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CN103313725B - 免疫增强剂吸附不溶性金属离子 - Google Patents

免疫增强剂吸附不溶性金属离子 Download PDF

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CN103313725B CN201180052204.4A CN201180052204A CN103313725B CN 103313725 B CN103313725 B CN 103313725B CN 201180052204 A CN201180052204 A CN 201180052204A CN 103313725 B CN103313725 B CN 103313725B
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Abstract

免疫增强剂能吸附于不溶性金属盐如铝盐，以改变其药代动力学、药效动力学、肌肉内保留时间、和/或免疫刺激效果。修饰免疫增强剂以引入某一部分如能调节吸附的瞵酸盐基团。这些经修饰化合物甚至在以吸附形式递送时能保持或改善其体内免疫学活性。

Description

免疫增强剂吸附不溶性金属离子
本申请要求美国临时申请号61/379,126(2010年9月1日提交)、美国临时申请号61/488,394(2011年3月2日提交)和美国临时申请号61/466,887(2011年3月23日提交)的权益，其完整内容在此通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明处于配制免疫增强化合物以用于体内应用的领域。更特定地，本发明涉及通过例如吸附与不溶性金属盐相关联来设计用于制剂的免疫增强剂。
背景技术
特定病原体种类的早期检测通过先天免疫系统在模式识别受体(PRR)辅助下完成。所检测病原体包括病毒、细菌、原生动物和真菌，各自组成型表达一组种类特异、突变耐受性分子，称为病原相关分子模式。
Toll样受体(TLR)是一个重要的PRR家族且在先天免疫细胞中广泛表达，包括树突细胞(DC)、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞和成纤维细胞。TLR对细菌、病毒和寄生虫共有的保守分子模式具有特异性。
已鉴定了许多不同TLR。这些TLR结合不同配体并由其激活，所述配体依次位于不同生物体或结构上。本领域中对开发能引起特异TLR反应的免疫增强化合物感兴趣。
例如，参考文献1描述作为TLR2激动剂的某些脂肽。参考文献2-5各描述TLR7的小分子激动剂种类。参考文献6和7描述用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。这些各种化合物包括小分子免疫增强剂(SMIP)。
这些化合物通常就其TLR调节活性进行选择，而不关注其药代动力学或药效学(PK/PD)特性或其在能有效产生免疫刺激效果的注射位点处的保留。因此，所述化合物体内引入时具有弱PK/PD或保留概况。此外，可能需要改良所述化合物的系统性暴露，如用于使广泛预防性免疫中的潜在全身副作用最小或在紧急免疫治疗设置中维持系统性暴露。如图1-5所示，在某一位点注射TLR7活性SMIP初始产生高血清浓度，所述浓度迅速下降，注射的化合物能在24小时内从肌肉中完全清除。
本发明的目的是提供新型免疫增强剂制剂，特定是能改良或提高免疫增强剂药理学特性的SMIP，所述特性如PK/PD概况、细胞摄入、注射位点保留、B细胞总体激活减少等。另一目的是提供能改善免疫刺激活性的制剂。
发明内容
发明者意外发现免疫增强剂(且特定是TLR激动剂)的PK/PD和其在注射位点的保留能通过将其吸附到不溶性金属盐如铝盐来改良。稳定吸附化合物理想地通过配体交换发生，但已知的SMIP通常缺乏合适官能团。因此，能修饰SMIP以引入吸附部分如膦酸酯基团，其随后可调节吸附。发明者发现这些经修饰SMIP(特定是TLR激动剂)甚至在以已吸附形式递送时能保持其体内免疫学活性，因此改善PK/PD特性不损害免疫刺激活性。确实，本文中显示吸附TLR7激动剂会提高其免疫刺激活性。此外，吸附化合物能降低峰值血清浓度并增加肌肉内注射位点的驻留时间，这可有助于改变和控制系统性暴露水平。高系统性暴露能引起血液中生成高水平促炎细胞因子，因此注射位点处更高驻留时间能有助于使血液中促炎细胞因子生成最小，从而改善化合物的安全性和/或耐受性。细胞摄入化合物还可通过吸附来增强。
本发明能修饰SMIP以包含至少一个吸附部分，从而经修饰SMIP具有吸附到不溶性金属盐佐剂的能力。发明者意识到此修饰的广泛应用性和随后作为整体配制免疫增强剂。因此，本文描述了广泛范围的功能化免疫增强化合物和含说明本发明的这些功能化化合物的组合物。
第一方面中，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR激动剂，前提是所述TLR激动剂：
(e)不是TLR4激动剂；
(f)不是TLR9激动剂；
(g)不是下面定义的式(I)或(II)所述化合物；
(h)不是下面定义的式(III)所述化合物；
(i)不是下面定义的式(I-A)所述化合物。
吸附部分的存在使TLR激动剂能用不溶性金属盐佐剂配制以改良或提高其药代动力学和药效学概况、增加其在肌肉内注射位点的保留、和/或增加其免疫刺激效果。
第二方面中，本发明提供含至少一个吸附部分的水溶性TLR激动剂，前提是所述水溶性TLR激动剂：
(a)不是TLR4激动剂；
(b)不是TLR9激动剂；
(c)不是下面定义的式(I)或(II)所述化合物；和
(d)不是下面定义的式(III)所述化合物。
第三方面中，本发明提供含至少一个膦酸酯基团的TLR激动剂，前提是所述TLR激动剂：
(a)不是下面定义的式(I)或(II)所述含膦酸酯化合物；
(b)不是下面定义的式(III)所述含膦酸酯化合物；
(c)不是下面定义的式(I-A)所述含膦酸酯化合物。
第四方面中，本发明提供含至少一个吸附部分的化合物，其中所述化合物是TLR1、TLR3、TLR5、TLR6、TLR8或TLR11的激动剂。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述化合物。因此，本发明提供含激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述激动剂化合物吸附于不溶性金属盐上。
第五方面中，本发明提供含至少一个吸附部分的化合物，其中所述化合物是TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR11的激动剂，前提是所述化合物：
(a)不是下面定义的式(I)或(II)所述化合物；
(b)不是下面定义的式(III)所述化合物；和
(c)不是下面定义的式(I-A)所述化合物。
第六方面中，本发明提供含TLR激动剂和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐，前提是所述TLR激动剂：
(a)不是TLR4激动剂；
(b)不是TLR9激动剂；
(c)不是下面定义的式(III)所述化合物；和
(d)不是下面定义的式(I-A)所述化合物。
在此第六方面的一些实施方式中，所述化合物不包括酰基链或胞嘧啶核苷酸。在此第六方面的一些实施方式中，所述激动剂化合物具有低于1500Da的分子量，如低于1300Da或优选低于1000Da。
根据第七方面，本发明提供含TLR激动剂和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐，前提是所述TLR激动剂：
(a)不是下面定义的式(III)所述化合物；
(b)不是下面定义的式(I-A)所述化合物；
(c)不包括酰基链；和
(d)不包括胞嘧啶核苷酸。
此第七方面的激动剂优选具有低于1000Da的分子量。
根据第八方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR4激动剂，只要所述TLR4激动剂不包括酰基链。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR4激动剂。因此，本发明提供含TLR4激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR4激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第九方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR9激动剂，只要所述TLR9激动剂不包括胞嘧啶核苷。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR9激动剂。因此，本发明提供含TLR9激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR9激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR2激动剂，只要所述TLR2激动剂不是下面定义的式(III)所述化合物。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR2激动剂。因此，本发明提供含TLR2激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR2激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十一方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR7激动剂，只要所述TLR7激动剂不是：(a)下面定义的式(I)所述化合物；(b)下面定义的式(II)所述化合物；或(c)下面定义的式(I-A)所述化合物。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR7激动剂。因此，本发明提供含TLR7激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR7激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十二方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR4激动剂，其中所述TLR激动剂具有小于1000Da的分子量。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR4激动剂。因此，本发明提供含TLR4激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR4激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十三方面，本发明提供含至少一个吸附部分的TLR9激动剂，其中所述TLR激动剂具有小于1000Da的分子量。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述TLR9激动剂。因此，本发明提供含TLR9激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述TLR9激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十四方面，本发明提供包括2-15个吸附部分的TLR激动剂。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂是(i)非TLR4激动剂(ii)非TLR9激动剂(iii)非式(III)化合物和/或(iv)非式(IV)化合物。本发明还提供吸附于不溶性金属盐的所述激动剂。因此，本发明提供含激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十五方面，本发明提供含TLR激动剂、不溶性金属盐和缓冲液的组合物，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐，前提是(i)所述缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂是(i)非TLR4激动剂(ii)非TLR9激动剂(iii)非式(III)化合物和/或(iv)非式(IV)化合物。
根据第十六方面，本发明提供选自任意式(C)、(D)、(E)和(H)所述化合物的TLR7激动剂：
其中：
(a)P3选自H、C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；前提是P3和P4中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，
(b)P5选自H、C1-C6烷基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P6选自H、C1-C6烷基(各可选取代有选自C1-C4烷基和OH的1-3个取代基)、-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P7选自H、C1-C6烷基、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-,-NHC1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；前提是P5、P6和P7中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
(c)P8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基(各可选取代有OH)、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P9和P10各自独立选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基(各可选取代有OH和C1-C6烷基)、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；前提是P8、P9或P10中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
(d)P16和各P18各自独立选自H、C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P17选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C1-C6烷基芳基、C1-C6烷基杂芳基、C1-C6烷基芳基-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，各可选取代有选自C1-C6烷基或杂环基的1-2个取代基，前提是P16、P17或P18中至少一个包含-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)部分；
RX和RY独立选自H和C1-C6烷基；
RC、RD和RH各自独立选自H和C1-C6烷基；
XC选自CH和N；
RE选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C(O)C1-C6烷基、卤素和-((CH2)pO)q(CH2)p-；
XE选自共价键、CRE2RE3和NRE4；
RE2、RE3和RE4独立选自H和C1-C6烷基；
XH1-XH2选自-CRH2RH3-、-CRH2RH3-CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-CRH2RH3C(O)-、-NRH4C(O)-、C(O)NRH4-、CRH2RH3S(O)2和–CRH2＝CRH2-；
RH2、RH3和RH4各自独立选自H、C1-C6烷基和P18；
XH3选自N和CN；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键、C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基；
m选自0或1；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4；和
s选自0或1。
根据第十七方面，本发明提供选自式(G)所述化合物的TLR8激动剂：
其中：
P11选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NRVRW和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
P12选自H、C1-C6烷基、可选取代有–C(O)NRVRW的芳基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
P13、P14和P15独立选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
前提是P11、P12、P13、P14或P15中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RV和RW独立选自H、C1-C6烷基或与其结合的氮原子一起形成4-7元杂环；
XG选自C、CH和N；
代表可选双键，其中如果是双键，则XG是C；和
RG选自H、C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键、C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4。
根据第十八方面，本发明提供式(B)或(F)或(J)的化合物：
如下所定义。
第十七和第十八方面包括吸附于不溶性金属盐的具有式(B)或(G)的所述激动剂。因此，本发明提供含激动剂化合物和不溶性金属盐的组合物，其中所述激动剂化合物吸附于不溶性金属盐。
根据第十九方面，本发明提供制备佐剂复合物的方法，所述方法包含混合TLR激动剂与不溶性金属盐的步骤，从而所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐形成复合物。所述TLR激动剂优选是上面多种描述的TLR激动剂，例如在一些实施方式中，所述激动剂不是TLR4激动剂、TLR9激动剂、式(III)的化合物、或式(I-A)的化合物。本发明还提供由此方法获得或可获得的佐剂复合物。所述复合物能混合免疫原以提供免疫原性组合物。
