MX2014010782A - Medios definidos para la expansion y el mantenimiento de celulas madre pluripotentes. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la proliferación de células madre pluripotentes indiferenciadas en medios definidos; específicamente, la invención proporciona una formulación de cultivo celular definido para el cultivo, mantenimiento y expansión de células madre pluripotentes, en donde las células madre en cultivo en la formulación de cultivo celular definido mantiene la pluripotencia y la estabilidad cariotípica de las células al menos por 10 pasajes; adicionalmente se describe una población celular cultivada bajo condiciones de medios definidos que expresan OCT4, SOX2, NANOG y FOXA2.

Description

MEDIOS DEFINIDOS PARA LA EXPANSIÓN Y EL MANTENIMIENTO DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. de Serie 61/607,706, presentada el 07 de Marzo, 2012, la cual se incorpora en su totalidad a la presente como referencia para todo propósito.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es en el campo de la proliferación y mantenimiento de células madre pluripotentes bajo las condiciones de medios definidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expansión de células madre pluripotentes indiferenciadas tradicionalmente ha empleado células "alimentadoras" que proporcionan suficientes factores para soportar la adhesión, proliferación y mantenimiento de marcadores pluripotenciales. Los primeros métodos para la generación y cultivo de células madre embrionarias humanas requerían del uso de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, por sus siglas en inglés). Las técnicas posteriores incluían el uso de "medios condicionados" y un recubrimiento de la matriz extracelular para reemplazar a las células alimentadoras. Los medios condicionados son medios que han sido modificados por células alimentadoras, tales como MEF. Sin embargo, ambos métodos presentan inconsistencias en los lotes de medios condicionados o células alimentadoras para mantener la expansión continua de las células madre pluripotentes. Además, ambos sistemas proporcionan factores indefinidos que pueden funcionar de forma diferente en células madre pluripotentes diferentes. Por consiguiente, establecer un medio de cultivo definido, económico, reproducible que mantener la expansión continua de células madre pluripotentes es de gran interés en el campo de la medicina regenerativa.

Una característica que define a las células madre embrionarias humanas (células hES) es que las células tienen una tendencia a diferenciarse en varios linajes. Esta diferenciación no deseada puede obstaculizar la diferenciación uniforme y dirigida que se requiere para generar posteriormente los tipos celulares específicos deseados. Efectivamente, tanto las células alimentadoras como las condiciones de cultivo de los medios condicionados típicamente dan como resultado cierto nivel de diferenciación no deseada, particularmente alrededor de los bordes de la colonia de células ES en crecimiento en el centro de la colonia.

Los esfuerzos recientes han dado lugar al reemplazo de las células alimentadoras o los medios condicionados por un huésped con condiciones de cultivo de reemplazo, tales como: sustituto de suero de eliminación (knock-out) (KSR) en el medio (2005, Nature Methods, 2:185-189). El KSR contiene una fracción indefinida de crudo de albúmina sérica bovina (BSA). Otros demostraron un mantenimiento a largo plazo de la pluripotencia en el medio definido químicamente con FGF2, activina A e insulina (Vallier et al., 2005, J Cell Sci, 118:4495-4509). Las formulaciones de medios comercializados que incluyen el medio mTeSR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) y, además, se usó anteriormente StemPro™ (Invitrogen, CA) para mantener y proliferar células madre pluripotentes humanas. La experiencia previa adicional focalizada en el desarrollo de medios definidos incluye las patentes de E.U.A. núms. 7449334, 7442548, 7005252, 2008/0268534, 7410798, 7297539 y 6800480. -Además, una publicación reciente perfeccionó aún más el medio mTeSR®1 a ocho componentes (Nature Methods, 2011 , 8:424-424) lo cual evidencia que aún en los medios definidos existen agentes innecesarios que pueden realmente demorar la proliferación de células ES o reducir su estado pluripotencial. El medio perfeccionado mTeSR®1 consiste en un medio basal DMEM/F12 complementado con insulina, selenio, transferrina, ácido ascórbico, FGF2 (bFGF), y TGFp o nodal, que tiene el pH ajustado con NaHCO3.

Por lo tanto es evidente que aún existe la necesidad de condiciones de medios totalmente definidos que proporcionen consistencia con respecto a la expansión de células pluripotentes mientras tienen una cantidad mínima de componentes agregados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una formulación de cultivo celular definido, el mantenimiento y la expansión de células madre pluripotentes, en donde la formulación de cultivo celular definida comprende el medio basal, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF y ácido ascórbico; Y en donde las células madre en cultivo en la formulación de cultivo celular definido mantienen la plurípotencia y la estabilidad cariotípica de las células madre por al menos 10 pasajes. En algunas modalidades de la invención, la formulación del cultivo celular comprende, además, el factor de crecimiento de insulina tipo 1 (IGF-1). En algunas modalidades de la invención, la formulación de cultivo celular comprende DMEM-F12.

La invención proporciona una formulación de cultivo celular definido para el cultivo, mantenimiento y expansión de células madre pluripotentes, en donde la formulación de cultivo celular definida comprende el medio basal, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF, ácido ascórbico, elementos traza C, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos y dipéptido L-alanil-L-glutamina; y en donde las células madre en cultivo en la formulación de cultivo celular definido mantiene la plurípotencia y la estabilidad cariotípica de las células madre por al menos 10 pasajes. En algunas modalidades de la invención, la formulación de cultivo celular comprende MCDB-131.

En algunas modalidades de la invención ITS-X proporciona la insulina, transferrina y selenio para la formulación de cultivo celular definida de la invención. En algunas modalidades de la invención, ITS-X está presente desde aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 2 %. En algunas modalidades de la invención, ITS-X está presente en aproximadamente 1 %. En algunas modalidades de la invención, la albúmina libre de ácidos grasos es grado reactivo. En algunas modalidades de la invención, el BSA libre de ácidos grasos grado reactivo está presente desde aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 2.5 %. En algunas modalidades de la invención, el BSA libre de ácidos grasos grado reactivo está presente en aproximadamente 2 %.

