将培养物维持在约6.9至约7.3的pH下。在具体实施方案中，可将培养物维持在约7.05与约7.15的pH下。
在某些实施方案中，本文中提供的方法可在培养基中产生具有至少600U/mgADAMTS13蛋白的比活性的ADAMTS13蛋白(即，表达的DAMTS13)。在其它实施方案中，比活性可为至少800U/mg ADAMTS13蛋白。在其它实施方案中，比活性为至少1000U/mg ADAMTS13蛋白。在其它实施方案中，比活性为至少1500U/mg ADAMTS13蛋白。在其它实施方案中，比活性为至少2000U/mg ADAMTS13蛋白。
在其它实施方案中，所述方法提供了产生至少400U的ADAMTS13活性/L培养物/天(U/L/D)的培养物。在一个实施方案中，所述方法提供产生至少800U的ADAMTS13活性/L培养物/天(U/L/D)的培养物。
A.ADAMTS13
在一个方面，本发明提供了用于表达具有增加的总活性和/或比 活性的ADAMTS13蛋白的方法。有利地，发现通过用钙、锌和/或烟酰胺(维生素B3)补充生长培养基，可重组表达具有高比活性的ADAMTS13多肽以及将其从细胞培养物回收。
用于表达ADAMTS13的方法提供于WO 2009/086309(为了所有目的将其公开内容通过引用整体并入本文)中。该参考资料描述了适当的方法和可在整个培养持续过程中得到维持的培养条件。如本文中所描述的，通常将用于ADAMTS13蛋白表达的细胞培养物维持在或约在34℃至37℃的温度下以及在或约在6.8至7.3的pH下。
监控培养温度和pH的方法在本领域是公知的并且通常依赖于被插入生物反应器或包含在籍此使培养基循环的环路中或被插入培养基的提取的样品中的探针。适当的在线pH传感器包括Mettler Toledo InPro 3100/125/Pt100传感器(Mettler-Toledo Ingold，Inc.，Bedford，MA)。改变特定参数以将其保持在预定水平的方法也是公知的。例如，保持温度恒定通常包括加热或冷却生物反应器或进料培养基(feed medium)(如果其为分批补料法或连续法)；保持pH恒定通常包括选择和供应足够的适当缓冲液(通常碳酸氢盐)和必要时向进料培养基中加入酸，例如盐酸或碱，例如氢氧化钠、碳酸氢钠或其混合物。在线pH探针的校准可能可随着时间的过去(在该过程中对细胞进行培养)例如随着数天或数周的时期过去偏移。在这种情况下，可以有益地通过使用从最近校准的离线探针(off-lineprobe)获得的测量来重新设置在线探针。
在一个实施方案中，所述方法包括在补充有至少一种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在具体实施方案中，ADAMTS蛋白在补充有至少两种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中表达。在另一个实施方案中，所述培养基补充有钙、锌和烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，所述培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。
1.锌补充
有利地，发现增加的ADAMTS13酶促活性和比活性可从生长在补充有锌的培养基中的细胞培养物恢复。例如，实施例1证明在含有1.432mg/L ZnSO4·7H2O(5μM锌)的培养基中表达的ADAMTS13蛋白具有比在仅含0.432mg/L ZnSO4·7H2O(1.5μM锌)的培养基中表达的ADAMTS13蛋白高40％至100％的比活性(比较，表10和表11)。此外，该效应是可重现的，如实施例2(比较，表13和表14)；实施例4(表16至表19)；和实施例5(表20和表21)中显示的。
因此，在一个方面，本发明提供了通过在补充有锌例如含有至少2μM锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来表达具有增加的比活性的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的方法。类似地，本发明还提供了通过在补充有锌例如含有至少2μM锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来制备具有增加的总活性或比活性的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少2μM锌或约2μM锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为5μM锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，所述培养基包含为或约为2μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，所述培养基包含为或约为5μM与12μM的锌。在其它实施方案中，所述培养基包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更大浓度的锌。适当的锌浓度范围通常通过可在高浓度锌例如高于20μM、25μM、30μM、40μM等的浓度的锌存在的情况下发生的细胞培养物毒性来确定。如将被本领域技术人员所理解的，锌浓度对特定 培养系统的抑制程度将高度取决于，除其它因素外，用于表达ADAMTS蛋白的细胞的类型、所使用的培养基的成分以及用于培养的运行模式(例如，分批对连续；悬浮对附着；恒化对灌注；等)。在某些情况下，当培养基的成分可从溶液隔离(sequester)锌时，例如在其中培养基包含白蛋白的情况下，可能需要更高的锌浓度。因此，适当的锌浓度通常通过培养细胞的身份、所使用的培养基和运行模式来确定。本领域技术人员基于所使用的个别培养系统可容易地能够确定使用锌补充的适当上限。
在一个实施方案中，提供了表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，包括在含有至少为或约为2μM锌的无动物蛋白质和/或无多肽培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在含有至少为或约为5μM锌的无动物蛋白质和/或无多肽培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基包含为或约为2μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基包含为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2μM的锌的化学成分确定的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为5μM的锌的化学成分确定的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，化 学成分确定的培养基包含为或约为2μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在某些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物源性蛋白质和/或多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为5μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为5μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2μM，或至少约3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基 还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约5μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含为或约为2μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含为或约为5μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包为或约约2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案 中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃之间。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约5μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃下。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为2μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为5μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约2μM，或至少为或约3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至 30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为5μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为2μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为5μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物 细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的培养基可补充至少约2μM至至少约12μM的终浓度的锌。在某些实施方案中，培养基可补充至少约2μM，或至少约3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM的终浓度的锌或更高水平的锌。通常，可将任何锌盐用于补充本发明的培养基，可接受的盐的非限定性实例包括ZnSO4·7H2O、ZnSO3·2H2O、(C6H5O7)2Zn3·2H2O、ZnBr2、ZnBr2·2H2O、ZnCl2、Zn(NO3)2·6H2O、Zn(H2PO4)2·H2O、(C2H3O2)2Zn·2H2O等。在某些实施方案中，将锌的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。
2.钙的补充
有利地，发现可从在补充有钙的培养基中生长的细胞培养物回收增加的ADAMTS13酶促活性和比活性。常规细胞培养基例如DMEM/F12通常包含约1mM的钙。历史上，将这些高钙水平引入培养基以帮助附着细胞培养。然而，如今设计用以悬浮培养的商购可得的培养基包含显著更低的钙水平，例如约0.1mM的钙。依赖这样的更低的钙水平来防止通过悬浮法培养的细胞聚集。已知更低的钙水平足以以悬浮方式繁殖细胞以及表达重组蛋白，然而，本发明人已发现这些低钙水平不足以表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)。
因此，在一个方面，本发明提供了通过在补充有钙例如包含至少0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来表达具有增加的比活性的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的方法。类似地，本发明还提供了通过在补充有钙例如包含至少0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋 白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来制备具有增加的总活性或比活性的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，培养基包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在其它实施方案中，所述培养基可包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的无动物蛋白质和/或无多肽培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为1.5mM的钙的无动物蛋白质和/或无多肽培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的化学成分确定的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为1.5mM的钙的化学成分确定的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，化学成分确定的培养基将不含动物源性蛋白质和/或多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细 胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，所述培养基包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基 中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在另一个实施方案中，所述方法包括包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在其它实施方案中，所述方法包括在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，所述培养基包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙，其中将培养物维持在35℃至37℃或约35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质 和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在另一个实施方案中，所述方法包括包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在其它实施方案中，所述方法包括在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，所述培养基包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK 细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个 实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为1.5mM的钙以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为1.5mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为1.5mM的钙以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为1.5mM的钙以及至少为或约为5μM的锌至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为1.5mM的钙以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括 在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，所述培养基包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙以及至少为或约为2μM的锌。在相关实施方案中，培养基包含或约0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙以及至少为或约5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续 培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
通常，任何钙盐可用于补充本发明的培养基。可接受的盐的非限定性实例包括CaCl2、CaCl2、CaFPO3·2H2O、CaI2、CaBr2、(C2H3O2)2Ca、(CHO2)2Ca、(C6H7O6)2Ca、(C6H5O7)2Ca3·2H2O等。在某些实施方案中，将钙的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。
3.烟酰胺(维生素B3)补充
有利地，发现可从生长在补充有烟酰胺(维生素B3)的培养基中的细胞培养物回收增加的ADAMTS13酶促活性和比活性。例如，实施例2证明在含有7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中表达的ADAMTS13蛋白具有比在仅含2mg/L烟酰胺的培养基中表达的ADAMTS13蛋白高60％的比活性(表13；将第4和7天与第11天比较)。令人惊讶地，该效应与锌的补充协同，如在含有7mg/L的烟酰胺(维生素B3)和5μM锌的培养基中表达ADAMTS13导致200％至300％的ADAMTS13蛋白的比活性的增加(将表14的第11天与表13的第4和7天比较)。
