ES2583258T3 - Medio de cultivo celular para expresión de proteína ADAMTS - Google Patents

Abstract

Procedimiento para expresar una proteína desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS), comprendiendo el procedimiento cultivar una célula que alberga un ácido nucleico que codifica una proteína ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc a una concentración de entre 2 μM y 12 μM.

Description

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DESCRIPCION

Medio de cultivo celular para expresion de protema ADAMTS

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n. ° 61/230.477 presentada el 31 de julio de 2009.

Declaracion sobre los derechos a las invenciones realizadas segun la investigacion o desarrollo patrocinado federalmente

Antecedentes de la invencion

Las protemas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I) son una familia de metaloproteinasas que contienen diversos dominios conservados, incluyendo un dominio catalttico dependiente de cinc, un dominio rico en cistema, un dominio similar a desintegrina y al menos una repeticion de trombospondina de tipo I y en la mayona de los casos muchas (para revision, vease Nicholson y col.,BMC Evol Biol. 4 de febrero de 2005; 5(1):11). Estas protemas, que estan relacionadas evolutivamente con las familias de metaloproteinasas ADAM y MMP (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. Febrero de 2006; 7(1):25-31), son enzimas secretadas que se han relacionado con varias enfermedades y afecciones, incluyendo purpura trombocitopenica trombotica (PTT) (Moake JL, Semin Hematol. Enero de 2004; 41(1):4-14), trastornos del tejido conjuntivo, canceres, inflamacion (Nicholson y col.,) y paludismo grave por Plasmodium falciparum (Larkin y col.,PLoS Pathog. Marzo de 2009; 5(3): e1000349). Debido a estas asociaciones, las enzimas ADAMTS se han reconocido como posibles dianas terapeuticas para diversas patologfas (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. Febrero de 2006; 7(1):25-31). Por consiguiente, se necesiran procedimientos de produccion de grandes rendimientos de protemas ADAMTS que tengan actividades espedficas altas, que esten libres de contaminantes, tales como virus, EEB y patogenos como bacterias Mycoplasma.

Para el cultivo de celulas, particularmente de celulas eucariotas, y mas espedficamente de celulas de mairnfero, hay una constante necesidad de usar medios de cultivo especiales que proporcionen las sustancias nutrientes que se requieren para el crecimiento eficaz de las celulas y para la produccion de productos biologicos, especialmente productos biofarmaceuticos, tales como, por ejemplo, protemas recombinantes, anticuerpos, virus, antfgenos virales y partmulas similares a virus. Para la produccion eficaz de dichos productos biologicos, es importante lograr una densidad celular optima, asf como un aumento de la propia expresion de protemas con el fin de obtener el maximo rendimiento del producto.

Las formulaciones de medios de cultivo celular se han complementado con diversos aditivos, incluidos componentes indefinidos como suero bovino fetal (FCS), diversas protemas de origen animal y/o hidrolizados de protemas de origen bovino, asf como hidrolizados de protemas de origen vegetal o derivados de levaduras.

En general, el suero o las sustancias derivadas de suero, tales como, por ejemplo, albumina, transferrina o insulina, pueden comprender agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productos biologicos obtenidos de los mismos. Ademas, se deben analizar los aditivos derivados de suero humano para detectar todos los virus conocidos, incluyendo el virus de la hepatitis y el VIH, que pueden transmitirse a traves del suero. Ademas, el suero bovino y los productos derivados del mismo conllevan el riesgo de contaminacion de EEB. Ademas, todos los productos derivados de suero pueden contaminarse con sustancias desconocidas. Cuando se usan aditivos de suero o protemas derivados de fuentes humanas o animales en cultivo celular, hay numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable de la composicion de lotes diferentes y el riesgo de contaminacion con Mycoplasma, virus o EEB), particularmente si las celulas se usan en la fabricacion de farmacos o vacunas para su administracion a seres humanos.

Por tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas huesped y condiciones de cultivo eficaces, que no requieran suero u otros compuestos proteicos de animales.

Tales medios libres de suero se han desarrollado basandose en extractos de protemas derivados de plantas o de levaduras. Por ejemplo, se sabe que los hidrolizados de soja son utiles para procesos de fermentacion y pueden potenciar el crecimiento de muchos organismos molestos, levaduras y hongos. El documento WO 96/26266 describe que las fracciones digeridas con papama de harina de soja son una fuente de hidratos de carbono y nitrogeno, y muchos de los componentes pueden usarse en cultivo tisular. Franek y col., (Biotechnology Progress (2000) 16, 688692) describen efectos estimulantes del crecimiento y la productividad de fracciones peptfdicas de hidrolizado de trigo y soja definidas.

El documento WO 96/15231 da a conocer un medio libre de suero compuesto de un medio esencial mmimo sintetico y un extracto de levadura para la propagacion de celulas de vertebrados y un procedimiento de produccion de virus. Una formulacion de medio compuesta de medio de cultivo celular basal que comprende un peptido de arroz y un extracto de levadura y un producto de digestion enzimatica del mismo, y/o un lfpido vegetal para el crecimiento de celulas animales se da a conocer en el documento WO 98/15614. Un medio que comprende hidrolizado de soja

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purificado para el cultivo de celulas recombinantes se da a conocer en el documento WO 01/23527. En el documento WO 00/03000 se da a conocer un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero tambien requiere la presencia de formas recombinantes de protemas animales, tales como factores de crecimiento.

En el documento EP-A-0 481 791 se describe un medio de cultivo definido bioqmmicamente para cultivar celulas CHO modificadas por ingeniena genetica, que esta libre de protemas, lfpidos e hidratos de carbono, aislado de una fuente animal, que comprende ademas una insulina recombinante o analogo de insulina, peptona de soja digerida con papama del 1 % al 0,025 % p/v y putrescina. En el documento WO 98/08934 se describe un cultivo celular eucariota libre de suero que comprende peptidos de soja hidrolizados (1-1000 mg/l), putrescina de 0,01 a 1 mg/l y diversos componentes derivados de animales, incluyendo albumina, fetuma, diversas hormonas y otras protemas. En este contexto, debe indicarse que se sabe que la putrescina tambien forma parte de un medio convencional como DMEM/F12 de Ham a una concentracion de 0,08 mg/l.

Sin embargo, los hidrolizados de plantas y/o levaduras son mezclas indefinidas de oligopeptidos y otros componentes y contaminantes desconocidos. Ademas, la calidad de muchos de los hidrolizados disponibles comercialmente es muy variable. Como resultado, hay grandes variaciones en la produccion de productos virales o protemas recombinantes (una variacion de hasta un factor de tres) en funcion de los lotes de hidrolizados usados (“variacion de un lote a otro”). Este inconveniente afecta a la proliferacion de las celulas, asf como a la expresion de protemas de cada celula. En el documento US 2007/0212770 se describen diversos medios de cultivo definidos qmmicamente, libres de oligopeptidos y libres de protemas animales que son utiles para la produccion a gran escala de productos biofarmaceuticos de protemas recombinantes.

Un miembro de la familia ADAMTS, ADAMTS13, escinde el factor de von Willebrand (vWF) entre los residuos Tyr 1605 y Met 1606, una funcion responsable de la degradacion de multimeros grandes de vWF in vivo. La perdida de actividad de ADAMTS13 se ha relacionado con diversas afecciones, tales como PTT (Moake JL, Semin Hematol. Enero de 2004; 41(1):4-14), inflamacion aguda y cronica (Chauhan y col.,J Exp Med. 1 de septiembre de 2008; 205(9):2065-74), y, mas recientemente, paludismo grave por Plasmodium falciparum (Larkin y col.,PLoS Pathog. Marzo de 2009; 5(3):e1000349).

La purpura trombocitopenica trombotica (PTT) es un trastorno caracterizado por microangiopatfa trombotica, trombocitopenia y trombosis microvascular que pueden producir diversos grados de isquemia e infarto en el tejido. Clmicamente, los pacientes con PTT se diagnostican por smtomas tales como trombocitopenia, esquistocitos (fragmentos de eritrocitos) y niveles elevados de lactato deshidrogenasa (Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake J L. von Willebrand factor, AdAmTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41:4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).

En 1982, Moake y col., encontraron multfmeros del factor de von Willebrand inusualmente grandes (UL-vWF) en el plasma de los pacientes con PTT cronica con recafda (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435). La relacion entre UL- vWF y PTT obtuvo respaldo con los hallazgos independientes de Furlan y col., y Tsai y Lian de que la mayona de los pacientes que padecen PTT tienen deficiencia de una metaloproteasa en plasma, que ahora se sabe que es ADAMTS13, que escinde el vWF (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3097-3103; Tsai H M, Sussman I I, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma J J, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W y R834Q: inhibition by doxycyline and by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89:1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594).

La proteasa ADAMTS13 es una protema glicosilada de 190 kDa producida predominantemente por el hugado (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factorcleaving protease; J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001; 98:1654-1661).

Se ha demostrado que mutaciones en el gen de ADAMTS13 producen PTT (Levy G G, Nichols W C, Lian E C,

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Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). La PTT idiopatica, a menudo causada por autoanticuerpos que inhiben la actividad de ADAMTS-13, es un trastorno mas frecuente que se produce en adultos y ninos mayores, y que puede reaparecer a intervalos regulares en del 11 % al 36 % de los pacientes (Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594; Furlan M, Lammle B. Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514).

Los autoanticuerpos no neutralizantes tambien pueden inhibir la actividad de ADAMTS13 a traves de la induccion del aclaramiento de la circulacion (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). La actividad de ADAMTS13 en plasma en adultos sanos oscila entre el 50 % y el 178 % (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). En la mayona de los pacientes con PTT familiar o adquirida, la actividad de ADAMTS13 en plasma esta ausente o es menor del 5 % de la actividad normal. Sin tratamiento, la tasa de mortalidad para PTT supera el 90 %, pero la terapia plasmatica ha reducido la mortalidad hasta aproximadamente el 20 % (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433).

El vWF sintetizado en megacariocitos y celulas endoteliales se almacena en granulos a de plaquetas y en cuerpos de Weibel-Palade, respectivamente, como vWF ultragrandes (UL-vWF) (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol.1982; 95:355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66:621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69:1531-1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood. 1989; 73:2074-2076). Una vez secretados por las celulas endoteliales, estos multimeros de UL-vWF se escinden mediante ADAMTS13 en circulacion, para dar una serie de multimeros mas pequenos en sitios de escision espedficos dentro de la molecula de vWF (Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest 1991; 88:774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure de von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:7503-7507).

ADAMTS13 escinde en la union Tyr842-Met843 en el dominio A2 central de la subunidad de vWF madura y requiere cinc o calcio para su actividad (Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). El vWF existe en forma filamentosa y de “ovillo de hilo” tal como puede observarse mediante microscopia electronica (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem.1985; 260:8559-8563). Ademas, la microscopia de fuerza atomica confirma que el vWF existe en una conformacion globular en condiciones estaticas y en un estado filamentoso no plegado tras la exposicion a tension de corte (Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88:2939-2950). Esto tambien podna producirse in vivo cuando un extremo del filamento de vWF esta anclado a una superficie.

Los trombos de los pacientes con PTT consisten en poca fibrina y principalmente en vWF y plaquetas, lo que sugiere la agregacion plaquetaria mediada por vWF como una causa de la trombosis (Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38:469-479). Los pacientes con PTT recidivante tienen multimeros ultragrandes en el plasma. Los multimeros de UL-vWF se acumulan a lo largo del tiempo debido a que la persistencia del inhibidor (anticuerpo anti-ADAMTS13) disminuye la actividad de ADAMTS13. Los multimeros de UL-vWF son hiperactivos y no estan plegados como resultado de la tension de corte que produce la agregacion plaquetaria, lo que da como resultado trombosis intravascular (Tsai H M. Von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80:639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic and thrombocytopenic purpura. Br J Haematol. 2003; 1:2038-2040; discussion 2040-2035).

Se cree que la presencia de multfmeros de UL-vWF hiperreactivos en el plasma debido a deficiencia de ADAMTS13

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podna estar asociada con aumento del riesgo de trombosis arterial relacionada con cardiopatfa coronaria.

Puesto que las protemas ADAMTS se han implicado en numerosas enfermedades y afecciones, existe la necesidad en la tecnica de procedimientos de produccion a gran escala de protemas ADAMTS recombinantes que tienen actividades espedficas altas, que son adecuadas para la formulacion y administracion farmaceuticas. La presente invencion proporciona procedimientos que satisfacen estas y otras necesidades en la tecnica para la produccion y purificacion de protemas ADAMTS.

Breve sumario de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos de expresion de una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS). En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado, ventajosamente, niveles de expresion aumentados y la produccion de protemas ADAMTS con actividades sustancialmente mejoradas. Estas propiedades mejoradas pueden lograrse, en un ejemplo, complementando el medio de cultivo usado para la expresion de protemas ADAMTS con niveles aumentados de diversos componentes, tales como calcio, cinc o nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es una protema ADAMTS13.

En otro aspecto, la invencion se refiere un procedimientos de aumento de los niveles de expresion y/o de actividad de una protema ADAMTS cultivando celulas recombinantes que albergan un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en medios libres de protemas animales y definidos qmmicamente en condiciones de cultivo celular discontinuo, semicontinuo o continuo. En algunas realizaciones, estos procedimientos comprenden el uso de cultivo celular discontinuo, semicontinuo, en perfusion o en quimiostato que puede realizarse o bien en suspension celular o bien formas adherentes de celulas. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es una protema ADAMTS13.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos de reduccion de la cantidad de perdida de actividad durante la purificacion de una protema ADAMTS. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden complementar tampones de purificacion con niveles adicionales de calcio y/o cinc. En una realizacion espedfica, los procedimientos se refieren a estabilizar la actividad de una protema ADAMTS durante las etapas de ultrafiltracion y/o de diafiltracion usadas durante la purificacion. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es una protema ADAMTS13.

Aun en otro aspecto, la presente invencion se refiere a procedimientos de produccion de una protema ADAMTS con actividad aumentada para su uso en la preparacion de una composicion farmaceutica. En determinadas realizaciones, estos procedimientos comprenden el uso de medios de cultivo libres de protemas animales y/o definidos qmmicamente en condiciones adecuadas para la expresion aumentada de una protema ADAMTS que tiene actividades aumentadas. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es una protema ADAMTS13.

En un aspecto relacionado, la presente invencion proporciona medios libres de protemas animales, libres de oligopeptidos y definidos qmmicamente que son utiles para la expresion de protemas ADAMTS que tienen actividades espedficas altas. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es una protema ADAMTS13.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Productividad volumetrica de ADAMTS13 humana recombinante mediante FRETS-vWF73 expresada en celulas CHO cultivadas en medio libre de protemas animales en diversas condiciones de temperatura y pH. Los resultados de los diversos experimentos de cultivo celular se muestran como (A) diagrama de contorno y (B) representaciones de diagrama de superficie de productividad volumetrica normalizada de ADAMTS13 mediante FRETS-VWF73 en funcion de la temperatura y el pH del cultivo.

Figura 2. Niveles de actividad espedfica (FRETS-VWF73 / antfgeno mediante ELISA) de celulas CHO que expresan ADAMTS13 humana recombinante cultivada en medio libre de protemas animales en diversas condiciones de temperatura y pH. Los resultados de los diversos experimentos de cultivo celular se muestran como (A) diagrama de contorno y (B) representaciones de diagrama de superficie de actividad espedfica en funcion de la temperatura y el pH del cultivo.

Descripcion detallada de la invencion

I. Introduccion

Las protemas ADAMTS (es decir, de ADAMTS-1 a ADAMTS-20) son una familia de cinc-metaloproteinasas secretadas que comparten una organizacion de dominios modulares comun (para revision, vease, Flannery C.R., Front Biosci. 1 de enero de 2006; 11:544-69). Todas las protemas ADAMTS comparten una arquitectura de dominios centrales comun que consiste en un peptido serial, seguido por un prodominio, un dominio catalttico de metaloproteinasa dependiente de cinc, un dominio similar a desintegrina, una repeticion de trombospondina de tipo I,

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un dominio rico en cistema y un dominio espaciador (Apte S.S., J Biol Chem. 13 de noviembre de 2009; 284(46):31493-7). Adicionalmente, todas, excepto ADAMTS-4, contienen al menos un dominio mas de repeticion de trombospondina de tipo I, y muchas de las protemas ADAMTS contienen uno o mas dominios auxiliares complementarios. De manera notable, se ha notificado que todas las protemas ADAMTS parecen contener al menos un sitio de union a calcio y al menos un sitio de union a cinc ubicados dentro del dominio catalttico de metaloproteinasa (Andreini y col., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pags. 881-888).

Se han notificado los papeles biologicos para las protemas ADAMTS para diversas enfermedades y afecciones, incluyendo, antiangiogenesis, fibrosis intersticial renal, remodelacion osea, foliculogenesis ovarica, aterosclerosis, desarrollo genitourinario y crecimiento/remodelacion tumoral (ADAMTS-1); smdrome de Ehler-Danlos de tipo 7C y dermatopraxis bovina (ADAMTS-2); artritis, aterosclerosis y tendinopatfa (ADAMTS-4); artritis y glioblastoma (ADAMTS-5); artritis (ADAMTS-7); antiangiogenesis, neoplasias malignas cerebrales, artritis y aterosclerosis (ADAMTS-8); artritis (ADAMTS-9, -12); purpura trombocitopenica trombotica (aDaMTS-13); y antitrombosis/accidente cerebrovascular (ADAMTS18) (para revision, vease, Lin y Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).

ADAMTS13 (A13) recombinante se ha expresado antes en celulas de mairnfero, sin embargo, la actividad espedfica vana ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular. Se ha encontrado que muchos medios de cultivo disponibles comercialmente no son suficientes para la expresion de A13 con actividades espedficas altas, expresadas como la razon de actividad, medida mediante el ensayo de FRETS-VWF73, con respecto al contenido de antfgenos, tal como se determina mediante ELISA. En un aspecto, los procedimientos proporcionados en el presente documento se basan en diversos hallazgos ventajosos que permiten la expresion de cultivo celular de A13 que tiene niveles aumentados de actividad total y espedfica.

Los estudios descritos en el presente documento demuestran que para la expresion de A13 activa se requiere una determinada concentracion minima de calcio en el medio de cultivo, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM. Adicionalmente, se encontro que complementando el medio de cultivo con niveles aumentados de cinc, la protema A13 expresada resultante tema actividades totales y espedficas superiores. Por ejemplo, en cultivos complementados con cinc adicional de 2 a 3 veces la concentracion normal, en comparacion con las concentraciones encontradas en medios definidos qmmicamente convencionales tales como medios basados en DMEM/F12, se aumentaba significativamente la actividad espedfica de A13. Ademas, podfa lograrse un aumento adicional en la actividad espedfica de A13 aumentando la concentracion de nicotinamida (vitamina B3) desde aproximadamente 2 mg/l, como en los medios basados en DMEM/F12 convencionales, hasta aproximadamente 7 mg/l. Cultivando celulas HEK293 o CHO recombinantes en medios complementados con calcio, cinc y/o nicotinamida adicional, pudieron lograrse actividades espedficas de al menos aproximadamente 500 mU/|ig,

I. 000 mU/|ig, hasta aproximadamente 2.000 mU/|ig en cultivos de expresion a gran escala de A13 humana recombinante. Estos niveles de actividad espedfica para las protemas A13 producidas de manera recombinante no se habfan notificado con anterioridad. Ventajosamente, estos niveles aumentados de actividad de A13 se lograron en medio definido qmmicamente libre de componentes derivados de animales, lo que permite la expresion de protemas ADAMTS de manera sistematica y reproducible a gran escala adecuada para la produccion de protemas para la formulacion farmaceutica. Ademas, estos medios estan incluso libres de protemas recombinantes, por ejemplo insulina, dando como resultado productos que pueden usarse de manera mas segura en formulaciones para administracion farmaceutica.

La presente divulgacion tambien proporciona procedimientos que impiden la perdida de actividad y actividad espedfica durante etapas de ultra/diafiltracion convencionales y otras etapas de purificacion. Ventajosamente, se encontro que complementando el tampon usado para la diafiltracion con calcio y cinc adicionales, podfa lograrse una reduccion significativa en la perdida de actividad de A13, tal como se mide mediante un ensayo de FRETS-VWF73.

Por consiguiente, debido a la relacion funcion-estructura compartida entre la familia ADAMTS de metaloproteinasas secretadas, los procedimientos proporcionados por la presente invencion permiten la expresion de todas las protemas ADAMTs en cultivo celular y la recuperacion del medio celular.

II. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, los terminos “vitamina B3”, “nicotinamida”, “niacinamida”, “niacina” y “acido nicotmico” pueden usarse de manera intercambiable para referirse a cualquier miembro de la familia B3 de vitaminas. Por consiguiente, cualquier miembro de esta familia puede usarse para complementar medio usado en los procedimientos de la presente invencion.