En algunas modalidades, el ligando TGF-ß en la formulación de cultivo celular definido de la invención es TGF-ß? . En algunas modalidades de la invención, TGF-ß? está presente desde aproximadamente 0.5 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml. En algunas modalidades de la invención, el TGF-B1 está presente a aproximadamente 1 ng/ml.

En algunas modalidades de la invención, el bFGF está presente en la formulación de cultivo celular desde aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En algunas modalidades de la invención, el bFGF está presente en la formulación de cultivo celular definido a aproximadamente 50 ng/ml. En algunas modalidades, el bFGF está presente en la formulación de cultivo celular definido en aproximadamente 100 ng/ml.

En algunas modalidades de la invención, el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) está presente desde aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml. En algunas modalidades de la invención, el IGF-1 está presente en la formulación de cultivo celular definido en aproximadamente 20 ng/ml.

En algunos aspectos de la invención, el ácido ascórbico está presente en la formulación de cultivo celular definido desde aproximadamente 0.2 mM a aproximadamente 0.3 m . En algunos aspectos de la invención, el ácido ascórbico está presente en la formulación de cultivo celular definido en aproximadamente 0.25 mM.

En una modalidad, la invención se refiere a una formulación de cultivo celular definido que consiste esencialmente en medio basal DMEM-F12, ITS-X (para proporcionar insulina, transferrina y selenio), albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF, factor de crecimiento de la insulina tipo 1 (IGF-1) y ácido ascórbico.

En una modalidad, la invención se relaciona con una formulación de cultivo celular definido que consiste esencialmente en MCDB-131 , ITS-X (como fuente de insulina, transferrina y selenio), albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF, ácido ascórbico, elementos traza C, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos y dipéptido L-alanil-L-glutamina.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para la expansión de células madre pluripotentes humanas, en donde el método comprende el cultivo de células madre pluripotentes humanas en una matriz libre de alimentador en una formulación de cultivo celular definido; en donde la formulación de cultivo celular definido comprende un medio basal, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF y ácido ascórbico; y en donde el cultivo de células madre en la formulación de cultivo celular definido mantiene la pluripotencia y la estabilidad cariotípica de las células al menos por 10 pasajes. En algunas modalidades, la formulación de cultivo celular definido comprende, además, el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1). En algunas modalidades, la formulación de cultivo celular comprende DMEM-F 2.

En una modalidad, la invención se relaciona con un método para la expansión de células madre pluripotentes humanas, en donde el método comprende el cultivo de células madre pluripotentes humanas en una matriz libre de alimentador en una formulación de cultivo celular definido; en donde la formulación de cultivo celular definido comprende el medio basal, insulina, transferrina, setenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF, ácido ascórbico, IGF-1, elementos traza C, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos y dipéptido L-alanil-L-glutamina. En algunas modalidades, la formulación de cultivo celular empleada en el método para la expansión de células madre pluripotentes humanas, comprende MCDB-131.

Una modalidad de la presente invención es una población celular in vitro caracterizada además porque más de 50 % de la población celular es positiva para la expresión proteica de OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2 con una expresión negativa o baja de SSEA-4 y ZFP42. La población se obtiene por cultivo de células madre pluripotentes en una formulación de cultivo celular definido que comprende un medio basal complementado con IGF-1 , insulina, bFGF, ligando TGF-B y albúmina libre de ácidos grasos; y en donde la formulación de cultivo celular definido no comprende ácido ascórbico.

En algunas modalidades de la invención, la formulación de cultivo celular definido comprende el medio basal DMEM/F12. En algunas modalidades de la invención la formulación de cultivo celular comprende insulina como ITS-X. En algunas modalidades de la invención, el ITS-X está presente desde aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 2 %. En algunos aspectos de la invención, el ITS-X está presente en aproximadamente 1 %. En algunas modalidades de la invención, la albúmina libre de ácidos grasos es grado reactivo. En algunos aspectos de la invención, la albúmina libre de ácidos grasos grado reactivo está presente de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 2.5 %. En algunas modalidades de la invención, la albúmina libre de ácidos grasos grado reactivo está presente en aproximadamente 2 %. En algunos aspectos de la invención, el ligando TGF-B es TGF-B1. En algunas modalidades de la invención, el TGF-B1 está presente de aproximadamente 0.5 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml. En algunos aspectos de la invención, el TGF-B1 está presente en aproximadamente 1 ng/ml.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A a 1 D muestran imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 3 pasajes en IH-3 (Figura 1A), IH-1 (Figura 1B), IH-6 (Figura 1C) y mTeSR®1 (Figura 1 D).

Las Figuras 2A a 2C muestran imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 10 pasajes en medios IH-3 (Figura 2A), IH-1 (Figura 2B) y mTeSR®1 (Figura 2C).

Las Figuras 3A a 3C muestran imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 18 pasajes en medios IH-3 (Figura 3A), IH-1 (Figura 3B) y mTeSR®1 (Figura 3C).

Las Figuras 4A a 4F muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas en los medios que se describen en el Ejemplo 1 que se recolectan en los pasajes 1 a 5 (P1-P5); ZFP42 (Figura 4A), SOX2 (Figura 4B), POU5F1 (OCT4) (Figura 4C), Nanog (Figura 4D), FOXA2 (Figura 4E) y AFP (Figura 4F).