根据第二十方面，本发明提供制备无菌佐剂复合物的方法，所述方法包含步骤：(i)混合TLR激动剂与不溶性金属盐，从而所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐形成复合物；和(ii)对所述复合物进行灭菌。所述激动剂优选是上面多种描述的激动剂，例如在一些实施方式中，所述激动剂不是TLR4激动剂或TLR9激动剂。本发明还提供由此方法获得或可获得的无菌佐剂复合物。所述无菌复合物能混合免疫原以提供免疫原性组合物。灭菌易通过高压灭菌(或类似过程[8])实现。
本发明还提供制备无菌佐剂复合物的方法，所述方法包含步骤：(i)对TLR激动剂的溶液或悬液进行灭菌；和(ii)组合已灭菌溶液或悬液与无菌不溶性金属盐。本发明还提供制备无菌佐剂复合物的方法，所述方法包含步骤：(i)对不溶性金属盐进行灭菌；和(ii)组合已灭菌不溶性金属盐与TLR激动剂的无菌溶液或悬液。本发明还提供制备无菌佐剂复合物的方法，所述方法包含组合TLR激动剂的无菌溶液或悬液与无菌不溶性金属盐的步骤。对TLR激动剂溶液/悬液灭菌能通过无菌过滤方便实现，此材料能以浓缩形式制备。对不溶性金属盐灭菌能通过高压灭菌方便实现。所述无菌不溶性金属盐通常是水性悬液。
根据第二十一方面，本发明提供制备免疫原性组合物的方法，其中所述方法包含混合TLR激动剂、不溶性金属盐与免疫原，从而提供免疫原性组合物。本发明还提供由此方法获得或可获得的免疫原性组合物。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂不是本文的化合物13。在此方面的一些实施方式中，所述免疫原不是参考文献40和73所公开287-953、936-741和961c的三蛋白混合物。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂是(i)非TLR4激动剂(ii)非TLR9激动剂(iii)非式(III)化合物和/或(iv)非式(IV)化合物。
根据第二十二方面，本发明提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含以下之一：(i)组合免疫原与含TLR激动剂和不溶性金属盐的混合物；(ii)组合不溶性金属盐与含TLR激动剂和免疫原的混合物；或(iii)组合TLR激动剂与含不溶性金属盐和免疫原的混合物。本发明还提供由此方法获得或可获得的免疫原性组合物。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂不是本文的化合物13。在此方面的一些实施方式中，所述免疫原不是参考文献40和73所公开287-953、936-741和961c的三蛋白混合物。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂是(i)非TLR4激动剂(ii)非TLR9激动剂(iii)非式(III)化合物和/或(iv)非式(IV)化合物。
根据第二十三方面，本发明提供改变或改善免疫增强剂药代动力学概况和/或增加免疫增强剂在肌肉内注射位点保持时间的方法，所述方法包含：化学修饰免疫增强剂以通过引入吸附基团形成经修饰免疫增强剂。所述吸附基团可经接头基团(如选自C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p，各可选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基等)连接免疫增强剂。经修饰化合物能吸附于不溶性金属盐。因此，本方法还可包含：将经修饰免疫增强剂吸附于不溶性金属盐。此吸附能改变或改善经修饰免疫增强剂药代动力学概况和/或相对未修饰免疫增强剂能增加其在肌肉内注射位点保持时间的方法。本方法还可包含组合经修饰吸附性免疫增强剂与免疫原的步骤，例如用于提供疫苗组合物。
根据第二十四方面，本发明提供包含以下的组合物：(a)根据式(I)或式(II)的化合物，和(b)免疫原。
根据第二十五方面，本发明提供包含以下的组合物：(a)含吸附于不溶性金属盐的TLR激动剂的佐剂复合物；和(b)至少2种不同免疫原。所述TLR激动剂优选是上面多种描述的TLR激动剂，例如在一些实施方式中，所述激动剂不是TLR4激动剂，在一些实施方式中，所述激动剂不是TLR9激动剂，在一些实施方式中，其具有式(I-A)等。在此方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂不是本文的化合物13。在此方面的一些实施方式中，所述免疫原不是参考文献40和73所公开287-953、936-741和961c的三蛋白混合物。本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含以下之一：(i)组合至少2种不同免疫原与含TLR激动剂和不溶性金属盐的混合物；(ii)组合不溶性金属盐与含TLR激动剂和至少2种不同免疫原的混合物；(iii)组合TLR激动剂与含不溶性金属盐和至少2种不同免疫原的混合物；或(iv)以任意顺序组合TLR激动剂、不溶性金属盐、第一免疫原和第二免疫原。
根据第二十六方面，本发明提供包含以下的组合物：(a)含吸附于不溶性金属盐的第一TLR激动剂的佐剂复合物；和(b)含吸附于不溶性金属盐的第二TLR激动剂的佐剂复合物。所述组合物还能包括一种或多种免疫原。
根据第二十七方面，本发明提供制备佐剂复合物的方法，所述方法包含步骤(i)制备TLR激动剂和可溶性铝盐的水性混合物；然后(ii)向水性混合物中加入非铝盐以形成吸附TLR激动剂的沉淀铝盐。所述TLR激动剂优选是上面多种描述的TLR激动剂。本发明还提供由此方法获得或可获得的佐剂复合物。所述复合物能混合免疫原以提供免疫原性组合物。
根据第二十八方面，本发明提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含混合(i)TLR激动剂和可溶性铝盐的水性混合物与(ii)免疫原的缓冲水性混合物的步骤，其中混合步骤引起吸附TLR激动剂和免疫原的铝盐沉淀。所述TLR激动剂优选是上面多种描述的TLR激动剂。本发明还提供由此方法获得或可获得的免疫原性组合物。
根据第二十九方面，本发明提供分析含吸附于不溶性金属盐的TLR激动剂的佐剂复合物的试验，所述试验包含步骤：(i)处理复合物以从不溶性金属盐中解吸TLR激动剂；然后(ii)检测解吸TLR激动剂。还提供多种其他试验(见下)。
在第三十方面，本发明提供含TLR激动剂和羟基磷酸铝佐剂的组合物，其中至少50％(如≥60％,≥70％,≥80％,≥85％,≥90％,≥95％,≥98％,≥99％)的TLR激动剂吸附于羟基磷酸铝，前提是所述TLR激动剂：
(a)不是TLR4激动剂；和
(b)不是TLR9激动剂。
在此第三十方面的一些实施方式中，所述TLR激动剂不是下面定义的式(III)所述化合物和/或不是下面定义的式(I-A)所述化合物。
根据第三十一方面，本发明提供制备佐剂复合物的方法，所述方法包含混合不溶性铝盐与TLR激动剂和不溶性铝盐的复合物的步骤，从而降低TLR激动剂与铝的比例。混合后，所述混合物可孵育以允许在添加的铝盐上重分布TLR激动剂。此方法使有高SMIP:Al+++比例的大量复合物能稀释成有所需SMIP:Al+++比例的复合物。所述散料能用作数种稀释的基础，因而简化多种不同终产物的整体生产。添加的不溶性铝盐理想地不含TLR激动剂，或另外有不同于其他材料的SMIP:Al+++比例，因而允许总体比例变化。2种混合材料中的铝盐优选是同一盐。
式(I)和(II)
在本发明的一些实施方式中，发明的TLR激动剂不是根据式(I)或(II)的化合物。然而，在其他实施方式中，例如在根据第六方面的实施方式中能使用具有这些式的TLR激动剂，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐。
式(I)和(II)对应于参考文献3公开的化合物。如本文所用，式(I)和(II)如下定义：
其中：
Z是-NH2或–OH；
X1是亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、亚炔基、取代的亚炔基、亚碳环基(carbocyclylene)、取代的亚碳环基、亚杂环基(heterocyclylene)、或取代的亚杂环基；
L1是共价键、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂环基、取代的亚杂环基、亚碳环基、取代的亚碳环基、-S-、-S(O)-、S(O)2,-NR5-、或-O-
X2是共价键、亚烷基、取代的亚烷基；
L2是NR5-、—N(R5)C(O)—、-O-、-S-、-S(O)-、S(O)2、或共价键；
R3是H、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂环基、取代的杂环基、杂环基烷基、或取代的杂环基烷基；
Y1和Y2各自独立地是共价键、-O-或-NR5-；或-Y1—R1和-Y2-R2各自独立是—O-N＝C(R6R7)；
R1和R2各自独立地是H、烷基、取代的烷基、碳环基、取代的碳环基、杂环基、取代的杂环基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂环基烷基、取代的杂环基烷基、-亚烷基-C(O)-O-R5、—(取代的亚烷基)-C(O)-O-R5、-亚烷基-O-C(O)-R5、-(取代的亚烷基)-O-C(O)-R5、-亚烷基-O-C(O)-O-R5、或-(取代的亚烷基)-O-C(O)-O-R5
R4是H、卤素、-OH、-O-烷基、-O-亚烷基-O-C(O)-O-R5、-O-C(O)-O-R5、-SH、或-NH(R5)；
各R5、R6和R7独立地是H、烷基、取代的烷基、碳环基、取代的碳环基、杂环基、取代的杂环基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂环基烷基、或取代的杂环基烷基。
参考文献3公开了一些包括吸附部分的式(I)和(II)化合物，但未报道这些部分能用于吸附。因此，参考文献3未认识到这些部分能用于提供已吸附化合物。
本发明还提供含以下的组合物：(a)式(I)或式(II)的化合物和(b)不溶性金属盐；其中式(I)或(II)的化合物吸附于不溶性金属盐。
式(III)
在本发明的一些实施方式中，发明的TLR激动剂不是根据式(III)的化合物。然而，在其他实施方式中，例如在根据第二十方面的实施方式中能使用具有式(III)的TLR激动剂，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐且随后灭菌。
式(III)对应于参考文献9公开的化合物。如本文所用，式(III)如下定义：
其中：
R1是H、-C(O)-C10-C18烷基；R2是C10-C18烷基；R3是C10-C18烷基；
L1是-CH2O-、-CH2OC(O)-、-CH2NR7C(O)-或–C(O)NR7-；
L2是-O-、-OC(O)-或-NR7C(O)-；
R4是-L3R5或-L4R5；
R5是–N(R7)2、-OR7、-P(O)(OR7)2、-C(O)OR7、-NR7C(O)L3R8、-OL3R6、-C(O)NR7L3R8、C1-C6烷基、C6芳基、C10芳基、C14芳基、5-14元杂芳基(含1-3个选自O、S和N的杂原子)、C3-C8环烷基或5-6元杂环烷基(含1-3个选自O、S和N的杂原子)，其中R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各可选取代有独立选自-OR9、-OL3R6、-OL4R6、-OR7和-C(O)OR7的1-3个取代基；
L3是C1-C10亚烷基，其中L3的C1-C6亚烷基可选取代有1-4个R6基团，或L3的C1-C6亚烷基用同一碳原子上的2个C1-C6烷基取代，所述烷基与其结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-或-(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-，其中各R11是C1-C6烷基，其与结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
各R6独立选自卤素、C1-C6烷基、-OR7、-N(R7)2、-C(O)N(R7)2、-P(O)(OR7)2、C6芳基、C10芳基和C14芳基；
各R7独立选自H和C1-C6烷基；
R8选自–SR7、-C(O)OH和5-6元杂环烷基，所述杂环烷基含1-3个选自O和N的杂原子；
R9是苯基；
各R10独立选自H和卤素；
各p独立选自1、2、3、4、5和6，和
q是1、2、3或4。
在本发明的一些实施方式中，发明的TLR激动剂是根据式(IIIa)而不是根据式(III)的化合物：
其中：
R1是H、-C(O)-C7-C18烷基或–C(O)-C1-C6烷基；
R2是C7-C18烷基；
R3是C7-C18烷基；
L1是-CH2OC(O)-、-CH2O-、-CH2NR7C(O)-或-CH2OC(O)NR7-；
L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；
R4是-L3R5或-L4R5；
R5是–N(R7)2、-OR7,-P(O)(OR7)2、-C(O)OR7、-NR7C(O)L3R8、-NR7C(O)L4R8、-OL3R6、-C(O)NR7L3R8、-C(O)NR7L4R8、-S(O)2OR7、-OS(O)2OR7、C1-C6烷基、C6芳基、C10芳基、C14芳基、5-14元环杂芳基(含1-3个选自O、S和N的杂原子)、C3-C8环烷基或5-6元环杂环烷基(含1-3个选自O、S和N的杂原子)，其中R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各自未取代或R5的杂环烷基各取代有独立选自-OR9、-OL3R6、-OL4R6、-OR7和-C(O)OR7的1-3个取代基；
L3是C1-C10亚烷基，其中L3的C1-C10亚烷基未取代，或L3的C1-C10亚烷基取代有1-4个R6基团，或L3的C1-C6亚烷基用同一碳原子上的2个C1-C6烷基取代，所述烷基与其结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-或-(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-，其中各R11是C1-C6烷基，其与结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
各R6独立选自卤素、C1-C6烷基、用1-2个羟基取代的C1-C6烷基、-OR7、-N(R7)2、-C(O)OH、-C(O)N(R7)2、-P(O)(OR7)2、C6芳基、C10芳基和C14芳基；
各R7独立选自H和C1-C6烷基；
R8选自–SR7、-C(O)OH、-P(O)(OR7)2、和5-6元环杂环烷基，所述杂环烷基含1-3个选自O和N的杂原子；
R9是苯基；
各R10独立选自H和卤素；
各p独立选自1、2、3、4、5和6，和
Q是1、2、3或4。
这些落在式(IIIa)范围内但在式(III)外的化合物可与式(F)和/或式(J)重叠。甚至在放弃权利的式(III)化合物中，在一些实施方式中，本发明仍可使用下列化合物72-101之一：
本发明一般使用的这30种化合物(化合物72-101，统称为“TLR2p”化合物)能用参考文献9所述操作制备。下面包括示例性合成。
式(I-A)
在本发明的一些实施方式中，发明的TLR激动剂不是根据式(I-A)的化合物。然而，在其他实施方式中，例如在根据第二十方面的实施方式中能使用式(I-A)的TLR激动剂，其中所述TLR激动剂吸附于不溶性金属盐且随后灭菌。
式(I-A)对应于参考文献4公开的化合物。如本文所用，式(I-A)如下定义：
其中：
X3是N；
X4是N或CR3
X5是-CR4＝CR5-；
R1和R2是H；
R3是H；
R4和R5各独立选自H、卤素、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)N(R11R12)、-N(R11R12)、-N(R9)2、-NHN(R9)2、-SR7、-(CH2)nOR7、-(CH2)nR7、-LR8、-LR10、-OLR8、-OLR10、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、和C3-C8杂环烷基，其中R4和R5的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、和C3-C8杂环烷基各可选取代有1-3个独立选自卤素、-CN、-NO2、-R7、-OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(0R10)2.-OP(O)(OR10)2、-C(O)N(R9)2、-S(O)2R8、-S(O)R8、-S(O)2N(R9)2、和-NR9S(O)2R8的取代基。
或者，R3和R4、或R4和R5、或R5和R6在相邻环原子上存在时，能可选连接在一起形成5-6元环，其中所述5-6元环可选取代有R7；
各L独立选自键、-(O(CH2)m)t-、C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基，其中L的C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基各可选取代有1-4个独立选自卤素、-R8、-OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、和-OP(O)(OR10)2的取代基；
R7选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、和C3-C8杂环烷基，其中R7的C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、和C3-C8杂环烷基各可选取代有1-3个R13基团，各R13独立选自卤素、-CN、-LR9、-LOR9、-OLR9、-LR10、-LOR10、-OLR10、-LR8、-LOR8、-OLR8、-LSR8、-LSR10、-LC(O)R8、-OLC(O)R8、-LC(O)OR8、-LC(O)R10、-LOC(O)OR8、-LC(O)NR9R11、-LC(O)NR9R8、-LN(R9)2、-LNR9R8、-LNR9R10、-LC(O)N(R9)2、-LS(O)2R8、-LS(O)R8、-LC(O)NR8OH、-LNR9C(O)R8、-LNR9C(O)OR8,-LS(O)2N(R9)2、-OLS(O)2N(R9)2、-LNR9S(O)2R8、-LC(O)NR9LN(R9)2、-LP(O)(OR8)2、-LOP(O)(OR8)2、-LP(O)(OR10)2和-OLP(O)(OR10)2；
