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CN104160018A - 用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基 - Google Patents

用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基 Download PDF

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CN104160018A
CN104160018A CN201380012670.9A CN201380012670A CN104160018A CN 104160018 A CN104160018 A CN 104160018A CN 201380012670 A CN201380012670 A CN 201380012670A CN 104160018 A CN104160018 A CN 104160018A
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Centocor Ortho Biotech Inc
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Abstract

本发明提供了促进成分确定的培养基中的未分化多能干细胞增殖的方法。具体地，本发明提供了用于培养、维持和扩增多能干细胞的成分确定的细胞培养制剂，其中在成分确定的细胞培养制剂中培养干细胞，使细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。还公开的是表达OCT4、SOX2、NANOG和FOXA2的在成分确定的培养基条件下生长的细胞群体。

Description

用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年3月7日提交的美国临时专利申请序列号61/607,706的权益，其以引用方式全文并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明处于在成分确定的培养基条件下增殖和维持多能干细胞的领域中。
背景技术
未分化的多能干细胞的扩增传统上已采用“饲养”细胞，所述“饲养”细胞提供支持贴壁、增殖和多能性标志物维持的足够因子。用于人胚胎干细胞生成和培养的早期方法需要使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞。后续技术包括使用“条件培养基”和细胞外基质涂层来替换饲养细胞。条件培养基是已通过饲养细胞例如MEF进行修饰的培养基。然而，两种方法均具有连续支持多能干细胞扩增的条件培养基或饲养细胞分批中的不一致性的缺点。此外，两种系统均提供了可对不同多能干细胞不同作用的成分未确定因子。因此，建立支持多能干细胞连续扩增的成分确定、廉价、重现性培养基在再生医学领域中具有极大兴趣。
人胚胎干细胞(hES细胞)的限定特征是细胞具有分化成多个谱系的趋势。该不需要的分化可阻碍随后生成所需特定细胞类型需要的均匀和定向分化。事实上，饲养细胞和条件培养基培养条件两者通常均导致特别是在生长中的ES细胞集落边缘周围或集落中心的一定水平的不需要的分化。
近期努力已导致用许多替代培养条件来替代饲养细胞或条件培养基，所述替代培养条件例如：培养基中的敲除血清替代物(KSR)(2005，Nature Methods，2：185-189)。KSR含有牛血清白蛋白(BSA)的成分不确定的粗制级分。其他已显示在具有FGF2、活化素A和胰岛素的化学成分确定的培养基中的多能性长期维持(Vallier等人，2005，J Cell Sci，118：4495-4509)。商购可得的培养基制剂包括1培养基(StemCellTechnologies，Vancouver，Canada)和StemProTM(Invitrogen，CA)先前也已用于维持并增殖人多能干细胞。集中于成分确定的培养基开发的另外现有技术包括US7449334、US7442548、US7005252、US2008/0268534、US7410798、US7297539和US6800480。此外，近期出版物将1培养基进一步精炼为八种组分(Nature Methods，2011，8：424-424)，突出显示即使在成分确定的培养基中也存在实际上可减慢ES细胞增殖或减少其多能性状态的一种或多种不必要的试剂。精炼的1培养基由DMEM/F12基础培养基组成，所述DMEM/F12基础培养基补充有胰岛素、硒、转铁蛋白、抗坏血酸、FGF2(bFGF)和TGFβ或nodal，具有由NaHCO3调节的pH。
因此明确的是仍存在成分完全确定的培养基条件的需要，所述成分完全确定的培养基条件提供关于多能细胞扩增的一致性，同时具有最低限度数目的添加组分。
发明内容
本发明提供了用于培养、维持和扩增多能干细胞的成分确定的细胞培养制剂，其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和抗坏血酸；并且其中在成分确定的细胞培养制剂中培养干细胞，使干细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。在本发明的一些实施例中，细胞培养制剂还包含胰岛素生长因子1(IGF-1)。在本发明的一些实施例中，细胞培养制剂包含DMEM-F12。