因此，在一个方面，本发明提供了用于通过在补充有烟酰胺(维生素B3)例如包含至少2mg/L烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有 编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来表达具有增加的比活性的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的方法。类似地，本发明还提供了用于通过在补充有烟酰胺(维生素B3)例如包含至少2mg/L烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来制备具有增加的总活性或比活性的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，培养基可包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。适当的烟酰胺(维生素B3)浓度范围通常通过可在高浓度，例如以高于15mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L等的浓度的烟酰胺(维生素B3)存在的情况下发生的细胞毒性来确定。如本领域技术人员将理解的，烟酰胺(维生素B3)浓度对特定培养系统的抑制程度将高度取决于(除其它因素外)用于表达ADAMTS蛋白的细胞的类型、所使用的培养基的成分以及用于培养的运行模式(例如，分批对连续；悬浮对附着；恒化对灌注；等)。在某些情况下，当培养基可从溶液中隔离烟酰胺(维生素B3)时，可能需要更高的烟酰胺(维生素B3)浓度。因此，适当的烟酰胺(维生素B3)浓度范围通常由培养细胞的身份、所使用的培养基和运行模式来确定。本领域技术人员将容易地能够基于所使用的个别培养系统确定使用烟酰胺(维生素B3)补充的上限。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括 在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的无动物蛋白质和/或多肽的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的无动物蛋白质和/或多肽的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的化学成分确定的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的化学成分确定的培养基中养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，无动物蛋白质和/或无多肽培养基可包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，化学成分确定的培养基将不含动物源性蛋白质和/或多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括 在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述方法包括在连续或分批补料培养的条件下在包含至少为或约为 2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将所述培养基维持在或约在35℃至37℃。在一个实施方案中，所述方法包括在包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在 36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在另一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在其它实施方案中，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维 持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述 方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实 施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L和10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实 施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，所述培养基包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM的锌。在相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)和至少为或约为5μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM至12μM的锌。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为5μM至12μM的锌。在某些实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在 或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为1.5mM的钙。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM、或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在一个实施方案中，将培养基维持在或约在35℃至37℃下。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃下。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施 方案中，连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为1.5mM的钙。在另一个相关实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在某些实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或浓度更高的钙。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码 ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为1.5mM的钙。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM和1.5mM的钙。在某些实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体 实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多肽。在另一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在另一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞，所述培养基包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM的钙。在相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为1.5mM的钙。在另一个相关实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在某些实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)以及至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是 恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达具有血小板反应蛋白模体13(ADAMTS13)蛋白的去整合素和金属蛋白酶的方法，所述方法包括在包含锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞。在某些实施方案中，锌以至少为或约为2μM、5μM、2μM至12μM、5μM至12μM或至少3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高的浓度存在于培养基中。在某些实施方案中，钙以至少为或约为0.5mM、1.5mM、0.5至1.5或至少0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高的浓度存在于培养基中。在某些实施方案中，烟酰胺(维生素B3)以至少为或约为2mg/L、7mg/L、2mg/L至7mg/L或至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高的浓度存在于培养基中。
如本文中明确公开并且提供为Var.14至Var.93(表3至表6)的，预期3种成分(即，锌、钙和烟酰胺(维生素B3))的浓度的任何组合被用于本发明的方法中。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在 35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，所述连续培养条件是恒化培养条件。在另一个具体实施方案中，所述连续培养条件是灌注培养条件。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。
表3.用于表达ADAMTS13蛋白的包含至少2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基的示例性实施方案。
*Var.＝变化
表4.用于表达ADAMTS13蛋白的包含至少7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基的示例性实施方案。
*Var.＝变化
表5.用于表达ADAMTS13蛋白的包含至少2至7mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基的示例性实施方案。
*Var.＝变化
表6.用于表达ADAMTS13蛋白的包含至少3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)的培养基的示例性实施方案。
*Var.＝变化
B.宿主细胞和载体
可通过在任何适当的原核或真核宿主系统中表达来产生重组ADAMTS蛋白。真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞和High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白可在细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞等中表达。例如，在人细胞系、仓鼠细胞系或鼠细胞系中表达。在一个具体实施方案中，所述细胞系是CHO、BHK或HEK细胞系。在优选实施方案中，所述细胞系是CHO细胞系。
在一个实施方案中，所述细胞可以是可以优选在制造过程(即，至少1升)中培养(以产生期望的ADAMTS蛋白例如ADAMTS13)的任何哺乳动物细胞。实例包括被SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(经亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR，例如DUKX-B11亚克隆(CHO，Uriaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod，23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺癌(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。优选，所述细胞系是啮齿类动物细胞系，优选仓鼠细胞系例如CHO或BHK。
许多种载体可用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)并且 可选自真核和原核表达载体。在某些实施方案中，包括用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的质粒载体。通常，将包含复制子和来源于与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与此类宿主结合使用。载体可具有复制位点以及能够提供转化的细胞的表型选择的标记序列。质粒可包含与一个或多个控制序列例如启动子有效连接的编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列。
制备表达重组ADAMTS蛋白的稳定CHO细胞克隆的优选如下。用DHFR表达载体转染DHFR缺陷CHO细胞系DUKX-B11，以允许相关重组蛋白质表达，基本上如第5,250,421号美国专利(Kaufman等人，Genetics Institute，Inc.)中所描述的。通过在无次黄嘌呤/胸苷(HT)培养基中生长进行选择，通过在浓度不断增加的氨甲蝶呤中增殖细胞来实现编码重组ADAMTS蛋白和DHFR基因的表达的相关区域的扩增。适当时，可使CHO细胞系适应在无血清和/或蛋白质的培养基中生长，基本上如US 6,100,061(Reiter等人，lmmunoAktiengesellschaft)中所描述的。
在另一个优选实施方案中，适当的HEK293细胞可通过用包含潮霉素选择标记的构建体转染，然后利用抗生素抗性选择转化株来制备。
某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞以及整合入宿主细胞基因组并且稳定且高效地表达病毒基因的能力，已使它们成为用于将外源核酸转移进入细胞(例如，哺乳动物细胞)的吸引人的候选者。因此，在某些实施方案中，将病毒载体用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。病毒载体可包含与一个或多个控制序列例如启动子有效连接的编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列。可选择地，病毒载体可以不包含控制序列，取而代之依赖于宿主细胞中的控制序列来驱动ADAMTS蛋白的表达。可用于递送核酸的病毒载体的非限定性实例包括腺病毒载体、AAV载体和逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，腺病毒载体包括包含足以支持构建体的包装和最终表达已被克隆入其中的ADAMTS构建体的腺病毒序列的那些构建体。腺病毒载体允许引入达到7kb的外源序列(Grunhaus等人，Seminar in Virology，200(2):535-546，1992))。
在另一个实施方案中，腺伴随病毒(AAV)可被用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。AAV系统先前已被描述并且在本领域通常是公知的(Kelleher和Vos，Biotechniques，17(6):1110-7，1994；Cotten等人，Proc NatlAcad Sci USA，89(13):6094-6098，1992；Curiel，Nat Immun，13(2-3):141-64，1994；Muzyczka，Curr Top Microbiol Immunol，158:97-129，1992)。关于rAAV载体的产生和用途的详细内容描述于例如第5,139,941和4,797,368号美国专利(为了所有目的将每一个专利通过引用整体并入本文)中。
在一个实施方案中，逆转录病毒表达载体可用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。这些系统先前已被描述并且在本领域通常是公知的(Mann等人，Cell，33:153-159，1983；Nicolas和Rubinstein，In:Vectors:Asurvey of molecular cloning vectors and their uses，Rodriguez和Denhardt编，Stoneham:Butterworth，pp.494-513，1988；Temin，In:Gene Transfer，Kucherlapati(ed.)，New York:Plenum Press，pp.149-188，1986)。在具体实施方案中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体(参见，例如，Naldini等人，Science，272(5259):263-267，1996；Zufferey等人，Nat Biotechnol，15(9):871-875，1997；Blomer等人，J Virol.，71(9):6641-6649，1997；美国专利No.6,013,516和5,994,136)。
用于原核表达的载体的非限定性实例包括质粒例如pRSET、pET、pBAD等，其中用于原核表达载体的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表达的载体的实例包括：(i)对于酵母中的表达，载体例如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用启动子例如AOX1、 GAP、GAL1、AUG1等；(ii)对于昆虫细胞中的表达，载体例如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等，使用启动子例如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等，和(iii)对于哺乳动物细胞中的表达，载体例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，和来源于病毒系统例如痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等的载体，使用启动子例如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。
在某些实施方案中，本发明的细胞培养法可包括使用微载体。本发明提供了，除其它以外，大规模ADAMTS蛋白表达的方法。在某些实施方案中，可在适合于提供高容积-比培养表面积以获得高细胞密度和蛋白质表达的条件下在大生物反应器中进行所述实施方案的细胞培养。提供此类生长条件的一个方法是在搅拌的生物反应器中使用微载体来进行细胞培养。在另一个实施方案中，这些生长要求通过使用悬浮细胞培养来满足。
C.培养方法
在某些实施方案中，本发明的方法可包括使用在分批或连续运行模式下运行的细胞培养系统。例如，当使用分批细胞培养时，可在单批、分批补料或重复分批模式下运行它们。同样地，可在例如灌注、恒浊或恒化模式下运行连续细胞培养。可在悬浮或附着条件下进行分批和连续细胞培养。当在悬浮条件下运行时，可游离地悬浮细胞，将其混合在培养基中。可选择地，在附着条件下，可将细胞与固相例如微载体、多孔微载体、盘载体(diskcarrier)、陶瓷筒(ceramic cartridge)、中空纤维、扁平薄片(flat sheet)、凝胶基质等结合。