各R8独立选自H、-CH(R10)2、C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基，其中R8的C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基各可选取代有1-3个独立选自-CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)N(R9)2、-C(O)OR11、-NR9C(O)R11、-NR9R10、-NR11R12、-N(R9)2、-OR9,-OR10、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2、和-OP(O)(OR11)2的取代基；
各R9独立选自H、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)R10、-C(O)OR10、-S(O)2R10、-C1-C6烷基、C1-C6杂烷基和C3-C6环烷基，或各R9独立地是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基与其结合的N一起形成C3-C8杂环烷基，其中C3-C8杂环烷基环可选包含选自N、O和S的额外杂原子，其中R9的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C3-C6环烷基或C3-C8杂环烷基各可选取代有1-3个独立选自-CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、OC(O)R11、-C(O)0R11、-NR11R12、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2的取代基；
各R10独立选自芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基，其中芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基可选取代有1-3个独立选自卤素、-R8、-OR8、-LR9、-LOR9、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9CO2R8.–CO2R8、-C(O)R8和-C(O)N(R9)2的取代基；
R11和R12独立选自H、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、和C3-C8杂环烷基，其中R11和R12的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、和C3-C8杂环烷基各可选取代有1-3个独立选自卤素、-CN、R8、-OR8、C(O)R8、OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-NR8C(O)R8、-NR8C(O)OR8、-C(O)N(R9)2、C3-C8杂环烷基、-S(O)2R8、-S(O)2N(R9)2、-NR9S(O)2R8、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基的取代基；
或R11和R12各自独立地是C1-C6烷基，与结合的N原子一起形成可选取代的C3-C8杂环烷基环，所述环可选包含选自N、O和S的额外杂原子；
环A是芳基或杂芳基，其中环A的芳基和杂芳基可选取代有1-3个RA基团，其中各RA独立选自-R8、-R7、-OR7、-OR8、-R10、-OR10、-SR8、-NO2、-CN、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9C(S)R8、-NR9C(O)N(R9)2、-NR9C(S)N(R9)2、-NR9CO2R8、-NR9NR9C(O)R8、-NR9NR9C(O)N(R9)2、-NR9NR9CO2R8、-C(O)C(O)R8、-C(O)CH2C(O)R8、-CO2R8、-(CH2)nCO2R8、-C(O)R8,-C(S)R8、-C(O)N(R9)2、-C(S)N(R9)2、-OC(O)N(R9)2、-OC(O)R8、-C(O)N(OR8)R8、-C(NOR8)R8、-S(O)2R8、-S(O)3R8、-SO2N(R9)2、-S(O)R8、-NR9SO2N(R9)2、-NR9SO2R8、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-N(0R8)R8、-CH＝CHCO2R8、-C(＝NH)-N(R9)2、和-(CH2)nNHC(O)R8或环A上的2个相邻RA取代基形成5-6元环，所述环含多至2个杂原子作为环成员；
n每次独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
各m独立选自1、2、3、4、5和6，和
t是1、2、3、4、5、6、7或8。
参考文献4公开了具有固有吸附特性的式(I-A)化合物，但发明人在提交参考文献4时没有报道存在这些特性并因而没有报道其能用于提供已吸附化合物。
式(IV)
在本发明的一些实施方式中，发明的TLR激动剂不是根据式(IV)的化合物。式(IV)对应于参考文献10公开的化合物。如本文所用，式(IV)如下定义：
其中：
R1是H、C1-C6烷基、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5、或-OL2R6；
L1是–C(O)-或–O-；
L2是C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L2的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基可选取代有1-4个氟基团；
各L3独立选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L3的C1-C6亚烷基可选取代有1-4个氟基团；
L4是亚芳基或杂亚芳基；
R2是H或C1-C6烷基；
R3选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、-OL3R7、-OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5和-C(R5)2OH；
各R4独立选自H和氟；
R5是-P(O)(OR9)2；
R6是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R7是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R8是H或C1-C4烷基；
各R9独立选自H和C1-C6烷基；
R10是H或C1-C4烷基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6，和
q是1、2、3或4。
式(C)、(D)、(E)、(G)和(H)
如上所讨论，发明的第十六方面提供具有式(C)、(D)、(E)或(H)的TLR7激动剂。发明的第十六方面提供式(C)的化合物。发明的第十六方面还且独立提供式(D)的化合物。发明的第十六方面还且独立提供式(E)的化合物。发明的第十六方面还且独立提供式(H)的化合物。
具有式(C)、(D)、(E)和(H)的‘母体’化合物是有用的TLR7激动剂(参见参考文献2-5和11-27)，但在本文中通过结合含磷部分来修饰。因此，式(C)、(D)、(E)和(H)的化合物能用于发明的多个方面。
在式(C)、(D)和(E)的一些实施方式中，所述化合物具有根据式(C`)、(D`)和(E`)的结构，如下所示：
式(C)、(D)和(E)和(H)的本发明实施方式还应用于式(C`)、(D`)、(E`)和(H`)。
在式(C)、(D)和(E)和(H)的实施方式中：X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(C)的其他实施方式中：P3选自C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；XC是CH；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；q是1或2。
在式(C)、(D)和(E)和(H)的其他实施方式中：X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(C)的其他实施方式中：P3选自C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；XC是N；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(D)的其他实施方式中：P5选自C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在式(D)的其他实施方式中：X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(D)的其他实施方式中：X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(E)的其他实施方式中：X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(E)的其他实施方式中：X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(E)的其他实施方式中：XE是CH2，P8是C1-C6烷氧基，可选取代有-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在式(E)的其他实施方式中：P9是-NHC1-C6烷基，可选取代有OH和C1-C6烷基、-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在一些实施方式中，式(C)的化合物不是其中P4为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)的化合物。
在一些实施方式中，式(C)的化合物中，P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基芳基。
式(C)、(D)和(E)的优选化合物是下述化合物(6)、(7)、(8)、(67)、(68)、(69)和(70)。本发明提供各个化合物(6)、(7)、(8)、(67)、(68)、(69)和(70)。
在式(H)的一些实施方式中：XH1-XH2是CRH2RH3，RH2和RH3是H，XH3是N，X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(H)的一些实施方式中：XH1-XH2是CRH2RH3，RH2和RH3是H，XH3是N，X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在一些实施方式中，发明的TLR激动剂例如式(H)的化合物不是下列2种化合物之一；
如上所讨论，发明的第十七方面提供式(G)的化合物。
式(G)的‘母体’化合物是有用的TLR8激动剂(参见参考文献6和7)，但在本文中通过结合含磷部分来修饰。因此，式(G)的化合物能用于发明的多个方面。
在式(G)的一些实施方式中，所述化合物具有根据式(G`)的结构；
在式(G)或(G`)的一些实施方式中：XG是C且代表双键。
在式(G)或(G`)的一些实施方式中：X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在式(G)或(G`)的一些实施方式中：X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
式(B)
发明的第十八方面提供根据式(B)的化合物
其中：
P1选自H、C1-C6烷基，可选取代有COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
P2选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
前提是P1和P2中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RB选自H和C1-C6烷基；
RX和RY独立选自H和C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；和
q选自1、2、3和4。
在式(B)的一些实施方式中：P1选自C1-C6烷基，可选取代有COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P2选自C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；RB是C1-C6烷基；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
在本发明的一些实施方式中(例如其中式(B)的化合物吸附于铝盐)，发明的TLR激动剂不是下列4种化合物之一：
在本发明的一些实施方式(如第25和第26方面)中，式(B)的优选化合物是本文的化合物1、2、5和13。
式(F)
发明的第十八方面提供根据式(F)的化合物：
其中：
RX和RY独立选自H和C1-C6烷基；
Q和V独立选自共价键、NH、S、C(O)和O；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；和
RF1、RF2和RF3独立选自H、C1-C18烷基、C1-C18烯基、C(O)C1-C18烷基和C(O)C1-C18烯基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；和
q选自1、2、3和4。
式(F)的‘母体’化合物是有用的TLR2激动剂(参见参考文献9)，但在本文中通过结合含磷部分来修饰。因此，式(F)的化合物能用于发明的多个方面。
在一些实施方式中，式(F)的化合物不是根据上面所定义式(III)的化合物。
在一些实施方式中，发明的TLR激动剂例如式(F)的化合物不是下列7种化合物(16)-(22)之一：
在一些实施方式(例如其中式(F)的化合物吸附于铝盐)中，发明的TLR激动剂不是化合物(17)、(19)或(22)之一。
在式(F)的一些实施方式中：Q和V是O。
在式(F)的一些实施方式中：X是O。
在式(F)的一些实施方式中：Y是O。
在式(F)的一些实施方式中：RX和RY是H；Q和V是O；X选自共价键和O；Y是NH；L选自C1-C6亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；RF1、RF2和RF3选自C1-C18烷基和C(O)C1-C18烷基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
式(J)
发明的第十八方面提供根据式(J)的化合物：
其中：
R1是H、-C(O)-C7-C18烷基或–C(O)-C1-C6烷基；
R2是C7-C18烷基；
R3是C7-C18烷基；
L1是-CH2OC(O)-、-CH2O-、-CH2NR7C(O)-或-CH2OC(O)NR7-；
L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；
R4是-L3R5或-L4R5；
R5是P(O)(OR7)2、-NR7C(O)L3-P(O)(OR7)2、-NR7C(O)L4-P(O)(OR7)2、-OL3-P(O)(OR7)2、-C(O)NR7L3-P(O)(OR7)2、或-C(O)NR7L4-P(O)(OR7)2；
L3是C1-C10亚烷基，其中L3的C1-C10亚烷基未取代，或L3的C1-C10亚烷基取代有1-4个R6基团，或L3的C1-C10亚烷基用同一碳原子上的2个C1-C6烷基取代，所述烷基与其结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-或-(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-，其中各R11是C1-C6烷基，与其结合的碳原子一起形成C3-C8环烷基；
各R6独立选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷基(取代有1-2个羟基、-OR7、-N(R7)2、-C(O)OH、-C(O)N(R7)2、-P(O)(OR7)2)、C6芳基、C10芳基和C14芳基；
各R7独立选自H和C1-C6烷基；
各R10独立选自H和卤素；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；和
q是1、2、3或4。
在(J)的一些实施方式中，R1是H。在(J)的其他实施方式中，R1是-C(O)-C15烷基；
在(J)的一些实施方式中：(i)L1是-CH2OC(O)-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；或(ii)或L1是-CH2O-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；或(iii)L1是-CH2NR7C(O)-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；或(iv)L1是-CH2OC(O)NR7-且L2是-OC(O)-、-O-,NR7C(O)-或-OC(O)NR7-。
在(J)的一些实施方式中：(i)L1是-CH2OC(O)-且L2is-OC(O)-；或(ii)L1是-CH2O-且L2是-O-；或(iii)L1是-CH2O-且L2是-NHC(O)-；或(iv)L1是-CH2OC(O)NH-且L2是-OC(O)NH-。