本发明提供了用于培养、维持和扩增多能干细胞的成分确定的细胞培养制剂，其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF、抗坏血酸、痕量元素C、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸、氯化锂、限定脂质和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；并且其中在成分确定的细胞培养制剂中培养干细胞，使干细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。在本发明的一些实施例中，细胞培养制剂包含MCDB-131。
在本发明的一些实施例中，ITS-X提供了用于本发明的成分确定的细胞培养制剂的胰岛素、转铁蛋白和硒。在本发明的一些实施例中，ITS-X以约0.5％至约2％存在。在本发明的一些实施例中，ITS-X以约1％存在。在本发明的一些实施例中，无脂肪酸白蛋白是试剂级。在本发明的一些实施例中，试剂级无脂肪酸BSA以约0.2％至约2.5％存在。在本发明的一些实施例中，试剂级无脂肪酸BSA以约2％存在。
在一些实施例中，本发明的成分确定的细胞培养制剂中的TGF-β配体是TGF-β1。在本发明的一些实施例中，TGF-β1以约0.5ng/mL至约10ng/mL存在。在本发明的一些实施例中，TGF-B1以约1ng/mL存在。
在本发明的一些实施例中，bFGF以约50ng/mL至约100ng/mL存在于细胞培养制剂中。在本发明的一些实施例中，bFGF以约50ng/mL存在于成分确定的细胞培养制剂中。在一些实施例中，bFGF以约100ng/mL存在于成分确定的细胞培养制剂中。
在本发明的一些实施例中，胰岛素生长因子1(IGF-1)以约10ng/mL至约50ng/mL存在。在本发明的一些实施例中，IGF-1以约20ng/mL存在于成分确定的细胞培养制剂中。
在本发明的一些方面，抗坏血酸以约0.2mM至约0.3mM存在于成分确定的细胞培养制剂中。在本发明的一些方面，抗坏血酸以约0.25mM存在于成分确定的细胞培养制剂中。
在一个实施例中，本发明涉及基本上由下述组成的成分确定的细胞培养制剂：DMEM-F12基础培养基、ITS-X(以提供胰岛素、转铁蛋白和硒)、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF、胰岛素生长因子1(IGF-1)和抗坏血酸。
在一个实施例中，本发明涉及基本上由下述组成的成分确定的细胞培养制剂：MCDB-131、ITS-X(作为胰岛素、转铁蛋白和硒的来源)、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF、抗坏血酸、痕量元素C、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸、氯化锂、葡萄糖、限定脂质和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
在一个实施例中，本发明涉及用于扩增人多能干细胞的方法，其中所述方法包括在成分确定的细胞培养制剂中的无饲养层基质上培养人多能干细胞；其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和抗坏血酸；并且其中在成分确定的细胞培养制剂中培养干细胞，使细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。在一些实施例中，成分确定的细胞培养制剂还包含胰岛素生长因子1(IGF-1)。在一些实施例中，细胞培养制剂包含DMEM-F12。
在一个实施例中，本发明涉及用于扩增人多能干细胞的方法，其中所述方法包括在成分确定的细胞培养制剂中的无饲养层基质上培养人多能干细胞；其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF、抗坏血酸、IGF-1、痕量元素C、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化锂、限定脂质和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。在一些实施例中，在用于扩增人多能干细胞的方法中使用的细胞培养制剂包含MCDB-131。
本发明的一个实施例是体外细胞群体，其中大于50％的细胞群体对于OCT4、SOX2、NANOG、FOXA2的蛋白质表达是阳性的，伴随SSEA-4和ZFP42的阴性或低蛋白质表达。该群体通过在成分确定的细胞培养制剂中培养多能干细胞获得，所述成分确定的细胞培养制剂包含补充有IGF-1、胰岛素、bFGF、TGF-B配体和无脂肪酸白蛋白的基础培养基；并且其中成分确定的细胞培养制剂不含抗坏血酸。
在本发明的一些实施例中，成分确定的细胞培养制剂包含DMEM/F12基础培养基。在本发明的一些实施例中，细胞培养制剂包含作为ITS-X的胰岛素。在本发明的一些实施例中，ITS-X以约0.5％至约2％存在。在本发明的一些方面，ITS-X以约1％存在。在本发明的一些实施例中，无脂肪酸白蛋白是试剂级。在本发明的一些方面，试剂级无脂肪酸以约0.2％至约2.5％存在。在本发明的一些实施例中，试剂级无脂肪酸以约2％存在。在本发明的一些方面，TGF-B配体是TGF-B1。在本发明的一些实施例中，TGF-B1以约0.5ng/mL至约10ng/mL存在。在本发明的一些方面，TGF-B1以约1ng/mL存在。