Las Figuras 5A a 5B muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de Nanog, POU5F1 (OCT4), SOX2 y ZFP42 (Figura 5A) y de AFP y FOXA2 (Figura 5B) en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas en los medios que se describen en el Ejemplo 1 y que se recolectan en el pasaje 10.

Las Figuras 6A y 6B muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de ZFP42, SOX2, POU5F1 (OCT4) y Nanog (Figura 6A) y de AFP y FOXA2 (Figura 6B) en las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas en los medios que se describen en el Ejemplo 1 y que se recolectan en el pasaje 18.

Las Figuras 7A a 7F muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en las células cultivadas durante 18 pasajes en los medios IH-3 que se describen en el Ejemplo 1 :control de isotipo (Figura 7A); KI-67 (Figura 7B); OCT4 (Figura. 7C)¡ SOX17 (Figura. 7D); FOXA2 (Figura. 7E); y SOX2 (Figura 7F). La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 8A a 8F muestran imágenes de las células cultivadas durante 18 pasajes en el medio IH-3 que se describe en el Ejemplo 1 y mediante inmunotinción para OCT-4, FOXA2, SOX2 y marcado con fluorescencia del ADN mediante DAPI. Las imágenes obtenidas para OCT4 (Figura 8A), FOXA2 (Figura 8B) y ADN marcado con DAPI (Figura 8C) se obtuvieron del mismo campo óptico pero con filtros diferentes. Asimismo, las imágenes para SOX2 (Figura 8D), FOXA2 (Figura 8E) y ADN marcado con DAPI (Figura 8F) se obtuvieron del mismo campo óptico pero con diferentes filtros.

Las Figuras 9A a 9F representan imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante cinco pasajes en medio mTeSR®1 (Figura 9A) y en las formulaciones de IH-3 (Figura 9B), IH-3-1 (Figura 9C), IH-3-2 (Figura 9D), IH-3-3 (Figura 9E) e IH-3-4 (Figura 9F) que se describen en el Ejemplo 2.

Las Figuras 10A a 10E muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas en los medios que se describen en el Ejemplo y que se recolectan en el pasaje 5: ZFP42 (Figura 10A), SOX2 (Figura 10B), FOXA2 (Figura 10C), Nanog (Figura 10D) y POU5F1 (OCT4) (Figura 10E).

Las Figuras 11A a 11 D representan imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 20 pasajes en medio mTeSR®1 (Figura 11 A), formulaciones de medios IH-3 (Figura 11 B), IH-1 (Figura 11C) e IH-3RT (Figura 11 D) que se describen en el Ejemplo 3.

Las Figuras 12A a 12F muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante 15 pasajes en los medios que se describen en el Ejemplo 3: AFP (Figura 12A), FOXA2 (Figura 12B), SOX2 (Figura 12C), Nanog (Figura 12D), POU5F1 (OCT4) (Figura 12E) y ZFP42 (Figura 12F).

Las Figuras 13A a 13F muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante 20 pasajes en medio mTeSR®1 y en los medios IH-1 e IH-3 que se describen en el Ejemplo 3: AFP Figura 13A), FOXA2 (Figura 13B), NANOG (Figura 13C), POU5F1 (OCT4) (Figura 13D), SOX2 (Figura 13E) y ZFP42 (Figura 13F).

Las Figuras 14A y 14B representan imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 4 días en formulaciones de los medios que se describen en el Ejemplo 5 que contienen BSA Sigma (Figura 14A) o que contienen BSA libre de ácidos grasos (Figura 14B).

Las Figuras 15A y 15B representan imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante tres pasajes en formulaciones de los medios que se describen en el Ejemplo 5 que contienen BSA Sigma (Figura 15A) o que contienen BSA libre de ácidos grasos (Figura 15B).

Las Figuras 16A a 16C muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante tres pasajes en formulaciones de medios que se describen en el Ejemplo 5 que contienen BSA Sigma o BSA libre de ácidos grasos: AFP (Figura 16A), MIXL1 (Figura 16B) y T (BRY) (Figura 16C).

Las Figuras 17A a 17D muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante tres pasajes en formulaciones de los medios que se describen en el Ejemplo 6: SOX2 (Figura 17A), POU5F1 (Figura 17B), NANOG (Figura 17C) y FOXA2 (Figura 17D).

Las Figuras 18A a 18E representan imágenes de contraste de fases de células H1 cultivadas durante 10 pasajes en formulaciones de los medios IH-3 (Figura 18A), IH-3P-2 (Figura 18B), IH-3P-3 (Figura 18C), IH-3P-4 (Figura 18D) e IH-3P-5 (Figura 18E) que se describen en Ejemplo 6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, sino a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.

Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios y extraembrionarios; (2) pluripotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios; (3) multipotentes, que significa que pueden producir un subconjunto de linajes celulares pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotentes restringidas a la sangre y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa que pueden producir un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madres multipotentes; y (5) unipotentes, que significa que tienen la capacidad de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

La diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se utiliza en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para el linaje de interés.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

"Medio basal" se refiere a una solución de sales, nutrientes y vitaminas que pueden soportar el crecimiento de células madre pluripotentes en el cultivo. El medio basal puede seleccionarse, entre otros, del medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio MCDB, RPMI. El DMEM, además, puede ser DMEM/F12 (conocido, además, como DM-F12), o DMEM de alta glucosa (conocido, además, como DMEM-hg). El medio MCDB puede seleccionarse de cualquier medio MCDB disponible y específicamente MCDB-131. Alternativamente, el medio basal se puede seleccionar mediante la mezcla de formulaciones de los medios básales enumerados anteriormente en la proporción apropiada para permitir la proliferación y el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre embrionarias. En algunas modalidades, el medio basal en la formulación de cultivo celular definido de la invención es DMEM-F12. En algunas modalidades, el medio basal en la formulación de cultivo celular definido de la invención es MCDB-131.