在(J)的一些实施方式中，(i)R2是-C11烷基且R3是-C11烷基；或(ii)R2是-C16烷基且R3是-C16烷基；或(iii)R2是-C16烷基且R3是-C11烷基；或(iv)R2是-C12烷基且R3是-C12烷基；或(v)R2是-C7烷基且R3是-C7烷基；或(vi)R2是-C9烷基且R3是-C9烷基；或(vii)R2是-C8烷基且R3是-C8烷基；或(viii)R2是-C13烷基且R3是-C13烷基；或(ix)R2是-C12烷基且R3是-C11烷基；或(x)R2是-C12烷基且R3是-C12烷基；或(xi)R2是-C10烷基且R3是-C10烷基；或(xii)R2是--C15烷基且R3是-C15烷基。
在(J)的一些实施方式中，R2是-C11烷基且R3是-C11烷基。
在(J)的一些实施方式中，L3是C1-C10亚烷基，其中L3的C1-C10亚烷基未取代或取代有1-4个R6基团。
在(J)的一些实施方式中，L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-；各R10独立选自H和F；各p独立选自2、3和4。
在(J)的一些实施方式中，各R6独立选自甲基、乙基、异丙基、异丁基、-CH2OH、-OH、-F、-NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-P(O)(OH)2和苯基。
在(J)的一些实施方式中，各R7独立选自H、甲基和乙基。
用于本发明的特定式(J)化合物包括上面公开的“TLR2p”基团。有用的其他特定式(J)化合物包括：
■(3-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)丙基)膦酸；(16)
■((8R,12R)-8-氨基-12-(十二烷酰氧基)-7,15-二氧-3,14-二氧杂-10-硫-6-氮杂二十六基)膦酸；(17)
■((12R,16R)-12-氨基-16-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-11,19-二氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸；(18)
■((11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮杂二十九基)膦酸；(19)
■((6S,9R,13R)-9-氨基-13-(十二烷酰氧基)-6-甲基-8,16-二氧-4,15-二氧杂-11-硫-7-氮杂二十七烷基)膦酸；(21)
■(3-((1-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)环丙基)甲氧基)丙基)膦酸；(22)
■(3-(4-(2-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)乙基)苯氧基)丙基)膦酸；(20)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二烷基)膦酸；(72)
■(4-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)-1,1-二氟丁基)膦酸；(73)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二烷基)膦酸；(74)
■((9R,13R)-9-氨基-13-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-8,16-二氧-4,15-二氧杂-11-硫-7-氮杂二十七烷基)膦酸；(75)
■((12R,16R)-12-氨基-16-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-11-氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸；(76)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(辛酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂二十八基)膦酸；(77)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十基)膦酸；(78)
■((14R,18R)-14-氨基-13,21-二氧-18-(十四烷酰氧基)-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十四基)膦酸；(79)
■((14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸；(80)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸；(81)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-甲基-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸；(82)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-甲基-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸；(83)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-甲基-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸；(84)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-甲基-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸；(85)
■((14R,18R)-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-14-棕榈酰胺-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸；(86)
■((12R,16R)-12-氨基-16-十二酰胺-1,1-二氟-11-氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸；(87)
■((14R,18R)-14-氨基-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸；(88)
■((14R,18R)-14-氨基-18-((辛基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十基)膦酸；(89)
■((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-14-棕榈酰胺-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸；(90)
■((14R,18R)-14-氨基-18-(十六烷氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十六基)膦酸；(91)
■((17R,21R)-17-氨基-21-(十二烷酰氧基)-16,24-二氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸；(92)
■((17R,21R)-17-氨基-21-(十二烷氧基)-16-氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸；(93)
■((17R,21R)-17-氨基-21-十二酰胺-16-氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸；(94)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-(羟甲基)-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸；(95)
■((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-(羟甲基)-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸；(96)
■((14R,18R)-14-乙酰胺-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸；(97)
■((14R,18R)-14-氨基-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸；(98)
■((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-14-庚酰氨基-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸；(99)
■((14R,18R)-14-氨基-18-((十二烷氧基)甲基)-13,20-二氧-3,6,9,19-四氧杂-16-硫-12,21-二氮三十一基)膦酸；(100)
■((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-14-己酰氨基-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸(101)
在一些实施方式中，式(J)的化合物不是化合物16-22之一。
在一些实施方式(例如其中所述化合物吸附于铝盐)中，式(J)的化合物不是化合物(17)、(19)或(22)之一。
本发明能使用式(J)的化合物、或其药学上可接受盐或酯。
本发明使用的化合物
一般，根据本文提及的附带条件，本发明使用的TLR激动剂由式(A1)表示：
其中：
RX和RY独立选自H和C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L是接头，例如选自C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4；和
n选自1、2和3；和
A是TLR激动剂部分。
在一个实施方式中，根据式(A1)的TLR激动剂如下：RX和RY是H；X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-2个卤素原子；p选自1、2和3；q选自1和2；和n是1。因此，在这些实施方式中，所述吸附部分包含磷酸基团。
在其他实施方式中，根据式(A1)的TLR激动剂如下：RX和RY是H；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各可选取代有1-2个卤素原子；p选自1、2或3；q选自1或2；和n是1。因此，在这些实施方式中，所述吸附部分包含磷酸基团。
就式(A1)而言有用的‘A’部分包括但不限于任意下列化合物的基团，如本文所定义或如参考文献1-7和9-27所公开：
在一些实施方式中，所述TLR激动剂部分‘A’具有小于1000Da的分子量。在一些实施方式中，式(A1)的TLR激动剂具有小于1000Da的分子量。
优选的TLR激动剂为水溶性。因此，其在25℃和1个大气压下混合于有水的pH7水性混合物以产生浓度至少为50μg/ml的溶液时能形成均一溶液。因此，术语“水溶性”排除这些条件下仅微溶的物质。
除了在pH7时为水溶性之外，优选的水溶性TLR激动剂在pH4-10如5-9、6-8、或优选6.5-7.5下可溶于水。
吸附部分
上面所指的吸附部分是能吸附于不溶性金属盐(例如不溶性铝盐，如羟基氧化铝)的官能团，例如通过配体交换或任何其他合适机制。因此，所述吸附部分可赋予活性化合物(如所述TLR激动剂)，有吸附于不溶性金属盐的能力。
配体交换是一种吸附机制，其中免疫增强剂化合物上的化学部分与不溶性金属盐表面上的化学部分交换，从而引起免疫增强剂吸附于金属盐表面。这是磷酸化蛋白如HbsAg的主要吸附机制[28,29]。因此，免疫增强剂能包含吸附部分如瞵酸盐基团，其能与盐表面基团如羟基氧化铝上的羟基交换。然而，在一些实施方式中，吸附能通过任何其他合适机制如静电或疏水方式[30](或通过机制的组合)发生。在一些实施方式中，可能不发生实际物理化学吸附且TLR激动剂可能反而陷于金属盐聚集物内的空隙空间(如参考文献31所讨论)，但此捕获能通过存在吸附基团而增强。在其他实施方式中，可以有吸附和截留TLR激动剂的混合物。
含磷的吸附部分特别有用，所述吸附部分可包含磷酸盐、瞵酸盐、亚膦酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐等。一种有用的吸附部分包含至少一个磷酸盐基团。优选的吸附部分包含至少一个瞵酸盐基团。
有用的含磷吸附部分组以式A1中的[方括号]显示，因此，TLR激动剂可包括磷酸盐(可选取代)或瞵酸盐(可选取代)，通过其能吸附于不溶性金属盐。
本发明使用的含磷基团可以多种质子化和去质子化形式存在，这取决于周围环境的pH，例如其溶解的溶剂pH。因此，尽管可说明特定形式，除非另外提及，这些说明仅意在具有代表性而不限于特定质子化或去质子化形式。
例如，在磷酸盐基团的情况中，其描述为–OP(O)(OH)2，但所述定义包括可在低于pH7下存在的质子化形式–[OP(O)(OH2)(OH)]+和–[OP(O)(OH2)2]2+，可在高于pH7下存在的去质子化形式–[OP(O)(OH)(O)]-和[OP(O)(O)2]2-。
本文公开的化合物能作为药学上可接受盐存在。因此，所述化合物可以其药学上可接受盐形式使用，即生理或毒物学上耐受盐(合适时包括药学上可接受的碱加成盐和药学上可接受的酸碱加成盐)。
提供吸附性TLR激动剂的含磷官能团的替代物是硝酸盐和/或硫酸盐基团。
本发明使用的化合物可包括单个吸附部分，或可包括一个以上如2-15个吸附部分。化合物通常包括1、2或3个吸附部分。
不溶性金属盐
如本文所公开，免疫增强剂能吸附于不溶性金属盐，从而形成吸附复合物。例如，其能吸附于不溶性钙盐(如磷酸钙)或，优选吸附于不溶性铝盐。这种铝盐有较长疫苗应用史。包括氢氧离子的铝盐是本发明使用的优选不溶性金属盐。
因此，本发明提供多个实施方式，其中TLR激动剂吸附于这种不溶性盐，如式(I)、(II)、(III)、(I-A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)或(J)的化合物。
有用的铝盐包括但不限于氢氧化铝、羟基氧化铝和羟基磷酸铝(包括羟基磷酸硫酸铝)。所述盐描述于例如参考文献32的第8和9章。
吸附免疫增强剂的优选盐是羟基氧化铝和/或羟基磷酸铝。这些具有能容易发生与含磷基团(如磷酸盐、瞵酸盐)配体交换的表面羟基基团以提供稳定吸附。
通常称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分为晶体。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，能与其它铝化合物例如氢氧化铝Al(OH)3通过红外(IR)光谱区分，特别是在1070cm-1处存在吸收带和在3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰[参考文献32的第9章]。衍射带半高宽(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如透射电子显微图中所见)，如直径约2nm的针样颗粒。氢氧化铝佐剂的pI通常为约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
通常称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1处的IR光谱带(例如，加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献32的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态，主要颗粒范围为50nm)。抗原吸附后的典型颗粒直径范围是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选5.0-6.5，例如约5.7。
溶液中的磷酸铝和氢氧化铝佐剂倾向于形成直径为1-10μm的稳定多孔聚集物[33]。
含吸附于金属盐的本发明TLR激动剂的组合物还可包括缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。然而，所述组合物包括磷酸盐缓冲液时，优选缓冲液中的磷酸根离子浓度应小于50mM，如<40mM、<30mM、<20mM、<10mM、或<5mM，或1-15mM。然而，在第十五方面的实施方式中，不能使用磷酸盐缓冲液。
由于本发明所用吸收性金属盐的不溶性，含已吸附免疫增强剂的组合物一般是有雾状表观的悬液。这能掩盖污染细菌生长，因此发明的组合物可包括防腐剂如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选组合物应不含(如<10μg/ml)汞物质，如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。
组合物能包括羟基氧化铝和羟基磷酸铝，免疫增强剂可吸附于一种或多种这些盐。
给予患者的组合物中Al+++浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。发明组合物中Al+++的优选范围是0.3-1mg/ml或0.3-0.5mg/ml。优选最大0.85mg/剂。由于纳入TLR激动剂能改善铝盐的佐剂效果，本发明宜允许较少量Al+++/剂，因此发明的组合物通常能包括每单位剂量10-250μgofAl+++。目前的儿童疫苗通常包括至少300μgAl+++。浓度方面，发明的组合物可具有10-500μg/ml的Al+++浓度，如10-300μg/ml、10-200μg/ml、或10-100μg/ml。
一般，组合物包括TLR激动剂和铝盐时，激动剂与Al+++的重量比小于5:1，如小于4:1、小于3:1、小于2:1、或小于1:1。因此，例如，Al+++浓度为0.5mg/ml时，TLR激动剂的最大浓度为2.5mg/ml。但能使用更高或更低水平；TLR激动剂质量通常小于Al+++，例如每剂量中100μgTLR激动剂与0.2mgAl+++。