分批培养通常是其中将细胞接种物在罐或发酵罐中培养至最大密度，然后作为单批进行收获和处理的大规模细胞培养。分批补料培养，其通常为用新鲜营养物(例如，生长限定物质(growth-limiting substrate))或添加剂(例如，产物前体)补充的分批培养。进料溶液通常 被高度浓缩以避免生物反应器的稀释。在重复分批培养中，将细胞置于培养基中并且生长至所需的细胞密度。为了避免衰退期和细胞死亡的发生，随后在细胞达到它们的最大浓度之前用完全生长培养基稀释培养物。稀释的量和频率变化很大并且取决于细胞系的生长特征和培养方法的方便性。在传代培养时，除非弃去细胞和培养基，否则可按要求重复所述方法多次，随着每一次稀释进行，培养物的容积将逐步增加。可通过使反应器具有足够大的大小来允许在容器内进行稀释或通过将稀释的培养物分入几个容器来处理不断增加的体积。该类型的培养的原理是将细胞维持在指数生长状态。连续传代培养的特征在于培养物的容积总是逐步增加，可存在多次收获，细胞持续生长并且只要需要该过程可持续进行。在某些实施方案中，可在收获分批培养物的上清液后回收ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)。
连续培养可以是通过流入新鲜培养基连续提供营养物的悬浮培养，其中培养容积通常通过废培养基的伴随性去除来保持恒定。在恒化和恒浊法中，提取的培养基包含细胞。因此，保留在细胞培养容器中的细胞必须生长至维持稳定状态。在恒化法中，生长速率通常通过控制稀释速率即加入新鲜培养的速率来进行控制。可通过改变稀释速率将培养中细胞的生长速率控制在例如次最大生长速率。相反地，在恒浊法中，设置稀释速率以允许细胞可在给定的运行条件例如pH和温度下实现的最大生长速率。
在灌注培养中，通过例如过滤或通过离心方法(该方法导致细胞至培养基的重新引入)使提取的培养基耗尽保留在培养容器中的细胞。然而，通常地用于过滤的膜不保留100％的细胞，因此当提取培养基时，一部分细胞被除去。以极高的生长速率运行灌注培养可以不是至关重要的，因为大部分细胞保留在培养容器中。
搅拌釜反应器系统可用于在悬浮或附着模式下运行的分批和连续细胞培养。通常，可运行搅拌釜反应器系统，如具有任何类型的搅拌器例如Rushton、水翼(hydrofoil)、斜叶(pitched blade)或marine的 任何常规搅拌釜反应器。
本发明的方法可包括使用分批补料细胞培养或连续细胞培养，例如灌注或恒化细胞培养，以用于表达ADAMTS蛋白。在某些实施方案中，发现补充有浓度达到至少约12μM的锌的分批补料培养基提供具有增加的比活性的ADAMTS蛋白的表达(表20)。值得注意地，在补充有12μM的终浓度的锌的分批补料培养物中，比细胞生长速率和总活性不受影响，虽然表达的ADAMTS13蛋白的比活性继续增加。这与在利用恒化细胞培养的实验中看到的相反。在这些实验中，利用5μM的终浓度的锌补充培养基导致上清液中ADAMTS13的比活性增加(表21)。然而，在更高水平(8.5μM和12μM)的补充中，比细胞生长速率和总ADAMTS13蛋白收率减少，虽然培养上清液中ADAMTS13的比活性仍然较高。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括使用分批补料细胞培养，培养基包含浓度至少为或约为2μM，至少为或约为5μM，为或约为2μM至12μM，为或约为2μM至5μM，为或约为5μM至12μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM的锌或更高浓度的锌。在某些实施方案中，锌的浓度可以为至少约5μM至至少约12μM。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。
1.连续培养
有利地，本发明提供了在连续培养中表达具有高比活性的ADAMTS蛋白例如ADAMTS13的方法。此类方法允许在延长的时期中从单一培养物连续表达和纯化ADAMTS蛋白。具体地，发现高水平的ADAMTS13蛋白表达和比活性可在由本发明提供的条件(实施例3，参见表15实施例3)下在10L恒化反应器中维持至少53天。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了表达具有高度特异性的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)进行延长的时期的方法。在某些实施方案中，将培养维持至少为或约为7天，或至少为或约为14天、21天、28天或至少为或约为5周、6周、7周或至少为或约为2个月或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在此类实施方案的某些实施方案中，将总ADAMTS蛋白表达、活性或比活性的水平在培养物中维持延长的时期。在其它实施方案中，将比生长速率、细胞密度等在培养物中维持延长的时期。在某些实施方案中，培养基可以以例如根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度补充例如钙、锌或烟酰胺(维生素B3)中的至少一种。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少7天。在另一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少14天。在另一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少21天。在另一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少1个月。在另一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项 的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少2个月。在另一个实施方案中，连续细胞培养技术可用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多个月。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在某些实施方案中，ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)表达的方法可包括使用利用培养基的连续细胞培养，进行至少7天，所述培养基包含浓度至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，为或约为2μM至5μM的锌，为或约为3μM至5μM的锌，为或约为5μM至12μM的锌，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM的浓度或更高浓度的锌。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法在连续培养的条件下在包含至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在其它实施方案中，培养基可包含至少约3μM的锌。在另一个实施方案中，培养可包含至少约5μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为2μM至5μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为3μM至5μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为2μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为3μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为5μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基可 包含至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天或至少5周、6周、7周或至少2个月或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续培养条件下在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在其它实施方案中，培养基可包含至少约1.0mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含至少约1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为1.0mM至1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天或至少5周、6周、7周或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续 培养条件下在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在其它实施方案中，培养基可包含至少约5mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含至少约7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为2mg/L至7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为5mg/L至7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高的烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续培养条件下在补充有锌和钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可以为Var94至Var113(表7)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS 蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续培养条件下在补充有锌和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度为本文中描述的度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var114至Var133(表8)之一。在某些实施方案中，将培养物维持t至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续培养条件下在补充有钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var134至Var149(表9)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在连续培养条件下在补充有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.14至Var.93(表3至表6)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，以约0.5×106至4×107个细胞/ml的细胞密度维持培养物，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约1.0×107个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约4.0×106个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约4.0×106个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约2.0×106至约4.0×106，或约1.0×106至约2.5×106，或约1.5×106至约3.5×106，或任何其它相似的范围的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。维持细胞产生重组ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)时所处的细胞密度将依赖于用于蛋白质表达的培养条件和培养基。本领域技术人员将可容易地能够确定用于产生ADAMTS蛋白的细胞培养的最佳细胞密度。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天、或至少5周、6周、7周、或至少2个月、或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培 养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在其它实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许每天每升培养物产生至少为或约为500个单位的AMTS13活性(500U/L/D)，例如ETS-VWF73的活性单位，比活性至少为或约为500U/mg A13。另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为600U/L/D的ADAMTS13活性。另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为700U/L/D的ADAMTS13活性。另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为800U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为900U/L/D的ADAMTS13活性。另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1000U/L/D的ADAMTS13活性。另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1100U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1200U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1300U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1400U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1500U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为2000U/L/D的ADAMTS13活性。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在另一个实施方案中，所述方法允许具有高比活性的ADAMTS13蛋白延长表达，例如允许至少约600U/mg A13蛋白，或至少约700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000或更多U/mg A13蛋白的比活性的ADAMTS13蛋白表达，进行延长的时期。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用恒化细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用恒浊细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用灌注细胞培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
2.分批培养