附图说明
图1A至图1D显示了在IH-3(图1A)、IH-1(图1B)、IH-6(图1C)和1(图1D)中培养3代的H1细胞的相差图像。
图2A至图2C显示了在IH-3(图2A)、IH-1(图2B)和1(图2C)培养基中培养10代的H1细胞的相差图像。
图3A至图3C显示了在IH-3(图3A)、IH-1(图3B)和1(图3C)培养基中培养18代的H1细胞的相差图像。
图4A至图4F显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：ZFP42(图4A)、SOX2(图4B)、POU5F1(OCT4)(图4C)、Nanog(图4D)、FOXA2(图4E)和AFP(图4F)，所述人胚胎干细胞系H1在实例1中所述的培养基中培养并在第1至5代(P1-P5)时收获。
图5A至图5B显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：Nanog、POU5F1(OCT4)、SOX2和ZFP42(图5A)、以及AFP和FOXA2(图5B)，所述人胚胎干细胞系H1在实例1中所述的培养基中培养并在第10代时收获。
图6A和图6B显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：ZFP42、SOX2、POU5F1(OCT4)和Nanog(图6A)、以及AFP和FOXA2(图6B)，所述人胚胎干细胞系H1在实例1中所述的培养基中培养并在第18代时收获。
图7A至图7F显示了在实例1中所述的IH-3培养基中培养18代的细胞中的下述标志物的FACS直方图表达谱：同种型对照(图7A)；KI-67(图7B)；OCT4(图7C)；SOX17(图7D)；FOXA2(图7E)；和SOX2(图7F)。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图8A至图8F显示了在实例1中所述的IH-3培养基中培养18代，并且就OCT-4、FOXA2、SOX2免疫染色并使用DAPI荧光标记DNA的细胞的图像。对于OCT4(图8A)、FOXA2(图8B)和DAPI染色的DNA(图8C)获得的图像得自相同光视野，但使用不同滤光片。相似地，关于SOX2(图8D)、FOXA2(图8E)和DAPI染色的DNA(图8F)的图像得自相同光视野，但使用不同滤光片。
图9A至图9F描述了在实例2中所述的1培养基(图9A)以及IH-3(图9B)、IH-3-1(图9C)、IH-3-2(图9D)、IH-3-3(图9E)和IH-3-4(图9F)制剂中培养五代的H1细胞的相差图像。
图10A至图10E显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：ZFP42(图10A)、SOX2(图10B)、FOXA2(图10C)、Nanog(图10D)和POU5F1(OCT4)(图10E)，所述人胚胎干细胞系H1在实例2中所述的培养基中培养并在第5代时收获。
图11A至图11D描述了在实例3中所述的1培养基(图1A)、IH-3(图11B)、IH-1(图11C)和IH-3RT(图11D)培养基制剂中培养20代的H1细胞的相差图像。
图12A至图12F显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：AFP(图12A)、FOXA2(图12B)、SOX2(图12C)、Nanog(图12D)、POU5F1(OCT4)(图12E)和ZFP42(图12F)，所述人胚胎干细胞系H1在实例3中所述的培养基中培养15代。
图13A至图13F显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：AFP(图13A)、FOXA2(图13B)、NANOG(图13C)、POU5F1(OCT4)(图13D)、SOX2(图13E)和ZFP42(图13F)，所述人胚胎干细胞系H1在实例3中所述的1培养基以及IH-1和IH-3培养基中培养20代。
图14A和图14B描述了在实例5中所述的培养基制剂中培养4天的H1细胞的相差图像，所述培养基制剂含有Sigma BSA(图14A)或含有无脂肪酸BSA(图14B)。
图15A和图15B描述了在实例5中所述的培养基制剂中培养三代的H1细胞的相差图像，所述培养基制剂含有Sigma BSA(图15A)或含有无脂肪酸BSA(图15B)。
图16A至图16C显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：AFP(图16A)、MIXL1(图16B)和T(BRY)(图16C)，所述人胚胎干细胞系H1在实例5中所述的含有Sigma BSA或无脂肪酸BSA的培养基制剂中培养三代。
图17A至图17D显示了来自人胚胎干细胞系H1的细胞中的下述基因表达的实时PCR分析的数据：SOX2(图17A)、POU5F1(图17B)、NANOG(图17C)和FOXA2(图17C)，所述人胚胎干细胞系H1在实例6中所述的培养基制剂中培养十代。
图18A至图18E描述了在实例6中所述的IH-3(图18A)、IH-3P-2(图18B)、IH-3P-3(图18C)、IH-3P-4(图18D)和IH-3P-5(图18E)培养基制剂中培养10代的HI细胞的相差图像。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