组合物包括TLR激动剂和不溶性金属盐时，优选组合物中至少50％(质量)免疫增强剂吸附于金属盐，如≥60％、≥70％、≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％，或甚至100％。最小80％吸附是典型的，优选至少90％或95％。
如上所讨论，吸附不溶性金属盐能引起改变SMIP的体内性质。因此，相对以非吸附形式注射的同一SMIP，已吸附SMIP能在肌肉内注射后显示较长肌肉驻留时间(如至少长2x)。能发生一些清除，但仍存在可检测部分的注射SMIP。因此，例如，已吸附SMIP肌肉内注射时，在至少12小时后仍存在于注射肌肉内，如24小时后。
在一些实施方式中，相对以非吸附形式注射的同一SMIP，已吸附SMIP显示较低峰值血清浓度。此峰通长表示为Cmax值。例如，已吸附SMIP肌肉内注射时，能具有比非吸附形式肌肉内注射的同一SMIP更低的血清Cmax值(如<95％的非吸附Cmax，<80％的非吸附Cmax，<50％的非吸附Cmax，或甚至<30％的非吸附Cmax)。
在一些实施方式中，相对以非吸附形式注射的同一SMIP，已吸附SMIP能显示注射后较低的总体系统药物暴露。系统药物暴露水平通常表示为AUC(浓度-时间曲线下面积)值(如以nM·hr计)。有利的是，例如，已吸附SMIP肌肉内注射时，具有比非吸附形式肌肉内注射的同一SMIP更低的注射后24小时血清AUC值(如<90％的非吸附AUC，<80％的非吸附AUC，或甚至<50％的非吸附AUC等)。
免疫原
本发明的已吸附免疫增强剂在免疫中使用。因此，本发明的已吸附复合物能与一种或多种免疫原联用。所述复合物和免疫原能作为混合物提供，或能分开提供以在混合后使用。在一些实施方式中，本发明的免疫增强剂能在不溶性金属盐缺失下与免疫原联合，之后能给予哺乳动物或能联合不溶性金属盐以后续给予哺乳动物。
本发明能与广泛范围的免疫原一起使用以治疗或防止各种不同疾病。所述免疫原可引起针对病毒性疾病(如缘于包膜病毒或无包膜病毒)、细菌性疾病(如缘于革兰氏阴性或革兰氏阳性菌)、真菌病、寄生虫病、自身免疫病、或任何其他疾病提供保护的免疫应答。所述免疫原还可用于免疫疗法，如用于治疗肿瘤/癌、阿尔茨海默病、或上瘾。
所述免疫原可采用多种形式，如全生物体、外膜囊泡、多肽、糖、脂多糖、偶联物(如运载体和半抗原的偶联物，或运载体和糖或脂多糖的偶联物)等。所述免疫原是多肽时，其通常为表面多肽，如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、纤突蛋白等。
所述免疫原可引起针对流感病毒的免疫应答，所述流感病毒包括A型和B型流感病毒。多种流感病毒免疫原形式目前可用，通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒粒子、裂解病毒粒子、或纯化表面抗原。流感抗原还能以病毒体形式呈现。血凝素是目前灭活疫苗中的主要免疫原，疫苗剂量通过参照HA水平而标准化，一般由SRID测量。现有疫苗通常包含每毒株约15μgHA，尽管可使用较低剂量，例如用于儿童、或大流行情况、或使用佐剂时。使用分数剂量如1/2(即每毒株约7.5μgHA)、1/4和1/8，也使用较高剂量(如3x或9x剂量[34,35])。因此，组合物可包括每流感病毒株0.1-150μgHA，优选0.1-50μg，如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如每毒株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等。就疫苗所含各毒株而言通常包括基本相同质量的HA，如因而各毒株的HA质量在每毒株平均HA质量的10％以内，优选平均值的5％以内。对于活疫苗，剂量由半数组织培养感染剂量而不是HA含量测定，每毒株TCID50通常为106-108(优选106.5-107.5)。可使用支持流感病毒复制的细胞系，而不使用SPF蛋作为病毒生长底物，其中从受感染的鸡蛋尿囊液收集病毒。所述细胞系通常具有哺乳动物来源，如MDCK。A型流感病毒免疫原可来自任何合适HA亚型株，如H1、H3、H5、H7、H9等，例如H1N1、H3N2和/或H5N1株。
所述免疫原可引起针对念珠菌(Candida)真菌如白色念珠菌(C.albicans)的免疫应答。例如，所述免疫原可以是能偶联载体蛋白的β-葡聚糖。所述葡聚糖可包括β-1,3和/或β-1,6连接。合适免疫原包括参考文献36和37公开的那些。
所述免疫原可引起针对链球菌(Streptococcus)的免疫应答，包括无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和酿脓链球菌(S.pyogenes)。例如，所述免疫原可以是能偶联载体蛋白的荚膜糖。对于无乳链球菌，所述糖可来自一种或多种血清型Ia、Ib、II、III、和/或V。对于肺炎链球菌，所述糖可来自一种或多种血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和/或23F。除了荚膜糖免疫原以外(或替代其)，可使用多肽免疫原引起抗链球菌的保护性免疫应答，如含参考文献38所公开的RrgB。
所述免疫原可引起针对葡萄球菌(Staphylococcus)的免疫应答，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。例如，所述免疫原可包含IsdA抗原、IsdB抗原、ClfA抗原、ClfB抗原、SdrD抗原、Spa抗原、EsxA抗原、EsxB抗原、Sta006抗原、溶血素、和/或Sta011抗原。合适的金黄色葡萄球菌免疫原和其组合公开于参考文献39。
所述免疫原可引起针对脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis))的免疫应答。例如，所述免疫原可以是能偶联载体蛋白的荚膜糖。荚膜糖特定用于针对脑膜炎球菌血清型A、C、W135和/或Y提供保护。除了荚膜糖免疫原以外(或替代其)，可使用多肽免疫原和/或外膜囊泡引起抗脑膜炎球菌的保护性免疫应答，特别用于血清型B，如参考文献40所公开。典型量的荚膜糖/单位剂量疫苗为2.5-10μg，尽管本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。
所述免疫原可引起针对肝炎病毒的免疫应答，如甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和/或戊肝病毒。例如，所述免疫原可以是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。典型量的HBsAg/单位剂量疫苗为5-20μg，但本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。
所述免疫原可引起针对呼吸道合胞体病毒的免疫应答。免疫原可来自A组RSV和/或B组RSV。合适免疫原可包含F和/或G糖蛋白或其片段，如参考文献41和42所公开。
所述免疫原可引起针对衣原体(Chlamydia)的免疫应答，包括沙眼衣原体(C.trachomatis)和肺炎衣原体(C.pneumoniae)。合适免疫原包括参考文献43-49所公开的那些。
所述免疫原可引起针对大肠杆菌(Escherichiacoli)的免疫应答，包括肠外致病菌株。合适免疫原包括参考文献50-52所公开的那些。
所述免疫原可引起针对冠状病毒的免疫应答，如人SARS冠状病毒。合适免疫原可包含纤突蛋白。
所述免疫原可引起针对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的免疫应答。合适免疫原包括CagA[53-56]、VacA[57,58]、和/或NAP[59-61]。
所述免疫原可引起针对白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的免疫应答。合适免疫原包括白喉类毒素(“DT”)。典型量的DT/单位剂量儿童疫苗为15-30Lf(“絮凝剂量极限”)，尽管本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。较低量在青少年或成人加强疫苗中也典型，如1-10Lf/剂。
所述免疫原可引起针对破伤风梭菌(Clostridiumtetani)的免疫应答。合适免疫原包括破伤风类毒素(“TT”)。典型量的TT/单位剂量儿童疫苗为5-15Lf(“絮凝剂量极限”)，尽管本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。较低量在青少年或成人加强疫苗中也典型，如1-5Lf/剂。
所述免疫原可引起针对百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的免疫应答。百日咳抗原为细胞(全细胞，采用灭活百日咳博德特氏菌(B.pertussis)细胞形式；‘wP’)或无细胞(‘aP”)的。使用无细胞抗原时，包括下列抗原中的1、2或(优选)3种：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT”)；(2)丝状血凝素(‘FHA”)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69kD外膜蛋白’)。PT可化学脱毒或可以是突变PT，其中酶活性通过突变降低[62]，如9K/129G双重突变体[63]。无细胞百日咳抗原组分中还能包括菌毛(如凝集原2和3)以及PT、FHA和百日咳杆菌粘附素。儿童疫苗中的典型PT量为10-30μg/剂。儿童疫苗中的典型FHA量为15-30μg/剂。儿童疫苗中的典型百日咳杆菌粘附素量为2-10μg/剂。本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。较低量在加强疫苗中也典型，如低～3倍。
所述免疫原可引起针对B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(“Hib”)的免疫应答。合适免疫原包括Hib荚膜糖偶联物(“PRP”)，如偶联破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素CRM197衍生物、流感嗜血杆菌蛋白D、和来自B群脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。典型量的Hib偶联物(作为糖测量)为2.5-15μg/剂，尽管本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。
所述免疫原可引起针对脊髓灰质炎病毒的免疫应答。合适免疫原包括灭活病毒。典型组合物包括3种脊髓灰质炎病毒抗原-1型脊髓灰质炎病毒(如Mahoney株)、2型脊髓灰质炎病毒(如MEF-1株)、和3型脊髓灰质炎病毒(如Saukett株)。典型量的脊髓灰质炎病毒/剂就1型而言为40DU(“D-抗原单位”)、2型为8DU，3型为32DU，尽管本发明由于佐剂的抗原节约性质可使用更低剂量。
所述免疫原可引起针对巨细胞病毒(‘CMV’’)的免疫应答。例如，所述免疫原可以是重组糖蛋白B，如参考文献64使用的可溶性抗原。
所述免疫原可引起针对人免疫缺陷病毒如HIV-1或HIV-2的免疫应答。例如，所述免疫原可以是HIV包膜糖蛋白。例如，工程改造的包膜糖蛋白可用，如gp140，其能形成寡聚体(称为“o-gp140”)。gp140多肽包括gp120序列和gp41胞外域[65]，据报道是优于gp120的免疫原[66]。因此，有用的包膜糖蛋白可包括部分gp41，但不包括其跨膜结构域。包膜糖蛋白的gp140形式能缺失其V2环以产生gp140ΔV2突变体，据报道所述缺失改善免疫原性。gp140的ΔV2突变体显示形成三聚体[67]。
所述免疫原可引起针对狂犬病病毒的免疫应答。合适免疫原是灭活的狂犬病病毒[68,RabAvertTM]。
所述免疫原可引起针对人乳头瘤病毒的免疫应答。有用的免疫原是L1衣壳蛋白，所述蛋白能组装形成称为病毒样颗粒(VLP)的结构。VLP可通过在酵母细胞(如酿酒酵母(S.cerevisiae))或昆虫细胞(如夜蛾(Spodoptera)细胞例如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，或果蝇(Drosophila)细胞)中重组表达L1来生成。对于酵母细胞，质粒载体能载有L1基因；对于昆虫细胞，杆状病毒载体能载有L1基因。更优选地，所述组合物包括来自HPV-16和HPV-18株的VLP。此二价组合显示高度有效[69]。除了HPV-16和HPV-18株以外，还能包括来自HPV-6和HPV-11株的VLP。
所述免疫原可引起针对肿瘤抗原的免疫应答，所述抗原如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3(MAGE-A3)、MART-1/黑色素A、酪氨酸酶、gp100、TRP-2等。所述免疫原可引起针对肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治疗反应。
所述免疫原可引起针对偶联载体蛋白的半抗原的免疫应答，其中所述半抗原是一种滥用的药物[70]。示例包括但不限于鸦片剂、大麻、安非他命、可卡因、巴比妥盐、格鲁米特、甲乙哌酮、水合氯醛、安眠酮、苯二氮卓类、LSD、尼古丁、抗胆碱能药、抗精神病药、色胺、其他拟精神病药物、镇静剂、苯环己哌啶、赛洛西宾、挥发性亚硝酸盐、和其他诱发身体和/或精神依赖性的药物。
可使用多种其他免疫原。
用于针对脑膜炎奈瑟氏菌免疫的组合物
本发明特定用于针对脑膜炎球菌如B群脑膜炎球菌免疫。
本发明的一种优选免疫原性组合物包含：(i)氢氧化铝佐剂；(ii)本文的化合物1、2或5；(iii)含SEQIDNO:1的第一多肽；(iv)含SEQIDNO:2的第二多肽；和(v)含SEQIDNO:3的第三多肽；其中(ii)的化合物吸附于氢氧化铝。
本发明的另一种优选免疫原性组合物包含：(i)氢氧化铝佐剂；(ii)本文的化合物1、2或5；(iii)含SEQIDNO:1的第一多肽；(iv)含SEQIDNO:2的第二多肽；和(v)含SEQIDNO:4的第三多肽；其中(ii)的化合物吸附于氢氧化铝。
本发明的另一种优选免疫原性组合物包含：(i)氢氧化铝佐剂；(ii)本文的化合物1、2或5；(iii)含SEQIDNO:1的第一多肽；(iv)含SEQIDNO:2的第二多肽；和(v)含SEQIDNO:5的第三多肽；其中(ii)的化合物吸附于氢氧化铝。
任何第一、第二和/或第三多肽能与相关SEQIDNO:1、2、3、4或5差异多至3个氨基酸，只要所述多肽仍能引起合适时结合某一多肽(由SEQIDNO:1、2、3、4或5组成)的抗体。
理想地，第一、第二和/或第三多肽中的1、2或3种还吸附于氢氧化铝。这些多肽更详细公开于参考文献40、71和91。所述组合物可包括5-100μg的各多肽。所述组合物理想地不包括任何细菌外膜囊泡。所述组合物可包括5-100μg的化合物1、2或5。例如，其可包括5-100μg的化合物2，或可包括5-100μg的化合物5。
所述组合物可包括组氨酸缓冲液，如10mM组氨酸缓冲液。其可包括蔗糖和/或氯化钠。其可以0.5ml剂量体积给予，如用于肌肉内注射。
本发明的其他免疫原性组合物可包含：(i)氢氧化铝佐剂；(ii)式(I-A)或式(IV)的TLR7激动剂；(iii)脑膜炎球菌H因子结合蛋白抗原，只要该抗原不是具有某一氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列包含来自参考文献73的SEQIDNO:8。H因子结合蛋白抗原也能吸附于氢氧化铝。
有多种不同免疫原的组合物
根据第二十五方面，本发明提供含发明佐剂复合物以及至少2种不同免疫原的组合物。
本发明还提供含以下的试剂盒：(i)第一容器中的佐剂复合物和(ii)第二容器中的至少一种免疫原。第一容器能可选包括复合物以外的至少一种免疫原。
佐剂复合物中的TLR激动剂可以是本文公开的任何激动剂。
在一些实施方式中，所述TLR激动剂是根据任何式(B)、(C)、(D)、(E)、或(H)的TLR7激动剂。在一些实施方式中，所述TLR激动剂是根据式(F)或(J)的TLR2激动剂。在一些实施方式中，所述TLR激动剂是根据式(G)的TLR8激动剂。
在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是TLR4激动剂。在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是TLR9激动剂。在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是根据本文所定义式(I)的化合物。在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是根据本文所定义式(II)的化合物。在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是根据本文所定义式(III)的化合物。在一些实施方式中，所述TLR激动剂不是根据本文所定义式(I-A)的化合物。
在优选的实施方式中，所述TLR激动剂是根据式(B)的TLR7激动剂。感兴趣的特定TLR7激动剂包括参考文献72第79-84页中表A的化合物1A-27A。
所述TLR激动剂是根据式(B)的TLR7激动剂时，一些实施方式中的“至少2种不同免疫原”由以下组成：(i)麻疹病毒免疫原、腮腺炎病毒免疫原、和风疹病毒免疫原的组合；(ii)麻疹病毒免疫原、腮腺炎病毒免疫原、风疹病毒免疫原、和水痘病毒免疫原的组合；(iii)白喉疫苗、破伤风疫苗和百日咳疫苗；(iv)来自脑膜炎球菌血清型A、C、W135和Y的偶联物的四价组合；(v)来自A、B、C、W135和/或Y群脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的细菌抗原组合；(vi)包括来自2种或更多不同流感病毒株的抗原的组合；(vii)来自A、C、W135、Y、X和/或B群脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡组合；(viii)来自不同肺炎球菌血清型的糖组合；(ix)卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)抗原组合；(x)百日咳博德特氏菌全毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3的组合；(xi)多种来自脑膜炎奈瑟氏菌的不同多肽抗原组合。