在另一个方面，本发明提供了用于在分批培养中表达具有高比活性的ADAMTS蛋白例如ADAMTS13的方法。在某些实施方案中，培养基可以以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度补充有钙、锌或烟酰胺(维生素B3)的至少一种。在一个具体实施方案中，所述方法包括使用单批细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用分批补料细胞培养。在另一个实施方案中，所述方法包括使用重复分批细胞培养。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少7天。在另一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9) 的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少14天。在另一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少21天。在另一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少1个月。在另一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少2个月。在另一个实施方案中，可将分批补料或重复分批细胞培养技术用于在以根据Var.1至Var.149(表2至表9)的任一项的浓度包含锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，进行至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多个月。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在某些实施方案中，ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)表达的方法包括使用利用培养基的分批补料或重复分批细胞培养，进行7天，所述培养基包含浓度至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，为或约为2μM至5μM的锌，为或约为3μM至5μM的锌，为或约为5μM至12μM的锌，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其 它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在其它实施方案中，培养基可包含至少约1.0mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含至少约1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为1.0mM至1.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基可包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在其它实施方案中，培养基可包含至少约5mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含至少约7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为2mg/L至7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含为或约为5mg/L至7mg/L 的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基可包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在包含锌和钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可为Var.94至Var.113(表7)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在补充有锌和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为Var.114至Var.133(表8)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或 至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在补充有钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为Var.134至Var.149(表9)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，用于表达ADAMTS蛋白的方法包括在分批补料或重复分批培养的条件下在补充有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞，进行至少7天。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为Var.14至Var.93(表3至表6)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在 其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，以约0.5×106至4×107个细胞/ml的细胞密度维持培养物，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约1.0×107个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约4.0×106个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约1.0×106至约4.0×106个细胞/ml的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。在其它实施方案中，以约2.0×106至约4.0×106，或约1.0×106至约2.5×106，或约1.5×106至约3.5×106，或任何其它相似的范围的浓度维持细胞密度，进行延长的时期。维持细胞产生重组ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)时所处的细胞密度将依赖于用于蛋白质表达的培养条件和培养基。本领域技术人员将可容易地能够确定用于产生ADAMTS蛋白的细胞培养的最佳细胞密度。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在其它实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为500个单位的ADAMTS13活性/升培养物/天(500U/L/D)，例如FRETS-VWF73活性单位，比活性至少为或约为500U/mg A13。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为600U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为700U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为800U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13 表达的方法允许产生至少为或约为900U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1000U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1100U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1200U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1300U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1400U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为1500U/L/D的ADAMTS13活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13表达的方法允许产生至少为或约为2000U/L/D的ADAMTS13活性。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在另一个实施方案中，所述方法允许具有高比活性的ADAMTS13蛋白延长表达，例如允许至少约600U/mg A13蛋白，或至少约700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000或更多U/mg A13蛋白的比活性的ADAMTS13蛋白表达，进行延长的时期。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在某些实施方案中，可以以悬浮分批培养的方式进行培养。在其它实施方案中，可以以附着分批培养的方式进行培养。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
3.培养条件
令人惊讶的是，还已发现可通过细胞培养的温度和pH的小变化增加细胞活力和ADAMTS13活性。如图2中可看到的，当在低于约7.30的pH下培养具有编码ADAMTS13蛋白的核苷酸的细胞时，表达的ADAMTS13的比活性得到极大增强。温度(虽然在更小的程度上)也是在这些研究中贡献ADAMTS13比活性的因素。类似地，发现在约6.80至约7.3的pH下生长的培养物的上清液中的A13的容积生产率(通过FRETS-VWF73测量的)获得极大的增加(与在高于和低于该范围的pH相比较)。ADAMTS13的生产率也受到培养的温度影响。在生长在约34℃至约37℃的温度下的培养物中发现最大活性。
在其它实施方案中，ADAMTS蛋白表达的方法包括在将培养基的温度维持在约34℃至约37℃的温度下的步骤。在某些实施方案中，可将培养基维持在36.5℃或更低，36.0℃或更低，35.5℃或更低，或低于35.0℃的温度下。在具体实施方案中，将温度维持在约36℃的温度下。在具体实施方案中，将培养物维持在上述温度和pH范围的组合下，例如36.5℃或更低和例如7.15或更低的pH下。在优选实施方案中，将培养物维持在36.0℃的温度和7.10的pH下。
因此，在某些实施方案中，ADAMTS蛋白表达的方法包括在将培养基的pH维持在约6.8至约7.3的pH下的步骤。在某些实施方案中，pH可以为约7.0至约7.25或约7.05至约7.15。在某些实施方案中，可将pH维持在7.20或更低，7.15或更低，7.10或更低或7.05或更低的pH下。在一个具体的实施方案中，可将培养基的pH维持在约7.1的pH。
在一个实施方案中，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白的方法，所述方法包括在或约在34℃至约37℃的温度以及为或约为6.8至7.3的pH下培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞。在另一个实施方案中，培养基的温度可以为或约为35℃至约37℃并且pH可以为或约为6.8至7.3。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为35.5℃至约36.5℃并且pH可以为或约为6.8 至7.3。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为36℃并且pH可以为或约为6.8至7.3。在一个实施方案中，培养基可补充有锌。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有钙。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，培养基可补充有锌和钙。在一个实施方案中，锌和钙的浓度可以为Var.94至Var.113(表7表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有锌和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.114至Var.133(表8表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.134至Var.149(表9表)之一。在另一个实施方案中，培养基可浓缩有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.14至Var.93(表3至表6表)之一。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白的方法，所述方法包括在或约在34℃至约37℃的温度以及在或约在6.9至7.25的pH下培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为35℃至约37℃并且pH可以为或约为6.9至7.25。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为35.5℃至约36.5℃并且pH可以为或约为6.9至7.25。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为36℃并且pH可以为或约为6.9至7.25。在一个实施方案中，培养基可补充有锌。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有钙。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，培养基可补充有锌和钙。在一个实施方案中，锌和钙的浓度可以为Var.94至Var.113(表7表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有锌和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.114至Var.133(表8表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.134至Var.149(表9表)之 一。在另一个实施方案中，培养基可浓缩有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.14至Var.93(表3至表6表)之一。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白的方法，所述方法包括在或约在34℃至约37℃的温度以及为或约为7.0至7.20的pH下培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为35℃至约37℃并且pH可以为或约为7.0至7.20。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为35.5℃至约36.5℃并且pH可以为或约为7.0至7.20。在另一个实施方案中，培养物的温度可以为或约为36℃并且pH可以为或约为7.0至7.20。在一个实施方案中，培养基可补充有锌。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有钙。在另一个具体实施方案中，培养基可补充有烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，培养基可补充有锌和钙。在一个实施方案中，锌和钙的浓度可以为Var.94至Var.113(表7表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有锌和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.114至Var.133(表8表)之一。在另一个实施方案中，培养基可补充有钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.134至Var.149(表9表)之一。在另一个实施方案中，培养基可浓缩有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为Var.14至Var.93(表3至表6表)之一。
微阵列上细胞生长的概念最早由van Wezel(van Wezel AL.，Nature 1967Oct 7；216(5110):64-5)描述，其允许细胞附着在悬浮于生长培养基中的小固体颗粒表面上。此类方法提供了高表达-对-容积比，从而允许高效营养物利用。此外，为了在真核细胞系中表达分泌性蛋白质，增加的表面-对-容积比允许更高水平的分泌，从而允许在培养物的上清液中获得更高的蛋白质收率。最后，此类方法允许容易地放大真核表达培养。
可在细胞培养物生长过程中将表达ADAMTS蛋白的细胞与球状或多孔微载体结合。微载体可以是选自基于葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及Butler(1988.In:Spier&Griffiths，Animal cell Biotechnology 3:283-303)中描述的其它物质的微载体的微载体。因此，根据本发明的一个实施方案，在球状微载体上培养表达ADAMTS蛋白的细胞。根据本发明的另一个实施方案，在多孔微载体上培养表达ADAMTS蛋白的细胞。还可能将细胞在球状微载体上生长成生物质(biomass)，并且当它们达到最终发酵罐生物质并且在于多孔微阵体上产生表达的蛋白质之前传代培养所述细胞，或反之亦然。球状微载体是选自光滑表面例如CytodexTM1、CytodexTM2和CytodexTM3(GE Healthcare)以及大孔微载体例如CytoporeTM1、CytoporeTM2、CytolineTM1和CytolineTM2(GE Healthcare)的微载体。
IV.培养基
在一个方面，本发明提供了用于表达具有高比活性的ADAMTS蛋白的培养基。有利地，已发现，通过用不同成分例如锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的组合物补充培养基，所述培养基中培养的细胞中表达的ADAMTS(例如，ADAMTS13)酶的活性得到极大增加，同时酶以与在非补充培养基中培养的细胞同样高(如果不是更高的话)的水平表达。
制备无动物蛋白质且化学成分确定的培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217和第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。在一个实施方案中，用本文中描述的方法的培养基是无动物蛋白质或无寡肽培养基。在某些实施方案中，培养基可以是化学成分确定的。在某些实施方案中，培养基可以以约0.5mg/L至约10mg/L的浓度包含至少一种多胺。
因此，在一个实施方案中，提供了补充有额外的钙、锌和/或维生素B3的培养基。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在某些实施方案中，按照第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217和第2008/0009040和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文，为了所有目的将两者通过引用整体并入本文)中所教导的制备无动物蛋白质或无寡肽培养基，并且所述培养基补充有额外的钙、锌和/或维生素B3。在具体实施方案中，化学成分确定的培养基可与达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)相似，所述化学成分确定的培养基已补充了额外的钙、锌和/或维生素B3，以增加在于所述培养基中培养的细胞中表达的ADAMTS蛋白的比活性。在其它实施方案中，培养基不含动物成分。在另一个实施方案中，培养基包含蛋白质，例如来自血清例如胎牛血清的动物蛋白质。在另一个实施方案中，已向培养基中外源加入重组蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质来自经检验无病原体的动物。
在某些实施方案中，培养基以为或约为0.5mg/L至30mg/L的浓度包含至少一种多胺。在另一个实施方案中，培养基以为或约为0.5mg/L至10mg/L的浓度包含至少一种多胺。在一个实施方案中，培养基以为或约为2mg/L至8mg/L的浓度包含至少一种多胺。在某些实施方案中，所述多胺来自鸟氨酸、腐胺、精胺或亚精胺等。在优选实施方案中，所述多肽是腐胺。在具体实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至8mg/L的腐胺。