干细胞通过其发育潜能分类为：(1)全能的，意指能够产生全部胚胎细胞和胚外细胞类型；(2)多能的，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的，意指能够产生细胞谱系子系，但全部在特定组织、器官或生理系统内(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代包括HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及其为正常血液组分的所有细胞类型和成分(例如血小板))；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子系；以及(5)单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
“基础培养基”指可支持培养中的多能干细胞生长的盐、营养物质和维生素的溶液。基础培养基可选自达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、MCDB培养基、RPMI等等。DMEM还可以是DMEM/F12(也称为DM-F12)、或DMEM-高糖(也称为DMEM-hg)。MCDB培养基可选自可获得的任何MCDB培养基且特别是MCDB-131。作为另外一种选择，基础培养基可通过以适当比率混合上文列出的基础培养基制剂进行选择，以允许胚胎干细胞的增殖和多能性的维持。在一些实施例中，本发明的成分确定的细胞培养制剂中的基础培养基是DMEM-F12。在一些实施例中，本发明的细胞培养制剂中的基础培养基是MCDB-131。
“饲养细胞”指多能干细胞在其上铺平板的非多能干细胞。饲养细胞提供足够的可溶性和不溶性因子，以支持通过多能干细胞的贴壁、增殖和多能性标志物的维持。
“条件培养基”指进一步补充有源自饲养细胞的可溶性因子的培养基。
“细胞外基质”或“成分确定的基质”或“合成基质”指可提供通过多能干细胞的贴壁、增殖和多能性标志物的维持的一种或多种物质。本文可互换使用的是“IGF”和“IGF-1”，其代表胰岛素样生长因子1。在人中，该蛋白质由肝制备，并且负责归于人生长激素的功能中的许多。
如本文所用，“FGF2”和“bFGF”可互换使用，以鉴定人碱性成纤维细胞生长因子。
本文可互换使用的是“TGF beta”、“TGF-B”和“TGF-β”。TGF-β配体可选自骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、活化素(活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C)、nodal和TGF-β。TGF-β可选自TGF-β1、TGF-β2、活化素A和TGF-β3。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致SSEA-4、Tra 1-60和Tra1-81表达(如果存在的话)的丧失，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，如由生产商描述的(VectorLaboratories，Burlingame CA)，所述碱性磷酸酶活性可通过用4％多聚甲醛固定细胞，随后用Vector Red作为底物显色来检测。如通过RT-PCR检测的，未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT。
增殖多能干细胞的另一种希望表型是分化成所有三种胚层的细胞的潜能：内胚层、中胚层和外胚层。可以例如通过如下方式来确认干细胞的多能性：将细胞注射入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检测，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。作为另外一种选择，与成分确定的培养基例如1培养基(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)组合的化学成分确定的表面可用于常规细胞扩增。多能细胞可使用酶促、机械或使用多种钙螯合剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)容易地从培养皿中取出。作为另外一种选择，多能细胞可在不存在任何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell Research Institute，Madison，WI)。也可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。还合适的是诱导多能细胞(IPS)或重编程的多能细胞，其可使用多种多能相关转录因子的被迫表达而源自成人体细胞，所述转录因子例如OCT4、Nanog、Sox2、KLF4和ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet，2011，12：165-185)。
人胚胎干细胞可如由Thomson等人所述进行制备(美国专利5,843,780；Science，1998：282：1145-1147；Curr Top Dev Biol，1998；38：133-165；1995，Proc Natl Acad Sci USA 92：7844-7848)。