"Células alimentadoras" se refiere a células madre no pluripotentes sobre las que se siembran células madre pluripotentes. Las células alimentadoras proporcionan suficientes factores solubles e insolubles para soportar la adhesión, la proliferación y el mantenimiento de los marcadores pluripotenciales por parte de células madre pluripotentes.

"Medio condicionado" se refiere a un medio que se complementa, además, con factores solubles derivados de células alimentadoras.

"Matriz extracelular" o "Matriz definida" o "Matriz sintética" se refiere a una o más sustancias que proporcionan la adhesión, proliferación y mantenimiento de marcadores pluripotenciales por parte de células madre pluripotentes. En la presente descripción se usan indistintamente "IGF" e "IGF-1" que significan factor de crecimiento insulinico tipo 1. En humanos esta proteína es producida por el hígado y es responsable por mucho de lo que se atribuye a la hormona del crecimiento humano.

Como se usa en la presente descripción, "FGF2" y "bFGF" se usan indistintamente para identificar el factor de crecimiento de fibroblastos básico humano.

En la presente descripción se usan indistintamente "TGF beta", "TGF-B" y "TGF-ß". Puede seleccionarse un ligando TGF-ß de las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), activinas (Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C), nodal y TGF-ß. Puede seleccionarse un TGF-ß de TGF-ß? , TGF- 2, activina A y TGF-p3.

Aislamiento, expansión v cultivo de células madre pluripotentes Caracterización de las células madre pluripotentes Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de las etapas (SSEA) 3 y 4 y los marcadores detectables usando los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282: 1 145, 1998). La diferenciación de células madre in vitro produce la pérdida de expresión de SSEA-4, Tra 1-60 y Tra1-81 (si está presente) y la expresión incrementada de SSEA-1. Las células madres pluripotentes no diferenciadas tienen, típicamente, actividad de fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar al fijar las células con paraformaldehído al 4 % y, después, desarrollarlas con Vector Red como sustrato, tal como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame CA). Además, las células madre pluripotentes indiferenciadas expresan, típicamente, OCT4 y TERT, como se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotenciales propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre se puede confirmar, por ejemplo, por la inyección de células en ratones (SCID) inmunodeficientes combinados severos, al fijar los teratomas que se forman por medio del uso de 4 % de paraformaldehído, y después examinándolos histológicamente para la evidencia de los tipos de células provenientes de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados. Las células pluripotentes pueden expandirse fácilmente en el cultivo mediante el uso de varías capas del alimentador o mediante el uso de recipientes recubiertos con la proteína matriz. Alternativamente, las superficies químicamente definidas combinadas con medios definidos como el medio mTeSR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) puede usarse para una expansión de las células de rutina. Las células pluripotentes pueden eliminarse fácilmente de las placas de cultivo mediante el uso de enzimáticos, mecánicos o de varios quelantes del calcio como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Alternativamente, las células pluripotentes pueden expandirse en suspensión en ausencia de cualquier proteína de matriz o capa del alimentador.

Fuentes de las células madre pluripotentes Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son líneas establecidas de células madre embrionarias humanas o células germinales embrionarias humanas, como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, Wl). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. Además, son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas, en ausencia de células del alimentador. Además, son adecuadas las células pluripotentes inducibles (IPS) o células pluripotentes reprogramadas que pueden derivar de células somáticas adultas mediante el uso de la expresión forzada de una cantidad de factores de transcripción pluripotentes relacionados, como OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011 , 12:165-185).

Las células madre embrionarias humanas pueden prepararse según la descripción de Thomson et al. (patente de E.U.A. núm. 5,843,780; Science, 1998; 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol, 1998; 38:133-165; 1995, Proc Nati Acad Sc¡ E.U.A. 92:7844-7848).

Las características de las células madre pluripotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y se continúan identificando las características adicionales de las células madre pluripotentes. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

Los marcadores de diferenciación, típicamente, se presentan en cultivos de células madre embrionarias incluyen, por ejemplo, AFP, FOXA2, SOX17, T(BRY) y MIXL1.

En una modalidad de la presente invención, las células, IGF, insulina, bFGF, ligando TGF-B y albúmina libre de ácidos grasos para sostener la proliferación de células madre pluripotentes mientras mantiene la pluripotencia y la estabilidad cariotípica de las células expandidas, al menos, durante 10 pasajes.

Una modalidad de la presente invención es una población celular in vitro caracterizada, además, porque más de 50 % de la población celular es positiva para la expresión proteica de OCT4, SOX2, NANOG y FOXA2 positiva pero con una expresión proteica baja de SSEA-4 y ZFP42.

Otro aspecto de la presente invención describe una formulación de cultivo celular definido in vitro que comprende IGF, insulina, bFGF, TGF- B, albúmina libre de ácidos grasos y sin ácido ascórbico que produce una población celular en donde más del 50 % de la población celular es positiva por tinción proteica para OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2 y la expresión proteica baja de SSEA-4 y ZFP42.

La presente invención se ilustra, además, pero no se limita a los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y porcentajes son por peso y los grados son Celsius, salvo que se indique lo contrario. Debe comprenderse que estos ejemplos, si bien indican modalidades preferidas de la invención, se presentan a modo ilustrativo solamente. En base al debate anterior y a estos ejemplos, una persona con experiencia en la materia puede determinar las características esenciales de esta invención y sin apartarse del espíritu y del alcance de esta, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Por lo tanto, en la presente descripción se muestran y se describen varias modificaciones de la invención, que las personas con experiencia en la materia evidenciarán a partir de la descripción anterior. Se prevé, además, que tales modificaciones entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad.