所述TLR激动剂是作为本文化合物1、2、3、4、5或13的TLR7激动剂时，一些实施方式中的“至少2种不同免疫原”不由多种来自脑膜炎奈瑟氏菌的不同多肽抗原组合组成，如参考文献40和73公开的组合。
“至少2种不同免疫原”能包括至少1种细菌抗原和至少1种病毒抗原。
如果“至少2种不同免疫原”仅包括细菌免疫原，其理想地包括至少2种不同细菌种的免疫原(因此，例如，排除不同脑膜炎球菌荚膜糖的组合，因为这些都来自单一物种)。
“至少2种不同免疫原”不应彼此偶联。因此，Hib糖和破伤风类毒素的偶联物不是本文所用的“至少2种不同免疫原”。
“至少2种不同免疫原”的优选实施方式包括含以下的组合物：(i)白喉类毒素、破伤风类毒素、和无细胞百日咳抗原如含百日咳类毒素、丝状血凝素、和/或百日咳杆菌粘附素；(ii)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、和B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)荚膜糖偶联物；(iii)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、和乙肝病毒表面抗原；(iv)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、乙肝病毒表面抗原和B型流感嗜血杆菌荚膜糖偶联物；(v)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、和灭活脊髓灰质炎病毒抗原；(vi)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、B型流感嗜血杆菌荚膜糖偶联物、乙肝病毒表面抗原、和灭活脊髓灰质炎病毒抗原；或(vii)甲肝病毒抗原和乙肝病毒抗原。
组合物包括灭活脊髓灰质炎病毒抗原时，优选包括来自各1型脊髓灰质炎病毒(如Mahoney株)、2型脊髓灰质炎病毒(如MEF-1株)、和3型脊髓灰质炎病毒(如Saukett株)的抗原。
组合物包括百日咳抗原时，理想地不包括全灭活百日咳博德特氏菌细胞，即其理想地是无细胞疫苗。
发明的组合物可包括其他抗原如其他病原体，以及包括D、T、Pa、HBsAg、Hib和/或脊髓灰质炎病毒抗原。例如，这些抗原可来自脑膜炎奈瑟氏菌(一种或多种血清型A、B、C、W135和/或Y)或肺炎链球菌。因此，组合物可包括以下2种或3种：(i)一个或多个D、T、Pa、HBsAg、Hib和/或脊髓灰质炎病毒抗原；(ii)来自一种或多种脑膜炎球菌血清型A、C、W135和/或Y的偶联荚膜糖；(iii)来自脑膜炎球菌的多肽抗原，如fHbp。
包括多种免疫原的本发明组合物优选不包括任何细菌外膜囊泡。
TLR激动
本发明使用TLR激动剂，包含吸附部分和TLR激动剂部分。所述吸附部分赋予吸附于不溶性金属盐的能力(见上)，而所述TLR激动剂部分赋予促进Toll样受体的能力。因此，发明的TLR激动剂通常起TLR激动剂作用，甚至没有其吸附部分。除非另有说明，发明的TLR激动剂能激活任何TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11。
本发明提供或指化合物为TLR激动剂时，所述化合物优选是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10或TLR11的激动剂。此组中，优选亚组是TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR11。更优选的亚组是TLR2、TLR7和TLR8。另一优选亚组是TLR2和TLR7。
最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。
发明的化合物可以是人TLR1的激动剂。发明的化合物可以是人TLR2的激动剂。发明的化合物可以是人TLR3的激动剂。发明的化合物可以是人TLR4的激动剂。发明的化合物可以是人TLR5的激动剂。发明的化合物可以是人TLR6的激动剂。发明的化合物可以是人TLR7的激动剂。发明的化合物可以是人TLR8的激动剂。发明的化合物可以是人TLR9的激动剂。发明的化合物可以是人TLR11的激动剂。
化合物针对任何特定Toll样受体的激动活性能通过标准试验确定。公司如Imgenex、Invivogen供应细胞系，所述细胞系稳定共转染有人TLR基因和NFκB以及用于测量TLR激活通路的合适报道基因。就敏感性、广泛工作范围动态设计其且能用于高通量筛选。通常在这种细胞系中组成型表达1或2种特定TLR。还参见参考文献74。
根据第二十六方面，组合物包括第一和第二TLR激动剂。这2种激动剂彼此不同且其靶向不同TLR。2种激动剂都吸附于铝盐。其可共吸附于铝盐或可分开吸附于铝盐(优选同一盐，如都吸附于氢氧化铝)且随后组合。TLR组合通过例如参考文献75了解。
原位沉淀方法
根据第二十七方面，本发明提供制备佐剂复合物的方法，所述方法包含步骤：(i)制备TLR激动剂和可溶性铝盐的水性混合物；然后(ii)向水性混合物中加入非铝盐以形成吸附TLR激动剂的沉淀铝盐。
根据第二十八方面，本发明提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含混合(i)TLR激动剂和可溶性铝盐的水性混合物与(ii)免疫原的缓冲水性混合物的步骤，其中混合步骤引起吸附TLR激动剂和免疫原的铝盐沉淀。
本发明提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含混合(i)可溶性铝盐的水溶液与(ii)免疫原和TLR激动剂的缓冲水性混合物的步骤，其中混合步骤引起吸附TLR激动剂和免疫原的铝盐沉淀。
本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包含混合(i)可溶性铝盐和免疫原的水溶液与(ii)TLR激动剂的缓冲水性混合物的步骤，其中混合步骤引起吸附TLR激动剂和免疫原的铝盐沉淀。
本发明还提供由这些方法获得或可获得的免疫原性组合物。
这些方法中，可溶性铝盐通常是明矾(KAl(SO4)2，一般为KAl(SO4)2.12H2O)或氯化铝。向此可溶性盐中加入替代性阴离子能引起铝盐佐剂原位沉淀。
替代性阴离子通常作为部分缓冲液加入。因此，例如，如果磷酸盐缓冲液加入可溶性铝盐，则磷酸铝佐剂能沉淀。所述缓冲液通常是乙酸盐、碳酸盐、或磷酸盐缓冲液。向明矾溶液中加入所述缓冲液引起无定形羟基硫酸铝(缓冲液阴离子)沉淀，如羟基磷酸硫酸铝(参见参考文献32的第9章)。所述免疫原和TLR激动剂能吸附于沉淀盐。
所述方法可涉及在磷酸盐缓冲液中加入所需免疫原溶液。这些方法能产生组合物，其中免疫原和/或TLR激动剂吸附于羟基磷酸硫酸铝。
分析试验
根据第二十九方面，本发明提供分析含吸附于不溶性金属盐的TLR激动剂的佐剂复合物的试验，所述试验包含步骤：(i)处理复合物以从不溶性金属盐中解吸TLR激动剂；然后(ii)检测解吸TLR激动剂。
多种技术可用于解吸，如步骤(i)所需。例如，所述复合物能用吸附性化合物处理，所述化合物对金属盐的亲和性更高并因而取代已吸附TLR激动剂。另一方法涉及用高浓度磷酸盐缓冲液孵育复合物，从而所述缓冲液离子取代已吸附TLR激动剂。另一方法使用盐和去污剂的混合物，如参见参考文献76。另一方法溶解不溶性金属盐，因此同时破坏吸附；在合适pH溶解包括柠檬酸盐在内的所述盐的合适方法能用于溶解铝盐佐剂，其他也多元或α-羟基羧酸可以。
步骤(ii)的检测可以是定质、定量或半定量。因此，检测步骤仅能确认发生解吸，或能用于定量吸附于金属盐的激动剂量。技术如HPLC能用于定量检测已解吸激动剂。
另一方面，本发明提供分析含吸附于不溶性金属盐的TLR激动剂的佐剂复合物的试验，所述试验包含步骤：(i)处理复合物以从不溶性金属盐中解吸TLR激动剂；然后(ii)检测解吸TLR激动剂的生物活性。测试激动剂活性的技术为本领域熟知(见上)。特别当定量分析活性时，此试验能用于确认吸附材料的稳定性，例如检测吸附于盐的材料在解吸后保留的总活性。如果所有材料解析但活性丧失，这可能指示该材料在吸附时降解。
药物组合物和产品
本发明提供含发明TLR激动剂的药物组合物。此组合物还能包括不溶性金属盐和/或免疫原。
本发明还提供含发明TLR激动剂和不溶性金属盐的药物组合物。此组合物还能包括免疫原。
本发明还提供含发明TLR激动剂和免疫原的药物组合物。此组合物还能包括不溶性金属盐。
本发明还提供制备药物组合物的方法，所述方法包含组合本发明TLR激动剂与一种或多种药学上可接受赋形剂的步骤。
本发明还提供制备药物组合物的方法，所述方法包含组合本发明混合物与一种或多种药学上可接受赋形剂的步骤。
药物组合物通常包括除了TLR激动剂、不溶性金属盐和/或免疫原以外的组分，例如其通常包括一种或多种药物运载体和/或赋形剂。关于所述组分的充分讨论可见参考文献77。
药物组合物优选采用水性形式，特别是在给予点，但其还能以非水性液体形式或干燥形式存在，如明胶胶囊、或作为冻干物等。
药物组合物可包括一种或多种防腐剂，如如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，可优选不含防腐剂的疫苗。
药物组合物能包括生理盐如钠盐，例如用于控制张力。氯化纳(NaCl)是典型的，其可以1-20mg/ml存在，如10±2mg/ml或9mg/ml。可存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠二水、氯化镁、氯化钙等。
药物组合物能具有200mOsm/kg-400mOsm/kg的渗透压，如240-360mOsm/kg、或290-310mOsm/kg。
药物组合物可包括溶于淡水(如w.f.i.)的化合物(有或没有不溶性金属盐)，但通常包括一种或多种缓冲液。典型缓冲液包括：磷酸盐缓冲液(除了第十五方面)、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂(特定有氢氧化铝佐剂)、或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲液盐通常以5-20mM范围包括在内。如果使用磷酸盐缓冲液，则一些实施方式中的磷酸根离子浓度应小于<50mM(见下)，例如<10mM。
药物组合物通常具有5.0-9.5的pH，如6.0-8.0。
药物组合物优选无菌。
药物组合物优选无热原，如含每剂量<1EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量<0.1EU。
药物组合物优选不含谷蛋白。
药物组合物适合给予动物(且特别是人)患者，因此包括人和动物应用。其可用于引起患者中免疫应答的方法，包含将所述组合物给予患者的步骤。组合物可在对象暴露于病原体前和/或对象暴露于病原体后给予。
药物组合物可以单位剂型制备。在一些实施方式中，单位剂量可具有0.1-1.0ml的体积，如约0.5ml。
本发明还提供含有本发明药物组合物的递送装置(如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等)。此装置能用于将组合物给予脊椎动物对象。
本发明还提供含有本发明药物组合物的无菌容器(如小瓶)，如包含单位剂量。
本发明还提供单位剂量的本发明药物组合物。
本发明还提供含有本发明药物组合物的密封容器。合适容器包括例如小瓶。
本发明还提供含第一和第二试剂盒组分的试剂盒，其中：(i)第一试剂盒组分包含不溶性金属盐和免疫原；和(ii)第二试剂盒组分包含发明的TLR激动剂化合物。第二组分理想地不包括不溶性金属盐和/或不包括免疫原。第一和第二组分能组合提供适合给予对象的组合物。
本发明还提供含第一和第二试剂盒组分的试剂盒，其中：(i)第一试剂盒组分包含不溶性金属盐和发明的TLR激动剂化合物；和(ii)第二试剂盒组分包含免疫原。第二组分理想地不包括不溶性金属盐和/或TLR激动剂。在一些实施方式中，第二组分被冻干。第一和第二组分能组合提供适合给予对象的药物组合物。
本发明还提供含第一和第二试剂盒组分的试剂盒，其中：(i)第一试剂盒组分包含免疫原和发明的TLR激动剂化合物；和(ii)第二试剂盒组分包含不溶性金属盐。第二组分理想地不包括免疫原和/或TLR激动剂。第一和第二组分能组合提供适合给予对象的药物组合物。
在一些实施方式中，这些试剂盒包含2个小瓶。在其他实施方式中，包含1个已填充注射器和1个小瓶，所述注射器内容物在注射前与所述小瓶内容物混合。使用注射器/小瓶配置，其中小瓶内容物被冻干。尽管通常第一和第二试剂盒组分都采用水性液体形式。
发明的药物组合物可以多种形式制备。例如，所述组合物可制备为注射剂，作为液体溶液或悬液。还可制备适于溶液或悬液的固体形式、注射前的液体载剂(如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。所述组合物可制备用于局部给予，如作为药膏、乳膏或粉末。所述组合物可制备用于口服给予，如作为片剂或胶囊、作为喷雾、或作为糖浆(可选调味)。所述组合物可制备用于肺部给予，如通过吸入器，使用细粉末或喷雾。所述组合物可制备为栓剂或子宫托。所述组合物可制备用于鼻、耳或眼部给予，如作为喷雾或滴剂。所述组合物可采用试剂盒形式，设计成合并的组合物在临给予患者前重建。这种试剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。用于肌肉内给予的注射剂是典型的。
组合物包含有效量的TLR激动剂，即某一量以单个剂量或作为一系列剂量一部分给予个体时有效提高对共给予免疫原的免疫应答。此量能根据待治疗个体健康和身体状况、年龄、待治疗个体分类组(如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配制、治疗医师对医疗情况的评价、和其他相关因素而变化。所述量落在能通过常规试验确定的相对广泛范围内。可使用1-1000μg/剂的量，例如每剂量5-100μg或每剂量10-100μg，理想地≤300μg/剂，如每剂量约5μg、10μg、20μg、25μg、50μg或100μg。因此，发明组合物中的TLR激动剂浓度可为2-2000μg/ml如10-200μg/ml，或约10、20、40、50、100或200μg/ml，理想地≤600μg/ml。这些剂量范围和特定剂量特定用于式(I-A)或(IV)的化合物。
治疗、给予免疫原性组合物的方法
本发明提供引起对象免疫应答的方法，所述方法包含将发明的TLR激动剂、复合物和/或组合物给予对象。
本发明还提供发明的TLR激动剂、复合物和/或组合物，用于引起对象免疫应答的方法。
本发明还提供发明的TLR激动剂或复合物在生产引起对象免疫应答的药物中的应用。
本发明还提供(i)本文定义的TLR激动剂和(ii)不溶性金属盐在生产引起对象免疫应答的药物中的应用。类似地，本发明还提供(i)本文定义的TLR激动剂(ii)不溶性金属盐和(iii)免疫原在生产引起对象免疫应答的药物(如疫苗)中的应用。
本发明适于引起人或非人动物(特别是哺乳动物)对象中的免疫应答。根据本发明制备的组合物可用于治疗儿童和成人。
由这些方法和应用刺激的免疫应答一般包括抗体反应，优选保护性抗体反应。评价免疫后抗体反应的方法为本领域熟知。
治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。给予一个以上剂量(通常2个剂量)特别用于原初免疫患者。一般以至少1周的间隔(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周等)给予多个剂量。
示例性化合物
下面的化合物1-102包含偶联核心结构的吸附性部分，所述结构显示为TLR激动剂。因此，这些化合物能如本文所述吸附于不溶性金属盐。因此，本发明提供各个下列化合物：
化合物1(3-(2-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸
化合物23-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酸乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物33-(5-氨基-2-(4-(4,4-二氟-4-膦酸丁氧基)-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物43-(5-氨基-2-(4-(2-(2-(3,3-二氟-3-膦酸丙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物53-(5-氨基-2-(4-(2-(3,3-二氟-3-膦酸丙氧基)乙氧基)-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物6(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苄基)膦酸
化合物7(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物8(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)膦酸
化合物9(2-(5-氨基-2-(4-甲氧基-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)乙基)膦酸
化合物10(2-(5-氨基-2-(4-甲氧基-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)-1,1-二氟-2-氧乙基)膦酸
化合物11(E)-(2-(5-氨基-2-(4-甲氧基-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)乙烯基)膦酸
化合物12(4-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物13(3-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)丙基)膦酸
化合物143-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(3-膦酸丙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物15(4-(2-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙氧基)乙氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物16(3-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)丙基)膦酸