多能干细胞的特征是本领域技术人员众所周知的，并且多能干细胞的附加特征不断被鉴定。多能干细胞标志物包括例如下述中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。
通常存在于胚胎干细胞的培养物中的分化标志物包括例如AFP、FOXA2、SOX17、T(BRY)和MIXL1。
在本发明的一个实施例中，人多能干细胞在成分确定的培养基中进行培养，所述成分确定的培养基包含抗坏血酸、IGF、胰岛素、bFGF、TGF-B配体和无脂肪酸白蛋白，以支持多能干细胞的增殖，同时使扩增细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。
本发明的一个实施例是体外细胞群体，其中大于50％的细胞群体对于OCT4、SOX2、NANOG和FOXA2的蛋白质表达是阳性的，但具有SSEA-4和ZFP42的低蛋白质表达。
本发明的另一个方面描述了包含IGF、胰岛素、bFGF、TGF-B、无脂肪酸白蛋白且不含抗坏血酸的体外成分确定的细胞培养制剂，所述细胞培养制剂导致其中大于50％的细胞群体通过关于OCT4、SOX2、NANOG、FOXA2的蛋白质染色是阳性的，以及SSEA-4和ZFP42的低蛋白质表达的细胞群体。
本发明还通过下述实例举例说明，但不受下述实例限制，其中份和百分比按重量计，并且度数是摄氏度，除非另有说明。应当理解，这些实例虽然指示出了本发明的优选实施例，但仅以举例说明的方式示出。根据上文讨论和这些实例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，并且无需背离本发明的实质和范围，可对本发明作出多种改变和修改以使其适合多种使用和条件。因此，本发明的多种修饰加上本文显示并描述的修饰根据前述说明书对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修饰意欲落入所附权利要求的范围内。在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。
实例1
测试多种培养条件，以鉴定对于未分化的胚胎干细胞增殖最佳的培养 基组分
在MATRIGELTM(1∶30稀释；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)涂布的皿中在1培养基(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)中培养，并使用EDTA传代的人胚胎干细胞系H1的细胞(在第35代至第40代时)用作起始群体，以测试多种培养基组成。使用在室温下的5-10分钟EDTA处理，将细胞作为小集落传代。培养物照常规在每次传代时以1∶6至1∶10的比率分开。表I列出了就其使H1细胞增殖同时维持其未分化的形态和多能性标志物的能力进行测试的初始培养基制剂。
表I
评估的培养基制剂
*：痕量元素C**(Mediatech，Manassas，VA)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；Invitrogen，Carlsbad，CA)、LiCl(Sigma，Saint Louis，MO)、葡萄糖(Sigma)、限定脂质***(Invitrogen)、试剂级无脂肪酸BSA(Proliant，Ankeny，IA)、TGF-β1(R&D Systems，Minneapolis，MN)、bFGF(R&DSystems)、IGF-1(R&D Systems)、GlutaMAXTM(在0.85％NaCl中的200mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；Invitrogen)、富含脂质的BSA-Albumax(Invitrogen)、ITS-X(胰岛素、转铁蛋白、硒-X-补充物；Invitrogen)、标准级New Zealand BSA(Lampire Biological Laboratories，Coopersburg，PA)、标准级BSA(Lampire)、NEAA(Invitrogen)、巯基乙醇(Invitrogen)、CHIR99021(Stemgent，Cambridge，MA)、PD0325901(Sigma)、Y2763(Sigma)。
**Mediatech痕量元素C目录号99-1761000x液体含有：1.20mg/L AlCl3H2O、0.17mg/L AgNO3、2.55mg/L Ba(C2H3O2)2、0.12mg/L KBr、2.28mg/L CdCl2、2.38mg/L CoCl2 6H2O、0.32mg/L CrCl3(无水)、4.20mg/L NaF、0.53mg/LGeO2、0.17mg/L KI、1.21mg/L RbCl和3.22mg/L ZrOCl2 8H2O。
***Invitrogen化学成分确定的脂质浓缩物目录号11905031含有100.0mL/L乙醇(200标准强度)和2mg/L花生四烯酸、220mg/L胆固醇、70mg/L DL-α-生育酚乙酸酯、0mg/L乙醇100％、10mg/L亚油酸、10mg/L亚麻酸、10mg/L肉豆蔻酸、10mg/L油酸、10mg/L棕榈酸、10mg/L棕榈油酸、90000mg/L普流尼克F-68、10mg/L硬脂酸和2200mg/L Tween(ICI Americas，Inc.Bridgewater，NJ)。
因为使用IH-4和IH-5培养的细胞未能生长经过第2代，所以对于进一步评估中止IH-4和IH-5的使用。在第2代时，在IH-2中生长的细胞显示与分化细胞一致的形态中的显著变化和塞满集落的丧失。选择培养基IH-1、IH-3和IH-6用于进一步评估。在第3-5代时，在IH-6中培养的细胞显示在ES集落周围处的分化细胞的形态证据(比较图1C与图1A、图1B和图1D)。