Ejemplo 1 Pruebas de varias condiciones de cultivo para identificar los componentes óptimos del medio para la proliferación de células madre embrionarias indiferenciadas Se usaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (desde el pasaje 35 al pasaje 40), cultivadas en placas recubiertas MATRIGEL™ (dilución 1 :30; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en medio mTeSR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) y transferidas mediante EDTA, como población inicial para probar diferentes composiciones de medios. Las células se transfirieron como pequeñas colonias mediante el uso de un tratamiento con EDTA durante 5 a 10 min a temperatura ambiente. Los cultivos se dividieron rutinariamente en una proporción de 1 :6 a 1 :10 en cada pasaje. La Tabla I enumera las formulaciones de medios iniciales probadas por su capacidad de proliferar células H1 mientras mantiee sus marcadores de morfología indiferenciada y pluripotencia.

Tabla I Formulaciones de medios evaluadas Elementos traza C** (Mediatech, Manassas, VA), (4-(2-h¡drox¡et¡l)-1-piperaz¡na ácido etanosulfónico HEPES; Invitrogen, Carlsbad, CA), LiCI (Sigma, Saint Louis, MO), glucosa (Sigma), lípidos definidos*** (Invitrogen), BSA libre de ácidos grasos grado reactivo (Proliant, Ankeny, IA), TGF-ß? (R & D Systems, Minneapolis, MN), bFGF (R & D Systems), IGF-1 (R & D Systems), GlutaMAX™ (200 mM de dipéptido L-alanil-L-glutamina en 0.85 % de NaCI; Invitrogen), BSA rico en llpidos- Albumax (Invitrogen), ITS-X (insulina, transferrina, complemento de selenium-X; Invitrogen), BSA de Nueva Zelanda grado estándar (Lampire Biological Laboratories, Coopersburg, PA), BSA grado estándar (Lampire), NEAA (Invitrogen), mercaptoetanol (Invitrogen), CHIR99021 (Stemgent, Cambridge, MA), PD0325901 (Sigma), Y2763 (Sigma).

Elementos tra2a C de Mediatech catálogo núm. 99-176 1000x liquido contiene: 1.20 mg/l AICI3 · 6H20, 0.17 mg/l AgN03, 2.55 mg/l Ba(C2H302)2, 0.12 mg/l KBr, 2.28 mg/l CdCI2, 2.38 mg/l CoCI2 · 6H20, 0.32 mg/l CrCI3 (anhidro), 4.20 mg/l NaF, 0.53 mg/l Ge02, 0.17 mg/l Kl, 1.21 mg/l RbCI, y 3.22 mg/l ZrOCI2 · 8H20.

Invitrogen Concentrado lipldico químicamente definido catálogo núm. 11905031 contiene 100.0 ml/l de alcohol etílico (graduación 200) y 2 mg/l de ácido araquidónico, 220 mg/l de colesterol, 70 mg/l de DL-alfa- acetato de tocoferol, O mg/I de alcohol etílico al 100 %, 10 mg/l de ácido linoleico, 10 mg/l de ácido linolénico, 10 mg/l de ácido mirlstico, 10 mg/l de ácido oleico, 10 mg/l de ácido palmítico, 10 mg/l ácido palmitoleico, 90000 mg/l de ácido L-plurónico F-68, 10 mg/l de ácido esteárico y 2200 mg/l de Tween 80® (ICI Americas, Inc. Bridgewater, NJ).

El uso de IH-4 e IH-5 se discontinuó para realizar nuevas evaluaciones debido a que las células cultivadas mediante el uso de IH-4 no presentaron crecimiento después del pasaje 2. En el pasaje 2, el crecimiento celular en IH-2 demostró un cambio significativo en la morfología compatible con células diferenciadas y pérdida de colonias empacadas. Se seleccionaron los medios IH-1 , IH-3 e IH-6 para evaluaciones adicionales. En los pasajes 3 a 5, las células cultivadas en IH-6 presentaron evidencias morfológicas en la periferia de las colonias ES (compare la Figura 1C con las Figura 1A, Figura 1B y Figura 1D).

Después del pasaje 5, solo IH-1 e IH-3 se compararon adicionalmente con las células cultivadas en medio mTeSR®1. En los pasajes 5 a 18 se recolectaron muestras de cultivos de IH-1 , IH-3 y mTeSR®1 y se evaluaron por análisis FACS, PCR, cariotipo (bandeo cromosómico o FISH), y tinción por inmunofluorescencia. Los resultados del análisis FISH se presentan en la Tabla II. Estos resultados muestran que las células H1 cultivadas en medio IH-1 o IH-3 mostraron un cariotipo normal, mientras que las células cultivadas en medio mTeSR®1 mostraron trisomía 12 anormal en los pasajes 10 y 18.

Tabla II Resultados del análisis FISH de los cromosomas 12 y 17 por CellLineGenetics (Madison. WD Además, de modo similar a las células que crecieron en medio mTeSR®1 , células transferidas continuamente en medio IH-1 mantuvieron una morfología de colonias ES característica con muy pocas células diferenciadas rodeando las colonias. Sin embargo, las células que crecieron en medio IH-3 comenzaron a perder la morfología de las colonias ES características después del pasaje 10 (Vea la Figura 1A, Figura 2A y la Figura 3A).

Se usó la evaluación de los marcadores de superficie e internos atribuidos a la pluripotencia para evaluar el impacto de las formulaciones probadas en el mantenimiento de la pluripotencia. Como se muestra en la Tabla III, en el pasaje 5, células cultivadas en IH-1 e IH-3 mostraron un perfil similar de los marcadores de superficie como cultivos expandidos en el medio mTeSR®1. Sin embargo, por el pasaje 10, las células H1 cultivadas en el medio IH-3 mostraron una caída significativa en la expresión de SSEA-4 y una disminución modesta en la expresión de TRA1-60 y 1-81. Las células H1 cultivadas en medio IH-1 para 10 pasajes mantuvieron un patrón de expresión similar a aquellas cultivadas en medio mTeSR® .