在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其包含至少为或约为2μM的锌。在另一个实施方案中，培养基包含至少为或约为5μM的锌。在一个实施方案中，培养基包含为或约为2μM至12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基包含为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，培养基可包含为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、 8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。
通常，可将任何锌盐用于补充本发明的培养基，可接受的盐的非限定性实例包括ZnSO4·7H2O、ZnSO3·2H2O、(C6H5O7)2Zn3·2H2O、ZnBr2、ZnBr2·2H2O、ZnCl2、Zn(NO3)2·6H2O、Zn(H2PO4)2·H2O、(C2H3O2)2Zn·2H2O等。在某些实施方案中，将锌的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。在其它实施方案中，可将含锌肽或蛋白质制剂例如胰岛素用于补充本发明提供的培养基。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其包含至少为或约为0.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基包含至少为或约为1.5mM的钙。在一个实施方案中，培养基包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙。在其它实施方案中，培养基可包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
通常，任何钙盐可用于补充本发明的培养基。可接受的盐的非限定性实例包括CaCl2、CaCl2、CaFPO3·2H2O、CaI2、CaBr2、(C2H3O2)2Ca、(CHO2)2Ca、(C6H7O6)2Ca、(C6H5O7)2Ca3·2H2O等。在某些实施方案中，将钙的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基包含至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，培养基包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，培养基可包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、 9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。
有利地，已发现通过用锌和烟酰胺(维生素B3)两者补充培养基，所述培养基中表达的ADAMTS13蛋白的比活性得到协同增加。因此，在一个实施方案中，本文中提供的用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基可补充有锌和钙。例如，培养基可以以表7中提供的水平，即以根据Var.94至Var.133的任一项的水平补充有锌和钙。
表7.用于表达ADAMTS13蛋白的补充有锌和钙的培养基的示例性实施方案。
*Var.＝变化
类似地，已发现通过用锌和烟酰胺(维生素B3)两者补充培养基，所述培养基中表达的ADAMTS13蛋白的比活性得到协同增加。例如，该效应可见于实施例2中(将表14的第11天与表13的第4和7天相 比较)。因此，在一个实施方案中，本文中提供的用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基可补充有锌和烟酰胺(维生素B3)。例如，培养基可以以表8中提供的水平，即以根据Var.114至Var.133的任一项的水平补充有锌和烟酰胺(维生素B3)。
表8.用于表达ADAMTS13蛋白的补充有锌和烟酰胺(维生素B3)的培养基的示例性实施方案。
Var.＝变化
有利地，已发现通过用烟酰胺和钙两者补充培养基，所述培养基中表达的ADAMTS13蛋白的比活性获得极大的增加。因此，在一个实施方案中，本文中提供的用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基可补充有烟酰胺(维生素B3)和钙。例如，培养基可以以表9中提供的水平，即以根据Var.134至Var.149的任一项的水平补充有烟酰胺(维生素B3)和钙。
表9.用于表达ADAMTS13蛋白的补充有烟酰胺(维生素B3)和钙的培养基的示例性实施方案。
Var.＝变化
在某些实施方案中，可以以液体或无水或粉末形式提供由本发明提供的培养基。可以以适合于单次使用的量预等分培养基，或以可用于超过一次细胞培养的更大的量提供培养基。通常，以无菌形式提供本发明的培养基。因此，本发明还提供了用于表达或产生ADAMTS13蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括适合用于表达具有高比活性的ADAMTS蛋白的培养基。
在一个方面，本发明提供了用于表达具有高比活性的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基。在一个实施方案中，培养基包含至少约2μM的锌。在另一个实施方案中，培养基包含约2μM至约12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基包含至少约5μM的锌。在一个实施方案中，培养基包含约5μM至约12μM的锌。在另一个实施方案中，培养基包含至少约0.5mM的钙。在另一个实施方案中，培养基包含约0.5mM至约1.5mM的钙。在一个实施方案中，培养基包含至少约2μM的锌和至少约0.5mM的钙。
在其它实施方案中，已发现烟酰胺(维生素B3)的添加还在细胞培 养物中增加ADAMTS蛋白的表达和比活性。在一个实施方案中，所述培养基还包含至少约2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，所述培养基还包含至少约7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在另一个实施方案中，培养基包含约2mg/L至约10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。
在某些实施方案中，培养基是无动物蛋白质培养基。在另一个实施方案中，培养基是化学成分确定的培养基。在某些实施方案中，培养基可包含一种或多种多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺，浓度为至少0.5mg/L。在具体实施方案中，培养基包含约2mg/L至约8mg/L的腐胺。
1.无蛋白质培养基
在某些方面，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源添加的蛋白质。“无蛋白质培养基”和相关术语是指不存在来自对于培养物中的细胞是外源的来源或除所述细胞外的来源的蛋白质的培养基，所述细胞在生长过程中天然流出蛋白质。在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源加入的蛋白质(即，无蛋白质)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，无蛋白质培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825和6,936,441美国专利、WO2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)中教导了示例性无蛋白质培养基。
在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，或为或约为5μM 至12μM的锌。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为0.5mM的钙，至少为或约为1.5mM的钙，或为或约为0.5至1.5mM的钙。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)，至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)，或为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无蛋白质培养基，其包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。
2.无寡肽培养基
在某些方面，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源添加的寡肽。在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源添加的寡肽(即，无寡肽)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，无寡肽培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825和 6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)中教导了示例性无寡肽培养基。
在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，所述培养基包含至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，或为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，所述培养基包含至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，所述培养基包含至少为或约为0.5mM的钙，至少为或约为1.5mM的钙，或为或约为0.5至1.5mM的钙。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，所述培养基包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，其包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)，至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)，或为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无寡肽培养基，其包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。
3.无血清培养基
在某些方面，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含血清。在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源添加的血清(即，无血清)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，无血清培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)中教导了示例性无血清培养基。
在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，所述培养基包含至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，或为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，所述培养基包含至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，其包含至少为或约为0.5mM的钙，至少为或约为1.5mM的钙，或为或约为0.5至1.5mM的钙。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，所述培养基包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，其包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)，至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)，或为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无血清培养基，其包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。
4.无动物蛋白质培养基
在某些方面，本发明提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含动物蛋白质。在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基，其不含外源添加的动物蛋白质或多肽(即，无动物蛋白质)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，无动物蛋白质培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)中教导了示例性无动物蛋白质培养基。
在一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，所述培养基包含至少为或约为2μM的锌，至少为或约为5μM的锌，为或约为2μM至12μM的锌，或为或约为5μM至12μM的锌。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，所述培养基包含至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，其包含至少为或约为0.5mM的钙，至少为或约为1.5mM的钙，或为或约为0.5至1.5mM的钙。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，所述培养基包含至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高浓度的钙。
在另一个实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，其包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)，至少为或约为7mg/L的烟酰胺(维生素B3)，或为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在其它实施方案中，提供了用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的无动物蛋白质培养基，其包含至少为或约为3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。
V.ADAMTS蛋白的纯化
ADAMTS13在体内被分泌进入血浆，在所述血浆中其通过切割用于vWF的大多聚体来调节凝血活性。可在于细胞培养中产生和纯化ADAMTS13组合物的过程中，利用哺乳动物细胞在表达后分泌ADAMTS13的能力。例如，通过在哺乳动物细胞培养中表达重组ADAMTS13，可容易地直接从培养物上清液回收ADAMTS13组合物而无需收获和裂解细胞。这允许使用技术例如连续细胞培养(例如，灌注或恒化细胞培养)来产生大量蛋白质而无多个培养延迟和恢复期。在本发明的一个方面，提供了用于从细胞培养物纯化具有高比活性的ADAMTS蛋白的方法。
因此，在一个实施方案中，在培养中表达ADAMTS13蛋白，直 接从培养上清液回收所述蛋白质。就这样，通过取出一部分培养物并且将ADAMTS13从上清液的其它成分纯化出而回收ADAMTS13蛋白。通常，这包括通过过滤或离心分离与上清液一起回收的细胞，以及将上清液经历一个或多个ADAMTS13纯化步骤。
第2005/0266528号美国专利申请公布和Zheng等人(2001，Blood，98:1662-1666)(为了所有目的将所述专利申请公布和文献的公开内容通过引用整体并入本文)提供了用于纯化ADAMTS13的示例性方法。可按照常规方法配制纯化的ADAMTS13，将其治疗性用于例如治疗TTP。
在一个方面，本发明提供了产生ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的方法。在第一实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在无动物蛋白质培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞；(b)从培养物中取出一部分上清液；(c)进行过滤或离心步骤以除去任何残留的细胞；(d)进行超滤步骤以浓缩ADAMTS蛋白；和(e)利用包含至少约0.5μM的锌以及至少约0.1mM的钙的缓冲液进行渗滤步骤；由此制备ADAMTS组合物。
在某些实施方案中，培养细胞的步骤包括分批细胞培养。在其它实施方案中，培养细胞的步骤包括连续细胞培养。
在某些实施方案中，培养基包含钙。在具体实施方案中，培养基包含至少0.5mM的钙。在其它实施方案中，培养基包含锌。在具体实施方案中，培养基包含至少2μM的锌。在其它实施方案中，培养基包含烟酰胺(维生素B3)。在具体实施方案中，培养基包含至少2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，渗滤缓冲液包含至少约5μM的锌以及至少约2mM的钙。
在某些实施方案中，低于约20％的ADAMTS13比活性在步骤(c)结束至步骤(e)结束之间损失。在其它实施方案中，低于约10％的ADAMTS13比活性在步骤(c)结束至步骤(e)结束之间损失。在其它实 施方案中，ADAMTS13组合物具有至少约为1000U/mg的比活性。在另一个实施方案中，ADAMTS13组合物具有至少约为1500U/mg的比活性。