在第5代后，仅IH-1和IH-3进一步与在1培养基中培养的细胞相比较。在第5至18代时，从IH-1、IH-3和1培养物中收集样品，并且通过FACS、PCR、核型分析(G显带或FISH)和免疫荧光染色进行评估。来自FISH分析的结果显示于表II中。这些结果显示在IH-1培养基或IH-3培养基中培养的H1细胞显示正常核型，而在1培养基中培养的细胞在第10-18代时展示异常三体12。
表II
通过CellLineGenetics(Madison，WI)的染色体12和染色体17的 FISH分析结果
此外，类似于在1培养基中生长的细胞，在IH-1培养基中连续传代的细胞维持特征性ES集落形态，在集落周围具有极少的分化细胞。然而，超过第10代，在IH-3培养基中生长的细胞开始丧失特征性ES集落形态(参见图1A、图2A和图3A)。
归于多能性的表面和内部标志物的评估用于评价测试制剂对多能性维持的影响。如表III中所示，在第5代时，在IH-1和IH-3中培养的细胞显示与在1培养基中扩增的培养物相似的表面标志物概况。然而，到第10代时，在IH-3培养基中培养的H1细胞显示SSEA-4表达中的显著下降以及TRA1-60和1-81表达中的中等下降。在IH-1培养基中培养10代的H1细胞维持与在1培养基中培养的细胞相似的表达模式。
表III
对于与细胞的多能性状态相关的表面标志物，在第5代和第10代时的 FACS结果
令人惊讶的是，类似于在1和IH-1培养基中培养的H1细胞，在IH-3培养基中培养的H1细胞在第11代时维持OCT4和SOX2标志物的强表达(表IV)。然而，对于在IH-3培养基中培养的H1细胞，存在SSEA-4的极低表达水平。
表IV
在IH-1、IH-3和 1培养基中培养11代的细胞的内部和表面标 志物
如图4中所示，对于在IH-1和IH-3培养基中培养的H1细胞通过第5代，核心多能性标志物例如Nanog(图4D)、OCT4(图4C)、SOX2(图4B)和ZPF42(图4A)的mRNA表达维持至与在1中培养的H1细胞相同的水平。然而，到第10至18代时，与在IH-1或1培养基中培养的H1细胞相比较，对于在IH-3培养基中生长的细胞，存在ZFP42表达中的显著降低，而OCT4、Nanog和SOX2的表达并无显著改变(参见图5A和图6A)。此外，在IH-3培养基中培养18代的H1细胞的FACS分析显示＞97％的细胞是OCT4+(图7C)、SOX2+(图7F)和KI-67+(图7B)。大约1％的细胞是SOX17+(图7D)，并且～85％的细胞是FOXA2+(图7E)。图8A至图8F显示了在IH-3培养基中培养18代的H1细胞的免疫荧光染色图像。这些图像示出显著数目的OCT4和SOX2阳性细胞也是FOXA2+。在IH3培养基中培养的H1细胞已获得其中至少70％的细胞是Oct4+NANOG+SOX2+KI-67+ZFP42-和FOXA2+的表型。这代表本领域仍未得到描述的细胞群体。
实例2
在用抗坏血酸掺料的IH-3培养基中培养H1细胞恢复未分化的胚胎干 细胞的主要特征
为了鉴定关于在IH-3中培养的H1细胞与在IH-1和1培养基中培养的H1细胞相比较SSEA-4和ZPF42下降的原因，进行差距分析，以鉴定在1和IH-1中存在但在IH-3培养基中不存在的主要试剂。IH-3培养基补充有如表V中所示的痕量元素C、抗坏血酸、氯化锂或限定脂质。
表V
对IH-3培养基的修饰
培养基 对IH-3培养基的添加
IH-3-1 1x痕量元素C
IH-3-2 0.25mM抗坏血酸
IH-3-3 1mM氯化锂
IH-3-4 1∶500X限定脂质
在IH-3中培养14代的H1细胞随后在上述培养基制剂中进行培养，并且与IH-3培养基中培养的细胞相比较。在多个传代时，使用多种培养基制剂培养的H1细胞就多能性标志物进行测定。如表VI所示，在五次另外传代后，与在其他测试培养基中培养的细胞相比较，在IH-3-2(补充有抗坏血酸的IH-3)培养基中培养的H1细胞恢复小百分比的其SSEA-4表达。
表VI
对于与H1细胞的多能性状态相关的表面标志物，在超过第15代五次 传代时的FACS结果。
如图9D中所示，在IH-3-2培养基中培养的H1细胞保留类似于在1(图9A)培养基中培养的细胞的典型胚胎干细胞形态。然而，在IH-3、IH-3-1、IH-3-3和IH-3-4中培养的H1细胞显示松散集落形态(参见图9B、图9C和图9F)。在上述培养基制剂中培养的细胞的PCR分析进一步证实在IH-3-2培养基中培养的H1细胞重新获得一些ZFP42表达，并且下调FOXA2的表达(参见图10A至图10E)。上述数据显示抗坏血酸的存在是维持ES细胞的多能性连同其特征性集落/细胞形态以及分化标志物的低表达所需的。基于该数据，HI细胞在IH-3培养基中的后续培养进一步补充有0.25mM抗坏血酸。
在IH-3-2中培养的细胞恢复ES细胞的特征性集落形态中的一些，而在其他IH培养基制剂中培养的细胞展示更松散的形态。
实例3
在IH-3和IH-1培养基中长期培养的H1细胞维持多能性和稳定核型
如实例1中所述，在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿中的1培养基中培养，并使用EDTA传代的人胚胎干细胞系H1的细胞(第35代至第40代)用作起始群体，以评估使用IH-1、IH-3-2和1培养基的长期培养。使用在室温下的5-10分钟EDTA处理，将细胞作为小集落传代。测试培养基的组分在表VII中列出。