Tal como se usa en el presente documento, una “protema ADAMTS” se refiere a un polipeptido de la familia de metaloproteinasas de desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I. Los miembros de esta familia incluyen las protemas humanas ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS 12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028),

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ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) y ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Las protemas ADAMTS incluyen tanto protemas de longitud completa como polipeptidos parciales que presentan al menos actividad biologica parcial, por ejemplo, al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o mas de la actividad demostrada por la protema de longitud completa, en particular la actividad proteasa demostrada por la protema de longitud completa. En determinados casos, una protema ADAMTS se modificara de manera postraduccional o bien in vivo o bien in vitro, por ejemplo, mediante medios enzimaticos o qmmicos. Se entiende que las protemas ADAMTS de la presente invencion incluyen alternativamente isoformas sometidas a empalme, protemas modificadas de manera conservativa, protemas sustancialmente identicas, homologos y similares.

En el contexto de la presente invencion, una protema ADAMTS abarca cualquier miembro de la familia ADAMTS de, por ejemplo, un mairnfero tal como un primate, ser humano, mono, conejo, cerdo, roedor, raton, rata, hamster, jerbo, animal canino, animal felino y derivados biologicamente activos del mismo. Tambien se abarcan protemas ADAMTS mutantes y variantes que tienen actividad, ya que son fragmentos funcionales y protemas de fusion de las protemas ADAMTS. Ademas, las protemas ADAMTS de la invencion pueden comprender ademas etiquetas que facilitan la purificacion, deteccion o ambas. Las protemas ADAMTS descritas en el presente documento pueden modificarse ademas con un resto terapeutico o un resto adecuado para la obtencion de imagenes in vitro o in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, una “protema ADAMTS13” se refiere a cualquier protema o polipeptido con actividad de ADAMTS13, particularmente la capacidad para escindir el enlace peptfdico entre los residuos Tyr- 842 y Met-843 de VWF. En una realizacion a modo de ejemplo, una protema ADAMTS13 se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es altamente similar a la de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, preproprotema) o a los aminoacidos de 75 a 1427 de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipeptido maduro). En otra realizacion, una protema ADAMTS13 se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es altamente similar a la de de NP_620596 (isoforma 2 de ADAMTS13, preproprotema) o a los aminoacidos de 75 a 1371 de NP_620594 (isoforma 2 de ADAMTS13, polipeptido maduro). Aun en otra realizacion, las protemas ADAMTS13 incluyen polipeptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos altamente similar a la de NP_620595 (isoforma 3 de ADAMTS13, preproprotema) o a los aminoacidos de 75 a 1340 de NP_620595 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipeptido maduro). Tal como se usa en el presente documento, una protema ADAMTS13 incluye variantes naturales con actividad de escision de vWF y construcciones artificiales con actividad de escision de vWF. Tal como se usa en la presente invencion, ADAMTS13 engloba cualquier variante natural, secuencia alternativa, isoforma o protema mutante que conserve algo de actividad basal. Los ejemplos de mutaciones de ADAMTS13 encontradas en la poblacion humana incluyen, sin limitacion, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, muchas de las cuales se han encontrado asociadas con purpura trombocitopenica trombotica (PTT). Las protemas ADAMTS13 tambien incluyen polipeptidos que contienen modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, se ha demostrado que ADAMTS13 va a modificarse mediante N- acetilglucosamina (GlcNAc) en los residuos 614, 667 y 1354, y se ha predicho que los residuos 142, 146, 552, 579, 707, 828 y 1235 tambien pueden modificarse de esta forma.

Puede prepararse ADAMTS13 recombinante proteoltticamente activa mediante la expresion en cultivos celulares de marnffero, tal como se describe en Plaimauer y col.,(2002, Blood. 15; 100(10):3626-32) y documento US 2005/0266528. En Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. Enero de 2004; 41(1):24-33 se dan a conocer procedimientos de cultivo recombinante de celulas que expresan ADAMTS13.

Tal como se usa en el presente documento, “una unidad de actividad de ADAMTS” se define como la cantidad de actividad en 1 ml de plasma humano normal reunido, independientemente del ensayo que este usandose. Por ejemplo, cuando la protema ADAMTS es ADAMTS13, una unidad de actividad de ADAMTS13 mediante FRETS- VWF73 es la cantidad de actividad necesaria para escindir la misma cantidad de sustrato de FRETS-VWF73 (Kokame y col., Br J Haematol. Abril de 2005; 129(1):93-100) que se escinde por un ml de plasma humano normal reunido. De manera conveniente, la actividad de ADAMTS13 puede determinarse mediante ensayos funcionales, tales como ensayos funcionales que emplean peptidos de factor de von Willebrand modificados como sustrato para ADAMTS13 (Tripodi y col., Br J Haematol. Septiembre de 2008; 6(9): 1534-41). Un procedimiento preferente de determinacion de actividad de ADAMTS13 humana recombinante se da a conocer en Gerritsen y col., (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (PTT). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). En una realizacion, para considerarse como una protema ADAMTS13 tal como se definio anteriormente, un polipeptido o protema debe tener al menos el 1 % de la actividad de escision de vWF de ADAMTS13 nativa. En otras realizaciones, una protema ADAMTS13 contendra al menos el 10 % de la actividad de ADAMTS13 nativa. Aun en otras realizaciones, una protema ADAMTS13 contendra al menos el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % de la actividad de ADAMTS13 nativa. La cantidad de una protema ADAMTS13 tambien puede determinarse mediante la medicion de un antfgeno de ADAMTS13, por ejemplo usando el procedimiento de ELISA dado a conocer en Rieger y col.,(2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212- 20).

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Tal como se usa en el presente documento, “|ig de ADAMTS13” o “|ig de antigeno de ADAMTS13” significa una cantidad de ADAMTS13 que proporciona el mismo nivel de protema detectable mediante ensayo ELISA que 1 ml de plasma humano normal reunido. Esto se basa en estimaciones publicadas de que esta presente 1 mg de ADAMTS13 en 1 ml de plasma humano normal, y por tanto es una medicion aproximada.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “derivado biologicamente activo”, cuando se usa en el contexto de una protema ADAMTS, tambien abarca polipeptidos obtenidos a traves de tecnologfa de ADN recombinante. Esto puede incluir cualquier procedimiento conocido en la tecnica para (i) la produccion de ADN recombinante mediante ingeniena genetica, por ejemplo, a traves de transcripcion inversa de aRn y/o amplificacion de ADN, (ii) introducir ADN recombinante en celulas procariotas o eucariotas mediante transfeccion, es decir, a traves de electroporacion o microinyeccion, (iii) cultivar dichas celulas transformadas, por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) expresar una protema ADAMTS, por ejemplo, de manera constitutiva o tras induccion, y (v) aislar dicha protema ADAMTS, por ejemplo, del medio de cultivo o recogiendo las celulas transformadas, con el fin de (vi) obtener protemas ADAmtS recombinantes sustancialmente purificadas, por ejemplo, a traves de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion molecular, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba, y similares. El termino “derivado biologicamente activo” incluye tambien moleculas quimericas tales como por ejemplo una protema ADAMTS, o un fragmento funcional de la misma, en combinacion con un segundo polipeptido, por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de albumina, con el fin de mejorar propiedades biologicas/farmacologicas como por ejemplo, la semivida de la protema ADAMTS en el sistema circulatorio de un mairnfero, particularmente un ser humano.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “ultrafiltracion” engloba una variedad de procedimientos de filtracion de membrana en los que la presion hidrostatica fuerza un lfquido contra una membrana semi-permeable. Los solidos y solutos suspendidos de alto peso molecular quedan retenidos, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a traves de la membrana. Este procedimiento de separacion se usa a menudo para purificar y concentrar disoluciones macromoleculares (103- 106 Da), especialmente disoluciones de protemas. Estan disponibles varias membranas de ultrafiltracion dependiendo del tamano de las moleculas que retienen. La ultrafiltracion se caracteriza normalmente por un tamano de poro de membrana de entre 2 nm y 0,05 |im y presiones de funcionamiento de entre 1 y 10 bar, y es particularmente util para separar protemas similares a coloides de pequenas moleculas como azucares y sales. En contraposicion, la nanofiltracion es otro procedimiento de filtracion accionado por presion caracterizado normalmente por un tamano de poro de membrana de entre 0,5 y 2 nm y presiones de funcionamiento de entre 5 y 40 bar. La nanofiltracion se usa frecuentemente para lograr una separacion entre azucares, otras moleculas organicas y sales multivalentes por un lado, y sales monovalentes y agua por otro. Generalmente, la ultrafiltracion puede realizarse o bien en modo de filtracion en lmea o bien en modo de filtracion de flujo tangencial (FFT).

Tal como se usa en el presente documento, el termino “diafiltracion” se refiere a otro procedimiento de filtracion de membrana, denominado en ocasiones como filtracion de flujo tangencial (FFT), en el que el lfquido se bombea de manera tangencial a lo largo de la superficie de una membrana de ultrafiltracion. Normalmente, el lfquido retenido se diluye con tampon de diafiltracion tras pasar sobre la membrana y posteriormente se devuelve a la membrana en un procedimiento de flujo continuo. Generalmente, la diafiltracion puede realizarse o bien en modo de filtracion en lmea o bien en modo de filtracion de flujo tangencial (FFT). Como tal, puede usarse un unico sistema para ambas operaciones de ultrafiltracion y diafiltracion, por ejemplo, para concentrar primero la muestra usando ultrafiltracion y realizar despues intercambio de tampon mediante diafiltracion.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “poliamina” se refiere a cualquiera de un grupo de compuestos organicos compuestos de carbono, nitrogeno e hidrogeno, y que contienen dos o mas grupos amino. Por ejemplo, el termino engloba moleculas seleccionadas del grupo que consiste en cadaverina, putrescina, agmatina, ornitina, espermina y espermidina.

En determinadas realizaciones del medio de cultivo definido qmmicamente usado para la expresion de una protema ADAMTS, la concentracion de la poliamina esta presente en el medio en una concentracion que oscila entre aproximadamente 0,5 mg/l y aproximadamente 30 mg/l, o entre aproximadamente 0,5 mg/l y aproximadamente 20 mg/l, o entre aproximadamente 0,5 mg/l y aproximadamente 10 mg/l, o entre aproximadamente 1 mg/l y aproximadamente 10 mg/l, o entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 10 mg/l, o entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 8 mg/l, o entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 5 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina a una concentracion de desde aproximadamente 2 mg/l hasta aproximadamente 8 mg/l.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “medio definido qmmicamente” se refiere a un medio de crecimiento sintetico en el que se conocen la identidad y la concentracion de todos los componentes. Los medios definidos qmmicamente no contienen extractos bacterianos, de levadura, animales o vegetales, aunque pueden incluir o no componentes individuales derivados de plantas o animales (por ejemplo, protemas, polipeptidos, etc.). Los ejemplos no limitativos de medios definidos qmmicamente disponibles comercialmente incluyen, diversos medios EXCELL® (SAFC Biosciences, Inc.), diversos medios de Eagle modificados por Dulbecco (DME) (Sigma- Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mezcla de nutrientes de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) y

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similares. Se conocen en la tecnica procedimientos de preparacion de medios de cultivo definidos qmmicamente, por ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217 y publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “medio de cultivo libre de oligopeptidos” se refiere a un medio libre de protemas que no comprende oligopeptidos, tales como, por ejemplo, oligopeptidos derivados de un hidrolizado de protemas. En una realizacion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen veinte o mas aminoacidos. En una realizacion de la presente invencion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen quince o mas aminoacidos. En otra realizacion de la invencion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen diez o mas aminoacidos. En una realizacion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen siete o mas aminoacidos. En otra realizacion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen cinco o mas aminoacidos. Todavfa en otra realizacion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen tres o mas aminoacidos. Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medio no comprende oligopeptidos que tienen dos o mas aminoacidos. Se conocen en la tecnica procedimientos de preparacion de medio de cultivo libre de oligopeptidos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217 y publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “medio de cultivo libre de suero” se refiere a un medio de cultivo que no esta complementado con un suero animal. Aunque con frecuencia los medios de cultivo libres de suero son medios definidos qmmicamente, los medios libres de suero pueden complementarse con protemas animales o vegetales diferenciadas o fracciones de protemas. Se conocen en la tecnica procedimientos de preparacion de medio de cultivo libre de suero, por ejemplo, en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217 y publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “medio de cultivo libre de protemas animales” se refiere a un medio de cultivo que no esta complementado con un suero, protema o fraccion de protemas animal. Aunque con frecuencia los medios de cultivo libres de protemas animales son medios definidos qmmicamente, los medios de cultivo libres de protemas animales pueden contener hidrolizados de plantas o levaduras. Se conocen en la tecnica procedimientos de preparacion de medio de cultivo libre de protemas animales, por ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217 y publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

Un “vector de expresion” es una construccion de acido nucleico, generada de manera recombinante o sintetica, con una serie de elementos de acido nucleico especificados que permiten la transcripcion de un acido nucleico particular en una celula huesped. El vector de expresion puede formar parte de un plasmido, virus o fragmento de acido nucleico. Normalmente, el vector de expresion incluye un acido nucleico que va a transcribirse unido operativamente a un promotor.

El termino “heterologo” cuando se usa con referencia a partes de un acido nucleico indica que el acido nucleico comprende dos o mas subsecuencias que no se encuentran en la misma relacion entre sf en la naturaleza. Por ejemplo, el acido nucleico se produce normalmente de manera recombinante, teniendo dos o mas secuencias de genes no relacionados dispuestos para obtener un nuevo acido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor procedente de una fuente y una region codificante procedente de otra fuente. De manera similar, una protema heterologa indica que la protema comprende dos o mas subsecuencias que no se encuentran en la misma relacion entre sf en la naturaleza (por ejemplo, una protema de fusion).

Un “promotor” se define como una serie de secuencias de control de acido nucleico que dirigen la transcripcion de un acido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, un promotor incluye secuencias de acido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripcion, tales como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor tambien incluye opcionalmente elementos de promotor o represor distales, que pueden ubicarse tanto como sea posible varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripcion. Un promotor “constitutivo” es un promotor que es activo en la mayona de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que es activo en regulacion medioambiental o de desarrollo. El termino “unido operativamente” se refiere a una union funcional entre una secuencia de control de expresion de acido nucleico (tal como un promotor, o serie de sitios de union de factores de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en el que la secuencia de control de expresion dirige la transcripcion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “aproximadamente” indica un intervalo aproximado de mas o menos el 10 % de un valor especificado. Por ejemplo, la expresion “aproximadamente el 20 %” engloba un intervalo del 18-22 %.

III. Expresion de protemas ADAMTS

En un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos de expresion de una protema desintegrina y

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metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS) que tiene actividad espedfica alta. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en medio de cultivo complementado con al menos un componente seleccionado de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion espedfica, una protema ADAMTS se expresa en un medio complementado con al menos dos componentes seleccionados de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo esta complementado con calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo usado para la expresion de una protema ADAMTS puede comprender un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente.

En un aspecto, se proporcionan procedimientos para la produccion de una protema ADAMTS. En una realizacion, los procedimientos comprenden las etapas de cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo complementado con al menos uno de cinc, calcio y nicotinamida; retirar una fraccion del sobrenadante del cultivo; realizar una etapa de centrifugacion o de filtracion para retirar cualquier celula residual; realizar una etapa de ultrafiltracion para concentrar la protema ADAMTS; y realizar una etapa de diafiltracion con un tampon que comprende al menos calcio o cinc. En algunas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser de al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas de 5 mM. En otras realizaciones, la concentracion de cinc puede ser de al menos aproximadamente 0,5 |iM, 1 |iM, 2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas de 10 |iM. En una realizacion determinada, el sobrenadante libre de celulas de recogida o el tampon de diafiltracion contiene combinaciones de calcio y cinc en las concentraciones mencionadas anteriormente. En una realizacion determinada, el punto de corte de las membranas de ultra y/o diafiltracion puede ser por ejemplo de aproximadamente 150 kD o 125 kD o 100 kD o 75 kD o 50 kD o 30 kD o 10 kD o menos de 10 kD. En una realizacion determinada, la protema ADAMTS es ADAMTS13 o un derivado biologicamente activo de la misma. En una realizacion espedfica, la protema ADAMTS13 es una protema ADAMTS13 humana o derivado biologicamente activo de la misma. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo usado en el procedimiento puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente.

En una realizacion, el procedimiento comprende ademas una etapa de purificacion seleccionada del grupo que consiste en cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de afinidad y cromatograffa de interaccion hidrofoba.

Aun en otra realizacion, puede proporcionarse complementacion con cinc mediante la adicion de una preparacion de protemas o polipeptidos que contiene cinc. Por ejemplo, las preparaciones ffpicas de insulina contienen cinc a concentraciones de manera que la complementacion del medio con entre aproximadamente 1 mg/l y aproximadamente 10 mg/l de insulina tambien daffa como resultado la complementacion con cinc de aproximadamente 0,03 |iM a aproximadamente 1,5 |iM, tal como se calcula a partir de la monograffa detallada para Novolin N InnoLet SubQ, insulina humana recombinante, que puede encontrarse en el servidor de Medscape. Por consiguiente, en una realizacion, el medio de cultivo usado para la expresion de una protema ADAMTS puede complementarse con una preparacion de insulina que contiene cinc.

El medio basal, que esta complementado con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) tal como se da a conocer en el presente documento, elegido para cultivar la lmea celular huesped no es cfftico para la presente invencion y puede ser cualquiera de, o una combinacion de, los conocidos en la tecnica que son adecuados para cultivar celulas de mairnfero. Un medio tal como medio Eagle modificado por Dulbecco, medio F-12 de Ham, medio esencial mmimo de Eagle y medio RPMI-1640 y similares estan disponibles comercialmente. La adicion de factores de crecimiento como insulina recombinante es opcional.

En una realizacion, el medio basal usado para cultivar una celula que expresa una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) puede comprender una mezcla de uno o mas medios definidos qmmicamente disponibles comercialmente, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y medio F-12 de Ham, que se ha complementado con uno o mas componentes distintos de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). Los ejemplos no limitativos de componentes que pueden usarse para complementar un medio disponible comercialmente incluyen, aminoacidos esenciales (por ejemplo, glutamina), tensioactivos no ionicos (por ejemplo, Synperonic), aminas primarias (por ejemplo, etanolamina), poliaminas (por ejemplo, putrescina), metales traza (por ejemplo, hierro) y agentes tampon (por ejemplo, bicarbonato de sodio). En una realizacion espedfica, el medio es un medio BCS tal como se proporciona en la tabla 1. En otra realizacion espedfica, el medio es un medio BACD, por ejemplo, medio BACD-A13.

Tabla 1. Composicion de medio de cultivo celular BCS.

Componente

Concentracion |g/kgl

DMEM/F12 de HAM

11,75

L-glutamina

0,9

Synperonic

1,00

Etanolamina

0,00153

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Componente

Concentracion |g/kgl

Putrescina.2HCl

0,0036

FeSO4.7H2O

0,0006

NaHCOa

2,0

Historicamente, las celulas animales se han cultivado en medos que contienen suero animal. Sin embargo, tales medios estan definidos de manera incompleta y conllevan el riesgo de infeccion. Por tanto, los expertos en la tecnica han ideado medios “libres de protemas” que o bien estan completamente libres de cualquier protema o bien al menos estan libres de cualquier protema que no se produzca de manera recombinante. La albumina serica humana se usa habitualmente como un complemento de cultivo libre de suero para la produccion de protemas recombinantes. Los medios preferentes incluyen los dados a conocer en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217 y publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

Opcionalmente, puede anadirse al medio un agente tensioactivo no ionico como agente desespumante, tal como 1 1 ® ^ ® ® 1 ® propilenglicol (por ejemplo Pluronic F-61, Pluronic F-68, Pluronic F-71, Pluronic F-108 o Synperonic ). Este

agente se aplica generalmente para proteger las celulas de los efectos negativos de la aireacion (“burbujeo”). La

cantidad de agente tensioactivo no ionico puede oscilar entre 0,05 y 10 g/l, preferentemente entre 0,1 y 5 g/l.

El medio del documento US 6 936 441 es particularmente muy adecuado para el cultivo de celulas CHO pero puede usarse tambien con otras celulas. Un medio adecuado adicional es el medio libre de oligopeptidos dado a conocer en la solicitud de patente estadounidense n. ° 2007/0212770 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.).

Tabla 2. Concentraciones a modo de ejemplo de concentracion de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) que pueden usarse para complementar medios de cultivo utiles para la expresion de una protema ADAMTS.