Tabla III Los resultados de FACS en los pasajes 5 v 10 para marcadores de superficie relacionados con el estado pluripotencial de las células Sorprendentemente, de modo similar a las células H1 cultivadas en medios mTeSR®1 e IH-1 , las células H1 cultivadas en medios IH-3 mantuvieron una fuerte expresión de los marcadores OCT4 y SOX2 en el pasaje 11 (Tabla IV). Esto fue a pesar de un nivel de expresión muy bajo de SSEA-4 para células H1 cultivadas en medio IH-3.

Tabla IV Marcadores internos y de superficie de las células cultivadas para 11 pasajes en medios IH-1 , IH-3 y mTeSR®1 Como se observa en las Figuras 4A a 4F, la expresión del ARNm de los marcadores de pluripotencia del núcleo, tales como Nanog (Figura 4D), OCT4 (Figura 4C), SOX2 (Figura 4B) y ZPF42 (Figura 4A) se mantuvo a través del pasaje 5 para las células H1 cultivadas en medios IH-1 e IH-3 al mismo nivel que las células H1 cultivadas en mTeSR®1. Sin embargo, en los pasajes 10 a 18 se observó una disminución significativa de la expresión de ZFP42 mientras que la expresión de OCT4, Nanog y SOX2 no se modificaron significativamente para el crecimiento celular en medio IH-3 en comparación con las células H1 cultivadas en medio IH-1 o mTeSR®1 (Consulte la Figura 5A y Figura 6A). Además, el análisis FACS de células H1 cultivadas en medio IH-3 durante 18 pasajes demostró que >97 % de las células eran OCT4+ (Figura 7C), SOX2+ (Figura 7F) y KI-67+ (Figura 7B). Aproximadamente 1 % de las células eran SOX17+ (Figura 7D) y -85 % de las células eran FOXA2+ (Figura 7E). Las Figuras 8A a 8F muestran imágenes de tinción de inmunofluorescencia de células H1 cultivadas en medio IH-3 durante 18 pasajes. Estas imágenes ilustran que una cantidad significativa de células OCT4 y SOX2 positivas eran, además, FOXA2+. Las células H1 cultivadas en medio IH3 adquirieron un fenotipo en donde al menos 70 % de las células eran Oct4+ NANOG+ SOX2+ KI-67+ ZFP42- y FOXA2+. Esto representa una población de células que aún no se describió en la materia.

Ejemplo 2 El cultivo de células H1 en medio IH-3 adicionadas con ácido ascórbico restablece las principales características de las células madre embrionarias indiferenciadas.

Para identificar la causa de la disminución de SSEA-4 y ZPF42 para células H1 cultivadas en IH-3 frente a aquellas cultivada en medio IH-1 y mTeSR®1 , se realizó un análisis de brecha, para identificar los principales reactivos presentes en mTeSR®1 y IH-1 pero está ausente en el medio IH-3. El medio IH-3 se complementó con elementos traza C, ácido ascórbico, cloruro de litio o lípidos definidos tal como se indica en la Tabla V.

Tabla V Modificaciones al medio IH-3 Las células H1 cultivadas durante 14 pasajes en IH-3 posteriormente se cultivaron en las formulaciones de los medios anteriores y se compararon con células cultivadas en medio IH-3. En diferentes pasajes, las células H1 cultivadas mediante el uso de varias formulaciones de medios se ensayaron para determinar marcadores pluripotenciales. Como se muestra en la Tabla VI, después de cinco pasajes adicionales, las células H1 cultivadas en medio IH-3-2 (IH-3 complementado con ácido ascórbico) recuperaron un pequeño porcentaje de su expresión SSEA-4 en comparación con las células cultivadas en otro medio probado.

Tabla VI Resultados de FACS en cinco pasajes después del pasaje 15 para determinar marcadores de superficie relacionados con el estado de pluripotencia de las células H1.

Como se observa en la Figura 9D, las células H1 cultivadas en medio IH-3-2 conservaron una morfología de célula madre embrionaria típica similar a las células del medio mTeSR®1 (Figura 9A). Sin embargo, las células H1 cultivadas en IH-3, IH-3-1 , IH-3-3 e IH-3-4 presentaron una morfología de colonias sueltas (Consulte las Figura 9B, Figura 9C y Figura 9F). El análisis de PCR de células cultivadas en las formulaciones de los medios anteriores confirma, adicionalmente, que las células H1 cultivadas en medio IH-3-2 recuperó parte de la expresión de ZFP42 y se redujo y se reguló la expresión de FOXA2 (consulte las Figura 10A a Figura 10E). Los datos anteriores muestran que se requiere que la presencia de ácido ascórbico mantenga la pluripotencia de células ES junto con su morfología de colonia/células características y baja expresión de marcadores de diferenciación. En base a estos datos, los cultivos posteriores de células H1 en medio IH-3 se complementaron, adicionalmente, con 0.25 mM de ácido ascórbico.

Las células cultivadas en IH-3-2 recuperaron algunas de las morfologías de colonias características de las células ES en donde las células cultivadas en formulaciones de otros medios IH presentaron una morfología más suelta.

Ejemplo 3 Los cultivos de células H1 en medio IH-3 e IH-1 mantienen la pluripotencia v el cariotipo estable a largo plazo Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pasajes 35 a 40), cultivados en MATRIGEL™ (dilución 1 :30) las placas recubiertas en medio mTeSR®1 y transferidas mediante el uso de EDTA, como se describió en el Ejemplo 1, se usaron como población inicial para evaluar cultivos a largo plazo mediante el empleo de medios IH-1 , IH-3-2 y mTeSR®1. Las células se transfirieron como pequeñas colonias mediante un tratamiento durante 5 a 10 minutos en EDTA a temperatura ambiente. Los componentes de los medios probados se enumeran en la Tabla VII.