表VII
在IH-1、IH-3-2和IH-3RT培养基制剂中使用的成分。
如图11A至图11D中可见，在IH-1、IH-3-2和IH-3RT中培养20代的H1细胞保留典型的ES形态。在IH-1、IH-3-2和IH-3RT中培养15代的H1细胞的PCR分析结果显示于图12A至图12F中。在IH-1、IH-3-2和IH-3RT中培养20代的H1细胞的PCR分析结果显示于图13A至图13F中。这些分析证实类似于在1培养基中培养的H1细胞，在IH-1、IH-3-2和IH-3RT(重组人转铁蛋白)培养基中培养15或20代的H1细胞保留所有核心多能性标志物，同时显示FOXA2和AFP的极低表达。在第15代和第20代时的FACS分析也证实与在1培养基中培养的H1细胞相同水平的与多能细胞相关的表面标志物表达(参见表VIII)。
表VIII
对于与细胞的多能性状态相关的表面标志物，在第15代和第20代时 测试的细胞的FACS结果
如通过G显带和FISH分析测量的，在IH-1、IH-3-2和IH-3RT中连续培养的H1细胞显示正常核型。然而，在1中培养10至20代的H1细胞显示异常染色体计数(参见表IX)。
表IX
在IH-1、IH-3、IH-3RT和 1中培养的H1细胞的FISH和G显 带分析。
实例4
在IH-1、IH-3和 1培养基中培养的H1细胞的相等增殖率
为了比较在先前测试的培养基中培养的细胞的增殖率，通过使用TrypLE(Invitrogen)释放在IH-1、IH-3-2和1培养基中培养的H1细胞，并且以5×105细胞/10cm MATRIGELTM涂布的皿的密度种植。为了减少单细胞的细胞凋亡并增强贴壁，用10μM Rock抑制剂(Sigma)预处理释放的细胞。每天更换培养基直至种植后三天。在第3天时，细胞作为单细胞释放并使用血球计计数。如表X中所示，在所有三种培养基制剂中培养的细胞显示相等的倍增时间。
表X
在 1、IH-1和IH-3-2培养基制剂中培养的H1细胞的倍增时 间。
实例5
高质量无脂肪酸BSA允许多能细胞的扩增
在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿中的1培养基中培养，并使用EDTA传代的人胚胎干细胞系H1的细胞(第35代至第40代)用作起始群体，以评估使用补充有2％Sigma BSA(目录号A2153；批次：061M1804V)或无脂肪酸BSA(Proliant，目录号7500804；批次：11G54001)的IH-3-2培养基的长期培养。使用在室温下的5-10分钟EDTA处理，将细胞作为小集落传代。图14A和图14B描述了在含有Sigma BSA(图14A)或无脂肪酸BSA(图14B)的培养基制剂中培养4天的Hi细胞的相差图像。图15A和图15B描述了在含有Sigma BSA(图15A)或无脂肪酸BSA(图15B)的培养基制剂中培养三代的H1细胞的相差图像。如图14A中可见，早在种植后第4天，在使用Sigma BSA的培养物中存在分化细胞的形态证据。然而，在用无脂肪酸BSA处理的培养物中不存在明显的肉眼可见的分化细胞形态(参见图14B)。在第3代时注意到相同趋势，在使用Sigma BSA的培养物中存在分化细胞的形态证据(参见图15A)，而在包含无脂肪酸BSA的培养基中培养的细胞中不存在明显的肉眼可见的分化细胞形态(参见图15B)。此外，与在包含试剂级脂肪酸BSA的培养基中培养的细胞相比较，在包含Sigma BSA的培养基中培养的细胞汇合度中存在显著下降(比较图15A和图15B)。
来自在含有Sigma BSA或无脂肪酸BSA的培养基制剂中培养三代的人胚胎干细胞系H1的细胞中的AFP(图16A)、MIXL1(图16B)、和T(BRY)(图16C)表达的实时PCR分析的数据显示于图16A、16B和16C中。在第3代时的PCR数据明确显示了对于在包含Sigma BSA的培养基中培养的细胞，与分化细胞相关的标志物的显著上调。该数据明确证实无脂肪酸BSA的使用在细胞的多能性、集落形态和增殖的维持中是关键的。
实例6
多能干细胞可使用广泛范围的无脂肪酸BSA和bFGF浓度在IH-3培养 基中进行繁殖并维持多能性
在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿中的1培养基中培养，并使用EDTA传代的人胚胎干细胞系H1的细胞(第35代至第40代)用作起始群体，以评估使用如表XI中所示补充的IH-3培养基的短期和长期培养。
表XI
补充有多个BSA和bFGF剂量的IH-3培养基中使用的成分
在第10代时，通过PCR就多能性和分化相关基因在形态上评估细胞。此外，使用染色体12和17的FISH分析就核型稳定性评估细胞。图17A至图17D显示了来自在表XI中列出的培养基制剂中培养十代的人胚胎干细胞系H1的细胞中的SOX2(图17A)、POU5F1(图17B)、NANOG(图17C)和FOXA2(图17C)表达的实时PCR分析的数据。如这些图中所示，相对于在1培养基中生长的细胞，所有上述制剂均保留多能性标志物的强表达。然而，在0-0.5％BSA中生长的细胞显示FOXA2的更高表达，指示与其他测试的制剂相比较，在这些培养物中更高水平的自发分化。图18A至图18E描述了在表XI中列出的IH-3-2(图18A)、IH-3P-2(图18B)、IH-3P-3(图18C)、IH-3P-4(图18D)和IH-3P-5(图18E)培养基制剂中培养10代的H1细胞的相差图像。如这些图中所示，该实例中测试的所有制剂均允许形成具有肉眼可见的分化形态的最低限度证据的ES集落。