Cinc al menos 2 |iM

Var. 1 Calcio al menos 0,5 mM Var. 2 Nicotinamida al menos 2 mg/l Var. 3

Cinc al menos 5 |iM

Var. 4 Calcio al menos 1,5 mM Var. 5 Nicotinamida al menos 7 mg/l Var. 6

Cinc entre 2 y 12 |iM

Var. 7 Calcio entre 0,5 y 1,5 mM Var. 8 Nicotinamida entre 2 y 7 mg/l Var. 9

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 10 Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3.0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas Var. 11 Nicotinamida al menos 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas Var. 12

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas

Var. 13

*Var. = Variacion

En una realizacion, la presente invencion proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende al menos uno de cinc a una concentracion de al menos aproximadamente 2 |iM o calcio a una concentracion de al menos aproximadamente 0,5 mM. En una realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS 1. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS2. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS3. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS4. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS5. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS6. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS7. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS8. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS9. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS10. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS 11. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS12. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS13. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS14. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS15. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS16. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS 17. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS 18. En otra realizacion, la protema ADAMTS es ADAMTS 19. En otra realizacion, la protema

ADAMTS es ADAMTS20. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el medio

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de cultivo contiene cinc entre aproximadamente 2 |iM y aproximadamente 12 |iM. Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc entre aproximadamente 5 |iM y aproximadamente 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene calcio al menos aproximadamente 0,5 mM. Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene calcio entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 2 |iM y calcio al menos aproximadamente 0,5 mM.

Aun en otras realizaciones, se ha encontrado que la adicion de nicotinamida (vitamina B3) potencia adicionalmente la expresion y la actividad espedfica de protemas ADAMTS en cultivo celular. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas nicotinamida al menos aproximadamente 2 mg/l (vitamina B3). En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas nicotinamida al menos aproximadamente 7 mg/l (vitamina B3). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 10 mg/l.

En determinadas realizaciones, el medio de cultivo es un medio de cultivo libre de protemas animales. En otra realizacion, el medio de cultivo es un medio definido qmmicamente. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede comprender una o mas poliaminas. En una realizacion particular, la poliamina es putrescina, por ejemplo, a una concentracion de al menos 0,5 mg/l. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene putrescina entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 8 mg/l.

En determinadas realizaciones, la celula o lmea celular usada en el cultivo es una celula bacteriana, una celula de levadura, una celula de insecto, una celula de ave o una celula de mairnfero. En una realizacion espedfica, la lmea celular es una lmea celular humana, una lmea celular de hamster o una lmea celular murina. En una realizacion mas espedfica, la lmea celular es una lmea celular CHO, BHK o HEK. En una realizacion preferente, la lmea celular es una lmea celular CHO.

En determinadas realizaciones, el acido nucleico que codifica la protema ADAMTS comprende una secuencia de control unida operativamente a la secuencia de nucleotidos que codifica la protema ADAMTS. En una realizacion, la secuencia de control es un promotor. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivo. En otras realizaciones, el promotor es un promotor inducible.

En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden el uso de un sistema de cultivo celular continuo (es decir, cultivo celular continuo). En una realizacion, el sistema de cultivo continuo es un sistema de cultivo en quimiostato (es decir, cultivo celular en quimiostato). En otra realizacion, el sistema de cultivo continuo es un sistema de cultivo en turbidostato (es decir, cultivo celular en turbidostato). Aun en otra realizacion, el sistema de cultivo continuo es un sistema de cultivo en perfusion (es decir, cultivo celular en perfusion). En determinadas realizaciones, el sistema de cultivo continuo puede hacerse funcionar en un modo de suspension. En otras realizaciones, el sistema de cultivo continuo puede hacerse funcionar en un modo adherente. En determinadas realizaciones, el modo adherente comprende el uso de un microportador, por ejemplo, un microportador poroso.

En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden el uso de un sistema de cultivo celular discontinuo (es decir, cultivo celular discontinuo). En una realizacion, el sistema de cultivo discontinuo es un sistema de cultivo de un unico lote (es decir, cultivo celular de un unico lote). En otra realizacion, el sistema de cultivo discontinuo es un sistema de cultivo semicontinuo (es decir, cultivo celular semicontinuo). Aun en otra realizacion, el sistema de cultivo discontinuo es un sistema de cultivo de lotes repetidos (es decir, cultivo celular de lotes repetidos). En determinadas realizaciones, el sistema de cultivo discontinuo puede hacerse funcionar en un modo en suspension. En otras realizaciones, el sistema de cultivo discontinuo puede hacerse funcionar en un modo adherente. En determinadas realizaciones, el modo adherente comprende el uso de un microportador, por ejemplo, un microportador poroso.

En determinadas realizaciones, el cultivo se mantendra a una temperatura de entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 37 °C. En otras realizaciones, el cultivo se mantendra a un pH de entre aproximadamente 6,9 y aproximadamente 7,3. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantendra a un pH de entre aproximadamente 7,05 y aproximadamente 7,15.

En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento produciran protemas ADAMTS13 en el medio de cultivo (es decir, ADAMTS13 expresada) con actividades espedficas de al menos 600 U por mg de protema ADAMTS13. En otras realizaciones, la actividad espedfica sera de al menos 800U por mg de protema ADAMTS13. En otras realizaciones, la actividad espedfica sera de al menos 1000 U por mg de protema ADAMTS13. En otras realizaciones, la actividad espedfica sera de al menos 1500 U por mg de protema ADAMTS13. En otras realizaciones, la actividad espedfica sera de al menos 2000 U por mg de protema ADAMTS13.

En otras realizaciones, los procedimientos proporcionan cultivos que producen al menos 400 U de actividad de ADAMTS13 por l de cultivo al dfa (U/l/d). En una realizacion, los procedimientos proporcionan cultivos que producen al menos 800 U de actividad de aDaMTS13 por l de cultivo al dfa (U/l/d).

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A. ADAMTS13

En un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para expresar una protema ADAMTS13 que tiene actividad total y/o espedfica aumentada. Ventajosamente, se encontro que complementando un medio de crecimiento con calcio, cinc y/o nicotinamida (vitamina B3), podfan expresarse de manera recombinante y recuperarse del cultivo celular polipeptidos ADMTS13 que teman actividad espedfica alta.

En el documento WO 2009/086309 se facilitan procedimientos para la expresion de ADAMTS13. Esta referencia describe procedimientos y condiciones de cultivo adecuados, que pueden mantenerse durante toda la duracion del cultivo. Tal como se describe en el presente documento, los cultivos celulares usados para la expresion de protemas ADAMTS13 generalmente se mantendran a una temperatura a o aproximadamente a entre 34 °C y 37 °C y un pH a o aproximadamente a entre 6,8 y 7,3.

Se conocen bien en esta tecnica maneras de monitorizar la temperatura y el pH del cultivo y generalmente se basan en sondas que se insertan en el biorreactor, o se incluyen en asas a traves de las cuales se hace circular el medio de cultivo, o se insertan en muestras extrafdas de medio de cultivo. Los sensores de pH en lmea adecuados incluyen el sensor InPro 3100/125/Pt100 de Mettler Toledo (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). Tambien se conocen bien maneras de alterar el parametro especificado con el fin de mantenerlo al nivel predefinido. Por ejemplo, mantener la temperatura constante habitualmente implica calentar o enfriar el biorreactor o el medio de alimentacion (si es un proceso semicontinuo o continuo); mantener el pH constante habitualmente implica elegir y suministrar una cantidad suficiente de un tampon apropiado (normalmente bicarbonato) y anadir al medio de alimentacion acido, tal como acido clortndrico, o alcali, tal como hidroxido de sodio, bicarbonato de sodio o una mezcla de los mismos, segun sea necesario. Es posible que la calibracion de una sonda de pH en lmea pueda desviarse a lo largo del tiempo, tal como a lo largo de periodos de dfas o semanas, durante los que se cultivan las celulas. En ese caso, puede ser beneficioso reajustar la sonda en lmea usando las mediciones obtenidas a partir de una sonda fuera de lmea calibrada recientemente.

En una realizacion, los procedimientos comprenden cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en medio de cultivo complementado con al menos un componente seleccionado de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion espedfica, una protema ADAMTS se expresa en un medio complementado con al menos dos componentes seleccionados de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo esta complementado con calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede ser un medio de cultivo libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente.

1. Complementacion con zinc

Ventajosamente, se encontro que la actividad enzimatica y la actividad espedfica aumentadas de ADAMTS13 podfan recuperarse a partir de un cultivo celular cultivado en un medio complementado con cinc. Por ejemplo, el ejemplo 1, demuestra que la protema ADAMTS13 expresada en medio de cultivo que contiene 1,432 mg/l de ZnSO4'7H2O (cinc 5 |iM) tiene una actividad espedfica superior del 40 % al 100 % que la protema ADAMTS13 expresada en medio de cultivo que contiene solo 0,432 mg/l de ZnSO4'7H2O (cinc 1,5 |iM) (comparese, la tabla 10 y la tabla 11). Ademas, este efecto es reproducible, tal como se muestra en el ejemplo 2 (comparese, la tabla 13 y la tabla 14); el ejemplo 4 (tabla 16 a tabla 19); y el ejemplo 5 (tabla 20 y tabla 21).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que tiene una actividad aumentada espedfica cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con cinc, por ejemplo, que contiene cinc al menos 2 |iM. De manera similar, la presente invencion tambien proporciona procedimientos para preparar una composicion de protema (por ejemplo, una composicion de ADAMTS13) que tiene actividad total o actividad espedfica aumentada cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con cinc, por ejemplo, que contiene cinc al menos 2 |iM.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. Los intervalos de concentracion de cinc

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adecuados se determinan generalmente por las toxicidades del cultivo celular que pueden producirse en presencia de altas concentraciones de cinc, por ejemplo, a concentraciones mayores de 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM, 40 |iM y similares. Tal como entendera el experto en la tecnica, el grado en que las concentraciones de cinc son inhibidoras para un sistema de cultivo particular sera altamente dependiente de, entre otros factores, el tipo de celula usada para expresar una protema ADAMTS, los componentes del medio de cultivo utilizado y el modo de funcionamiento empleado para el cultivo (por ejemplo, discontinuo frente a continuo; suspension frente a adherente; quimiostato frente a perfusion; etc.). En determinados casos, pueden requerirse concentraciones superiores de cinc cuando los componentes del medio de cultivo pueden secuestrar cinc de la solucion, por ejemplo, en casos en los que el medio de cultivo contiene albumina. Por consiguiente, los intervalos de concentracion de cinc adecuados se determinan generalmente por la identidad de las celulas cultivadas, el medio y el modo de funcionamiento empleados. Un experto podra determinar facilmente los lfmites superiores apropiados para el uso de complementacion con cinc basandose en el sistema de cultivo individual empleado.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales contiene cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales contiene cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qmmicamente que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qmmicamente que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo definido qmmicamente contiene cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo definido qmmicamente contiene cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM,

14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En determinadas realizaciones, el medio definido qmmicamente estara libre de protemas y/o polipeptidos derivados de animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mam^era que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mam^era que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM,

15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mam^era se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la

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poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de marnffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura del cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el procedimiento

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comprende cultivar una celula de mai^ero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de marnffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM,

30 |iM o mas, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, el medio de cultivo usado para la expresion de una protema ADAMTS puede complementarse con cinc a una concentracion final de al menos aproximadamente 2 |iM a al menos aproximadamente 1 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede complementarse con cinc a una concentracion final de al menos aproximadamente 2 |iM, o al menos aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o niveles superiores de cinc. Generalmente, puede usarse cualquier sal de cinc para complementar los medios de la invencion, incluyendo ejemplos no limitativos de sales aceptables, ZnSO4-7^O, ZnSOa-2H2O, (C6H5Oy)2Zn3-2H2O, ZnBr2, ZnBr2-2^O, ZnCl2, Zn (NO3)2-6H2O, Zn (H2PO4)2'H2O, (C2H3O2)2Zn2H2O y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de cinc farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion.

2. Complementacion con calcio

Ventajosamente, se encontro que la actividad enzimatica y la actividad espedfica aumentadas de ADAMTS13 podfan recuperarse a partir de un cultivo celular cultivado en un medio complementado con calcio. Los medios de cultivo celular tradicionales, por ejemplo, DMEM/F12, normalmente conteman calcio aproximadamente 1 mM. Historicamente, estos niveles altos de calcio se introdujeron en el medio para ayudar con los cultivos celulares adherentes. Sin embargo, en la actualidad, los medios disponibles comercialmente disenados para cultivos en suspension contienen significativamente niveles de calcio inferiores, por ejemplo, calcio aproximadamente 0,1 mM. Tales niveles de calcio inferiores se basan en impedir la agregacion de celulas cultivadas a traves de procedimientos de suspension. Se sabe que niveles de calcio inferiores son suficientes para propagar celulas en suspension y expresar protemas recombinantes, sin embargo, los inventores han encontrado que estos bajos niveles de calcio son insuficientes para la expresion de las protemas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que tiene una actividad espedfica aumentada cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con calcio, por ejemplo, que contiene calcio al menos 0,5 mM. De manera similar, la presente invencion tambien proporciona procedimientos para preparar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, una composicion de ADAMTS13) que tiene actividad total o actividad espedfica aumentada cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con calcio, por ejemplo, que contiene calcio al menos 0,5 mM.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 M,

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1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM,

3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales contiene calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y

1.5 mM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM,

1,0 M, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qmmicamente que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qmmicamente que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo definido qmmicamente contiene calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En determinadas realizaciones, el medio definido qmmicamente estara libre de protemas y/o polipeptidos derivados de animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de marnffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mam^era que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 M, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 M, 2,0 mM, 2,25 mM,

2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mam^era que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM,

1.5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM,

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5.0 mM o mas, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM,

2.0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura del cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l.

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En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o

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al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de marnffero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5

mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el

medio de cultivo comprende calcio a o aproximadamente a 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende calcio a o aproximadamente a 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5

mM, 5,0 mM o mas y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion

relacionada, el medio de cultivo comprende calcio a o aproximadamente a 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende calcio a o aproximadamente a 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM,

1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de calcio para complementar los medios de la invencion. Los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen CaCl2, CaCl2, CaFPO3-2H2O, Cal2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6HyO6)2Ca, (C6H5Oy)2Ca3-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de calcio farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion.

3. Complementacion con nicotinamida (vitamina B3)

Ventajosamente, se encontro que la actividad enzimatica y la actividad espedfica aumentadas de ADAMTS13 podfan recuperarse a partir de un cultivo celular cultivado en un medio complementado con nicotinamida (vitamina B3). Por ejemplo, en el ejemplo 2 se demuestra que la protema ADAMTS13 expresada en medio de cultivo que contiene nicotinamida (vitamina B3) 7 mg/l tiene una actividad espedfica superior en un 60 % que la protema ADAMTS13 expresada en medio de cultivo que contiene solo nicotinamida 2 mg/l (tabla 13; comparense los dfas 4 y 7 con el dfa 11). Sorprendentemente, este efecto es sinergico con la complementacion con cinc, ya que la expresion de ADAMTS13 en medio que contiene nicotinamida (vitamina B3) 7 mg/l y cinc 5 |iM da como resultado un aumento

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del 200 % al 300 % en la actividad espedfica de la protema ADAMTS13 (comparese la tabla 14 dfa 11 con la tabla 13 dfas 4 y 7).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que tiene una actividad espedfica aumentada cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con nicotinamida (vitamina B3), por ejemplo, que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos 2 mg/l. De manera similar, la presente invencion tambien proporciona procedimientos para preparar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, una composicion de ADAMTS13) que tiene actividad total o actividad espedfica aumentada cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con nicotinamida (vitamina B3), por ejemplo, que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos 2 mg/l.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l. En una realizacion, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores. Los intervalos de concentracion de nicotinamida (vitamina B3) adecuados se determinan generalmente por las toxicidades del cultivo celular que pueden producirse en presencia de altas concentraciones de nicotinamida (vitamina B3), por ejemplo, a concentraciones mayores de 15 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l y similares. Tal como entendera el experto en la tecnica, el grado en que las concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) son inhibidoras para un sistema de cultivo particular sera altamente dependiente de, entre otros factores, el tipo de celula usada para expresar una protema ADAMTS, los componentes del medio de cultivo utilizado, y el modo de funcionamiento empleado para el cultivo (por ejemplo, discontinuo frente a continuo; suspension frente a adherente; quimiostato frente a perfusion; etc.). En determinados casos, pueden requerirse concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) superiores cuando los componentes del medio de cultivo pueden secuestrar nicotinamida (vitamina B3) de la solucion. Por consiguiente, los intervalos de concentracion de nicotinamida (vitamina B3) adecuados se determinan generalmente por la identidad de las celulas cultivadas, el medio y el modo de funcionamiento empleados. Un experto podra determinar facilmente los lfmites superiores apropiados para el uso de complementacion con nicotinamida (vitamina B3) basandose en el sistema de cultivo individual empleado.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l. En una realizacion, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 g/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o concentraciones superiores de nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qdmicamente que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo definido qmmicamente que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l. En una realizacion, el medio de cultivo definido qmmicamente contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales puede contener concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores. En determinadas realizaciones, el medio definido qmmicamente estara libre de protemas y/o polipeptidos derivados de animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa

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con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de marnffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 g/l, 20 mg/l o superiores, en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores, en el que el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura del cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o

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polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mairnfero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En otra realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. Aun en otras realizaciones, el procedimiento comprende cultivar una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 g/l, 20 mg/l o superiores, en el que el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida

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(vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mam^era es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 g/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y al menos o aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. Aun en otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y al menos o aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l,

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8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

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En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mairnfero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l,

9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En una realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion relacionada, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l,

10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y calcio al menos o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo comprende concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores y calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13 (ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 en un medio de cultivo que comprende cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el cinc esta presente en el medio de cultivo a una concentracion de al menos o aproximadamente 2 |iM, 5 |iM, entre 2 |iM y 12 |iM, entre 5 |iM y 12 |iM, o al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, 13 |iM, 14 m|iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En determinadas realizaciones, el calcio esta presente en el medio de cultivo a una concentracion de al menos o aproximadamente 0,5 mM, 1,5 mM, entre 0,5 y 1,5, o al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En determinadas realizaciones, la nicotinamida (vitamina B3) esta

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presente en el medio de cultivo a una concentracion de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 7 mg/l, entre 2 mg/l y 7 mg/l, o al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas.

Tal como se da a conocer expresamente en el presente documento, y se facilita como Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6), se contempla cualquier combinacion de concentraciones de los tres componentes (es decir, cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3)) para su uso en los procedimientos de la invencion. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo o semicontinuo. En una realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo quimiostatico. En otra realizacion espedfica, la condicion de cultivo continuo es una condicion de cultivo en perfusion. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS13 es una celula de marnffero. En realizaciones particulares, la celula de mairnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina.

Tabla 3. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo que contienen nicotinamida (vitamina B3) al menos 2 mg/l, que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 14 Var. 15 Var. 16 Var. 17

Cinc al menos 5 |iM

Var. 18 Var. 19 Var. 20 Var 21

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 22 Var. 23 Var. 24 Var. 25

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 26 Var. 27 Var. 28 Var. 29

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas

Var. 30 Var. 31 Var. 32 Var. 33

*Var. = Variacion

Tabla 4. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo que contienen nicotinamida (vitamina B3) al menos 7 mg/l, que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 34 Var. 35 Var. 36 Var. 37

Cinc al menos 5 |iM

Var. 38 Var. 39 Var. 40 Var. 41

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 42 Var. 43 Var. 44 Var. 45

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 46 Var. 47 Var. 48 Var. 49

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM,

Var. 50 Var. 51 Var. 52 Var. 53

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas

*Var. = Variacion

Tabla 5. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo que contienen nicotinamida (vitamina B3) entre 2 y 7 mg/l, que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 54 Var. 55 Var. 56 Var. 57

Cinc al menos 5 |iM

Var. 58 Var. 59 Var. 60 Var. 61

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 62 Var. 63 Var. 64 Var. 65

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 66 Var. 67 Var. 68 Var. 69

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas

Var. 70 Var. 71 Var. 72 Var. 73

*Var. = Variacion 5

Tabla 6. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo que contienen nicotinamida (vitamina B3) al menos 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas, que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 74 Var. 75 Var. 76 Var. 77

Cinc al menos 5 |iM

Var. 78 Var. 79 Var. 80 Var. 81

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 82 Var. 83 Var. 84 Var. 85

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 86 Var. 87 Var. 88 Var. 89

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM,

Var. 90 Var. 91 Var. 92 Var. 93

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Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1.0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 mM o mas

12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas

*Var. = Variacion

B. Celulas huesped y vectores

Pueden producirse protemas recombinantes ADAMTS mediante la expresion en cualquier sistema de huesped procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de celulas eucariotas incluyen, sin limitacion, celulas de mairnfero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; celulas de insecto, por ejemplo celulas SF9, celulas SF21, celulas S2 y celulas High Five; y celulas de levadura, por ejemplo celulas de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realizacion, las protemas ADAMTS pueden expresarse en celula bacterianas, celulas de levadura, celulas de insecto, celulas de ave, celulas de mai^ero, y similares. Por ejemplo, en una lmea celular humana, una lmea celular de hamster o una lmea celular murina. En una realizacion particular, la lmea celular es una lmea celular CHO, BHK o HEK. En una realizacion preferente, la lmea celular es una lmea celular CHO.