Ingredientes usados en las formulaciones de medios IH-1 , IH-3-2 e IH-3RT Como se observa en las Figura 11A a 11 D, las células H1 cultivadas durante 20 pasajes en IH-1 , IH-3-2 e IH-3RT retuvieron la morfología típica de ES. Los resultados del análisis de PCR de células H1 cultivados durante 15 pasajes en medio IH-1 , IH-3-2 e IH-3RT se muestran en las Figura 12A a 12F. Los resultados del análisis de PCR de células H1 cultivadas durante 20 pasajes en IH-1 , IH-3-2, e IH-3RT se muestran en las Figura 13A a 13F.

Estos análisis confirmaron que, de forma similar a las células H1 se cultivaron en medio mTeSR®1 , las células cultivadas durante 15 o 20 pasajes en medio IH-1, IH-3-2 e IH-3RT (transferrina humana recombinante) retuvieron todos los marcadores pluripotenciales centrales mientras mostraban una expresión muy baja de FOXA2 y AFP. El análisis FACS en el Pasaje 15 y Pasaje 20 también confirmaron la expresión de marcadores de superficie relacionados con las células pluripotentes a los mismos niveles como células H1 cultivadas en medio mTeSR®1 (Consulte la Tabla VIII).

Tabla VIII Los resultados de FACS para las células probadas en el Pasaje 15 v Pasaje 20 para marcadores de superficie relacionados con el estado pluripotencial de las células Las células H1 cultivadas continuamente en IH-1 , IH-3-2 e IH-3RT presentaron un cariotipo normal tal como se midió mediante el análisis de bandeo cromosómico y el análisis FISH. Sin embargo, las células H1 cultivadas durante 10 a 20 pasajes en mTeSR®1 presentaron recuentos cromosómicos anormales (Consulte la Tabla IX).

Tabla IX Análisis FISH y de bandeo cromosómico de células H1 cultivadas en IH-1.

IH-3. IH-3RT v mTeSR®1.

Ejemplo 4 Velocidad de proliferación equivalente para células H1 cultivadas en medio IH-1. IH-3 v mTeSR®1 Para comparar la velocidad de proliferación de células cultivadas en medios probados anteriormente, las células H1 cultivadas en medio IH-1 , IH-3-2 y mTeSR®1 se liberaron mediante el uso de TrypLE (Invitrogen) y se sembraron con una densidad de 5 X 105 células por placas recubiertas MATRIGEL™ de 10 cm. Para reducir la apoptosis de las células individuales y mejorar la adhesión, las células liberadas se trataron previamente con 10 µ? de inhibidor Rock (Sigma). Se cambió el medio de cultivo diariamente hasta tres días después de la siembra. El día 3, se liberaron las células como células individuales y se contaron mediante un hemocitómetro. Como se ve en la Tabla X, las células cultivadas en las tres formulaciones de medios presentaron tiempos de duplicación equivalentes.

Tabla X Tiempos de duplicación de células H1 cultivadas en formulaciones de Ejemplo 5 El BSA libre de ácidos grasos de alta calidad permite la expansión de células pluripotentes Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pasajes 35 a 40), cultivadas en placas recubiertas MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTeSR®1 y transferidas mediante EDTA, se usaron como población inicial para evaluar cultivos a corto plazo mediante el uso del medio IH-3-2 complementado con BSA al 2 % de Sigma (catálogo núm. A2153; Lote: 061M1804V) o BSA libre de ácidos grasos (Proliant, catálogo núm. 7500804; Lote: 11G54001). Las células se transfirieron como pequeñas colonias mediante un tratamiento durante 5 a 10 minutos en EDTA a temperatura ambiente. Las Figuras 14A y 14B representan imágenes de contraste de células H1 cultivadas durante 4 días en formulaciones de medios que contienen BSA Sigma (Figura 14A) o BSA libre de ácidos grasos (Figura 14B). Las Figuras 15A y 15B representan imágenes de contraste de células H1 cultivadas durante tres pasajes en formulaciones de medios que contienen BSA Sigma (Figura 15A) o BSA libre de ácidos grasos (Figura 15B). Como se observa en la Figura 14A, desde el día 4 posterior a la siembra, se observaron evidencias morfológicas de células diferenciadas en cultivos en los que se usó BSA Sigma. Sin embargo, no hubo evidencia macroscópica de morfología de células diferenciadas en cultivos tratados con BSA libre de ácidos grasos (vea la Figura 14B). Se observó la misma tendencia en el pasaje 3, en donde hubo evidencias morfológicas de células diferenciadas en cultivos mediante el uso de BSA Sigma (vea la Figura 15A), mientras que no hubo evidencias macroscópicas de morfología de células diferenciadas en células cultivadas en medio de BSA libre de ácidos grasos (vea la Figura 15B). Además, no hubo una reducción significativa en la confluencia de células cultivadas en medios que comprenden BSA Sigma en comparación con células cultivadas en medios que comprenden BSA libre de ácidos grasos grado reactivo (compare las Figura 15A y Figura 15B).

Los datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de AFP (Figura 16A), MIXL1 (Figura 16B) y T (BRY) (Figura 16C) en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante tres pasajes en formulaciones de medios que contenían BSA Sigma o BSA libre de ácidos grasos se muestran en las Figura 16A, 16B y 16C. Los datos de PCR en el pasaje 3 demostraron claramente una regulación por incremento de marcadores asociados con una célula diferenciada para células cultivadas en medios que comprenden BSA Sigma. Estos datos demuestran claramente que el uso de BSA libre de ácidos grasos es crítico en el mantenimiento de la pluripotencia, morfología de colonia y proliferación de células.