A.缓冲液更换
通常，当从培养上清液纯化分泌型蛋白质时，纯化方法的第一步骤包括用缓冲液更换培养基，这有利于目的蛋白质的进一步纯化。存在用于用缓冲液更换培养基的几种选择，包括但不限于渗滤、透析、缓冲液更换技术、凝胶过滤、层析等。
发现，ADAMTS13蛋白组合物在需要引入新的缓冲液的此类纯化步骤(例如，渗滤、透析、缓冲液更换、层析及类似步骤)中损失了大部分它们的比活性，无论从培养物收获上清液与纯化步骤之间的时间长度如何。然而，有利地，本发明人发现通过在待引入系统的缓冲液中包含锌和钙，例如在渗滤、透析、缓冲液更换、凝胶过虑和层析步骤中，ADAMTS13组合物的高比活性得到保持。作为该发现的证据，实施例6证明利用不存在钙和锌的缓冲液渗滤ADAMTS13组合物导致几乎25％的组合物的比活性的平均损失，然而钙和锌的包含几乎完全阻止该损失(表22)。因此，本发明提供了通过在缓冲系统中包含锌和钙来减少渗滤(或类似方法，例如，渗析、缓冲液交换、层析)后ADAMTS蛋白组合物的活性的损失的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞；(b)回收一部分包含ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基上清液；和(c)用包含锌和钙的缓冲液更换培养基，从而制备ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物。在一个实施方案中，培养基包含锌、钙和任选地烟酰胺(维生素B3)。在优选实施方案中，培养细胞的步骤包括连续培养(例如，灌注和恒化培养)。在另一个优选实施方案中，将培 养物维持在34℃至37℃的温度下。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在6.9至7.2的pH下。
在一个具体的实施方案中，用缓冲液更换培养基上清液的步骤包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可以为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可以为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。通常，上述浓度的任何组合适合用于本方法。
在一个实施方案中，提供了通过用包含钙和锌的缓冲液进行缓冲液更换(例如，渗滤、透析、凝胶过滤等)来进行ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13)的缓冲液更换的方法。在一个具体的实施方案中，所述方法包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为1mM的钙以及至少为或约为1μM的锌。在一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为2μM的锌。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在其它实施方案中，缓冲液包含0.5mM至5mM的钙以及0.5μM至5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可以为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可以为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。在某些实施方案中，收获物，无细胞上清液或渗滤缓冲液包含以上述浓度存在的钙和锌的组合。
在另一个实施方案中，提供了用于在细胞培养中表达后稳定ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的酶促活性的方法，所述方法包括用钙和锌补充含细胞的收获物、无细胞上清液或用于浓缩或更换 ADAMTS溶液的缓冲液的渗滤缓冲液。在一个具体的实施方案中，所述方法包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，所述缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可以为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可以为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。在某些实施方案中，收获物，无细胞上清液或渗滤缓冲液包含以上述浓度存在的钙和锌的组合。
在其它实施方案中，本文中提供的方法导致低于15％的存在于任何单个步骤中的比活性的损失。在优选实施方案中，本文中提供的方法导致低于10％的存在于任何单个步骤中的比活性的损失。在具体实施方案中，低于15％的存在于回收的培养上清液中的比活性在单个缓冲液更换步骤(例如，渗滤或透析)中损失。在优选实施方案中，低于10％的存在于回收的培养上清液中的比活性在初始缓冲液更换步骤(例如，渗滤或透析)中损失。
B.层析
在某些实施方案中，通过一个或多个层析步骤进一步富集ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物。在一个实施方案中，提供了用于提供富集的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞；(b)回收一部分包含ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基上清液；(c)用包含锌和钙的缓冲液更换培养基上清液，以形成第一ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物；和(d)利用层析步骤进一步富集ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)，由此提供富集的ADAMTS(例如，ADAMTS13)组合物。在一个实施方案中，培养基包含锌、钙和任选地烟酰胺(维生素B3)。在优选实施方案中，培养细胞的步骤包括连续培养(例如，灌注或恒 化培养)。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在34℃至37℃的温度下。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在6.9至7.2的pH下。
在一个具体的实施方案中，用缓冲液更换培养基上清液的步骤和/或层析步骤包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在优选实施方案中，两个步骤都包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。通常，上述浓度的任何组合适合用于本方法。
在一个实施方案中，提供了通过用锌和钙补充用于层析步骤的缓冲液来在层析步骤中维持ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物的比活性的方法。在一个具体的实施方案中，所述方法包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。通常，上述浓度的任何组合适合用于本方法。
可用于纯化ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的层析技术的非限定性实例包括阴离子交换层析(AEC)、阳离子交换层析(CEC)、疏水交换层析(HIC)、羟磷灰石层析(HAP)、免疫亲和层析、大小排阻层析(即，凝胶过滤)戒其它适当的层析步骤。可以以批量或柱子模式进行层析步骤。在某些实施方案中，用于进行此类层析技术 的任何技术的缓冲液包含锌和钙。在一个具体的实施方案中，所述方法包括使用包含至少为或约为0.5mM的钙以及至少为或约为0.5μM的锌的缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液包含至少为或约为2mM的钙以及至少为或约为5μM的锌。在某些实施方案中，钙的浓度可为至少约0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM或更高浓度的钙。在某些实施方案中，锌的浓度可为至少约0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM或更高浓度的锌。通常，上述浓度的任何组合适合用于本方法。
任何适当的阴离子交换树脂可用于本文中提供的方法。适合使用的阴离子交换树脂的非限定性实例包括二乙氨基乙酯(DEAE)、季铵基乙基(QAE)和季铵(Q)树脂。
任何适当的阳离子交换树脂可用于本文中提供的方法。适合使用的阳离子交换树脂的非限定性实例包括羧甲基(CM)、磺丙基(SP)、磺酸甲酯(S)树脂。
任何适当的羟基磷灰石或基他基于钙的树脂可用于本文中提供的方法。适当的树脂的非限定性实例包括羟基磷灰石树脂、氟磷灰石树脂、氟磷灰石树脂等。
任何适当的疏水作用层析树脂可用于本文中提供的方法。适当的树脂的非限定性实例包括苯基-树脂、甲基-树脂、丁基-树脂、辛基-树脂等。
在某些实施方案中，ADAMTS13蛋白(例如，ADAMTS13)可通过例如利用缀合有抗体、适体或对ADAMTS13蛋白(例如，ADAMTS13)高度特异的其它结合分子的树脂进行免疫亲和层析来进一步富集。
在一个实施方案中，减少ADAMTS活性的损失的方法在任何单个步骤(包括但不限于缓冲液更换、渗滤、透析、凝胶过滤、离子交 换层析、亲和层析、纳米过滤、超滤、无菌过滤等)中导致低于20％的净损失。在其它实施方案中，本文中提供的方法导致低于15％的存在于任何单个步骤中的比活性的损失。在优选实施方案中，本文中提供的方法导致低于10％的存在于任何单个步骤中的比活性的损失。在具体实施方案中，低于15％的存在于回收的培养上清液中的比活性在初始缓冲液更换步骤(例如，渗滤或透析)中损失。在优选实施方案中，低于10％的存在于回收的培养上清液中的比活性在初始缓冲液更换步骤(例如，渗滤或透析)中损失。
C.病毒灭活和/或去除
在某些实施方案中，本文中提供的用于制备ADAMTS(例如，ADAMTS13)组合物的方法还包括至少一个病毒灭活或去除步骤。在某些实施方案中，本文中提供的方法可包括至少两个或至少三个病毒灭活或去除步骤。可与本文中提供的方法一起使用的病毒灭活或去除步骤的非限定性实例包括溶剂去垢剂处理(Horowitz等人，Blood Coagul Fibrinolysis1994(5Suppl 3):S21-S28和Kreil等人，Transfusion2003(43):1023-1028，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)、纳米过滤(Hamamoto等人，VoxSang1989(56)230-236和Yuasa等人，J Gen Virol.1991(72(pt 8)):2021-2024，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)。在优选实施方案中，本发明提供了用于制备ADAMTS(例如，ADAMTS13)组合物的方法，所述方法包括溶剂去垢剂处理和纳米过滤。
在一个实施方案中，提供了用于提供病毒上安全的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞；(b)回收一部分包含ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的培养基上清液；(c)用包含锌和钙的缓冲液更换培养基上清液，以形成第一ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物；(d)任选地还利用层析 步骤富集ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)；和(e)进行至少一个病毒灭活或去除步骤，由此提供病毒上安全的ADAMTS(例如，ADAMTS13)组合物。在一个实施方案中，培养基包含锌、钙和任选地烟酰胺(维生素B3)。在优选实施方案中，培养细胞的步骤包括连续培养(例如，灌注或恒化培养)。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在34℃至37℃的温度下。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在6.9至7.2的pH下。在一个实施方案中，病毒去除步骤是纳米过滤。
1.溶剂和去垢剂(S/D)处理
为了灭活可存在于ADAMTS培养物中的不同病毒污染物，一种或多种ADAMTS(例如，ADAMTS13)中间溶液可经历溶剂去垢剂(S/D)处理。用于溶液的去垢剂处理的方法在本领域是公知的(关于综述参见，Pelletier JP等人，Best Pract Res Clin Haematol.2006；19(1):205-42，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)。通常，可将任何标准S/D处理与本文中提供的方法结合使用。例如，下面提供用于S/D处理的示例性方法。
在一个实施方案中，将Triton X-100、Tween-20和三(正-丁基)磷酸酯(TNBP)以分别为或约为1.0％、0.3％和0.3％的终浓度加入ADAMTS(例如，ADAMTS13)中间溶液。随后在或约在18℃至25℃的温度下搅拌混合物，进行至少约1小时。
2.纳米过滤和超滤/渗滤
为了减少本文中提供的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)组合物的病毒载量，可使用适当的纳米过滤设备对组合物进行纳米过滤。在某些实施方案中，纳米过滤设备可具有为或约为15nm至200nm的平均孔径。适合用于该用途的纳米过滤的实例包括但不限于DVD、DV50、DV 20(Pall)、ViresolveViresolve(Millipore)、 15N、20N、35N和75N(Planova)。在具体实施方案中，纳 米过滤可具有为或约为15至72nm，或为或约为19至35nm，或为或约为15nm、19nm、20nm、35nm或72nm的平均孔径。在优选实施方案中，纳米过滤可具有为或约为19nm、20nm或35nm的平均孔径，例如Asahi20N或35N滤器或其等同物。
在纳米过滤后，可任选地利用超滤和/或通过渗滤调整的缓冲液组合物浓缩滤液。在某些实施方案中，利用开放通道筛选(open channel screen)在盒(cassette)中进行超滤，并且超滤膜具有小于为或约为175kDa或小于为或约为170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30或更小的kDa的公称截留分子量(NMWCO)。在优选实施方案中，超滤膜具有不超过30kDa的NMWCO。在另一个优选实施方案中，超滤膜具有不超过30kDa的NMWCO。
3.冻干法和热处理
在其它实施方案中，可通过热处理冻干的组合物来进一步减小先前可能已经历其它病毒灭活或去除步骤例如纳米过滤的冻干的ADAMTS13蛋白(例如，ADAMTS13)的病毒活性。用于灭活血液因子中的病毒载量的热处理在本领域是公知的(例如，参见，Piszkiewicz等人，Thromb Res.1987Jul 15；47(2):235-41；Piszkiewicz等人，Curr Stud HematolBlood Transfus.1989；(56):44-54；Epstein和Fricke，Arch Pathol Lab Med.1990Mar；114(3):335-40)。
VI.ADAMTS组合物
有利地，已发现在补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的细胞培养物中表达的ADAMTS蛋白例如ADAMTS13具有预料之外的高比活性。如本文中所提供的，已开发了用于此类具有高比活性的ADAMTS蛋白的连续表达和回收的方法。例如，本文中提供的连续细胞培养法允许表达超过1mg ADAMTS13/升/天(大于1000U/mg的比活性)，进行1周或更长时间。类似地，本文中还提供了用于减少通常在ADAMTS13蛋白的纯化过程中遭遇的活性损失的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了根据本文中提供的方法在细胞培养物中表达的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)。例如，提供了ADAMTS蛋白组合物，其中通过在补充有至少一种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来表达所述蛋白。还提供了根据本文中提供的方法纯化的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)。例如，提供了已根据本发明的方法纯化的ADAMTS蛋白组合物，所述方法包括缓冲液更换步骤，其中所述更换缓冲液包含锌和钙。在本发明的优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白组合物为ADAMTS13组合物。
在另一个方面，本发明提供了通过下述方法制备的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)，所述方法包括根据本文中提供的任何方法在细胞培养物中表达ADAMTS蛋白。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在相关方面，本发明提供了通过下述方法制备的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)，所述方法包括在从培养基纯化ADAMTS蛋白的过程中在至少一种缓冲液中包含锌和钙两者。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