En una realizacion, las celulas pueden ser cualquier celula de marnffero que puede cultivarse, preferentemente en un procedimiento de fabricacion (es decir, al menos 1 litro), para producir una protema ADAMTS deseada tal como ADAMTS13. Los ejemplos incluyen la lmea CV1 de rinon de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon de embrion humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham y col.,J. Gen Virol., 36:59 (1977)); celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR, tal como el subclon DUKX-B11 (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV ATCC CcL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, AtCc cRl-1587); celulas de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); celulas de rinon de perro (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hngado de rata bufalo (BRL 3a, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de tngado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MmT 060562, AtCc CCL51); celulas TRI (Mather y col.,Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y la lmea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la lmea celular es una lmea celular de roedor, especialmente una lmea celular de hamster tal como CHO o BHK.

Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) y pueden seleccionarse de vectores de expresion eucariotas y procariotas. En determinadas realizaciones, se contempla un vector de plasmido para su uso en la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13). En general, se usan vectores de plasmido que contienen secuencias de replicon y de control que se derivan de especies compatibles con la celula huesped en relacion con esos huespedes. El vector puede portar un sitio de replicacion, asf como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar seleccion fenotfpica. El plasmido comprendera una secuencia de nucleotidos que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida operativamente a una o mas secuencias de control, por ejemplo, un promotor.

Un procedimiento preferente de preparacion de clones de celulas CHO estables que expresan una protema ADAMTS recombinante es tal como sigue. Se transfecta una lmea celular CHO deficiente en DHFR, DUKX-B 11, con un vector de expresion de DHFR para permitir la expresion de la protema recombinante relevante, esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense numero 5.250.421 (Kaufman y col.,Genetics Institute, Inc.). Se lleva a cabo la seleccion mediante crecimiento en medios libres de hipoxantina/timidina (HT) y se logra la amplificacion de la region relevante que codifica la expresion de la protema ADAMTS recombinante y el gen de DHFR mediante la propagacion de las celulas en concentraciones crecientes de metotrexato. Cuando resulta apropiado, las lmeas celulares CHO pueden adaptarse para crecimiento en medio libre de suero y/o protemas, esencialmente tal como se describe en el documento US 6.100.061 (Reiter et al, lmmuno Aktiengesellschaft).

En otra realizacion preferente, se preparan celulas HEK293 estables transfectando con una construccion que contiene un marcador seleccionable de higromicina y seleccionando transformantes mediante resistencia a antibioticos.

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La capacidad de determinados virus para infectar celulas o para entrar en celulas a traves de endocitosis mediada por receptor y para integrarse en el genoma de la celula huesped y expresar genes virales de manera estable y eficaz ha hecho de ellos candidatos atractivos para la transferencia de acidos nucleicos extranos en celulas (por ejemplo, celulas de mairnfero). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se usa un vector viral para introducir una secuencia de nucleotidos que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una celula huesped para su expresion. El vector viral comprendera una secuencia de nucleotidos que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida operativamente a una o mas secuencias de control, por ejemplo, un promotor. Alternativamente, el vector viral puede no contener una secuencia de control y en cambio se basara en una secuencia de control dentro de la celula huesped para dirigir la expresion de la protema ADAMTS. Los ejemplos no limitativos de vectores virales que pueden usarse para suministrar un acido nucleico incluyen vectores adenovirales, vectores de VAA y vectores retrovirales.

En una realizacion, un vector de expresion de adenovirus incluye las construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para soportar el empaquetamiento de la construccion y, en ultima instancia, para expresar una construccion de ADAMTS que se ha clonado en el mismo. Los vectores adenovirales permiten la introduccion de secuencias extranas de hasta 7 kb (Grunhaus y col.,Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).

En otra realizacion, puede usarse un virus adenoasociado (VAA) para introducir una secuencia de nucleotidos que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una celula huesped para su expresion. Los sistemas de VAA se han descrito anteriormente y generalmente se conocen bien en la tecnica (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten y col.,Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141- 64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Detalles relativos a la generacion y el uso de vectores de VAAr se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.°5.139.941 y 4.797.368,

En una realizacion, puede usarse un vector de expresion retroviral para introducir una secuencia de nucleotidos que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una celula huesped para su expresion. Estos sistemas se han descrito anteriormente y generalmente se conocen bien en la tecnica (Mann y col.,Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas y Rubinstein, En: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez y Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pags. 494-513, 1988; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pags. 149-188, 1986). En una realizacion espedfica, el vector retroviral es un vector lentiviral (vease, por ejemplo, Naldini y col.,Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey y col.,Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer y col.,J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; patentes estadounidenses n.° 6.013.516 y 5.994.136).

Los ejemplos no limitativos de vectores para expresion en procariotas incluyen plasmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en los que los promotores usados en vectores de expresion en procariotas incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Los ejemplos de vectores para expresion en eucariotas incluyen: (i) para expresion en levaduras, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, que usan promotores tales como aOx1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresion en celulas de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., que usan promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresion en celulas de mai^ero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/VRS, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, herpesvirus, retrovirus, etc., que usan promotores tales como de CMV, SV40, EF-1, UbC, VRS, ADV, VPB y p-actina.

En determinadas realizaciones, los procedimientos de cultivo celular de la invencion pueden comprender el uso de un microportador. La presente invencion proporciona, entre otros aspectos, procedimientos de expresion de la protema ADAMTS a gran escala. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en grandes biorreactores en condiciones adecuadas para proporcionar grandes areas de superficie de cultivo espedficas de volumen para lograr densidades celulares y expresion de protemas altas. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microvehmulos para cultivo celular en biorreactores de tanque con agitacion. En otra realizacion, estos requisitos de crecimiento se cumplen a traves del uso de un cultivo celular en suspension.

C. Procedimientos de cultivo

En determinadas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion pueden comprender el uso de un sistema de cultivo celular que se hace funcionar en modo de funcionamiento discontinuo o continuo. Por ejemplo, cuando se utilizan cultivos celulares discontinuos, pueden hacerse funcionar en modo de un unico lote, semicontinuo o de lotes repetidos. Asimismo, los cultivos celulares continuos pueden hacerse funcionar, por ejemplo, en modo en perfusion, turbidostato o quimiostato. El cultivo celular discontinuo y continuo pueden realizarse en condiciones o bien en suspension o bien en adherencia. Cuando se hacen funcionar en condiciones en suspension, las celulas estaran suspendidas libremente y se mezclaran dentro del medio de cultivo. Alternativamente, en condiciones en adherencia, las celulas se uniran a una fase solida, por ejemplo, un microportador, un microportador poroso, portador de disco, cartucho de ceramica, fibra hueca, lamina plana, matriz de gel, y similares.

Un cultivo discontinuo normalmente es un cultivo celular a gran escala en el que se cultiva un inoculo celular hasta una densidad maxima en un tanque o fermentador, y se recoge y se procesa como un unico lote. Un cultivo

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semicontinuo normalmente es un cultivo discontinuo al que se suministran o bien nutrientes nuevos (por ejemplo, sustratos limitantes del crecimiento) o bien aditivos (por ejemplo, precursores para los productos). La solucion alimentada habitualmente esta altamente concentrada para evitar la dilucion del biorreactor. En un cultivo de lotes repetidos, las celulas se colocan en un medio de cultivo y se hacen crecer hasta una densidad celular deseada. Para evitar el comienzo de una fase de disminucion y muerte celular, se diluye entonces el cultivo con medio de crecimiento completo antes de que las celulas alcancen su concentracion maxima. La cantidad y la frecuencia de dilucion vanan ampliamente y depende de las caractensticas de crecimiento de la lmea celular y de la conveniencia del procedimiento de cultivo. El procedimiento puede repetirse tantas veces como se requiera y, a menos que las celulas y el medio se desechen como subcultivo, el volumen del cultivo aumentara gradualmente a medida que se realiza cada dilucion. El volumen creciente puede manejarse teniendo un reactor de tamano suficiente como para permitir diluciones dentro del recipiente o dividiendo el cultivo diluido en varios recipientes. El fundamento de este tipo de cultivo es mantener las celulas en un estado de crecimiento exponencial. El subcultivo en serie se caracteriza porque el volumen del cultivo siempre esta creciendo gradualmente, puede haber multiples recogidas, las celulas continuan creciendo y el procedimiento puede continuar durante tanto tiempo como se desee. En determinadas realizaciones, puede recuperarse una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) tras recoger el sobrenadante de un cultivo discontinuo

Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspension al que estan suministrandose continuamente nutrientes mediante el flujo de entrada de medio nuevo, en el que el volumen de cultivo habitualmente se mantiene constante mediante la retirada simultanea del medio gastado. En los procedimientos en quimiostato y turbidostato, el medio extrafdo contiene celulas. Por tanto, las celulas que permanecen en el recipiente de cultivo celular deben crecer hasta mantener un estado estacionario. En el procedimiento en quimiostato, la tasa de crecimiento se controla normalmente controlando la tasa de dilucion, es decir, la tasa a la que se anade medio nuevo. La tasa de crecimiento de las celulas en el cultivo puede controlarse, por ejemplo, a una tasa de crecimiento submaxima, mediante la alteracion de la tasa de dilucion. En contraposicion, en el procedimiento en turbidostato, la tasa de dilucion se fija para permitir la tasa de crecimiento maxima que pueden lograr las celulas en las condiciones de funcionamiento dadas, tales como pH y temperatura.

En un cultivo en perfusion, el medio extrafdo presenta reduccion de celulas, que se retienen en el recipiente de cultivo, por ejemplo, mediante filtracion o mediante procedimientos centnfugos que conducen a la reintroduccion de las celulas en el cultivo. Sin embargo, normalmente las membranas usadas para la filtracion no retienen el 100 % de las celulas, y por tanto se retira una proporcion cuando se extrae el medio. Puede que no sea crucial hacer funcionar cultivos en perfusion a tasas de crecimiento muy altas, ya que la mayona de las celulas quedan retenidas en el recipiente de cultivo.

El sistema de reactor de tanque con agitacion puede usarse para cultivos celulares discontinuos y continuos que se hacen funcionar en modos en suspension o adherente. Generalmente, el sistema de reactor de tanque con agitacion puede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque con agitacion convencional con cualquier tipo de agitador tal como un dispositivo Rushton, perfil hidrodinamico, pala con ajuste de paso o helice.

Los procedimientos de la invencion pueden comprender el uso de cultivo celular semicontinuo o cultivo celular continuo, tal como cultivo celular en perfusion o quimiostatico, para la expresion de una protema ADAMTS. En determinadas realizaciones, se encontro que los medios de cultivo semicontinuos complementados con cinc a concentraciones de hasta al menos aproximadamente 12 |iM proporcionaban expresion de una protema ADAMTS con actividades espedficas aumentadas (tabla 20). De manera notable, en cultivos semicontinuos complementados con cinc a una concentracion final de 12 |iM las tasas de crecimiento celular espedficas y la actividad total no resultaron afectadas, mientras que las actividades espedficas de las protemas ADAMTS13 expresadas continuaron aumentando. Esto esta en contraposicion con lo que se observo en experimentos que emplean cultivos celulares en quimiostato. En estos experimentos, la complementacion del medio de cultivo con cinc a una concentracion final de 5 |iM dio como resultado un aumento en la actividad espedfica de ADAMTS13 en el sobrenadante (tabla 21). Sin embargo, a niveles de complementacion superiores, 8,5 |iM y 12 |iM, las tasas de crecimiento celular espedficas y los rendimientos de protema ADAMTS13 totales disminuyeron, aunque la actividad espedfica de ADAMTS13 en el sobrenadante de cultivo permanecio alta.

Por consiguiente, en una realizacion los procedimientos de la invencion comprenden el uso de un cultivo celular semicontinuo con un medio que comprende cinc a una concentracion de cinc de al menos o aproximadamente 2 |iM, al menos o aproximadamente 5 |iM, de o aproximadamente entre 2 |iM y 12 |iM, de o aproximadamente entre 2 |iM y 5 |iM, de o aproximadamente entre 5 |iM y 12 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, en determinados aspectos comparativos 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En algunas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser de desde al menos aproximadamente 5 |iM hasta al menos aproximadamente 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente.

1. Cultivo continuo

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Ventajosamente, la presente invencion proporciona procedimientos de expresion de una protema ADAMTS, por ejemplo ADAMTS13, con actividad espedfica alta en un cultivo continuo. Estos procedimientos permiten la expresion y purificacion continuas de protemas ADAMTS procedentes de un unico cultivo a lo largo de periodos de tiempo prolongados. Espedficamente, se encontro que pod^an mantenerse niveles altos de expresion y actividad espedfica de protema ADAMTS13 durante al menos 53 d^as en un biorreactor de quimiostato de l0 l, en las condiciones proporcionadas por la presente invencion (ejemplo 3, vease, tabla 15). En una realizacion preferente, la protema AdAmTs es ADAmTs13.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona procedimientos de expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) con alta especificidad durante un periodo de tiempo prolongado. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos o aproximadamente 7 dfas, o al menos o aproximadamente 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos o aproximadamente 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos o aproximadamente 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas de estas realizaciones, el nivel de expresion, actividad o actividad espedfica totales de la protema ADAMTS se mantiene en el cultivo durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la tasa de crecimiento espedfica, la densidad celular, y similares se mantiene en el cultivo durante un periodo de tiempo prolongado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede complementarse con al menos uno de calcio, cinc, o nicotinamida (vitamina B3), por ejemplo, a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9). En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 7 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 14 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 21 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 1 mes. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 2 meses. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular continuo para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o mas meses. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En determinadas realizaciones, los procedimientos de expresion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) pueden comprender el uso de cultivo celular continuo con un medio que comprende cinc a una concentracion de cinc de al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 3 |iM y 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM, o cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas durante al menos 7 dfas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM durante al menos 7 dfas. En otras realizaciones, el medio de cultivo contendra cinc al menos aproximadamente 3 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra cinc al menos aproximadamente 5 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra o contendra aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 5 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra o contendra aproximadamente entre cinc 3 |iM y cinc 5 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra o contendra aproximadamente entre cinc 2 |iM y cinc 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo

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contendra o contendra aproximadamente entre cinc 3 |iM y cinc 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo

contendra o contendra aproximadamente entre cinc 5 |iM y cinc 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo

contendra cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, 13

|iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al

menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 d^as, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM durante al menos 7 dfas. En otras realizaciones, el medio de cultivo contendra calcio al menos aproximadamente 1,0 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio al menos aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio a o aproximadamente a entre 1,0 mM y 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM,

1.4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM,

4.5 mM, 5,0 mM o mas. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l durante al menos 7 dfas. En otras realizaciones, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 5 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B7) a o aproximadamente a entre 5 mg/l y 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con calcio durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses

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o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAmTs es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con calcio como con nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAmTs es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo continuo, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAmTs es ADAMTS13.

En una realizacion, el cultivo se mantiene a una densidad celular de entre aproximadamente 0,5x106 y 4x107 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x10° y aproximadamente 1,0x107 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. Aun en otras realizaciones, la densidad celular puede mantenerse a una concentracion de entre aproximadamente 2,0x106 y aproximadamente 4,0x106, o entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 2,5x106, o entre aproximadamente 1,5x106 y aproximadamente 3,5x106, o cualquier otro intervalo similar, durante un periodo de tiempo prolongado. La densidad celular a la que se mantiene un cultivo celular para la produccion de una protema AdAmTS recombinante (por ejemplo, ADAMTS13) dependera de las condiciones de cultivo y del medio usado para la expresion de la protema. Un experto en la tecnica podra determinar facilmente la densidad celular optima para un cultivo celular que produce una protema ADAMTS. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 500 unidades de actividad de ADAMTS13 por litro de cultivo al dfa (500 U/l/d), por ejemplo unidades de actividad mediante FRETS-VWF73, con una actividad espedfica de A13 de al menos o aproximadamente 500 U/mg. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 600 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 700 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 800 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 900 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1000 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1100 U/l/d. En otras realizaciones, los

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procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1200 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1300 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1400 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1500 U/l/d. Aun en otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 2000 U/l/d. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En otra realizacion, los procedimientos permiten la expresion ampliada de la protema ADAMTS13 con actividades espedficas altas, por ejemplo, una actividad espedfica de protema A13 de al menos aproximadamente 600 U/mg, o de protema A13 de al menos aproximadamente 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o mas U/mg durante un periodo de tiempo prolongado. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en quimiostato. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en turbidostato. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular en perfusion. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

2. Cultivo discontinuo

En otro aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos de expresion de una protema ADAMTS, por ejemplo ADAMTS13, con actividad espedfica alta en un cultivo discontinuo. En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede complementarse con al menos uno de calcio, cinc o nicotinamida (vitamina B3), por ejemplo, a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9). En una realizacion particular, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular de un unico lote. En otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular semicontinuo. Aun en otra realizacion, el procedimiento comprende el uso de cultivo celular de lotes repetidos. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 7 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 14 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 21 dfas. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 1 mes. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 2 meses. En otra realizacion, puede usarse una tecnica de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos para expresar una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un cultivo celular que contiene cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) a una concentracion segun una cualquiera de Var. 1 a Var. 149 (tabla 2 a tabla 9) durante al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o mas meses. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En determinadas realizaciones, los procedimientos de expresion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) pueden comprender el uso de cultivo celular semicontinuo o de lotes repetidos con un medio que comprende cinc a una concentracion de cinc de al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 3 |iM y 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM, o cinc al menos o aproximadamente 3 |iM,

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4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas durante al menos 7 d^as. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM durante al menos 7 dfas. En otras realizaciones, el medio de cultivo contendra calcio al menos aproximadamente 1,0 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio al menos aproximadamente 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio a o aproximadamente a entre 1,0 mM y 1,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema aDaMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l durante al menos 7 dfas. En otras realizaciones, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 5 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina B7) a o aproximadamente a entre 5 mg/l y 7 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contendra nicotinamida (vitamina b3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema

ADAMTS es ADAMTS13.

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En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con calcio durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

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En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con calcio como con nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 d^as. En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS comprende cultivar, en condiciones de cultivo semicontinuo o de lotes repetidos, una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) durante al menos 7 dfas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, el cultivo se mantiene a una densidad celular de entre aproximadamente 0,5x106 y 4x107 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x10° y aproximadamente 1,0x107 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentracion de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 celulas/ml durante un periodo de tiempo prolongado. Aun en otras realizaciones, la densidad celular puede mantenerse a una concentracion de entre aproximadamente 2,0x106 y aproximadamente 4,0x106, o entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 2,5x106, o entre aproximadamente 1,5x106 y aproximadamente 3,5x106, o cualquier otro intervalo similar, durante un periodo de tiempo prolongado. La densidad celular a la que se mantiene un cultivo celular para la produccion de una protema AdAmTS recombinante (por ejemplo, ADAMTS13) dependera de las condiciones de cultivo y del medio usado para la expresion de la protema. Un experto en la tecnica podra determinar facilmente la densidad celular optima para un cultivo celular que produce una protema ADAMTS. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 500 unidades de actividad de ADAMTS13 por litro de cultivo al dfa (500 U/l/d), por ejemplo unidades de actividad mediante FRETS-VWF73, con una actividad espedfica de A13 de al menos o aproximadamente 500 U/mg. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 600 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 700 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 800 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 900 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1000 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1100 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1200 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1300 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1400 U/l/d. En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 1500 U/l/d. Aun en otras realizaciones, los procedimientos de expresion de ADAMTS13 permiten la produccion de al menos o aproximadamente 2000 U/l/d. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones,

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el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADaMTS es ADAMTS13.

En otra realizacion, los procedimientos permiten la expresion ampliada de la protema ADAMTS13 con actividades espedficas altas, por ejemplo, una actividad espedfica de protema A13 de al menos aproximadamente 600 U/mg, o de protema A13 de al menos aproximadamente 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, l300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o mas U/mg durante un periodo de tiempo prolongado. En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En algunas realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos en suspension. En otras realizaciones, los cultivos pueden realizarse como cultivos discontinuos adherentes. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema aDaMTS es ADAMTS13.