表XII
通过CellLineGenetics分析的染色体12和17的FISH分析
培养基 P10
IH-3-2 正常
IH-3P-2 正常
IH-3P-3 正常
IH-3P-4 正常
IH-3P-5 正常
如表XII中可见，如通过FISH分析测量的，在表XI中列出的培养基制剂中培养十代的H1细胞保留染色体12和17的正常计数。上述数据指示当使用广泛范围的无脂肪酸BSA和bFGF浓度时，由DMEM/F12基础培养基组成的成分确定的培养基允许多能细胞的扩增，同时维持细胞的多能性，所述DMEM/F12基础培养基补充有ITS-X、试剂级无脂肪酸BSA、TGF-B 1、IGF-1和抗坏血酸。

Claims (17)

1. 一种用于培养、维持和扩增多能干细胞的成分确定的细胞培养制剂，其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和抗坏血酸；并且其中在所述成分确定的细胞培养制剂中培养干细胞，使所述细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。
2. 根据权利要求1所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述细胞培养制剂还包含胰岛素生长因子1（IGF-1）。
3. 根据权利要求1或2所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述细胞培养制剂包含DMEM-F12。
4. 根据权利要求1所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述细胞培养制剂还包含痕量元素C、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化锂、葡萄糖、限定脂质和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
5. 根据权利要求4所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述细胞培养制剂包含MCDB-131。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的成分确定的细胞培养制剂，其中ITS-X提供胰岛素、转铁蛋白和硒。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述无脂肪酸白蛋白是试剂级。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的成分确定的细胞培养制剂，其中所述TGF-β配体是TGF-β1。
9. 一种成分确定的细胞培养制剂，所述成分确定的细胞培养制剂基本上由DMEM-F12基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和IGF-1组成。
10. 一种成分确定的细胞培养制剂，所述成分确定的细胞培养制剂基本上由DMEM-F12基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF、IGF-1和抗坏血酸组成。
11. 一种成分确定的细胞培养制剂，所述成分确定的细胞培养制剂基本上由MCDB-131、痕量元素C、抗坏血酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化锂、葡萄糖、限定脂质、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽组成。
12. 一种用于扩增人多能干细胞的方法，其中所述方法包括在成分确定的细胞培养制剂中的无饲养层基质上培养所述人多能干细胞；其中所述成分确定的细胞培养制剂包含基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、硒、无脂肪酸白蛋白、TGF-β配体、bFGF和抗坏血酸；并且其中在所述成分确定的细胞培养制剂中培养所述干细胞，使所述细胞的多能性和核型稳定性维持至少10代。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述成分确定的细胞培养制剂还包含胰岛素生长因子1（IGF-1）。
14. 根据权利要求12或13所述的方法，其中所述细胞培养制剂包含DMEM-F12。
15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述成分确定的细胞培养制剂还包含痕量元素C、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化锂、葡萄糖、限定脂质和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述成分确定的细胞培养制剂包含MCDB-131。
17. 一种在包含ITS-X、无脂肪酸白蛋白、TGF-B1、bFGF和IGF-1的DMEM/F12培养基中培养的多能细胞的体外群体，其中所述群体中的至少70%细胞是Oct4+、NANOG+、SOX2+、KI67+、FOXA2+和ZFP42-。
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