本发明提供了通过本文中提供的方法制备的ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)。在一个实施方案中，通过在补充有至少两种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来制备所述ADAMTS组合物(例如，ADAMTS13组合物)。在具体实施方案中，通过在补充有至少两种选自钙、锌和烟酰胺(维生素B3)的成分的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来制备ADAMTS组合物。在另一个实施方案中，培养基补充有钙、锌和烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质、无寡肽或化学成分确定的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)可通过在包含至少为或约为2μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来制备。在另一个实施方案中，所述组合物可通过在包含至少为或约为5μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来制备。在一个实施方案中，所述组合物通过在包含为或约为2μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来制备。在另一个实施方案中，所述组合物通过在包含为或约为5μM至12μM的锌的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备。在其它实施方案中，所述组合物通过在培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备，所述培养基包含至少为或约为2μM，或至少为或约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM或更高浓度的锌。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在另一个实施方案中，将培养物pH维持在或约6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在另一个实施方案中，在以悬浮模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞为哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可 以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)的一个实施方案中，可用终浓度为至少约2μM至至少约12μM的锌补充用于表达ADAMTS蛋白的培养基。在某些实施方案中，可以以至少约为2μM，或至少约为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM的终浓度的锌或更高水平的锌补充培养基。通常，可将任何锌盐用于补充本发明的培养基，可接受的盐的非限定性实例包括ZnSO4·7H2O、ZnSO3·2H2O、(C6H5O7)2Zn3·2H2O、ZnBr2、ZnBr2·2H2O、ZnCl2、Zn(NO3)2·6H2O、Zn(H2PO4)2·H2O、(C2H3O2)2Zn·2H2O等。在某些实施方案中，将锌的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在另一个实施方案中，ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)通过在包含至少为或约为0.5mM的钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来进行制备。在另一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在包含至少为或约为1.5mM的钙的培养基中培养培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备。在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在包含为或约为0.5mM至1.5mM的钙的培养基中培养培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备。在其它实施方案中，ADAMTS组合物通过在培养基中培养培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备，所述培养基包含至少为或约为0.5mM，或至少为或约为0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM或更高 浓度的钙。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在另一个实施方案中，将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在另一个实施方案中，在分批培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
通常，任何钙盐可用于补充本发明的培养基。可接受的盐的非限定性实例包括CaCl2、CaCl2、CaFPO3·2H2O、CaI2、CaBr2、(C2H3O2)2Ca、(CHO2)2Ca、(C6H7O6)2Ca、(C6H5O7)2Ca3·2H2O等。在某些实施方案中，将钙的药学上可接受的盐用于补充本发明的培养基。
在另一个实施方案中，ADAMTS蛋白组合物(例如，ADAMTS13组合物)通过在包含至少为或约为2mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞来进行制备。在另一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在包含至少为或约为7mg/L的 烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备。在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在包含为或约为2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备。在其它实施方案中，ADAMTS组合物通过在培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白的核酸的哺乳动物细胞来进行制备，所述培养基包含至少为或约为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L或更高浓度的烟酰胺(维生素B3)。在一个实施方案中，将培养物维持在或约在35℃至37℃。在具体实施方案中，将培养物维持在或约在36℃。在另一个实施方案中，将培养物的pH维持在或约在6.9至7.3。在一个实施方案中，将培养物的温度和/或pH维持至少7天。在一个实施方案中，在连续培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的恒化、恒浊或灌注培养条件下进行所述方法。在另一个实施方案中，在分批培养条件下进行所述方法。在具体实施方案中，在以悬浮模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在其它具体实施方案中，在以附着模式运行的单批、重复分批或分批补料培养条件下进行所述方法。在一个实施方案中，具有编码ADAMTS蛋白的核酸的细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞系、HEK 293细胞系或BHK细胞系。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在无动物蛋白质和/或无多肽培养基中。在另一个实施方案中，将哺乳动物细胞培养在合成培养基中，所述培养基可以不含或可以包含动物蛋白质和多肽。在一个实施方案中，所述培养基还包含为或约为0.5mg/L至30mg/L的多胺。在另一个实施方案中，所述培养基还为或约为2mg/L至8mg/L的多胺。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在补充有锌和钙的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来进行制备。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和钙的浓度可为Var.94至Var.113(表7)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个实施方案中，所述培养是灌注培养。在另一个实施方案中，所述培养是恒化培养。在其它实施方案中，所述培养是分批补料或重复分批培养。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在补充有锌和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来进行制备。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以是本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为Var.114至Var.133(表8)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个实施方案中，所述培养是灌注培养。在另一个实施方案中，所述培养是恒化培养。在其它实施方案中，所述培养是分批补料或重复分批培养。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在补充有钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来进行制备。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为变化Var.134至Var.149(表9)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少 14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个实施方案中，所述培养是灌注培养。在另一个实施方案中，所述培养是恒化培养。在其它实施方案中，所述培养是分批补料或重复分批培养。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在一个实施方案中，ADAMTS组合物通过在补充有锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的培养基中培养具有编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核酸的细胞来进行制备。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可以为本文中描述的浓度的任何浓度。在某些实施方案中，锌、钙和烟酰胺(维生素B3)的浓度可为变化Var.14至Var.93(表3至表6)之一。在某些实施方案中，将培养物维持至少7天，或至少14天、21天、28天，或至少5周、6周、7周，或至少2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。在一个实施方案中，所述培养是灌注培养。在另一个实施方案中，所述培养是恒化培养。在其它实施方案中，所述培养是分批补料或重复分批培养。在优选实施方案中，所述ADAMTS蛋白为ADAMTS13。
在另一个实施方案中，提供了具有高比活性，例如至少600U/mg A13蛋白的比活性的ADAMTS13组合物。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少700U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少800U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少900U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1000U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1100U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1200U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1300U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1400U/mg的比活性。在另一 个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1500U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1600U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1700U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1800U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少1900U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2000U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2100U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2200U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2300U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2400U/mg的比活性。在另一个实施方案中，所述ADAMTS13组合物具有至少2500U/mg的比活性。
VII.实施例
实施例1
通过在化学成分确定的BACD-A13培养基中对表达人ADAMTS13的重组HEK293细胞系1020/1013-2使用生物反应器培养来进行分批补料实验。观察用额外的锌补充培养基的效应。
在1.5L具有叶片式叶轮的生物反应器中，于在线控制的7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下通过分批补料细胞培养方式来培养表达人ADAMTS13的重组HEK293细胞。将细胞悬浮物转移至2个相同的装有基于DMEM/F12的化学成分确定的培养基(BACD-A13；表12)的生物反应器中。将两个培养物在利用0.432mg/L ZnSO4·7H2O(如在DMEM/F12中)制备的或通过额外补充1mg/L ZnSO4·7H2O(以1.432mg/L的终浓度)制备的BACD-A13培养基中进行生长。或者同样地处理两个分批补料培养，从而可直接将它们相互比 较。
在离心或过滤上清液以除去残留细胞后利用FRETS-VWF73测定法测量培养上清液中A13的活性。使用A13-特异性抗体(表10)，通过ELISA测量A13的总量。来自利用BACD-A13培养基(具有标准DMEM/F12锌浓度)的培养物的上清液在第3天和第6天分别具有728mU/mL和826mU/mL的A13活性。培养物的比活性分别为482mU/μg和526mU/μg A13。相反地，来自额外补充有Zn的培养物的上清液(尽管只具有略微提高的A13表达的收率(在第3和6天分别地高出7％和19％))显示了显著提高的总A13活性和比活性A13活性(表11)。如可通过比较表10与表11的结果看见的，与在0.432mg/L ZnSO4·7H2O下生长的培养物相比较，在1.432mg/LZnSO4·7H2O下生长的培养物的总A13FRETS-VWF73活性在第3天高出118％(1589对728)以及在第6天高出61％(1381对728)。类似地，补充的培养物中A13蛋白的比活性在第3天高出104％(981对482mU/μg)以及在第6天高出42％(739对526mU/μg)。
从生物反应器取出样品，通过ELISA分析其A13，利用FRETS-VWF73测定法测量A13的活性。利用Nucleocounter技术测定细胞计数。测量稀释速率，将其用于计算生长速率和容积生产率。
表10.在具有无锌补充的BACD-A13培养基的1.5L生物反应器中进行的分批补料培养1的发酵数据
表1.在具有补充有锌的BACD-A13培养基的1.5L生物反应器中进行的分批补料实验的发酵数据
表12.化学成分确定的BACD-A13细胞培养基的组成
实施例2
通过在化学成分确定的BACD-A13培养基中对表达人ADAMTS13的重组CHO细胞系#938使用生物反应器培养来进行分批补料实验。观察用额外的锌和/或维生素B3补充培养基的效应。
使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的 BCS培养基(BCS培养基)。解冻来自Development Working Cell Bank#01(DWCB#01)的克隆#938，在BCS培养基中制备细胞接种物。将细胞转移至两个具有叶片式叶轮的1.5L生物反应器中，在具有在线控制的7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度的具有专利权的BACD-A13培养基中在分批补料培养下生长所述细胞。将两个培养物在利用0.432mg/L ZnSO4·7H2O(如在DMEM/F12中)制备的或通过额外补充1mg/L ZnSO4·7H2O(以1.432mg/L的终浓度)制备的BACD-A13培养基中进行生长。或者相同地处理两个分批补料培养物，从而可将它们直接进行相互比较。在第4和7天收获上清液，测定A13蛋白和活性水平。在第7天收获后，以7.02mg/L的终浓度用额外的5mg/L的烟酰胺(维生素B3)补充两个培养物，将两个培养物在相同的条件下生长，进行另外4天。在第11天再次收获上清液，测定A13蛋白和活性水平。
在未补充锌的情况下生长的第一培养物中，收获的上清液中A13的活性水平在第4天和第7天分别为642和488mU/ml(表13)。这些上清液的比活性在第4天和第7天分别为371和273mU/μg。如先前在实施例1中看到的，补充有额外锌的培养上清液中A13的总活性和比活性得到显著增加(比较在表13的第4天和表14的第7天收获的情况)。如先前一样，在两个培养物中产生的总A13相似，然而，来自补充有额外的锌的第二培养物的上清液的A13在第4天和第7天分别具有高出40％和104％的总活性，以及在第4天和第7天分别具有高出78％和75％的比活性(表14对表13)。其他参数，包括总A13收率和细胞生长速率似乎不受额外的锌补充影响。