3. Condiciones de cultivo

Sorprendentemente, tambien se ha encontrado que las viabilidades celulares y las actividades de ADAMTS13 pueden aumentarse mediante pequenas variaciones en la temperatura y el pH del cultivo celular. Tal como puede observarse en la figura 2, la actividad espedfica de ADAMTS13 expresada se mejora enormemente cuando se cultivan celulas que albergan un nucleotido que codifica una protema ADAMTS13 a un pH por debajo de aproximadamente 7,30. La temperatura, aunque en un grado menor, tambien es un factor que contribuye a la actividad de ADAMTS13 espedfica en estos estudios. De manera similar, se encontro que la productividad volumetrica de A13 (medida mediante FRETS-VWF73) en los sobrenadantes de cultivos cultivados a un pH de entre aproximadamente 6,80 y aproximadamente 7,3 aumentaba enormemente en comparacion con niveles de pH por encima y por debajo de ese intervalo. La productividad de ADAMTS13 tambien resultaba afectada por la temperatura del cultivo. Se encontro actividad maxima en cultivos cultivados a temperatura de entre aproximadamente 34 °C y aproximadamente 37 °C.

En otras realizaciones, los procedimientos de expresion de la protema ADAMTS comprenden una etapa de mantenimiento de la temperatura del medio de cultivo a una temperatura de aproximadamente 34 °C y aproximadamente 37 °C. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede mantenerse a una temperatura de 36,5 °C o menos, 36,0° o menos, 35,5 °C o menos, o menos de 35,0 °C. En una realizacion espedfica, la temperatura se mantiene a una temperatura de aproximadamente 36 °C. En una realizacion espedfica el cultivo se mantiene a una combinacion de los intervalos de temperatura y pH mencionados anteriormente, por ejemplo 36,5 °C o menos y a un pH por ejemplo de 7,15 o menos. En una realizacion preferente, el cultivo se mantiene a una temperatura de 36,0 °C y a un pH de 7,10.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, los procedimientos de expresion de la protema ADAMTS comprenden una etapa de mantenimiento del pH del medio de cultivo a un pH de entre aproximadamente 6,8 y 7,3. En determinadas realizaciones, el pH puede ser de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,25 o de entre aproximadamente 7,05 y aproximadamente 7,15. En determinadas realizaciones el pH puede mantenerse a un pH de 7,20 o menos, 7,15 o menos, 7,10 o menos o 7,05 o menos. En una realizacion espedfica, el pH del medio de cultivo se mantiene a un pH de aproximadamente 7,1.

En una realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) a una temperatura de o aproximadamente de entre 34 °C y aproximadamente 37 °C a un pH de o aproximadamente de entre 6,8 y 7,3. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35 °C y aproximadamente 37 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,8 y 7,3. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35,5 °C y aproximadamente 36,5 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,8 y 7,3. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de 36 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,8 y 7,3. En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con calcio. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y calcio. En una realizacion, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo se concentrara con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6).

En otra realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) a una temperatura de o aproximadamente de entre 34 °C y aproximadamente 37 °C a un pH de o

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aproximadamente de entre 6,9 y 7,25. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35 °C y aproximadamente 37 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,9 y 7,25. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35,5 °C y aproximadamente 36,5 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,9 y 7,25. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de 36 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 6,9 y 7,25. En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con calcio. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y calcio. En una realizacion, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo se concentrara con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6).

En otra realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para la expresion de una protema ADAMTS que comprende cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) a una temperatura de o aproximadamente de entre 34 °C y aproximadamente 37 °C a un pH de o aproximadamente entre 7,0 y 7,20. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35 °C y aproximadamente 37 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 7,0 y 7,20. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de entre 35,5 °C y aproximadamente 36,5 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 7,0 y 7,20. En otra realizacion, la temperatura del cultivo sera de o aproximadamente de 36 °C y el pH sera de o aproximadamente de entre 7,0 y 7,20. En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con calcio. En otra realizacion espedfica, el medio de cultivo se complementara con nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y calcio. En una realizacion, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En otra realizacion, el medio de cultivo se complementara con calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo se concentrara con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6).

El concepto de crecimiento celular sobre microveldculos los describio por primera vez van Wezel (van Wezel AL., Nature, 7 de octubre de 1967;216(5110):64-5) y permite la union celular sobre la superficie de pequenas partmulas solidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos procedimientos proporcionan altas razones de superficie con respecto a volumen y, por tanto, permiten la utilizacion eficaz de nutrientes. Ademas, para la expresion de protemas secretadas en lmeas celulares eucariotas, la razon aumentada de superficie con respecto a volumen permite niveles de secrecion superiores y por tanto rendimientos de protema superiores en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos procedimientos permiten la ampliacion a escala facil de cultivos de expresion en eucariotas.

Las celulas que expresan una protema ADAMTS pueden unirse a un microvedculo esferico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microvedculo seleccionado del grupo de microvedculos basados en dextrano, colageno, plastico, gelatina y celulosa, y otros tal como se describe en Butler (1988. En: Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303). Por tanto, segun una realizacion de la invencion, las celulas que expresan una protema ADAMTS se cultivan en microvedculos esfericos. Segun otra realizacion de la invencion, las celulas que expresan una protema ADAMTS se cultivan sobre microvedculos porosos. Tambien es posible hacer crecer las celulas hasta una biomasa sobre microvedculos esfericos y subcultivar las celulas cuando han alcanzado la biomasa final del fermentador y antes de la produccion de la protema expresada sobre un microportador poroso o viceversa. Los microvedculos esfericos son aquellos seleccionados del grupo de superficie lisa tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microvedculos macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, y Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

IV. Medios de cultivo

En un aspecto, la presente invencion proporciona medios de cultivo que son utiles para la expresion de protemas ADAMTS que tienen actividades espedficas altas. Ventajosamente, se ha encontrado que complementando un medio de cultivo con diversos componentes, tales como combinaciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3), las actividades de enzimas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) expresadas en celulas cultivadas en el medio se potencian enormemente, mientras que las enzimas se expresan a niveles tan altos, si no superiores, que las celulas cultivadas en medios no complementados.

Se conocen en la tecnica procedimientos de preparacion de medios de cultivo definidos qmmicamente, por ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770. En una realizacion, el medio de cultivo usado

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en los procedimientos descritos en el presente documento es medio libre de protemas animales o libre de oligopeptidos. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede estar definido qmmicamente. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo puede contener al menos una poliamina a una concentracion de aproximadamente 0,5 mg/l to aproximadamente 10 mg/l.

Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona un medio de cultivo que esta complementado con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicional. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En determinadas realizaciones, el medio libre de protemas animales o libre de oligopeptidos se prepara tal como se ensena en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770, y se complementa con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicional. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo definido qmmicamente puede ser similar a un medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que se ha complementado con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicional, con el fin de aumentar la actividad espedfica de una protema ADAMTS expresada en una celula cultivada en el medio. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo esta libre de componentes animales. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene protema, por ejemplo, protema animal de suero tal como suero de ternera fetal. En otra realizacion, el cultivo tiene protemas recombinantes anadidas de manera exogena. En otra realizacion, las protemas son de un animal libre de patogenos certificado.

En determinadas realizaciones, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentracion de a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 10 mg/l. En una realizacion, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En determinadas realizaciones la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similares. En una realizacion preferente, la poliamina es putrescina. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene o contiene aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l de putrescina.

En una realizacion, un medio de cultivo se proporciona para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, o al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados

aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de cinc para complementar los medios de la invencion, los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen ZnSO4'7H2O, ZnSO3-2H2O, (C6H5Oy)2Zn3-2H2O, ZnBr2, ZnBr2'2^O, ZnCl2, Zn (NO3)2'6H2O, Zn (H2PO4)2'H2O, (C2H3O2^Zn-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de cinc farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion. En otras realizaciones, puede usarse una preparacion de peptido o protema que contiene cinc, por ejemplo insulina, para complementar el cultivo proporcionado en el presente documento.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de calcio para complementar los medios de la invencion, los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen CaCl2, CaCl2, CaFPO3'2H2O, Cal2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6HyO6)2Ca, (C6H5Oy)2Ca3-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de calcio farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l. En una realizacion, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o concentraciones superiores

Ventajosamente, se ha encontrado que complementando un medio de cultivo tanto con cinc como con calcio, la actividad espedfica de la protema ADAMTS13 expresada en el medio de cultivo aumenta enormemente. Por consiguiente, en una realizacion, los medios de cultivo proporcionados en el presente documento para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) pueden complementarse tanto con cinc como con calcio. Por

ejemplo, un medio de cultivo puede complementarse con cinc y calcio a niveles proporcionados en la tabla 7, es dedr, a un nivel segun una cualquiera de Var. 94 a Var. 113.

Tabla 7. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivos complementados tanto con cinc como con calcio, 5 que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Calcio al menos 0,5 mM Calcio al menos 1,5 mM Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4.5 mM, 5,0 mM, o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 94 Var. 95 Var. 96 Var. 97

Cinc al menos 5 |iM

Var. 98 Var. 99 Var. 100 Var. 101

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 102 Var. 103 Var. 104 Var. 105

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 106 Var. 107 Var. 108 Var. 109

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM, o mas

Var. 110 Var. 111 Var. 112 Var. 113

*Var. = Variacion

De manera similar, se ha encontrado que complementando un medio de cultivo tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina B3), la actividad espedfica de protema ADAMTS13 expresada en el medio de cultivo

10 aumenta sinergicamente. Por ejemplo, este efecto puede observarse en el ejemplo 2 (comparese la tabla 14 dfa 11 con la tabla 13 dfas 4 y 7). Por consiguiente, en una realizacion, los medios de cultivo proporcionados en el presente documento para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) pueden complementarse tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina B3). Por ejemplo, un medio de cultivo puede complementarse con cinc y nicotinamida (vitamina B3) a niveles proporcionados en la tabla 8, es decir, a un nivel segun una cualquiera de Var.

15 114 a Var. 133.

Tabla 8. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo complementados tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina B3), que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Nicotinamida al menos 2 mg/l Nicotinamida al menos 7 mg/l Nicotinamida entre 2 mg/l y 7 mg/l Nicotinamida al menos 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, o mas

Cinc al menos 2 |iM

Var. 114 Var. 115 Var. 116 Var. 117

Cinc al menos 5 |iM

Var. 118 Var. 119 Var. 120 Var. 121

Cinc entre 2 |iM y 12 |iM

Var. 122 Var. 123 Var. 124 Var. 125

Cinc entre 5 |iM y 12 |iM

Var. 126 Var. 127 Var. 128 Var. 129

Cinc al menos 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, y en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM, o mas

Var. 130 Var. 131 Var. 132 Var. 133

Var. = Variacion

20

Ventajosamente, se ha encontrado que complementando un medio de cultivo tanto con nicotinamida como con calcio, la actividad espedfica de la protema ADAMTS13 expresada en el medio de cultivo aumenta enormemente. Por consiguiente, en una realizacion, los medios de cultivo proporcionados en el presente documento para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) pueden complementarse tanto con nicotinamida 25 (vitamina B3) como con calcio. Por ejemplo, un medio de cultivo puede complementarse con nicotinamida (vitamina B3) y calcio a niveles proporcionados en la tabla 9, es decir, a un nivel segun una cualquiera de Var. 134 a Var. 149.

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Tabla 9. Realizaciones a modo de ejemplo de medios de cultivo complementados tanto con nicotinamida (vitamina B3) como con calcio, que son utiles para la expresion de una protema ADAMTS13.

Nicotinamida al menos 2 mg/l Nicotinamida al menos 7 mg/l Nicotinamida entre 2 mg/l y 7 mg/l Nicotinamida al menos 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, o mas

Calcio al menos 0,5 mM

Var. 134 Var. 135 Var. 136 Var. 137

Calcio al menos 1,5 mM

Var. 138 Var. 139 Var. 140 Var. 141

Calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM

Var. 142 Var. 143 Var. 144 Var. 145

Calcio al menos 0,6 mM, 0,7 mM,

0,8

mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM,

1,2

mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM,

1,6

mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1.9 mM,

2,0 Var. 146 Var. 147 Var. 148 Var. 149

mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM,

3,0

mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM,

5,0

mM, o mas

Var. = Variacion

En algunas realizaciones, el medio de cultivo proporcionado por la invencion puede proporcionarse en una forma lfquida o seca o de polvo. El medio puede alicuotarse previamente en una cantidad adecuada para uso individual o proporcionarse en una cantidad mayor que puede usarse para mas de un cultivo celular. Generalmente, el medio de la invencion se proporcionara de una manera esteril. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona kits para la expresion o produccion de una protema ADAMTS13, comprendiendo los kits un medio de cultivo adecuado para la expresion de una protema ADAMTS que tiene actividad espedfica alta.

En un aspecto, la presente invencion proporciona medios de cultivo utiles para la expresion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) con actividades espedficas altas. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc entre aproximadamente 2 |iM y aproximadamente 12 mM. Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 5 |iM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc entre aproximadamente 5 |iM y aproximadamente 12 |iM. En otra realizacion, el medio de cultivo contiene calcio al menos aproximadamente 0,5 mM. Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene calcio entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 1,5 mM. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc al menos aproximadamente 2 |iM y calcio al menos aproximadamente 0,5 mM.

Aun en otras realizaciones, se ha encontrado que la adicion de nicotinamida (vitamina B3) potencia adicionalmente la expresion y la actividad espedfica de las protemas ADAMTS en cultivo celular. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 2 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas nicotinamida (vitamina B3) al menos aproximadamente 7 mg/l. Aun en otra realizacion, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 10 mg/l.

En determinadas realizaciones, el medio de cultivo es un medio de cultivo libre de protemas animales. En otra realizacion, el medio de cultivo es un medio definido qmmicamente. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede comprender una o mas poliaminas. En una realizacion particular, la poliamina es putrescina, por ejemplo, a una concentracion de al menos 0,5 mg/l. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene putrescina entre aproximadamente 2 mg/l y aproximadamente 8 mg/l.

1. Medios de cultivo libres de protemas

En determinados aspectos, la presente invencion proporciona medios de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que estan libres de protema anadida de manera exogena. “Medio de cultivo libre de protemas” y terminos relacionados se refiere un medio de cultivo que carece de protema que es de una fuente exogena a o distinta de las celulas en el cultivo, que liberan de manera natural protemas durante el crecimiento. En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que esta libre de protema anadida de manera exogena (es decir, libre de protema) y se complementa con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas contiene una poliamina. Por ejemplo, a una concentracion de al menos 2 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 30 mg/l, o a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. Se ensenan medios de cultivo libres de protemas a modo de ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

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En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, o cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM,

25 |iM, 30 |iM o mas.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, o calcio a o aproximadamente a entre 0,5 y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM,

1.2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM,

3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

Aun en otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, o nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas.

2. Medios de cultivo libres de oligopeptidos

En determinados aspectos, la presente invencion proporciona medios de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que estan libres de oligopeptidos anadidos de manera exogena. En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que esta libre de oligopeptidos anadidos de manera exogena (es decir, libre de polipeptidos) y se complementa con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo libre de oligopeptidos contiene una poliamina. Por ejemplo, a una concentracion de al menos 2 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 30 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. Se ensenan medios de cultivo libres de oligopeptidos a modo de ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, a o cinc aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, o cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM,

15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, o calcio a o aproximadamente a entre 0,5 y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM,

1.2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM,

3.5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

Aun en otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAmTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, o nicotinamida (vitamina b3) a o aproximadamente a entre 2 mg/k. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de oligopeptidos para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas.

3. Medios de cultivo libres de suero

En determinados aspectos, la presente invencion proporciona medios de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que estan libres de suero. En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que esta libre de suero anadido de manera exogena (es decir, libre de suero) y se complementa con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En

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determinadas realizaciones, el medio de cultivo libre de suero contiene una poliamina. Por ejemplo, a una concentracion de al menos 2 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 30 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. Se ensenan medios de cultivo libres de suero a modo de ejemplo en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM, o cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, o calcio a o aproximadamente a entre 0,5 y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM,

1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM,

3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

Aun en otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, o a o aproximadamente a entre nicotinamida (vitamina B3) 2 mg/l. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de suero para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas.

4. Medios de cultivo libres de protemas animales

En determinados aspectos, la presente invencion proporciona medios de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que estan libres protemas animales. En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), que esta libre de polipeptidos o protemas animales anadidos de manera exogena (es decir, libre de protemas animales) y se complementa con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo libre de protemas animales contiene una poliamina. Por ejemplo, a una concentracion de al menos 2 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 30 mg/l, o a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. Se ensenan medios de cultivo libres de protemas animales en las patentes estadounidenses numeros 6.171.825 y 6.936.441, WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud estadounidense numeros 2008/0009040 y 2007/0212770.

En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 2 |iM, cinc al menos o aproximadamente 5 |iM, cinc a o aproximadamente entre 2 |iM y 12 |iM, cinc o a o aproximadamente entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene cinc al menos o aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, en determinados aspectos comparativos 12 |iM, en determinados

aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas.

En otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM, calcio al menos o aproximadamente 1,5 mM, o calcio a o aproximadamente a entre 0,5 y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas.

Aun en otra realizacion, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 2 mg/l, nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 7 mg/l, o nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l. Aun en otras realizaciones, se proporciona un medio de cultivo libre de protemas animales para la expresion de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos o aproximadamente 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o mas.

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V. Purificacion de la protema ADAMTS

Se secreta ADAMTS13 al plasma in vivo, donde funciona regulando la actividad de coagulacion escindiendo mulffmeros grandes de vWF. La capacidad de las celulas de mai^ero para secretar ADAMTS13 tras la expresion puede aprovecharse durante la produccion y purificacion de composiciones de ADAMTS13 en cultivo celular. Por ejemplo, expresando ADAMTS13 recombinante en cultivo de celulas de mairnfero, pueden recuperarse facilmente composiciones de ADAMTS13 directamente del sobrenadante de cultivo sin la necesidad de recoger y lisar las celulas. Esto permite el uso de tecnicas tales como cultivo celular continuo (por ejemplo, cultivo celular quimiostaticos o en perfusion) para producir grandes cantidades de la protema sin multiples periodos de demora y recuperacion del cultivo. En un aspecto de la invencion, se proporcionan procedimientos para la purificacion de protemas ADAMTS que tienen una actividad espedfica alta del cultivo celular.

Por consiguiente, en una realizacion, se expresan protemas ADAMTS13 en cultivo y se recuperan directamente del sobrenadante de cultivo. De este modo, se recuperan protemas ADAMTS13 retirando una fraccion del cultivo y purificando ADAMTS13 de los otros componentes del sobrenadante. Generalmente, esto implica separar cualquier celula que se recupere junto con el sobrenadante mediante filtracion o centrifugacion y someter el sobrenadante a una o mas etapas de purificacion de ADAMTS13.

La publicacion de solicitud de patente estadounidense numero 2005/0266528 y Zheng y col.,(2001, Blood, 98:16621666) proporcionan procedimientos a modo de ejemplo para purificar ADAMTS13. Puede formularse ADAMTS13 purificada segun procedimientos convencionales y usarse terapeuticamente, por ejemplo, para tratar la PTT.

En un aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para producir una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, una composicion de ADAMTS13). En una primera realizacion, el procedimiento comprende las etapas de: (a) cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo libre de protemas animales; (b) retirar una fraccion del sobrenadante del cultivo; (c) realizar una etapa de filtracion o centrifugacion para retirar cualquier celula residual; (d) realizar una etapa de ultrafiltracion para concentrar la protema ADAMTS; y (e) realizar una etapa de diafiltracion con un tampon que comprende cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM y calcio al menos aproximadamente 0,1 mM; preparando de ese modo una composicion de ADAMTS.

En determinadas realizaciones, la etapa de cultivar una celula comprende cultivo celular discontinuo. En otras realizaciones, la etapa de cultivar una celula comprende cultivo celular continuo.

En determinadas realizaciones, el medio de cultivo contiene calcio. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene calcio al menos 0,5 mM. En otras realizaciones, el medio de cultivo contiene cinc. En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene cinc al menos 2 |iM. Aun en otras realizaciones, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion espedfica, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) al menos 2 mg/l. En determinadas realizaciones, el tampon de diafiltracion contiene cinc al menos aproximadamente 5 |iM y calcio al menos aproximadamente 2 mM.

En determinadas realizaciones, se pierde menos de aproximadamente el 20 % de la actividad de ADAMTS13 espedfica entre el final de la etapa (c) y el final de la etapa (e). En otras realizaciones, se pierde menos de aproximadamente el 10 % de la actividad de ADAMTS13 espedfica entre el final de la etapa (c) y el final de la etapa (e). Aun en otras realizaciones, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos aproximadamente 1.000 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos aproximadamente 1.500 U/mg.