Ejemplo 6 Las células madre plurípotentes pueden propagarse v mantener la pluripotencia en medio IH-3 mediante el uso de una amplia variedad de BSA libre de ácidos grasos y concentraciones de bFGF Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pasaje 35 a pasaje 40), cultivadas en placas recubiertas MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr®1 y transferidas mediante EDTA, se usaron como población inicial para evaluar cultivos a corto y largo plazo mediante el uso del medio IH-3 complementado como se indica en la Tabla XI.

Tabla XI Ingredientes usados en medio IH-3 complementado con varias dosis de BSA bFGF En el pasaje 10, se evaluó morfológicamente a las células mediante PCR para determinar la pluripotencia y los genes asociados a la diferenciación.

Además, las células se evaluaron para determinar la estabilidad cariotípica mediante el análisis FISH para detectar los cromosomas 12 y 17. Las Figuras 17A a 17D muestran datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de SOX2 (Figura 17A), POU5F1 (Figura 17B), NANOG (Figura 17C) y FOXA2 (Figura 17D) en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 cultivadas durante diez pasajes en las formulaciones de medios enumeradas en la Tabla XI. Como se observa en estas figuras, todas las formulaciones anteriores mantuvieron una fuerte expresión de marcadores de pluripotencia en relación al crecimiento celular en el medio mTeSR®1. Sin embargo, el crecimiento celular en BSA al 0-0.5 % BSA demostró una expresión mayor de FOXA2 lo cual indica un nivel mayor de diferenciación espontánea en estos cultivos en comparación con las otras formulaciones probadas. Las Figuras 18A a 18E representan imágenes de células H1 cultivadas durante 10 pasajes en las formulaciones de medios IH-3-2 (Figura 18A), IH-3P-2 (Figura 18B), IH-3P-3 (Figura 18C), IH-3P-4 (Figura 18D) e IH-3P-5 (Figura 18E) enumeradas en la Tabla XI. Como se indica en estas figuras, todas las formulaciones probadas en este ejemplo permitieron la formación de colonias ES con mínimas evidencias de morfología macroscópica diferenciada.

Tabla XII Análisis FISH de los cromosomas 12 y 17 analizado por CellLineGenetics Como se observa en la Tabla XII, las células H1 cultivadas durante diez pasajes en las formulaciones de medios enumeradas en la Tabla XI mantuvieron los recuentos normales para los cromosomas 12 y 17 según la medición del análisis FISH. Los datos anteriores indican que medios definidos que consisten en medios básales DMEM/F12 complementados con ITS-X, BSA libre de ácidos grasos grado reactivo, TGF-B1, IGF-1 y ácido ascórbico permiten la expansión de las células pluripotentes mientras mantienen la pluripotencia de las células cuando se usa una amplia variedad de concentraciones de BSA libre de ácidos grasos y bFGF.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una formulación de cultivo celular definido para el cultivo, mantenimiento y expansión de células madre pluripotentes, en donde la formulación de cultivo celular definido comprende medio basal, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF y ácido ascórbico; y en donde las células madre en cultivo en la formulación de cultivo celular definido mantienen la pluripotencia y la estabilidad cariotípica de las células por lo menos durante 10 pasajes.

2. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la formulación de cultivo celular comprende adicionalmente el factor de crecimiento de insulina tipo 1 (IGF-1).

3. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque la formulación de cultivo celular comprende DMEM-F12.

4. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la formulación de cultivo celular comprende adicionalmente elementos traza C, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos y dipéptido L-alanil-L-glutamino.

5. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la formulación de cultivo celular comprende MCDB-131.

6. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque ITS-X proporciona la insulina, transferrina y selenio.

7. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque la albúmina libre de ácidos grasos es grado reactivo.

8. La formulación de cultivo celular definido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque el ligando TGF- es TGF-ß? .

9. Una formulación de cultivo celular definido, que consiste esencialmente en medio basal DMEM-F12, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF e IGF-1.

10. Una formulación de cultivo celular definido, que consiste esencialmente en medio basal D EM-F12, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF, IGF-1 y ácido ascórbico.

1 1. Una formulación de cultivo celular definido, que consiste esencialmente en MCDB-131 , elementos traza C, ácido ascórbico, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina ácido etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF y dipéptido L-alanil-L-glutamina.

12. Un método para la expansión de células madre pluripotentes humanas, en donde el método comprende el cultivo de células madre pluripotentes humanas en una matriz libre de alimentador en una formulación de cultivo celular definido; en donde la formulación de cultivo celular definido comprende un medio basal, insulina, transferrina, selenio, albúmina libre de ácidos grasos, un ligando TGF-ß, bFGF y ácido ascórbico; y en donde el cultivo de las células madre en la formulación de cultivo celular definido mantiene la pluripotencia y la estabilidad cariotípica de las células al menos por 10 pasajes.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la formulación de cultivo celular definido comprende además factor 1 de crecimiento insulínico (IGF-1).

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizado además porque la formulación de cultivo celular definido comprende DMEM-F12.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la formulación de cultivo celular definido comprende adicionalmente elementos traza C, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico, cloruro de litio, glucosa, lípidos definidos y dipéptido L-alanil-L-glutamina.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la formulación de cultivo celular comprende MCDB-131.

17. Una población in vitro de células pluripotentes cultivadas en medio DMEM/F12 que comprende ITS-X, albúmina libre de ácido graso, TGF-B1, bFGF y IGF-1 , en donde al menos 70 % de las células de la población son Oct4+, NANOG+, SOX2+, KI67+, FOXA2+ y ZFP42-.