化合物17((8R,12R)-8-氨基-12-(十二烷酰氧基)-7,15-二氧-3,14-二氧杂-10-硫-6-氮杂二十六基)膦酸
化合物18((12R,16R)-12-氨基-16-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-11,19-二氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸
化合物19((11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮杂二十九基)膦酸
化合物20(3-(4-(2-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)乙基)苯氧基)丙基)膦酸
化合物21((6S,9R,13R)-9-氨基-13-(十二烷酰氧基)-6-甲基-8,16-二氧-4,15-二氧杂-11-硫-7-氮杂二十七烷基)膦酸
化合物22(3-((1-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)环丙基)甲氧基)丙基)膦酸
化合物23(2-(5-氨基-2-(4-甲氧基-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)-1,1-二氟乙基)膦酸
化合物24(4-(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物25(2-(2-(2-(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物26(4-(4-((4-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧-2,3-二氢1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯氧基)丁基)膦酸
化合物27(4-(4-((4-氨基-2-氧-6-(三氟甲基,3-二氢1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯氧基)丁基)膦酸
化合物28(3-((6-氨基-9-苄基-8-氧-8,9-二氢-7H-嘌呤-2-基)氧)丙基)膦酸
化合物29(3-(2-((6-氨基-9-苄基-8-氧-8,9-二氢-7H-嘌呤-2-基)氧)乙氧基-1,1-二氟丙)膦酸
化合物30(3-((4-氨基-1-(4-(丁氧基瞵酸盐)苄基)-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)氨基)丙基)膦酸
化合物31(3-((4-氨基-1-苄基-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)硫代)丙基)膦酸
化合物32(3-(4-氨基-1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)丙基)膦酸
化合物33(3-(4-氨基-1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-3-氧丙基)膦酸
化合物34(3-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-1,1-二氟丙基)膦酸
化合物35(2-(2-((4-氨基-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-(甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)氧)乙氧基)乙基)膦酸
化合物36(3-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丙基)膦酸
化合物37(3-(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸
化合物38(4-((4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)甲基)苄基)膦酸
化合物39(3-(4-氨基-2-(甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丙基)膦酸
化合物40(3-((4-氨基-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)甲氧基)丙基)膦酸
化合物41(4-((4-氨基-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)甲氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物42(4-(2-((4-氨基-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)氨基)乙氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物43(4-(2-((4-氨基-1-异丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基)氧基)乙氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物44(3-((2-氨基-5-(2-甲氧基-4-(2-甲氧基-2-氧乙基)苄基)-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)丙基)膦酸
化合物45(4-((2-氨基-5-(4-(2-乙氧基-2-氧乙基)-2-甲氧基苄基)-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物46(2-(2-(2-((2-氨基-5-(2-甲氧基-4-(2-甲氧基-2-氧乙基)苄基)-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物47(3-((2-氨基-5-(4-(2-((2-羟乙基)氨基)-2-氧乙基)-2-甲氧基苄基)-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)丙基)膦酸
化合物48(3-(2-(4-((2-氨基-4-(丁基氨基)-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)乙酰氧基)丙基)膦酸
化合物49(4-(2-(4-((2-氨基-4-(丁基氨基)-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)乙酰氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物50(2-(2-(2-(2-(4-((2-氨基-4-丁氧基-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物51(3-((2-(4-((2-氨基-4-((1-羟戊-2-基)氨基)-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)-2-甲基丙酰基)氧基)丙基)膦酸
化合物52(4-(2-氨基-4-(乙氧基羰基)-4,5-二氢-3H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-8-基)苯基)膦酸
化合物53(4-((2-氨基-4-(二乙基氨甲酰)-3,3-二甲基-4,5-二氢-3H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-8-基)氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物54(3-(4-(2-氨基-4-(乙氧基羰基)-5-甲基-4,5-二氢-3H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-8-基)苯甲酰胺)丙基)膦酸
化合物55(2-(2-(2-((2-氨基-4-(乙氧基羰基)-3H-苯并[b]氮杂卓-8-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物56(4-((2-氨基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂卓-4-羰基)氧基)-1,1-二氟丁基)膦酸
化合物57(3-(2-(2-氨基-3,3,8-三甲基-4,5-二氢-3H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-4-甲酰胺)乙氧基)丙基)膦酸
化合物581-(2-氨基-3,3-二甲基-8-(4-(哌啶-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂卓-4-羰基)吡咯烷-3-基磷酸二氢盐
化合物59(4-(2-氨基-5,5-二甲基-4,5-二氢-3H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-4-甲酰胺)丁基)膦酸
化合物603-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-(2-磷酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸
化合物61(5-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)戊基)膦酸
化合物62(4-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)丁基)膦酸
化合物63(14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十基膦酸
化合物644-((R)-2-氨基-3-((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙硫基)丙酰胺)-1,1-二氟丁基膦酸
化合物65(14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十基膦酸
化合物66((14R,18R)-14-氨基-18-十二烷酰胺-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十基)膦酸
化合物67(4-((4-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苄基)膦酸
化合物68(2-(2-(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物69(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)苄基)膦酸
化合物70(2-(2-(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)乙基)膦酸
化合物71(3-(2-(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸
化合物72((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二烷基)膦酸
化合物73(4-((R)-2-氨基-3-(((R)-2,3-双(十二烷酰氧基)丙基)硫代)丙酰胺)-1,1-二氟丁基)膦酸；
化合物74((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二烷基)膦酸
化合物75((9R,13R)-9-氨基-13-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-8,16-二氧-4,15-二氧杂-11-硫-7-氮杂二十七烷基)膦酸
化合物76((12R,16R)-12-氨基-16-(十二烷酰氧基)-1,1-二氟-11-氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸
化合物77((14R,18R)-14-氨基-18-(辛酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂二十八基)膦酸
化合物78((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十基)膦酸
化合物79((14R,18R)-14-氨基-13,21-二氧-18-(十四烷酰氧基)-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十四基)膦酸
化合物80((14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸
化合物81((14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷酰氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸
化合物82((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-甲基-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸
化合物83((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-甲基-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸
化合物84((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-甲基-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸
化合物85((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-甲基-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸
化合物86((14R,18R)-18-(十二烷酰氧基)-13,21-二氧-14-棕榈酰胺-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十二基)膦酸
化合物87((12R,16R)-12-氨基-16-十二酰胺-1,1-二氟-11-氧-4,7,18-三氧杂-14-硫-10-氮杂三十基)膦酸-氨基
化合物88((14R,18R)-14-氨基-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物89((14R,18R)-14-((14R,18R)-14-氨基-18-((辛基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十基)膦酸
化合物90((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-14-棕榈酰胺-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物91((14R,18R)-14-氨基-18-(十六烷氧基)-13-氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12-氮杂三十六基)膦酸
化合物92((17R,21R)-17-氨基-21-(十二烷酰氧基)-16,24-二氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸
化合物93((17R,21R)-17-氨基-21-(十二烷氧基)-16-氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸
化合物94((17R,21R)-17-氨基-21-十二酰胺-16-氧-3,6,9,12,23-五氧杂-19-硫-15-氮杂三十五基)膦酸
化合物95((11S,14R,18R)-14-氨基-18-(十二烷氧基)-11-(羟甲基)-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸
化合物96((11S,14R,18R)-14-氨基-18-十二酰胺-11-(羟甲基)-10,13-二氧-3,6,20-三氧杂-16-硫-9,12-二氮三十二基)膦酸
化合物97((14R,18R)-14-乙酰胺-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物98((14R,18R)-14-氨基-18-((癸基氨甲酰)氧基)-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物99((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-14-庚酰氨基-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物100((14R,18R)-14-氨基-18-((十二烷氧基)甲基)-13,20-二氧-3,6,9,19-四氧杂-16-硫-12,21-二氮三十一基)膦酸
化合物101((14R,18R)-18-((癸基氨甲酰)氧基)-14-己酰氨基-13,21-二氧-3,6,9,20-四氧杂-16-硫-12,22-二氮三十二基)膦酸
化合物1024-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲苯基磷酸二氢盐
本发明还提供含两种或更多所述化合物1-62的组合物。本发明还提供含两种或更多所述化合物1-66的组合物。本发明还提供含两种或更多所述化合物1-102的组合物。
化合物1-15、23-51、60-62、67-71、和102是本发明使用的经磷酸修饰TLR7激动剂。
化合物16-22、63-66和72-101是本发明使用的经磷酸修饰TLR2激动剂。
化合物52-59是本发明使用的经磷酸修饰TLR8激动剂。