A. Intercambio de tampon

Normalmente, cuando se purifica una protema secretada de un sobrenadante de cultivo, la primera etapa del procedimiento de purificacion implica intercambiar el medio de cultivo por una solucion tamponada, lo que facilita la purificacion adicional de la protema de interes. Existen varias opciones para intercambiar el medio de cultivo por un tampon, incluyendo sin limitacion, diafiltracion, dialisis, tecnicas de intercambio de tampon, filtracion en gel, cromatograffa, y similares.

Se encontro que composiciones de protema ADAMTS13 pierden una fraccion significativa de su actividad espedfica durante tales etapas de purificacion que requieren la introduccion de nuevos tampones, por ejemplo, diafiltracion, dialisis, intercambio de tampon, cromatograffa, y etapas similares, independientemente de la duracion de tiempo entre la recogida del sobrenadante del cultivo y la etapa de purificacion. Sin embargo, ventajosamente, los presentes inventores han descubierto que incluyendo cinc y calcio en el tampon que esta introduciendose en el sistema, tal como en diafiltracion, dialisis, intercambio de tampon, filtracion en gel y etapas cromatograficas, se conservan las actividades espedficas altas de la composicion de ADAMTS13. Como prueba de esto, el ejemplo 6 demuestra que la diafiltracion de una composicion de ADAMTS13 con un tampon que carece de calcio y cinc da como resultado una perdida promedio de casi el 25 % de la actividad espedfica de la composicion, mientras que la inclusion de calcio y

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cinc casi previene totalmente esta perdida (tabla 22). Por consiguiente, la presente invencion proporciona procedimientos para reducir la perdida de actividad para una composicion de protema ADAMTS tras la diafiltracion,

0 procedimientos similares, por ejemplo, dialisis, intercambio de tampon, cromatograffa, mediante la inclusion de cinc y calcio en el sistema de tampon.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para purificar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13), comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo; (b) recuperar una parte del sobrenadante del medio de cultivo que contiene una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13); y (c) intercambiar el sobrenadante del medio de cultivo por una solucion tamponada que contiene cinc y calcio, preparando de ese modo una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13). En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc, calcio y opcionalmente nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion preferente, la etapa de cultivar una celula comprende un cultivo continuo (por ejemplo, cultivo quimiostatico o en perfusion). En otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a una temperatura de entre 34 °C y 37 °C. Aun en otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a un pH de entre 6,9 y 7,2.

En una realizacion espedfica, la etapa de intercambiar el sobrenadante del medio de cultivo por una solucion tamponada comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM,

1 |iM, 2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas. Generalmente, cualquier combinacion de las concentraciones anteriores es adecuada para su uso en los presentes procedimientos.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para el intercambio de tampon de una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) realizando el intercambio de tampon (por ejemplo, diafiltracion, dialisis, filtracion en gel, etc.) con un tampon que contiene calcio y cinc. En una realizacion espedfica, el procedimiento comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 1 mM y cinc al menos o aproximadamente 1 |iM. En una realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 2 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. Aun en otras realizaciones, el tampon contiene calcio entre 0,5 mM y 5 mM y cinc entre 0,5 |iM y 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM, 1 |iM,

2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas. En una realizacion determinada la cosecha, el sobrenadante libre de celulas o el tampon de diafiltracion contienen combinaciones de calcio y cinc a las concentraciones mencionadas anteriormente.

En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para estabilizar la actividad enzimatica de una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) tras la expresion en cultivo celular que comprende complementar la cosecha que contiene celulas, el sobrenadante libre de celulas o un tampon de diafiltracion usado para concentrar o para el intercambio de tampon de una solucion de ADAMTS con calcio y cinc. En una realizacion espedfica, el procedimiento comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM, 1 |iM, 2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas. En una realizacion determinada la cosecha, el sobrenadante libre de celulas o el tampon de diafiltracion contiene combinaciones de calcio y cinc en las concentraciones mencionadas anteriormente.

En otras realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado una perdida de menos del 15 % de la actividad espedfica presente durante cualquier etapa individual. En una realizacion preferente, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado una perdida de menos del 10 % de la actividad espedfica presente durante cualquier etapa individual. En una realizacion particular, se pierde menos del 15 % de la actividad espedfica presente en el sobrenadante de cultivo recuperado durante una etapa de intercambio de tampon inicial (por ejemplo, diafiltracion o dialisis). En una realizacion preferente, se pierde menos del 10 % de la actividad espedfica presente en el sobrenadante de cultivo recuperado durante una etapa de intercambio de tampon inicial (por ejemplo, diafiltracion o dialisis).

B. Cromatografia

En determinadas realizaciones, la composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) se enriquece adicionalmente mediante una o mas etapas cromatograficas. En una realizacion, se proporciona un procedimiento para proporcionar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) enriquecida, comprendiendo el

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procedimiento las etapas de (a) cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo; (b) recuperar una parte del sobrenadante del medio de cultivo que contiene una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13); (c) intercambiar el sobrenadante del medio de cultivo por una solucion tamponada que contiene cinc y calcio, para formar una primera composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13); y (d) enriquecer adicionalmente la protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) con una etapa cromatografica, proporcionando de ese modo una composicion de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) enriquecida. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc, calcio y opcionalmente nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion preferente, la etapa de cultivar una celula comprende un cultivo continuo (por ejemplo, cultivo quimiostatico o en perfusion). En otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a una temperatura de entre 34 °C y 37 °C. Aun en otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a un pH de entre 6,9 y 7,2.

En una realizacion espedfica, la etapa de intercambiar el sobrenadante del medio de cultivo por una solucion tamponada y/o la etapa cromatografica comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En una realizacion preferente, ambas etapas comprenden el uso de tampones que contienen calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM, 1 |iM, 2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas. Generalmente, cualquier combinacion de las concentraciones anteriores es adecuada para su uso en los presentes procedimientos.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para mantener la actividad espedfica de una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) durante una etapa cromatografica complementando el/los tampon/tampones usado(s) en la etapa cromatografica con cinc y calcio. En una realizacion espedfica, el procedimiento comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 |iM, 1 |iM, 2 |iM, 3 |iM, 5 |iM, 10 |iM o mas. Generalmente, cualquier combinacion de las concentraciones anteriores es adecuada para su uso en los presentes procedimientos.

Los ejemplos no limitativos de tecnicas cromatograficas que pueden usarse para purificar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, una composicion de ADAMTS13) incluyen cromatograffa de intercambio anionico (AEC), cromatograffa de intercambio cationico (CEC), cromatograffa de intercambio hidrofobo (HIC), cromatograffa de hidroxiapatita (HAP), cromatograffa de inmunoafinidad, cromatograffa de exclusion molecular (es decir, filtracion en gel), u otra etapa cromatografica adecuada. Las etapas cromatograficas pueden realizarse en modo o bien discontinuo o bien en columna. En determinadas realizaciones, los tampones usados para realizar cualquiera de estas tecnicas cromatograficas incluiran cinc y calcio. En una realizacion espedfica, el procedimiento comprende el uso de un tampon que contiene calcio al menos o aproximadamente 0,5 mM y cinc al menos o aproximadamente 0,5 |iM. En otra realizacion, el tampon contiene calcio al menos o aproximadamente 2 mM y cinc al menos o aproximadamente 5 |iM. En determinadas realizaciones, la concentracion de calcio puede ser calcio al menos aproximadamente 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM o mas. En determinadas realizaciones, la concentracion de cinc puede ser cinc al menos aproximadamente 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM o mas. Generalmente, cualquier combinacion de las concentraciones anteriores es adecuada para su uso en los presentes procedimientos.

Puede usarse cualquier resina de intercambio anionico adecuada en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de resinas de intercambio anionico adecuadas para su uso incluyen resinas de dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q).

Puede usarse cualquier resina de intercambio cationico adecuada en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de resinas de intercambio cationico adecuadas para su uso incluyen resinas de carboximetilo (CM), sulfopropilo (SP), sulfonato de metilo (S).

Puede usarse cualquier resina a base de hidroxiapatita u otra a base de calcio adecuada en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de resinas adecuadas incluyen resinas de hidroxiapatita, resinas de fluorapatita, resinas de fluorhidroxiapatita, y similares.

Puede usarse cualquier resina de cromatograffa de interaccion hidrofoba adecuada en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de resinas adecuadas incluyen fenil-resinas, metil-resinas, butil-resinas, octil-resinas, y similares.

En determinadas realizaciones, una protema ADAMTS13 (por ejemplo, ADAMTS13) puede enriquecerse

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adicionalmente mediante cromatograffa de inmunoafinidad, por ejemplo con resinas conjugadas con un anticuerpo, aptamero u otra molecula de union altamente espedfica para la protema ADAMTS13 (por ejemplo, ADAMTS13).

En una realizacion, el procedimiento de reduccion de la perdida de actividad de ADAMTS da como resultado una perdida neta de menos del 20 % durante cualquier etapa individual, incluyendo pero sin limitarse a, intercambio de tampon, diafiltracion, dialisis, filtracion en gel, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, nanofiltracion, ultrafiltracion, filtracion esteril, y similares. En otras realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado una perdida de menos del 15 % de la actividad espedfica presente durante cualquier etapa individual. En una realizacion preferente, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado una perdida de menos del 10 % de la actividad espedfica presente durante cualquier etapa individual. En una realizacion particular, se pierde menos del 15 % de la actividad espedfica presente en el sobrenadante de cultivo recuperado durante una etapa de intercambio de tampon inicial (por ejemplo, diafiltracion o dialisis). En una realizacion preferente, se pierde menos del 10 % de la actividad espedfica presente en el sobrenadante de cultivo recuperado durante una etapa de intercambio de tampon inicial (por ejemplo, diafiltracion o dialisis).

C. Inactivacion y/o eliminacion de virus

En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento para la preparacion de una composicion de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) incluira ademas al menos una etapa de inactivacion o eliminacion viral. En determinadas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento incluiran al menos dos o al menos tres, etapas de inactivacion o eliminacion viral. Los ejemplos no limitativos de etapas de inactivacion o eliminacion viral que pueden emplearse con los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, tratamiento con disolvente-detergente (Horowitz y col.,Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 y Kreil y col.,Transfusion 2003 (43):1023-1028), nanofiltracion (Hamamoto y col.,Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasa y col.,J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024). En una realizacion preferente, la presente invencion proporciona procedimientos para la preparacion de una composicion de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) que comprende tratamiento con disolvente-detergente y nanofiltracion.

En una realizacion, se proporciona un procedimiento para proporcionar una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) segura desde el punto de vista de los virus, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo; (b) recuperar una parte del sobrenadante del medio de cultivo que contiene una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13); (c) intercambiar el sobrenadante del medio de cultivo por una solucion tamponada que contiene cinc y calcio, para formar una primera composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13); (d) opcionalmente enriquecer adicionalmente la protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) con una etapa cromatografica; y (e) realizar al menos una etapa de inactivacion o eliminacion de virus, proporcionando de ese modo una composicion de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) segura desde el punto de vista de los virus. En una realizacion, el medio de cultivo contiene cinc, calcio y opcionalmente nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion preferente, la etapa de cultivar una celula comprende un cultivo continuo (por ejemplo, cultivo quimiostatico o en perfusion). En otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a una temperatura de entre 34 °C y 37 °C. Aun en otra realizacion preferente, el cultivo se mantiene a un pH de entre 6,9 y 7,2. En una realizacion, la etapa de eliminacion de virus es nanofiltracion.

1. Tratamiento con disolvente y detergente (S/D)

Con el fin de inactivar diversos contaminantes virales que pueden estar presentes en cultivo de ADAMTS, pueden someterse una o mas disoluciones intermedias de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) a un tratamiento con disolvente-detergente (S/D). Se conocen bien en la tecnica procedimientos para el tratamiento con detergente de disoluciones (para revision vease Pelletier JP y col.,Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19(1):205-42). Generalmente, puede usarse cualquier tratamiento con S/D convencional conjuntamente con los procedimientos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se proporciona a continuacion un protocolo para un tratamiento con S/D.

En una realizacion, se anaden Triton X-100, Tween-20 y tri(n-butil)fosfato (TNBP) a una solucion intermedia de ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) a concentraciones finales de a o aproximadamente el 1,0 %, el 0,3 % y el 0,3 %, respectivamente. Entonces se agita la mezcla a una temperatura a o aproximadamente a entre 18 °C y 25 °C durante al menos aproximadamente una hora.

2. Nanofitracion y ultra/diafiltracion

Con el fin de reducir la carga viral de una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) proporcionada en el presente documento, la composicion puede nanofiltrarse usando un dispositivo de nanofiltracion adecuado. En determinadas realizaciones, el dispositivo de nanofiltracion tendra un tamano de poro medio de a o aproximadamente a entre 15 nm y 200 nm. Los ejemplos de nanofiltros adecuados para este uso incluyen, sin limitacion, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP®, Viresolve NFR® (Millipore), Planova® 15N, 20N, 35N y 75N

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(Planova). En una realizacion espedfica, el nanofiltro puede tener un tamano de poro medio de a o aproximadamente a entre 15 y 72 nm, o a o aproximadamente a entre 19 y 35 nm, o de a o aproximadamente a 15 nm, 19 nm, 20 nm, 35 nm o 72 nm. En una realizacion preferente, el nanofiltro tendra un tamano de poro medio de a o aproximadamente a 19 nm, 20 nm o 35 nm, tal como un filtro Asahi PLANOVA® 20N o PLANOVA® 35N o equivalente del mismo.

Posteriormente a la nanofiltracion, el filtrado puede concentrarse opcionalmente mediante ultrafiltracion y/o la composicion de tampon ajustarse mediante diafiltracion. En determinadas realizaciones, la ultrafiltracion se lleva a cabo en un casete con un tamiz de canal abierto y la membrana de ultrafiltracion tiene un punto de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de menos de a o aproximadamente a 175 kDa o menos de a o aproximadamente a 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, o menos kDa. En una realizacion preferente, la membrana de ultrafiltracion tiene un NMWCO de no mas de 30 kDa. En otra realizacion preferente, la membrana de ultrafiltracion tiene un NMWCO de no mas de 30 kDa.

3. Liofilizacion y tratamiento termico

Aun en otras realizaciones, la actividad viral de una composicion de protema ADAMTS13 (por ejemplo, ADAMTS13) liofilizada, que puede haberse sometido previamente a otras etapas de inactivacion o eliminacion viral tales como nanofiltracion, puede reducirse adicionalmente mediante tratamiento termico de la composicion liofilizada. Se conocen bien en la tecnica tratamientos termicos para la inactivacion de cargas virales en factores sangumeos (por ejemplo, vease, Piszkiewicz y col.,Thromb Res. 15 de julio de 1987; 47(2):235-41; Piszkiewicz y col.,Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein y Fricke, Arch Pathol Lab Med. Marzo de 1990; 114(3):335-40).

VI. Composiciones de ADAMTS

Ventajosamente, se ha encontrado que protemas ADAMTS, tales como ADAMTS13, expresadas en cultivos celulares complementados con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3) tienen actividades espedficas inesperadamente altas. Tal como se proporciona en el presente documento, se han desarrollado procedimientos para la expresion continua y recuperacion de tales protemas ADAMTS con actividades espedficas altas. Por ejemplo, procedimientos de cultivo celular continuo proporcionados en el presente documento permiten la expresion de mas de 1 mg de ADAMTS13 por litro al dfa con actividades espedficas de mas de 1000 U/mg durante mas de una semana o mas. De manera similar, tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos para reducir la perdida de actividad normalmente encontrada durante la purificacion de la protema ADAMTS13.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona composiciones de protema ADAMTS (por ejemplo, composiciones de ADAMTS13) expresadas en cultivo celular segun los procedimientos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se proporcionan composiciones de protema ADAMTS, en el que la protema se expresa cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en medio de cultivo complementado con al menos un componente seleccionado de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). Tambien se proporcionan composiciones de protema ADAMTS (por ejemplo, composiciones de ADAMTS13) que se purifican segun a procedimiento proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, se proporcionan composiciones de protema ADAMTS que se han purificado segun un procedimiento que comprende una etapa de intercambio de tampon, en el que el tampon de intercambio incluye cinc y calcio. En realizaciones preferentes de la invencion, la composicion de protema ADAMTS es una composicion de ADAMTS13.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona composiciones de protema ADAMTS (por ejemplo, composiciones de ADAMTS13) que se preparan mediante un procedimiento que comprende la expresion de la protema ADAMTS en un cultivo celular segun cualquier procedimiento proporcionado en el presente documento. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En un aspecto relacionado, la presente invencion proporciona composiciones de protema ADAMTS (por ejemplo, composiciones de ADAMTS13) que se preparan mediante un procedimiento que comprende la inclusion de tanto cinc como calcio en al menos un tampon durante la purificacion de la protema ADAMTS de un medio de cultivo. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

La presente invencion proporciona composiciones de protema ADAMTS (por ejemplo, composiciones de ADAMTS13) preparadas mediante un procedimiento proporcionado en el presente documento. En una realizacion, la composicion de ADAMTS (por ejemplo, composicion de ADAMTS13) se prepara cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en medio de cultivo complementado con al menos un componente seleccionado de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En una realizacion espedfica, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema AdAmTS en medio de cultivo complementado con al menos dos componentes seleccionados de calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). Aun en otra realizacion, el medio de cultivo esta complementado con calcio, cinc y nicotinamida (vitamina B3). En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede ser un medio de cultivo libre de protemas animales, libre de oligopeptidos o definido qmmicamente. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

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En una realizacion, se prepara una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, composicion de ADAMTS13) cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc al menos a o aproximadamente a 2 |iM. En otra realizacion, la composicion se prepara cultivando una celula de mairnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc al menos a o aproximadamente a 5 |iM. En una realizacion, la composicion se prepara cultivando una celula de mamnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 2 |iM y 12 |iM. En otra realizacion, la composicion se prepara cultivando una celula de mamnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc a o aproximadamente a entre 5 |iM y 12 |iM. Aun en otras realizaciones, la composicion se prepara cultivando una celula de marnffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc al menos a o aproximadamente a 2 |iM, o al menos a o aproximadamente a 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, en determinados aspectos comparativos 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En otra realizacion, el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo de suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo adherente. En otra realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo discontinuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo en modo en suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo en modo adherente. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion de una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, composicion de ADAMTS13), el medio de cultivo usado para la expresion de la protema ADAMTS puede complementarse con cinc a una concentracion final de al menos aproximadamente 2 |iM a al menos aproximadamente 12 |iM. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede complementarse con cinc a una concentracion final de al menos aproximadamente 2 |iM, o al menos aproximadamente 3 |iM, 4 |iM, 5 |iM, 6 |iM, 7 |iM, 8 |iM, 9 |iM, 10 |iM, 11 |iM, 12 |iM, 13 |iM, 14 |iM, 15 |iM, 20 |iM, 25 |iM, 30 |iM o niveles superiores de cinc. Generalmente, puede usarse cualquier sal de cinc para complementar los medios de la invencion, los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen ZnSO4'7H2O, ZnSOa-2H2O, ^HaOy^Zna^^O, ZnBr2, ZnBr2'2H2O, ZnCh, Zn(NO3)2'6H2O, Zn (H2PO4)2H2O, (C2H3O2)2Zn-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de cinc farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En otra realizacion, se prepara una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, composicion de ADAMTS13) cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende calcio al menos a o aproximadamente a 0,5 mM. En otra realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende calcio al menos a o aproximadamente a 1,5 mM. En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende calcio a o aproximadamente a entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aun en otras realizaciones, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende calcio al menos a o aproximadamente a 0,5 mM, o al menos a o aproximadamente a 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o mas. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C. En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En otra realizacion, el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo en suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo adherente. En otra realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo discontinuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo

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funcionando en modo en suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo funcionando en modo adherente. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS es una celula de mamnfero. En realizaciones particulares, la celula de mamnfero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de calcio para complementar los medios de la invencion. Los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen CaCl2, CaCl2, CaFPO3-2H2O, Cal2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (CaH5O7)2Ca3-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de calcio farmaceuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invencion.

En otra realizacion, se prepara una composicion de protema ADAMTS (por ejemplo, composicion de ADAMTS13) cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos a o aproximadamente a 2 mg/l. En otra realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamnfero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos a o

aproximadamente a 7 mg/l. En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aun en otras realizaciones, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula de mamffero que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende nicotinamida (vitamina B3) al menos a o

aproximadamente a 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o

concentraciones superiores. En una realizacion, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 35 °C y 37 °C.