在于第7天收获上清液后，再用额外的5mg/L的烟酰胺(维生素B3)补充两个培养物，将其在相同的条件下再生长另外4天。如先前一样在第11天收获上清液。维生素B3的补充导致在两种培养物的上清液中发现的A13的总FRETS-VWF73活性和比活性的增加(
表表13和表14，第11天)。值得注意地，这些值在两个培养物 中几乎加倍。在第11天，来自补充有额外的锌和维生素B3的培养物2的上清液与从培养物1收获的上清液显示的相比较，显示几乎高出200％(2366对791mU/mL)的总活性和高出174％(1189对432mU/μg)的比活性。
单独用烟酰胺补充培养基导致约60％的A13的总活性(791mU/ml对488mU/ml；比较表13的第7天和11天)和比活性(432mU/μg对273mU/μg；比较表13的第7天和11天)的增加。类似地，单独用锌补充培养基导致约70％至80％的A13的总活性和比活性的增加(比较表13和表14的第4和7天)。令人惊讶地，利用烟酰胺和锌一起补充培养基导致约300％至400％的A13的总活性(将表14的第11天与表13的第4和7天相比较)和约200％至300％的比活性(将表14的第11天与表13的第4和7天相比较)的协同增加，从而显示锌与烟酰胺的效应之间的预料之外的协同相互作用。
表13.分批实验CP_07/18_M04:hA13CHO Klon#985/1938DWCB#01的发酵数据
*BAV-CD-A13；0.432mg/L ZnSO4·7H2O；2mg/L烟酰胺
BAV-CD-A13；0.432mg/L ZnSO4·7H2O；7mg/L烟酰胺
表14.分批实验CP_07/18_M07:hA13CHO Klon#985/1985DWCB#01的发酵数据
*BAV-CD-A13；1.432mg/L ZnSO4·7H2O；2mg/L烟酰胺
BAV-CD-A13；1.432mg/L ZnSO4·7H2O；7mg/L烟酰胺
实施例3
将表达人ADAMTS13的重组CHO细胞系#640-2的恒化细胞培养物生长在补充有额外锌和维生素B3的化学成分确定的BACD-A13培养基中。将10L培养物维持53天，并且随时间过去监控A13蛋白和活性的产生。
使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的专利培养基(BCS培养基)。将细胞库小瓶解冻，在BCS培养基中制备细胞接种物。将从A13表达克隆#640-2繁殖的细胞转移至具有Rushton型叶轮的10L生物反应器中，利用具有专利权的BACD-A13培养基，于在线控制的7.15-7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下以重复分批培养方式培养所述细胞。将2个分批培养物生长至10L的终工作体积，在第5天将生物反应器转换成连续培养基进料，以恒化模式运行另外48天。
每周一次从生物反应器取出上清液的样品，利用ELISA分析其A13蛋白的产量，利用FRETS-VWF73测定法测定A13的活性。利用Nucleocounter技术测定细胞计数。测量稀释速率，将其用于计算生长速率和容积生产率。
在连续培养条件下，通过使用以1.432mg/L ZnSO4·7H2O和 7.02mg/L烟酰胺的终浓度补充有锌和烟酰胺的化学成分确定的BACD-A13培养基，获得了0.9至1.3mg/L/D的高水平A13蛋白产量和约800至1100mU/μgA13的比活性(表15)。这些结果与利用CHO克隆#938获得的蛋白质产量和比活性一致，如实施例2中一样。值得注意地，容积和细胞比生产率在长期培养中随时间过去增加，可能归因于随时间过去不断增加的生长和稀释速率。可将所表达的A13的高比活性在至少整个7周中维持在恒定的高水平上，将培养物在恒化条件下生长。事实上，培养物中产生的A13的比活性实际上从第2周的约800mU/μgA13增加至第7周的约1100mU/μgA13。
表15.连续培养实验CP_07/30_F02:hA13CHO Klon#987/1640-2的发酵数据
实施例4
通过在化学成分确定的BACD-A13培养基中对表达人ADAMTS13的重组CHO细胞系#640-2使用生物反应器培养来进行分批补料和恒化细胞培养实验。观察利用不同水平的锌补充培养基的效应。
在分批补料模式中，使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的具有专利权的培养基(BCS培养基)。简而言之，将 DWCB#05解冻，在BCS培养基中制备细胞接种物。将细胞转移至具有叶片式叶轮的1.5L生物反应器中和以7mg/L的终浓度补充有烟酰胺但无锌补充的具有专利权的BACD-A13培养基中(于在线控制的7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下)。随后将分批细胞悬浮物分入3个相同的装有补充有终浓度为7mg/L的烟酰胺和不同Zn补充(0mg/L；0.5mg/L；和1.0mg/L ZnSO4·7H2O，至0.432mg/L；0.932mg/L和1.432mg/L ZnSO4·7H2O的终浓度)的BACD-A13培养基的生物反应器。
BACD-A13培养基包含0.432mg/L ZnSO4·7H2O，具有或不具有额外的锌补充。另外，培养物和培养基相同，从而可直接相互比较。以分批补料方式生长培养物，进行约1周，测定上清液的A13蛋白产量和FRETS-VWF73活性。随后将所有3个生物反应器转换成恒化培养模式，在连续培养条件下，使用具有不同锌补充的培养基运行约2周，如上文中所描述的。
在分批补料培养条件下，与实施例1和2中看到的结果一致，用0.5mg/L或1.0mg/LZnSO4·7H2O补充培养基与未补充额外的锌(437mU/μg)的培养基相比较显著增加了上清液中A13蛋白的比活性(分别地，785mU/μg和876mU/μg)(表16)。与先前一样，其他参数，包括总A13蛋白产量和比细胞生长，不受额外的锌补充影响。
表16.具有和不具有额外的锌补充的培养基中人A13表达的分批补料实验的发酵数据
在将生物反应器转换成恒化模式后，如上文中所述，使用具有不同锌补充的培养基，在连续培养条件下生长培养物，进行约1周(第2周)。每周一次从生物反应器取出上清液的样品，利用ELISA分析A13蛋白产量，利用FRETS-VWF73测定法测定A13活性。与对于在分批补料模式下生长的培养物看到的结果相似，利用额外的锌补充用于连续培养生长的生长培养基在1周后导致与无补充(553mU/μg)相比较，A13比活性(对于0.5mg/L和1.0mg/LZnSO4·7H2O补充，分别地697mU/μg和729mU/μg)的显著提高(表17、表18和表19)。
先前已看到在连续细胞培养中表达的A13的比活性实际上随着延长的时期过去得到提高(参见，实施例3)。为了研究该结果是否可重复，将生长在补充有额外的锌的培养基中的培养物继续再培养一周。如表18和表19中看到的，两个培养物的上清液中A13的比活性再次随时间过去而增加。补充有0.5mg/L ZnSO4·7H2O的培养基的上清液中发现的A13的比活性从第2周的697mU/mg增加至第3周的759mU/mg(表18)。类似地，补充有1.0mg/L ZnSO4·7H2O的培养基的上清液中发现的A13的比活性从第2周的729mU/mg增加至第3周的812mU/mg(表19)。与先前一样，比细胞生长不受额外的锌补充影响。然而，值得注意地，与未补充锌的培养物中的产量相比较，A13蛋白的产量在两个补充有额外的锌的培养物中似乎增加。
表2.在额外的锌补充不存在的情况下恒化细胞培养实验的发酵数据
表18.利用0.5mg/L的额外的锌补充的恒化细胞培养实验的发酵数据
表3.利用1.0mg/L的额外的锌补充的恒化细胞培养实验的发酵数据
实施例5
通过在化学成分确定的BACD-A13培养基中对表达人ADAMTS13的重组CHO细胞系#F6使用生物反应器培养来进行分批补料和恒化细胞培养实验。观察利用更高水平的锌补充培养基的效应。
在分批补料模式中，使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的具有专利权的培养基(BCS培养基)。亚克隆适应的群体，克隆#F6衍生自所述群体。
简而言之，将DWCB#19解冻，在BCS培养基中制备细胞接种物。将细胞转移至3个具有叶片式叶轮的1.5L生物反应器中和在用1.0mg/L、2.0mg/L和3.0mg/L ZnSO4·7H2O(分别地终浓度为1.432mg/L、2.432mg/L和3.432mg/L ZnSO4·7H2O)补充的具有专利权的BACD-A13培养基中。将培养物于在线控制的7.15的pH、36℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下进行生长。
以重复分批模式(3批)生长培养物进行约1周，测定上清液的A13 蛋白的产量和FRETS-VWF73活性。随后将所有3个生物反应器转换成恒化培养模式，如上文中所描述的，在连续培养条件下，使用具有不同锌补充的培养基运行约10天。
在分批补料培养条件下，用不断增加的量的锌补充培养基进一步增加在培养上清液中分泌的A13的比活性。与上文中报导的先前的结果一致，用额外的1.0mg/L ZnSO4·7H2O补充培养基导致806mU/μg的高比活性。锌浓度的进一步增加，即利用2.0mg/L和3.0mg/L的补充，导致更高水平的A13比活性(分别地880mU/μg和889mU/μg)(表20)。与先前一样，其他参数，包括总A13蛋白产量和比细胞生长，不受额外的锌补充影响。
表20.利用额外的锌补充的分批实验的发酵数据(3批的平均数据)
在将生物反应器转换成恒化模式后，如上文中所述，使用具有不同锌补充的培养基，在连续培养条件下生长培养物，进行10天。利用ELISA分析来自生物反应器的上清液的样品的A13蛋白产量，利用FRETS-VWF73测定法测定A13活性。与对于在分批补料模式下生长的培养物看到的结果不同，利用更高水平的锌补充用于连续培养生长的生长培养基导致比生长速率和总细胞活力的减小。在补充有额外1.0mg/L ZnSO4·7H2O的培养基中生长的恒化培养物继续展现高细胞活力(88.6％)和比生长速率(0.256/天)(表21)，与上述先前的结果一致。
相反地，生长在补充有更高水平的ZnSO4·7H2O(2.0mg/L和3.0mg/L)的培养基中的培养物展现细胞存活(分别地72.1％和80.4％)和比生长速率(分别地0.091和0.134/天)的水平的显著降低。然而，值得注意地，两个培养上清液中A13的比活性保持高水平(分别地863mU/μg和771mU/μg)(表21)。
表21.利用额外的锌补充的恒化细胞培养实验的发酵数据
实施例6
在50L生物反应器中，在补充有额外的锌和烟酰胺的化学成分确定的BACD-A13培养基中于重组CHO细胞系#640-2中表达人A13蛋白。在收获培养物的上清液后，比较使用具有和不具有锌和钙的缓冲液的超滤/渗滤(50kD)步骤。
使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的专利培养基(BCS培养基)。简而言之，将DWCB解冻，在BCS培养基中制备细胞接种物。将细胞经10L生物反应器转移至具有Rushton型叶轮的50L生物反应器中，并且于在线控制的7.15-7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下，以恒化模式在具有专利权的BACD-A13培养基中进行培养。
过滤来自生物反应器的上清液，使用50kD PES膜(浓集因素约1:10)超滤无细胞收获物，随后用5倍体积的含有50mM NaCl和20mMTRIS，pH 7.7的缓冲液进行渗滤。比较具有或不具有2mM Ca和5μM Zn的渗滤缓冲液以确定对渗滤与层析纯化之间活性损失的影响。
在渗滤后立即测定比活性(记录为通过ELISA检测的mU FRETS-VWF73/μgA13)，然后立即加载样品以进行进一步纯化。将样品在约2至8℃下贮存最多3天的时间(约少于80个小时)。当将样品贮存更长的时期时，可将它们在渗滤结束至层析开始前保持在-15℃以下。在渗滤后立即测量和比较样品，然后立即加载至层析柱上。
尽管超滤/渗滤步骤与额外的纯化步骤之间进行相对短的保持时间，但当渗滤缓冲液不存在锌和钙时，A13比活性的显著缺失(23.3％)发生。相反地，当使用包含2mM Ca和5μM Zn的渗滤缓冲液时，A13比活性的损失(7.3％)大大降低(表22)。
表22.使用具有和不具有钙和锌的渗滤缓冲液的渗滤实验的结果
实施例7
比较恒化与灌注连续细胞培养以测定在几种重组CHO细胞系中表达的A13的相对产量和比活性。
简而言之，使表达重组人A13的重组CHO细胞的不同克隆适应 用于接种物制备的化学成分确定的具有专利权的培养基(BCS)。将细胞在生物反应器培养中，在以1.432mg/LZnSO4·7H2O和7.02mg/L烟酰胺的终浓度补充了锌和烟酰胺的具有专利权的BACD-A13培养基中进一步培养。随后将来自每一个细胞克隆的接种物转移至两个生物反应器中，将其中一个在恒化条件(CST)下进行培养，而另一个在灌注条件下培养，如表23中显示的。在CytoporeTMII微载体(GE Biosciences)上以约2×106至4×106个细胞/ml的密度培养细胞。
在连续培养条件下生长培养物3至4周，利用ELISA定期分析来自生物反应器的上清液的样品的A13蛋白产量，利用FRETS-VWF73测定法测定A13活性。表23中给出的值代表3至4周时期的平均值。与在上面实施例1至6中获得的结果一致，在恒化条件下生长的培养物产生约1mg/L/d至约2mg/L/d的具有约700mU/μg至约1000mU/μg的高比活性的A13蛋白(表23)。令人惊讶地，生长在灌注培养条件下的培养物与生长在恒化条件下的相同克隆相比较恒定地显示更高的A13的蛋白质产量和活性水平。灌注培养物中产生的A13的比活性非常高，4个克隆中有3个显示至少约1000mU/μg。
表23.比较恒化与灌注细胞培养的实验的结果
实施例8
为了确定温度和pH对在使用化学成分确定的无动物蛋白质培养基的真核细胞培养中生长的重组人ADAMTS13蛋白的产量的影响，在35.0℃至38.0℃的温度、7.05至7.30的pH下生长培养物。
简而言之，将具有专利权的BACD-A13培养基中的表达人A13的重组CHO细胞转移至具有叶片式叶轮的1.5L生物反应器中。于在线控制的7.05至7.30的pH、35.0℃至38.0℃的温度和20％空气饱和度的溶解氧浓度下生长培养物。使用反应表面法设计和执行实验。使用统计分析软件包15.1.0.0进行统计分析。
从生物反应器获得样品，利用ELISA分析样品的A13，利用FRETS-VWF73测定法测量A13的活性。利用Nucleocounter技术测定细胞计数。测量稀释速率，将其用于计算生长速率和容积生长率。
如可在图1和2中看到的，温度和pH对容积A13生产率(通过FRETS-VWF73测量的，图1)以及比活性(通过ELISA测定的FRETS-VWF73活性/抗原，图2)具有重大影响。具体地，可在约7.05至7.2的更低的pH范围内(特别地约7.10)和在约35.0℃至37.0℃的温度(特别地约36℃)下生长的培养物中获得最大容积FRETS生产率。具体地，在于约7.05至7.2的更低的pH范围内(特别地低于约7.10)和在约35.0℃至37.0℃的温度(特别地低于约36℃)下生长的培养物中获得最大比活性(通过ELISA测定的FRETS-VWF73/抗原)。通过使用约36℃的温度与约7.10的pH的组合在最佳收率和产品质量方面获得用于A13生产的特别地最佳条件。
应理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的并且根据其的不同变动或变化对于本领域技术人员来说是显然的，并且包括在本申请的精神和权限内以及所附权利要求的范围内。为了所有目的将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
Claims (12)
1.一种用于提高从细胞培养物上清液中回收的人ADAMTS13活性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在无动物蛋白培养基中培养具有编码人ADAMTS13蛋白的核酸的细胞；
(b)从培养物中取出一部分上清液；
(c)进行过滤或离心步骤以除去从培养物中取出的一部分上清液中任何残留细胞，从而形成澄清上清液；
(d)进行超滤步骤以浓缩澄清上清液中的人ADAMTS13蛋白，从而形成浓缩上清液；和
(e)利用包含5μM的锌以及2mM的钙的缓冲液对浓缩上清液进行渗滤；从而制备具有回收的人ADAMTS活性提高的人ADAMTS13组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少3μM的锌和0.5mM的钙。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少5μM的锌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含5μM至12μM的锌。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少2mg/L的烟酰胺(维生素B3)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少7mg/L的烟酰胺(维生素B3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含2mg/L至10mg/L的烟酰胺(维生素B3)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)形成的组合物中ADAMTS13比活性大于步骤(c)形成的澄清上清液中ADAMTS13比活性的80％。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)形成的组合物中ADAMTS13比活性大于步骤(c)形成的澄清上清液中ADAMTS13比活性的85％。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)形成的组合物中ADAMTS13比活性大于步骤(c)形成的澄清上清液中ADAMTS13比活性的90％。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中培养细胞的步骤包括分批细胞培养。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中培养细胞的步骤包括连续细胞培养。
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