En una realizacion espedfica, el cultivo se mantiene a o aproximadamente a 36 °C. En otra realizacion, el pH del cultivo se mantiene a o aproximadamente a entre 6,9 y 7,3. En una realizacion, la temperatura y/o el pH del cultivo se mantienen durante al menos 7 dfas. En una realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo continuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo en suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de quimiostato, turbidostato o perfusion funcionando en modo adherente. En otra realizacion, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo discontinuo. En realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo funcionando en modo en suspension. En otras realizaciones espedficas, el procedimiento se realiza en condiciones de cultivo de un unico lote, lotes repetidos o semicontinuo funcionando en modo adherente. En una realizacion, la celula que alberga el acido nucleico que codifica una protema ADAMTS es una celula de mamffero. En realizaciones particulares, la celula de mamffero es una celula de hamster, humana o murina. En una realizacion espedfica, la celula es una lmea celular CHO, una lmea celular HEK 293 o una lmea celular BHK. En otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo libre de protemas y/o polipeptidos animales. Aun en otra realizacion, la celula de mamffero se cultiva en un medio de cultivo sintetico, que puede estar o no libre de protemas y polipeptidos animales. En una realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas una poliamina a o aproximadamente a entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realizacion espedfica, la poliamina es putrescina. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con calcio. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y calcio seran una de Var. 94 a Var. 113 (tabla 7). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion, el cultivo en un cultivo en perfusion. En otra realizacion, el cultivo es un cultivo quimiostatico. En otras realizaciones, el cultivo es un cultivo semicontinuo o cultivo de lotes repetidos. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con cinc como con nicotinamida (vitamina b3). En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 114 a Var. 133 (tabla 8). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses

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o mas. En una realizacion, el cultivo es un cultivo en perfusion. En otra realizacion, el cultivo es un cultivo quimiostatico. En otras realizaciones, el cultivo es un cultivo semicontinuo o de lotes repetidos. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado tanto con calcio como con nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de Var. 134 a Var. 149 (tabla 9). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion, el cultivo es un cultivo en perfusion. En otra realizacion, el cultivo es un cultivo quimiostatico. En otras realizaciones, el cultivo es un cultivo semicontinuo o de lotes repetidos. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En una realizacion, se prepara una composicion de ADAMTS cultivando una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en un medio de cultivo complementado con cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cinc, calcio y nicotinamida (vitamina B3) seran una de las variaciones Var. 14 a Var. 93 (tabla 3 a tabla 6). En determinadas realizaciones, el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas, o al menos 14 dfas, 21 dfas, 28 dfas, o al menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o mas. En una realizacion, el cultivo es un cultivo en perfusion. En otra realizacion, el cultivo es un cultivo quimiostatico. En otras realizaciones, el cultivo es un cultivo semicontinuo o de lotes repetidos. En una realizacion preferente, la protema ADAMTS es ADAMTS13.

En otra realizacion, se proporcionan composiciones de ADAMTS13 con actividades espedficas altas, por ejemplo, una actividad espedfica de al menos 600 U/mg de protema A13. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos 700 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos 800 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos 900 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos 1000 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos 1100 U/mg. En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1200 U/mg.

En otra realizacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1300 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1400 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1500 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1600 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1700 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1800 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

1900 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

2000 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

2100 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

2200 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

2300 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

2400 U/mg. 2500 U/mg.

En otra real izacion, la composicion de ADAMTS13 tiene una actividad espedfica de al menos

VII. Ejemplos

Ejemplo 1

Se realizaron experimentos semicontinuos usando cultivos en biorreactor de la lmea de celulas HEK293 recombinantes 1020/1 013-2 que expresan ADAMTS13 humana en medio BACD-A13 definido qmmicamente. Se investigo el efecto de complementar el medio de cultivo con cinc adicional.

Se cultivaron celulas HEK293 recombinantes que expresan ADAMTS13 humana mediante cultivos celulares semicontinuos en biorreactores de 1,5 l con impulsores de paletas a un pH controlado en lmea de 7,20 a 37 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire. Se transfirio la suspension celular a 2 biorreactores identicos que conteman un medio de cultivo definido qmmicamente basado en DMEM/F12 (BACD- A13; tabla 12). Se hicieron crecer los dos cultivos en medios BACD-A13 preparados con o bien ZnSO4'7H2O 0,432 mg/l, como en DMEM/F12, o bien con una complementacion adicional de ZnSO4'7H2O 1 mg/l para una concentracion final de 1,432 mg/l. Por lo demas, los dos cultivos semicontinuos se trataron igual y por tanto pueden compararse directamente entre sf.

Se midio la actividad de A13 en sobrenadantes de cultivo mediante el ensayo de FRETS-VWF73 tras centrifugar o

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filtrar los sobrenadantes para retirar celulas residuales. Se midio la cantidad total de A13 mediante ELISA, usando un anticuerpo espedfico de A13 (tabla 10). El sobrenadante del cultivo que empleaba medio BACD-A13 con una concentracion de cinc en DMEM/F12 convencional tema una actividad de A13 de 728 y 826 mU/ml los dfas 3 y 6, respectivamente. Las actividades espedficas de los cultivos eran 482 mU/|ig y 526 mU/|ig de A13, respectivamente. En contraposicion, los sobrenadantes de cultivos que teman complementacion adicional de Zn, aunque tema solo rendimientos ligeramente mejorados de expresion de A13 (el 7 % y el 19 % mayores los dfas 3 y 6, respectivamente), mostraron actividades espedficas y totales de A13 drasticamente mejoradas (tabla 11). Tal como puede observarse comparando los resultados en la tabla 10 y la tabla 11, la actividad de FRETS-VWF73 de A13 total era el 118 % superior (1589 frente a 728) el dfa 3 y el 61 % superior (1381 frente a 728) el dfa 6 para cultivos hechos crecer en presencia de ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l en comparacion con cultivos hechos crecer a ZnSO4-7H2O 0,432 mg/l. De manera similar, la actividad espedfica de la protema A13 en los cultivos complementados era el 104 % superior (981 frente a 482 mU/mg) el dfa 3 y el 42 % superior (739 frente a 526 mU/mg) el dfa 6.

Se tomaron muestras de los biorreactores y se analizaron para determinar A13 mediante ELISA, se midio la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. Se determinaron los recuentos celulares mediante tecnologfa Nucleocounter. Se midieron las tasas de dilucion y se usaron para el calculo de las tasas de crecimiento y las productividades volumetricas.

Tabla 10. Datos de fermentacion para el cultivo semicontinuo 1 realizado en un biorreactor de 1,5 l con medio BACD-A13 sin complementacion con cinc.

Dfa de recogida del sobrenadante

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

3

2,18 0,619 728 1,51 482 228 0,41

6

1,88 0,256 826 1,57 526 178 0,32

Tabla 11. Datos de fermentacion para el experimento semicontinuo realizado en un biorreactor de 1,5 l con medio BACD-A13 con complementacion con cinc.

Dfa de recogida del sobrenadante

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

3

2,48 0,662 1589 1,62 981 515 0,45

6

1,38 0,11 1381 1,87 739 249 0,41

Tabla 12. Composicion del medio de cultivo celular BACD-A13 definido qmmicamente.

Composicion del medio de cultivo celular BACD-A13

Concentracion convencional

Aminoacidos

mg/l

L-Alanina

13,3500

L-Arginina HCl

147,5000

L-Asparagina-H2O

45,1600

Acido L-aspartico

19,9500

L-Cistema HCEH2O

32,5500

L-Cistema 2HCl

102,3500

Acido L-glutamico

22,0500

Glicina

26,2500

L-Histidina-H2O HCl

51,4800

L-Isoleucina

74,4700

L-Leucina

119,0500

L-Lisina HCl

146,2500

L-Metionina

100,0000

L-Fenilalanina

60,4800

L-Prolina

63,7400

L-Serina

36,750

L-Treonina

53,4500

L-Triptofano

29,0100

L-Tirosina 2Na 2H2O

75,7900

L-Valina

82,8500

Sales

mg/l

Cloruro de calcio (CaCh)

Variable (58,3-174,9)

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Sulfato de cobre (CuSO4-5H2O)

0,0026

Nitrato ferrico (Fe(NOa)3-9H2O)

0,0500

Sulfato ferroso (FeSO4-7H2O)

1,0170

Cloruro de magnesio (MgCh)

28,6400

Sulfato de magnesio (MgSO4)

48,8400

Cloruro de potasio (KCl)

311,8000

Cloruro de sodio (NaCl)

5495,5000

Na2HPO4 anhidro

106,5100

NaH2PO4 anhidro

54,3500

Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4-27H2O)

Variable (0,432-3,432)

Selenito de sodio.anhidro

0,0087

Vitaminas

mg/l

Acido ascorbico

3,499

Biotina

0,0035

Cloruro de colina

8,980

D-Pantotenato de Ca

2,240

Acido folico

2,650

I-Inositol

12,600

Nicotinamida

Variable (2,0-7,0)

Piridoxina HCl

2,031

Riboflavina

0,219

Tiamina HCl

2,170

Vitamina B12

0,680

Miscelaneo

mg/l

D-Glucosa

5000,00

Acido linoleico

0,042

Acido lipoico

0,105

Putrescina 2HCl

3,681

Timidina

0,365

Hipoxantina de Na

2,390

Piruvato de sodio

55,000

mg/l

L-Glutamina

1000,0000

Pluronic F68

1000,0000

Etanolamina

1,5300

Hidrogenocarbonato de Na

1,5000

Ejemplo 2

Se realizaron experimented semicontinuos usando cultivos en biorreactor de la lmea celular CHO recombinante n.° 938 que expresa ADAMTS13 humana en medio BACD-A13 definido qmmicamente. Se investigo el efecto de la complementacion del medio de cultivo con cinc y/o vitamina B3 adicional.

Se adaptaron celulas CHO recombinantes que expresan ADAMTS13 humana a un medio BCS definido qmmicamente (medio BCS). Se descongelo el clon n.° 938 de Development Working Cell Bank#01 (DWCB#01) y se preparo el inoculo celular en medio BCS. Se transfirieron las celulas a dos biorreactores de 1,5 l con impulsores de paletas y se hicieron crecer en cultivo celular semicontinuo en medio BACD-A13 registrado con un pH controlado en lmea de 7,20 a 37 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire. Se hicieron crecer los dos cultivos en medios BACD-A13 preparados con o bien ZnSO4-7H2O 0,432 mg/l, como en DMEM/F12, o bien con una complementacion adicional de ZnSO4-7H2O 1 mg/l para una concentracion final de 1,432 mg/l. Por lo demas, los dos cultivos semicontinuos se trataron igual y, por tanto, pueden compararse directamente entre sf. Se recogieron los sobrenadantes los dfas 4 y 7 y se analizaron para determinar la protema A13 y los niveles de actividad. Tras la recogida el dfa 7, se complementaron ambos cultivos con nicotinamida (vitamina B3) 5 mg/l adicional, para una concentracion final de 7,02 mg/l, y se hicieron crecer en condiciones identicas durante 4 dfas adicionales. Se recogieron de nuevo los sobrenadantes el dfa 11 y se analizaron para determinar los niveles de protema A13 de actividad.

En el primer cultivo, cultivado sin complementacion con cinc, los niveles de actividad de A13 en el sobrenadante recogido fueron de 642 y 488 mU/ml los dfas 4 y 7, respectivamente (tabla 13). Las actividades espedficas para estos sobrenadantes fueron de 371 y 273 mU/|ig los dfas 4 y 7, respectivamente. Tal como se observo anteriormente en el ejemplo 1, las actividades espedficas y total de la A13 en el sobrenadante de cultivo complementado con cinc adicional estaban significativamente aumentadas (comparense la tabla 13 y la tabla 14 los dfas de recogida 4 y 7). Como anteriormente, la A13 total producida en ambos cultivos era similar, sin embargo, la actividad total de la A13 del sobrenadante del segundo cultivo, complementado con cinc adicional, fue un 40 % y un

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104 % mayor los dfas 4 y 7, respectivamente, y la actividad espedfica fue un 78 % y un 75 % mayor los dfas 4 y 7 (tabla 14 frente a tabla 13). Otros parametros, incluyendo el rendimiento de A13 total y la tasa de crecimiento celular paredan no estar afectados por la complementacion adicional con cinc.

Tras la recogida de los sobrenadantes el dfa 7, se complementaron adicionalmente ambos cultivos con nicotinamida (vitamina B3) 5 mg/l adicional y se cultivaron en condiciones identicas durante 4 dfas adicionales. Se recogieron los sobrenadantes como anteriormente el dfa 11. La complementacion con vitamina B3 dio como resultado un aumento en la actividad de FRETS-VWF73 total y la actividad espedfica de A13 encontrada en los sobrenadantes de ambos cultivos (tabla 13 y tabla 14, dfa 11). De manera notable, estos valores se duplicaron aproximadamente en ambos cultivos. El dfa 11, el sobrenadante del cultivo 2, complementado con adicion de cinc y vitamina B3, demostro una actividad total casi del 200 % mayor (2.366 frente a 791 mU/ml) y una actividad espedfica el 174 % mayor (1.189 frente a 432 mU/mg) que el sobrenadante recogido del cultivo 1.

La complementacion del medio con nicotinamida sola dio como resultado un aumento de aproximadamente el 60 % de la actividad total (791 mU/ml frente a 488 mU/ml; comparese la tabla 13 los dfas 7 y 11) y la actividad espedfica (432 mU/|ig frente a 273 mU/|ig; comparese en la tabla 13 los dfas 7 y 11) de A13. De manera similar, la complementacion del medio con cinc solo dio como resultado aumentos de entre aproximadamente el 70 % y el 80 % en la actividad total y actividad espedfica de A13 (comparense la tabla 13 y la tabla 14 los dfas 4 y 7). Sorprendentemente, la complementacion del medio de cultivo con tanto nicotinamida como cinc dio como resultado un aumento sinergico de entre aproximadamente el 300 % y el 400 % en la actividad total (comparese la tabla 14 el dfa 11 con la tabla 13 los dfas 4 y 7) y de entre aproximadamente el 200 % y el 300 % en la actividad espedfica (comparese la tabla 14 el dfa 11 con la tabla 13 los dfas 4 y 7) de A13, demostrando una interaccion sinergica inesperada entre los efectos del cinc y la nicotinamida.

Tabla 13. Datos de fermentacion para el experimento discontinuo CP_07/18_M04: hA13 CHO Klon #985/1 938 DWCB#01.

Dfa de recogida del sobrenadante

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

4*

2,33 0,539 642 1,73 371 161 0,43

7*

1,58 0,407 488 1,79 273 120 0,48

11

1,65 0,413 791 1,83 432 173 0,37

* BAV-CD-A13; ZnSO4-7H2O 0,432 mg/l; nicotinamida 2 mg/ f BAV-CD-A13; ZnSO4-7H2O 0,432 mg/l; nicotinamida 7 mg/l

Tabla 14. Datos de fermentacion para el experimento discontinuo CP_07/18_M07: hA13 CHO Klon #985/1 985 DWCB#01.

Dfa de recogida del sobrenadante

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

4*

1,73 0,527 898 1,36 660 224 0,34

7*

2,10 0,505 996 2,08 479 252 0,57

11f

1,88 0,420 2366 1,99 1189 550* 0,41

* BAV-CD-A13; ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l; nicotinamida 2 mg/ f BAV-CD-A13; ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l; nicotinamida 7 mg/l

Ejemplo 3

Se hizo crecer un cultivo celular en quimiostato de la lmea celular CHO recombinante n.° 640-2 que expresaba ADAMTS13 humana, en medio BACD-A13 definido qmmicamente complementado con cinc adicional y vitamina B3. Se mantuvo el cultivo de 10 l durante 53 dfas y se monitorizo la produccion de protema A13 y la actividad a lo largo del tiempo.

Se adaptaron celulas CHO recombinantes que expresaban ADAMTS13 humana a un medio registrado definido qmmicamente (medio BCS). Se descongelo un vial del banco de celulas y se preparo el inoculo celular en medio BCS. Se transfirieron celulas propagadas a partir del clon de expresion de A13 n.° 640-2 a un biorreactor de 10 l con impulsores de tipo Rushton y se cultivaron en cultivos discontinuos repetidos con medio BACD-A13 registrado a un pH controlado en lmea de 7,15-7,20 a 37 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire. Tras cultivar los 2 cultivos discontinuos hasta el volumen de trabajo final de 10 l, se cambio el biorreactor a alimentacion continua con medio el dfa 5 y se hizo funcionar durante 48 dfas adicionales en un modo en quimiostato.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se tomaron semanalmente muestras del sobrenadante de los biorreactores y se analizaron para determinar la produccion de protema A13 mediante ELISA y la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. Se determinaron los recuentos celulares mediante tecnologfa Nucleocounter. Se midieron las tasas de dilucion y se usaron para el calculo de las tasas de crecimiento y las productividades volumetricas.

En condiciones de cultivo continuo usando medio BACD-A13 definido qmmicamente complementado con cinc y nicotinamida a una concentracion final de ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l y nicotinamida 7,02 mg/l, se lograron niveles altos de produccion de protema A13, entre 0,9 y 1,3 mg/l/D, y actividades espedficas, entre aproximadamente 800 y 1100mU/|ig de A13 (tabla 15). Estos resultados concordaban con la produccion de protema y las actividades espedficas logradas con el clon de CHO n.° 938, como en el ejemplo 2. De manera notable, las productividades espedficas de celulas y volumetricas aumentaron a lo largo del tiempo en el cultivo a largo plazo, probablemente debido a las tasas de dilucion y crecimiento crecientes a lo largo del tiempo. La actividad espedfica alta de la A13 expresada pudo mantenerse al menos a un nivel alto de manera constante a lo largo de al menos las 7 semanas en las que el cultivo se hizo crecer en condiciones quimiostaticas. De hecho, la actividad espedfica de la A13 producida en el cultivo aumento realmente desde aproximadamente 800 mU/|ig de A13 en la semana 2 hasta aproximadamente 1100 mU/|ig de A13 en la semana 7.

Tabla 15. Datos de fermentacion para el experimento de cultivo continuo CP_07/30_F02: hA13 CHO Klon #987/1 640-2.

Semana de cultivo en quimostato n.°

Concen tracion celular Tasa de crecimiento espedfica Tasa de dilucion FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

f10B celulas/mll

[1/d] [1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

2

1,43 0,36 0,36 1954 2,48 788 713 0,91

3

1,56 0,41 0,40 2254 2,32 972 913 0,94

4

1,46 0,38 0,40 2244 2,41 931 889 0,95

5

1,58 0,43 0,43 2514 2,88 873 1086 1,24

6

1,70 0,51 0,46 2737 2,71 1010 1270 1,26

7

1,76 0,53 0,52 2322 2,18 1065 1200 1,13

Ejemplo 4

Se realizaron experimentos de cultivo celular en quimiostato y semicontinuo usando cultivos en biorreactor de la lmea celular CHO recombinante n.° 640-2 que expresa aDaMTS 13 humana en medio BACD-A13 definido qmmicamente. Se investigo el efecto de la complementacion del medio de cultivo con diferentes niveles de cinc.

Se adaptaron celulas CHO recombinantes que expresan ADAMTS13 humana a un medio registrado definido qmmicamente, medio BCS, en modo semicontinuo. En resumen, se descongelo DWCB#05 y se preparo el inoculo celular en medio BCS. Se transfirieron las celulas a un biorreactor de 1,5 l con impulsores de paletas y en medio BACD-A13 registrado complementado con nicotinamida a una concentracion final de 7 mg/l, pero sin complementacion con cinc a un pH controlado en lmea de 7,20 a 37 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire. Entonces se dividio la suspension de celulas del lote en tres biorreactores identicos que conteman medio BACD-A13 complementado con nicotinamida a una concentracion final de 7 mg/l con diferentes complementaciones con Zn (ZnSO4-7H2O 0 mg/l; 0,5 mg/l; y 1,0 mg/l hasta una concentracion final de ZnSO4-7H2O 0,432 mg/l; 0,932 mg/l; y 1,432 mg/l).

Los medios BACD-A13 inclman ZnSO4'7H2O 0,432 mg/l con o sin complementacion de cinc adicional. Por lo demas, los cultivos y el medio eran iguales y por tanto pueden compararse directamente entre sf. Se hicieron crecer los cultivos en modo semicontinuo durante aproximadamente una semana y se sometio a ensayo el sobrenadante para determinar la produccion de protema A13 y la actividad de FRETS-VWF73. A continuacion, se cambiaron los tres biorreactores al modo de cultivo en quimiostato y se hicieron funcionar durante aproximadamente 2 semanas en condiciones de cultivo continuo usando los medios con diferentes complementaciones con cinc, tal como se ha descrito anteriormente.

En las condiciones de cultivo semicontinuo, consecuente con los resultados observados en los ejemplos 1 y 2, la complementacion del medio con ZnSO4'7H2O o bien 0,5 mg/l o bien 1,0 mg/l aumento significativamente la actividad espedfica de la protema A13 en el sobrenadante (785 mU/|ig y 876 mU/|ig, respectivamente) en comparacion con medio no complementado con cinc adicional (437 mU/|ig) (tabla 16). Como anteriormente, otros parametros, incluyendo la produccion de protema A13 total y el crecimiento celular espedfico, no se vieron afectados por la complementacion con cinc adicional.

Tabla 16. Datos de fermentacion para experimentos semicontinuos de la expresion de A13 humana en medio con y sin complementacion con cinc adicional.

5

10

15

20

25

30

35

Cinc adicional

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

0

1,44 0,420 853,0 1,952 437 230,3 0,506

0,5 mg/l

1,73 0,502 1687,7 2,151 785 470,0 0,563

1,0 mg/l

1,44 0,441 1589,2 1,814 876 430,8 0,472

Tras cambiar los biorreactores al modo en quimiostato, se hicieron crecer los cultivos en condiciones de cultivo continuo durante aproximadamente una semana (semana 2) usando los medios con diferentes complementaciones con cinc, tal como se describio anteriormente. Se tomaron semanalmente muestras del sobrenadante de los biorreactores y se analizaron para determinar la produccion de protema A13 mediante ELISA y la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. Similar a los resultados observados para cultivos hechos crecer en el modo semicontinuo, la complementacion del medio de crecimiento usado para cultivo continuo hecho crecer con cinc adicional dio como resultado la mejora sustancial de actividades espedficas de A13 (697 mU/|ig y 729 mU/|ig para la complementacion con ZnSO4-7H2O 0,5 mg/l y 1,0 mg/l, respectivamente) tras una semana, en comparacion con ausencia de complementacion (553 mU/|ig) (tabla 17, tabla 18 y tabla 19).

Anteriormente, se habfa observado que la actividad espedfica de A13 expresada en cultivo celular continuo mejoro realmente a lo largo de un periodo de tiempo prolongado (vease el ejemplo 3). Para investigar si este resultado podfa repetirse o no, los cultivos hechos crecer en medio complementado con cinc adicional se continuaron durante una semana adicional. Tal como se observa en la tabla 18 y la tabla 19, la actividad espedfica de A13 en los sobrenadantes de ambos cultivos aumentaron de nuevo a lo largo del tiempo. La actividad espedfica de A13 encontrada en el sobrenadante del medio complementado con ZnSO4-7H2O 0,5 mg/l aumento desde 697 mU/mg en la semana 2 hasta 759 mU/mg en la semana 3 (tabla 18). De manera similar, la actividad espedfica de A13 encontrada en el sobrenadante del medio complementado con ZnSO4-7H2O 1,0 mg/l aumento desde 729 mU/mg en la semana 2 hasta 812 mU/mg en la semana 3 (tabla 19). Como anteriormente, el crecimiento celular espedfico no se vio afectado por la complementacion con cinc adicional. Sin embargo, de manera notable, la produccion de protema A13 pareda aumentar en ambos cultivos complementados con cinc adicional en comparacion con la produccion en cultivos no complementados con cinc.

Tabla 17. Datos de fermentacion para experimentos de cultivo celular en quimiostato sin complementacion de cinc adicional.

Semana de cultivo en quimostato n.°

Concen- tracion celular Tasa de crecimiento espedfica Tasa de dilucion FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

2

1,25 0,340 0,339 1091,8 1,973 553 370,1 0,669

Tabla 18. Datos de fermentacion para experimentos de cultivo celular en quimiostato con complementacion de cinc adicional de 0,5 mg/l.

Semana de cultivo en quimostato n.°

Concen- tracion celular Tasa de crecimiento espedfica Tasa de dilucion FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

2

1,37 0,350 0,341 1725,5 2,476 697 588,4 0,844

3

1,37 0,362 0,353 1971,7 2,597 759 696,0 0,917

Tabla 19. Datos de fermentacion para experimentos de cultivo celular en quimiostato con complementacion de cinc adicional de 1,0 mg/l.

Semana de cultivo en quimostato n.°

Concen- tracion celular Tasa de crecimiento espedfica Tasa de dilucion FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

2

1,21 0,327 0,340 1681,7 2,307 729 571,8 0,784

3

1,21 0,330 0,353 1892,2 2,331 812 667,9 0,823

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se realizaron experimentos de experimentos de cultivo celular en quimiostato y semicontinuo usando cultivos en biorreactor de la lmea celular CHO recombinante n.° F6 que expresa ADAMTS13 humana en medio BACD-A13 definido qmmicamente. Se investigo el efecto de complementar el medio de cultivo con niveles superiores de cinc.

Se adaptaron celulas CHO recombinantes que expresan ADAMTS13 humana a un medio registrado definido qmmicamente, medio BCS, en modo semicontinuo. Se subclonaron las poblaciones adaptadas y se derivo un clon n.° F6 a partir de las mismas.

En resumen, se descongelo DWCB#19 y se preparo el inoculo celular en medio BCS. Se transfirieron las celulas a tres biorreactores de 1,5 l con impulsores de paletas y en medio BACD-A13 registrado complementado con ZnSO4'7H2O 1,0 mg/l, 2,0 mg/l y 3,0 mg/l para concentraciones finales de ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l, 2,432 mg/l y 3,432 mg/l, respectivamente. Se hicieron crecer los cultivos a un pH controlado en lmea de 7,15 a 36 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire.

Se hicieron crecer los cultivos en modo discontinuo repetido (3 lotes) durante aproximadamente una semana y se sometio a ensayo el sobrenadante para determinar la produccion de protema A13 y la actividad de FRETS-VWF73. Entonces se cambiaron los tres biorreactores al modo de cultivo en quimiostato y se hicieron funcionar durante 10 dfas en condiciones de cultivo continuo usando los medios con diferentes complementaciones con cinc, tal como se describio anteriormente.

En las condiciones de cultivo semicontinuo, la complementacion de los medios de cultivo con cantidades crecientes de cinc aumento adicionalmente la actividad espedfica de A13 secretada en los sobrenadantes de cultivo. Consecuente con los resultados previos notificados anteriormente, la complementacion del medio con ZnSO4-7H2O 1,0 mg/l adicional dio como resultado una actividad espedfica alta de 806 mU/|ig. Aumentos adicionales en la concentracion de cinc, es decir complementacion con 2,0 mg/l y 3,0 mg/l, dieron como resultado niveles incluso superiores de actividad de A13 espedfica (880 mU/|ig y 889 mU/|ig, respectivamente) (tabla 20). Como anteriormente, otros parametros, incluyendo la produccion de protema A13 total y el crecimiento celular espedfico, no se vieron afectados por la complementacion con cinc adicional.

Tabla 20. Datos de fermentacion para experimentos discontinuos con complementacion de cinc adicional (datos medios de 3 lotes).

Cinc adicional

Concentracion celular Tasa de crecimiento espedfica FRETS de A13 ELISA de A13 Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[106 celulas/ml]

[1/d] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

1,0 mg/l

1,78 0,592 1666,6 2,074 806 633,8 0,687

2,0 mg/l

1,68 0,596 1678,0 1,883 880 621,8 0,619

3,0 mg/l

1,55 0,589 1670,1 1,844 889 580,8 0,625

Tras cambiar los biorreactores al modo en quimiostato, se hicieron crecer los cultivos en condiciones de cultivo continuo durante 10 dfas usando los medios con diferentes complementaciones con cinc, tal como se describio anteriormente. Se analizaron muestras del sobrenadante de los biorreactores para determinar la produccion de protema A13 mediante ELISA y la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. A diferencia de los resultados observados para cultivos hechos crecer bajo el modo semicontinuo, la complementacion del medio de crecimiento usado para el crecimiento del cultivo continuo con niveles superiores de cinc dio como resultado una disminucion en la tasa de crecimiento espedfica y la viabilidad celular global. El crecimiento del cultivo en quimiostato en medio complementado con ZnSO4-7^O 1,0 mg/l adicional siguio presentando una alta viabilidad celular (88,6 %) y una tasa de crecimiento espedfico (0,256 al dfa) (tabla 21) consecuente con los resultados previos descritos anteriormente.

En cambio, los cultivos hechos crecer en medios complementados con niveles superiores de ZnSO4-7H2O, 2,0 mg/l y 3,0 mg/l, presentaron reducciones significativas en los niveles de viabilidad celular (el 72,1 % y el 80,4 %, respectivamente) y las tasas de crecimiento espedfico (0,091 y 0,134 al dfa, respectivamente). Sin embargo, de manera notable, la actividad espedfica de A13 en los dos sobrenadantes de cultivo permanecio alta (863 mU/|ig y 771 mU/|ig, respectivamente) (Tabla 21).

Tabla 21. Datos de fermentacion para experimentos de cultivo celular en quimiostato con complementacion de cinc adicional.

Cinc

Concen- Tasa Tasa Viabi- FRETS ELISA Acti- Rendi- Rendi- Consumo

adicional

tracion de de lidad de A13 de vidad miento miento de

celular creci- dilucion celular A13 espe- de de A13 glucosa

miento dfica FRETS

5

10

15

20

25

30

35

40

especf- fica

[106 celulas/ ml]

[1/d] [1/d] [%] [mU/ml] [|ig/ml] [mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d] [g/L/d]

1,0 mg/l

1,28 0,256 0,336 88,6 2716,0 3,127 868 911,5 1,050 1,21

2,0 mg/l

0,55 0,091 0,321 72,1 1408,9 1,632 863 452,7 0,524 0,58

3,0 mg/l

0,56 0,134 0,321 80,4 1359,8 1,763 771 436,5 0,566 0,64

Ejemplo 6

Se expreso la protema A13 humana en la lmea celular CHO recombinante n.° 640-2 en un medio BACDA13 definido qmmicamente complementado con cinc adicional y nicotinamida en biorreactores de 50 l. Tras recoger los sobrenadantes de los cultivos, se realizo una comparacion de las etapas de ultra/diafiltracion (50 kD) usando tampones con y sin cinc y calcio.

Se adaptaron celulas CHO recombinantes que expresan ADAMTS13 humana a un medio registrado definido qmmicamente, medio BCS. En resumen, se descongelo un DWCB y se preparo el inoculo celular en medio BCS. Se transfirieron las celulas por medio de un biorreactor de 10 l a un biorreactor de 50 l con impulsores de tipo Rushton y se cultivaron en modo en quimiostato en medio BACD-A13 registrado a un pH controlado en lmea de 7,15-7,20 a 37 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire.

Se filtraron los sobrenadantes de los biorreactores y se ultrafiltraron las cosechas libres de celulas usando una membrana de PES de 50 kD (factor de concentracion de aproximadamente 1:10) y luego se diafiltraron con 5 volumenes de un tampon que contema NaCl 50 mM y TRIS 20 mM a pH 7,7. Se comparo el tampon de diafiltracion con o sin Ca 2 mM y Zn 5 |iM para determinar el efecto sobre la perdida de actividad entre la diafiltracion y la purificacion cromatografica.

Se determinaron las actividades espedficas, registradas como mU de FRETS-VWF73 por |ig de A13 detectadas mediante ELISA, inmediatamente despues de la diafiltracion y justo antes de cargar la muestra para su purificacion adicional. Se almacenaron las muestras a entre aproximadamente 2 y 8 °C durante un tiempo maximo de 3 dfas (aproximadamente menos de 80 horas). Cuando se almacenaron las muestras durante periodos de tiempo mas prolongados, se mantuvieron a menos de -15 °C entre el final de la diafiltracion y el comienzo de la cromatograffa. Se midieron las muestras y se compararon inmediatamente despues de la diafiltracion y justo antes de cargar la columna cromatografica.

A pesar del tiempo de espera relativamente corto entre las etapas de ultra/diafiltracion y las etapas de purificacion adicionales, se produjo una perdida significativa de actividad espedfica de A13 (23,3 %) cuando el tampon de diafiltracion careda de cinc y calcio. En cambio, cuando el tampon de diafiltracion que se uso contema Ca 2 mM y Zn 5 |iM, la perdida de actividad espedfica de A13 (7,3 %) se redujo enormemente (tabla 22).

Tabla 22. Resultados de los experimentos de diafiltracion usando tampon de diafiltracion con y sin calcio y cinc.

Muestra

Diafiltracion Actividad espedfica tras la filtracion Actividad espedfica en carga de purificacion % de perdida de actividad

1

sin Ca/Zn 999 740 25,9

2

sin Ca/Zn 924 734 20,6

Media

sin Ca/Zn 962 737 23,3

Desv. est.

sin Ca/Zn 53 4,2 N/A

3

con Ca/Zn 849 835 1,6

4

con Ca/Zn 951 985 -3,6

5

con Ca/Zn 929 877 5,6

6

con Ca/Zn 1131 844 25,4

Media

con Ca/Zn 965 885 7,3

Desv. est.

con Ca/Zn 119 68,9 N/A

Ejemplo 7

Se compararon los procedimientos de cultivos celular continuo en perfusion y en quimiostato para determinar la produccion relativa y las actividades espedficas de A13 expresadas en varias lmeas celulares CHO recombinantes.

En resumen, se adaptaron diferentes clones de celulas CHO recombinantes que expresan A13 humana recombinante a un medio registrado definido qmmicamente (BCS), que se uso para la preparacion de inoculos. Se cultivaron adicionalmente las celulas en cultivos en biorreactor en medio BACD-A13 registrado complementado con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

cinc y nicotinamida a concentraciones finales de ZnSO4-7H2O 1,432 mg/l y nicotinamida 7,02 mg/l. Se transfirieron entonces inoculos de cada clon celular a dos biorreactores, de los cuales uno se cultivo en condiciones quimiostaticas (CST) y el otro bajo perfusion, tal como se indica en la tabla 23. Se cultivaron las celulas a una densidad de entre aproximadamente 2x106 y 4x106 celulas/ml en microvehmulos Cytopore™ II (GE Biosciences).

Se hicieron crecer los cultivos en condiciones de cultivo continuo durante de 3 a 4 semanas y se analizaron de manera periodica muestras del sobrenadante de los biorreactores para determinar la produccion de protema A13 mediante ELISA y la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. Los valores proporcionados en la tabla 23 representan promedios para el periodo de 3 a 4 semanas. Consecuente con los resultados obtenidos en los ejemplos 1 a 6 anteriormente, los cultivos hechos crecer en condiciones quimiostaticas produjeron de aproximadamente 1 mg/l/d a aproximadamente 2 mg/l/d de protema A13 que tema actividades espedficas altas de aproximadamente 700 mU/|ig a aproximadamente 1000 mU/|ig (tabla 23). Sorprendentemente, los cultivos hechos crecer en condiciones de cultivo en perfusion demostraron de manera constante niveles de actividad y produccion de protema de A13 mayores en el sobrenadante de cultivo que los clones identicos hechos crecer en condiciones quimiostaticas. Las actividades espedficas para A13 producida en los cultivos de perfusion eran muy altas, demostrando tres de los cuatro clones al menos aproximadamente 1.000 mU/|ig.

Tabla 23. Resultados de los experimentos que comparan el cultivo celular en perfusion y en quimiostato.

Clon

Volumen Modo Actividad espedfica Rendimiento de FRETS Rendimiento de A13

[l]

[mU/|ig] [U/l/d] [mg/l/d]

F6

50,0 CST 800 800 1,0

F6

10,0 Perfusion 1.000 1.600 1,6

D6

1,5 CST 690 900 1,3

D6

1,5 Perfusion 890 1.700 1,9

X1

1,5 CST 1.040 2.400 2,3

X1

1,5 Perfusion 1.000 2.600 2,6

E2

1,5 CST 710 500 0,7

E2

1,5 Perfusion 1.000 1.600 1,6

Ejemplo 8

Con el fin de determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la produccion de protema ADAMTS13 humana recombinante sembrada en cultivo de celulas eucariotas usando un medio de cultivo libre de protemas animales definido qmmicamente, se hicieron crecer los cultivos a temperaturas de entre 35,0 °C y 38,0 °C a pH de entre 7,05 y 7,30.

En resumen, se transfirieron celulas CHO recombinantes que expresan A13 humana a biorreactores de 1,5 l con impulsores de paletas, en medio BACD-A13 registrado. Se hicieron crecer los cultivos a pH controlados en lmea de entre 7,05 y 7,30 a temperaturas que oscilaban entre 35,0 °C y 38,0 °C con una concentracion de oxfgeno disuelto del 20 % de saturacion de aire. Se disenaron y ejecutaron los experimentos usando el enfoque de superficie de respuesta. Se realizo el analisis estadfstico usando el paquete de software estadfstico Minitab® 15.1.0.0.

Se tomaron muestras de los biorreactores y se analizaron para determinar A13 mediante ELISA, se midio la actividad de A13 mediante ensayo de FRETS-VWF73. Se determinaron los recuentos celulares mediante la tecnologfa Nucleocounter. Se midieron las tasas de dilucion y se usaron para el calculo de las tasas de crecimiento y las productividades volumetricas.

Tal como puede observarse en las figuras 1 y 2, tanto la temperatura como el pH tuvieron un efecto sustancial sobre la productividad de A13 volumetrica (medida mediante FRETS-VWF73, figura 1), y la actividad espedfica (actividad de FRETS-VWF73 / antigeno mediante ELISA, figura 2). Espedficamente, se logro la productividad de FRETS volumetrica maxima en cultivos hechos crecer en un intervalo de pH inferior de entre aproximadamente 7,05 y 7,2, especialmente de aproximadamente 7,10 y temperaturas de entre aproximadamente 35,0 °C y 37,0 °C, especialmente de aproximadamente 36 °C. Espedficamente, se logro la actividad espedfica maxima (FRETS- VWF73 frente a antfgeno mediante ELISA) en cultivos hechos crecer en un intervalo de pH inferior de entre aproximadamente 7,05 y 7,2, especialmente por debajo de 7,10 y temperaturas de entre aproximadamente 35,0 °C y 37,0 °C, especialmente por debajo de 36 °C. Espedficamente, se lograron condiciones optimas para la produccion de A13 con una combinacion de una temperatura de aproximadamente 36 °C y un pH de aproximadamente 7,10 en cuanto a calidad de producto y rendimiento optimos.

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritas en el presente documento son para fines ilustrativos unicamente y que a la luz de los mismos los expertos en la tecnica daran lugar a diversas modificaciones o cambios que se incluiran dentro del espmtu y ambito de la presente solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (18)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para expresar una protema desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS), comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo que comprende cinc a una concentracion de entre 2 |iM y 12 |iM.
2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo contiene cinc al menos 5 |iM.
3. 3. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el medio de cultivo contiene

   calcio al menos 0,5 mM, preferentemente calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM.
4. 4. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio de cultivo comprende ademas nicotinamida (vitamina B3) al menos 2 mg/l, preferentemente nicotinamida (vitamina B3) al menos 7 g/l.
5. 5. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio de cultivo comprende ademas poliamina al menos 0,5 mg/l.
6. 6. El procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que la poliamina es putrescina.
7. 7. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio de cultivo esta libre

   de protemas animales.
8. 8. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medio de cultivo esta definido qmmicamente.
9. 9. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la celula es una celula de mairnfero, y en el que la celula de mairnfero es una lmea celular seleccionada del grupo que consiste en una lmea celular humana, una lmea celular de hamster y una lmea celular murina.
10. 10. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el procedimiento comprende cultivo celular continuo.
11. 11. El procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que el cultivo celular continuo comprende cultivo celular en suspension continua.
12. 12. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que el cultivo se mantiene durante al menos 7 dfas.
13. 13. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la protema ADAMTS es ADAMTS13.
14. 14. El procedimiento segun la reivindicacion 13, en el que la actividad espedfica de la protema ADAMTS13 en el medio de cultivo es de al menos 600 U por mg de protema ADAMTS13.
15. 15. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que el cultivo produce al menos 400 U de actividad de ADaMtS13 por l de cultivo al dfa (U/l/d).
16. 16. Un procedimiento para producir una composicion de ADAMTS, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

    (a) cultivar una celula que alberga un acido nucleico que codifica una protema ADAMTS en un medio de cultivo libre de protemas animales;

    (b) retirar una fraccion del sobrenadante del cultivo;

    (c) realizar una etapa de filtracion o centrifugacion para retirar cualquier celula residual;

    (d) realizar una etapa de ultrafiltracion para concentrar la protema ADAMTS; y

    (e) realizar una etapa de diafiltracion con un tampon que comprende cinc al menos 0,5 |iM y calcio al menos 0,1 mM; preparando de ese modo una composicion de ADAMTS;

    en el que el medio de cultivo contiene cinc entre 2 |iM y 12 |iM.
17. 17. El procedimiento segun la reivindicacion 16, en el que la protema ADAMTS es ADAMTS13.
18. 18. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en el que menos del 20 % de la

    5 actividad espedfica de ADAMTS13 se pierde entre el final de la etapa (c) y el final de la etapa (e).