其他生物学受体
本发明通过参考TLR激动剂如上定义，但其能更广泛应用于不经TLR作用的其他SMIP。特定地，本发明可使用的SMIP能促进C型凝集素受体(CLR)或CD1d而不是(或除此之外)TLR。因此，本公开包括上面关于TLR激动所述的发明，但其中参考TLR激动剂(或类似)通过参考CLR激动剂或CD1d激动剂来取代。因此，CLR或CD1d激动剂能修饰成包含至少一个吸附性部分以提供吸附不溶性金属盐佐剂的能力。
CLR激动剂包括但不限于6,6'-二霉菌酸海藻糖(TDM)、其合成类似物D-(+)-海藻糖-6,6'-二山嵛酸(TDB)、和其他海藻糖及脂肪酸的6,6'-二酯。这些海藻糖酯能容易修饰(如就第二十三方面所公开)成包括吸附性基团。所述吸附性基团可如上所述经接头基团连接免疫增强剂。经修饰化合物能吸附于不溶性金属盐。因此，本发明能应用于作为CLR激动剂的海藻糖酯和二酰基海藻糖。这些激动剂可具有式(T)：
其中，R1C(O)-和R2C(O)-相同或不同且是酰基基团，前提是(i)单糖环之一(ii)R1或(iii)R2包括吸附性部分。合适酰基可以饱和或不饱和。其可选自分支菌酸、白喉菌酸、2-十四基-3-羟基十八烷酸、2-二十基-3-羟基二十四烷酸、波衣酸(bourgeanicacid)、二十二酸、棕榈酸等的酰基残基。有用的分支菌酸包括α-、甲氧基-、和酮-分支菌酸，采用顺式或反式。
CD1d激动剂包括但不限于α-糖基神经酰胺[78-87]如α-半乳糖神经酰胺。这些能容易修饰(如就第二十三方面所公开)成包括吸附性基团。所述吸附性基团可如上所述经接头基团连接免疫增强剂。经修饰化合物能吸附于不溶性金属盐。因此，本发明能应用于作为CD1d激动剂的糖基神经酰胺，包括α-半乳糖神经酰胺、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖)-2-(N-二十六烷氨基)-1,3,4-十八烷三醇]、OCH、KRN7000CRONY-101、3″-O-磺基-半乳糖神经酰胺等，前提是CD1d激动剂包括吸附性基团。
化学基团
除非另有明确定义，本文所讨论的化学基团用于本说明书时具有下列含义：
术语“酰基”包括饱和烃残基，包含：
-多至10个原子(C1-C10)、或多至6个原子(C1-C6)、或多至4个原子(C1-C4)的直链基团。所述烷基示例包括但不限于C1–甲基、C2–乙基、C3–丙基和C4-正丁基。
-3-10个原子(C3-C10)、或多至7个原子(C3-C7)、或多至4个原子(C3-C4)的支链基团。所述烷基示例包括但不限于C3–异丙基、C4-仲丁基、C4–异丁基、C4-叔丁基和C5-新戊基。
术语“亚烷基”指从烷基衍生的二价烃基，且应根据上面定义构建。
术语“烯基”包括单不饱和烃残基，包含：
-2-6个原子(C2-C6)的直链基团。所述烯基示例包括但不限于C2-乙烯基、C3-1-丙烯基、C3-烯丙基、C4-2-丁烯基。
-3-8个原子(C3-C8)的支链基团。所述烯基示例包括但不限于C4-2-甲基-2-丙烯基和C6-2,3-二甲基-2-丁烯基。
术语“亚烯基”指从烯基衍生的二价烃基，且应根据上面定义构建。
术语“烷氧基”包括O-连接烃残基，包含：
-1-6个原子(C1-C6)、或1-4个原子(C1-C4)的直链基团。所述烷氧基示例包括但不限于C1–甲氧基、C2–乙氧基、C3-正丙氧基和C4-正丁氧基。
-3-6个原子(C3-C6)或3-4个原子(C3-C4)的支链基团。所述烷氧基示例包括但不限于C3–异丙氧基、和C4-仲丁氧基和叔丁氧基。
卤素选自Cl、F、Br和I。卤素优选是F。
术语“芳基”包括含6或10个碳原子的单一或融合芳环系统；其中，除非另有说明，每次出现的芳基可选取代有独立选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、卤素、CN、COOR14、CF3和NR14R15的多至5个取代基；如上所定义。通常，芳基可选取代有1、2或3个取代基。可选的取代基选自上述那些。合适芳基示例包括苯基和萘基(各可选如上所述取代)。亚芳基指从芳基衍生的二价烃基，且应根据上面定义构建。
术语“杂芳基”包括5、6、9或10元单或双环芳环，含有1或2个N原子，可选为NR14原子、或一个NR14原子和S或O原子、或一个S原子、或一个O原子；其中，除非另有说明，所述杂芳基可选取代有1、2或3个独立选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、卤素、CN、COOR14、CF3和NR14R15的取代基；如下所定义。合适杂芳基示例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、恶二唑、噻二唑、四唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、喹啉基和异喹啉基(可选如上所述取代)。杂亚芳基指从杂芳基衍生的二价烃基，且应根据上面定义构建。
术语“杂环基”是C连接或N连接的3-10元非芳族、单或双环，其中所述杂环烷基环在可能情况下包含1、2或3个独立选自N、NR14、S(O)q和O的杂原子；所述杂环烷基环在可能情况下可选包含1或2个双键，且可选在碳上取代有1或2个独立选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、OH、CN、CF3、卤素、COOR14、NR14R15和芳基的取代基。
在上面定义中，R14和R15独立选自H和(C1-C6)烷基。
结构式用经未指定、或“浮动”键结合分子核心的取代基定义时，例如式(C)情况中的基团P3，此定义涵盖未指定取代基结合环上任何原子的情况，其中浮动键定位其内，而同时符合该原子的可允许化合价。
在可以互变异构体形式(即酮或烯醇式)存在的本发明化合物情况中，例如式(C)或(H)的化合物，提及特定化合物可选包括所有这种互变异构体形式。
概述
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10％。
除非特别说明，含混合2种或更多组分部分的方法不要求任何特定混合顺序。因此，组分能以任何顺序混合。有3种组分时，则2种组分能相互组合，然后所述组合可与第三组分组合等。
动物(且特定是牛)材料用于细胞培养时，其应获自没有传染性海绵状脑病(TSE)且特定没有牛海绵状脑病(BSE)的来源。总体尚，优选在完全没有动物衍生材料时培养细胞。
化合物作为组合物一部分给予机体时，该化合物可另外由合适前药取代。
放弃权项如上所定义时，放弃权利的化合物应包括至少一种吸附性部分。
附图简要说明
图1-4显示肌肉内注射后24小时段中游离或吸附的化合物2,5,1和3的血清浓度(μM)。
图5显示注射后24小时的化合物肌肉水平(μM)。x轴显示化合物数目；+指示吸附Al-H，而–指示没有Al-H。各柱代表单只动物，每组3只动物。
图6显示MenB抗原混合物的SDS-PAGE。标注‘std’的泳道显示3个浓度的纯化抗原标准。抗原用单独Al-H或吸附化合物1的Al-H配制。‘Sn’显示吸附后的上清；‘Des’显示解吸处理后的上清；‘TCA’显示沉淀后的上清。
图7显示用5CVMB时针对菌株NZ98的SBA效价，所述5CVMB用(a)单独Al-H、(b)Al-H+25μg化合物1、(c)Al-H+100μg化合物1、(d)单独化合物、或(e)Al-H和MenB外膜囊泡配制。
图8显示用5CVMB时针对NZ98的SBA效价，所述5CVMB用(a)无佐剂、(b)Al-H+OMV、(c)100μg化合物2、(d)25μg化合物2+Al-H、或(e)100μg化合物2+Al-H配制。
图9显示用5CVMB时针对NZ98的SBA效价，所述5CVMB用(a)无佐剂、(b)Al-H和囊泡、(c)100μg化合物5、(d)25μg化合物5(e)100μg化合物5+Al-H、或(f)25μg化合物5+Al-H配制。
图10和11显示给予化合物1或化合物2后血清细胞因子相较单独载剂的增加倍数。各细胞因子显示2条柱：左侧柱显示接受Al-H-吸附化合物后的水平，而右侧柱显示接受单独化合物后的水平。
图12显示化合物1、2、3、4、5和13的结构。
图13显示用SIF(◆)、缓冲液(●)或血浆/缓冲液混合物(▲)孵育后5小时阶段中化合物3的浓度(μM)。
图14显示用10mM(◆)、100mM(■)或500mM(▲)磷酸钾处理后5小时阶段中化合物1的解吸度(％)。
图15显示用RSVF/抗原时小鼠中针对RSV的中和效价，所述RSVF/抗原用(a)Al-H、(b)Al-H和25μg化合物2、(c)Al-H和25μg的不同TLR4激动剂、(d)Al-H和微粒TLR9激动剂(由免疫刺激寡核苷酸复合聚阳离子寡肽组成)、或(e)无佐剂配制。
图16显示100μgi.m.注射后化合物74随着时间(小时)的血清水平(μM)。
图17A显示用流感病毒血凝素免疫后6个时间点的总IgG效价，所述血凝素有单独Al-H(圆)或Al-H+化合物2(方形)作为佐剂。时间点为第一剂量后7、11、16和21天，接着第二剂量后7和14天。图17B显示第二剂量后14天的IgG效价。左侧的一对柱显示佐剂为单独Al-H时的效价，而右侧的一对柱是在Al-H/cmpd2组中。各对中，左侧柱显示IgG1效价且右侧柱显示IgG2a效价。
图18显示用指定量的Al-H和化合物2时小鼠中的F特异性IgG效价。标注为(*)的数据使用微粒TLR9激动剂用于比较。
图19显示3次肌肉内注射后针对(A)Hla-H35L(B)EsxAB(C)Sta006(D)Sta011的IgG效价。各图中，所述4个组从作到右为：单独Al-H佐剂；Al-H+化合物2；Combo-1+Al-H；Combo-1+Al-H+化合物2。A*指示针对单独佐剂的统计学显著差异(p<0.05)。A**指示针对Combo-1+Al-H的统计学显著差异(p<0.05)。
图20显示％CD40阳性细胞。线为：*＝LPS；X＝Al-H和化合物2，连续稀释；三角形＝Al-H和化合物2，有固定Al+++剂量；和方形＝没有Al-H的可溶性化合物。(A)是单独介质的阴性对照。(B)是测试可溶性化合物2时的单独缓冲液阴性对照或测试已吸附化合物2时的单独Al-H。X轴上的其他值是测试化合物的量。
图21显示％CD80阳性细胞。格式与图20相同。
图22显示高压灭菌前后Al-H/化合物2的色谱图。
图23显示化合物(A)6(B)67(C)68和(D)71在肌肉内注射(100μg)后随着时间(X轴上的小时)的血清水平(nM)。
图24显示肌肉内注射100μg化合物后且比吸附Al-H早24小时，化合物(A)67(B)71和(C)68的肌肉水平(四头肌中的nM)。箭头显示就未吸附化合物而言没有可检测水平。
图25显示用组氨酸缓冲液(可溶；b,c和d)或Al-H(吸附；e,f和g)给予时响应化合物67(b和e)、68(c和f)和71(d和g)的B细胞激活(％CD19+细胞，其为CD69+)。瑞喹莫德用作阳性对照(h)，单独缓冲液作为阴性对照(a)。对于所有a-h，左侧柱显示腹股沟淋巴结中的细胞且右侧柱显示脾脏中的细胞。
图26显示在第0和21天免疫后第35天的gp140特异性IgG效价。佐剂是：(A)无佐剂；(B)Al-H；(C)Al-H+TLR4激动剂；(D)吸附于Al-H的化合物2；(E)MF59乳液。
具体实施方式
磷酸修饰的苯并萘啶
化合物‘O’是有用的TLR7激动剂，其如参考文献4的实施例48所公开制备：
对所述‘母体’苯并萘啶化合物进行多种修饰以改善其物理化学性质，且特定增加其水溶性并赋予其吸附于氢氧化铝佐剂的能力，从而确保以受控方式体内递送，延长注射位点处的持久性。为此，上面称为化合物1-15和60-62的化合物如参考文献10所述合成(还参见参考文献72)。
示例性化合物1、2、3、4、5、和13(图12)包括经乙二醇接头结合化合物O苯基环的瞵酸盐基团。所述瞵酸盐基团提供能与铝盐发生配体交换的基团而乙二醇接头增加化合物的水溶性。化合物2、3、4和5额外包括还用于改善水溶性的羧基部分。化合物1、3、4和5中的瞵酸盐包括α碳上的2个带负电氟取代基，旨在改善水溶性。
示例性化合物102包括结合化合物O苯基环的瞵酸盐基团。所述瞵酸盐基团提供能与铝盐发生配体交换的基团。化合物102如参考文献10所述合成。
吸附研究-氢氧化铝
在多个pH研究化合物与氢氧化铝(Al-H)的吸附。
化合物13(0.5mg/mL)溶于10mMNaOH(pH6.5或pH9)并加入氢氧化铝佐剂(2mg/mL)，产生100μg/剂制剂。所述上清用C18(50cmx4.6mm)ACE柱上的弹道梯度(2.5分钟内从10％CH3CN-0.1％TFA到100％CH3CN-0.1％TFA)通过HPLC在45℃评价。为评价上清温度和孵育时间对结合的影响，所述上清在室温以及1小时、5小时和24小时后于37℃评估。还评价没有氢氧化铝的对照。有和没有氢氧化铝的化合物1制剂在任一温度和任一pH的HPLC色谱图显示该化合物1在氢氧化铝存在的任何时间点不存在于上清中，提示其已吸附于金属盐。
化合物12(1mg/mL)以相同方式在pH9测试。化合物12还在10mM组氨酸缓冲液中于pH6.7测试。同样，制剂包括氢氧化铝时化合物10在上清中于任一pH和任一温度不出现。
有机溶剂提取方法用于评价化合物13是否共价结合氢氧化铝。所述制剂如下制备：2mg/ml氢氧化铝、100μg/剂化合物13、10mM组氨酸缓冲液；调整pH至9。还制备没有氢氧化铝的对照制剂。1ml制剂混合1mlKH2PO41MpH9(0.5M终浓度,pH9)并37℃温和搅拌过夜。如果所述化合物通过配体交换吸附铝盐，则所述游离磷酸根阴离子会取代其。然后进行有机提取：1ml各样品混合1ml正丁醇并涡旋。形成2相后，回收上相(丁醇)，用N2干燥并重悬于MeOH/10mMNaOH。对制剂上清和丁醇提取样品进行HPLC分析(C18柱；2分钟内0-100％B；A＝含0.1％TFA的H2O；B＝含0.1％TFA的ACN)。用KH2PO4处理的制剂上清中观察到化合物13的量增加，表明化合物13被磷酸根阴离子置换，即解析。
还评价和定量化合物1、2、3、4、5(以及下述其他化合物6、67、68和71)在10mM组氨酸缓冲液,pH6.5中的吸附。这些化合物在1mg/ml时为水溶性且如下吸附Al-H：
化合物 1 2 3 4 5 6 67 68 71
％ 98.2％ 97.0％ 96.2％ 96.0％ 94.5％ 88％ 82％ 94％ 85％
与这些磷酸修饰化合物所见的高比例吸附相反，‘母体’化合物O不能吸附Al-H佐剂。
磷酸化合物1为固有荧光性。Al-H佐剂(3mg/ml)在混合化合物1(0.25mg/ml)前后的共聚焦显微镜直观显示磷酸化合物结合不溶性金属盐颗粒。用化合物2的流式细胞术显示类似结果：发现化合物O在Al-H存在时为单独群，而化合物2与Al-H共定位。
解吸操作方案用于进一步确认磷酸-化合物与Al-H的结合。所述化合物/Al-H制剂(荧光)用0.5M磷酸盐缓冲液处理且随后用水(用于水溶性化合物)或丁醇(用于弱水溶性化合物)洗涤。然后分析洗涤的Al-H，且如同混合磷酸-化合物前的Al-H，没有显示荧光。
稳定性研究显示吸附的化合物在化合物稳定性和吸附方面稳定数周。所有化合物1、2、3、4、5和13显示至少3周阶段内的至少95％吸附。持续研究化合物2和5显示其稳定6周或更长。甚至在5CVMB抗原存在下(见下)持续RP-HPLC研究化合物2显示所述抗原和TLR7激动剂在水性条件下于4℃保持稳定吸附而不降解，持续至少24周，或于37℃持续至少4周。渗透压和pH还在存储阶段中保持于可接受范围内。
图14显示100℃,pH7存储多至5小时的化合物1的解吸。解吸开始迅速，磷酸钾水平增加(10mM、100mM、500mM)引起1小时后解吸增加(20％、60％、80％)，但不比5小时后增加更多。10mM磷酸盐时，所述化合物在100℃5小时后保持>70％结合，70℃5小时后保持>80％结合。
就化合物1解吸测试多种缓冲液阴离子，使用内在荧光和HPLC跟踪化合物。如所预期，KH2PO4(0.5M,pH9)能从Al-H完全解吸化合物1。用谷氨酸盐、抗坏血酸盐和柠檬酸盐观察到结合略有下降(部分解吸)。相反，NaCl和Tris-HCl不改变吸附；硫酸钠或HEPES、或KH2PO4在pH7也不改变。
就Al-H吸附测试化合物102。方法：1.化合物2溶液：2mg化合物溶于2mL水制备1mg/mL溶液。简言之，向2mg化合物2中加入2mL水且悬液用超声波处理10分钟。1NNaOH以2μL增量添加直到溶液变得澄清；总共加入12μL1NNaOH。溶液的终pH用pH试纸条测定为～10。溶液进一步超声波处理5分钟并室温维持。2.明矾吸附：明矾吸附样品用3mg/mL氢氧化铝和没有缓冲液的0.5mg/mL化合物2制备。a)实验：303μL水+197μL氢氧化铝(15.22mg/mL，批号1050)+500μL1mg/mL化合物2，室温摇晃过夜。b)对照：500μL水+500μL1mg/mL化合物2，室温摇晃过夜。结果：1)目测：就实验小瓶加入化合物2后，悬液变白且混浊，与膦酸盐和氟膦酸盐(化合物2和5)观察到的类似。2)RP-HPLC：吸附和回收通过RP-HPLC测定。所用标准为400、40和4μg/mL；斜率为面积＝18000x浓度(μg/mL)。a)吸附效率：分析10x稀释上清。i)实验：面积＝133708；浓度(1x)＝74.3μg/mL；效率＝85.1％。ii)对照：面积＝923681；浓度(1x)＝513.2μg/mL；效率＝-2.6％(等同于0％)。b)回收：用0.5MNa2HPO4(pH9)煮沸后的10x稀释上清。i)实验：面积931578；浓度(1x)＝517.5μg/mL；回收＝103.5％。ii)对照：面积＝870826；浓度(1x)＝483.8μg/mL；回收＝96.8％。结论：含磷酸盐的TLR7调节剂化合物102以>80％吸附效率吸附氢氧化铝以在100μL注射体积中递送50μg剂量。
ζ电势
Al-H颗粒(2mg/ml)的表面电荷在化合物2缺失时测量，或浓度从10-200μg增加。ζ电势测量是基于微粒系统的光散射。制剂在有NaCl的10mM组氨酸缓冲液中制备，然后在制剂缓冲液中1:10稀释。结果如下：
化合物2(μg) ζ电势(mV) ％吸附
0 +20±2 -
10 +23.5±0.6 100
25 +17±1 100
50 +10.6±0.7 100
100 -11.5±0.8 100
150 -28.9±0.1 99
200 -41±2 98.8
因此，Al-H颗粒上的净电荷随着SMIP加入而减少，在50-100μgSMIP间反转极性。这显示该SMIP结合Al-H颗粒并修饰铝盐表面电荷。
有100μgSMIP的净电荷不排除以下可能性：Al-H表面具有部分正电荷的区域。这种区域通过基于电荷的机制可用于抗原吸附。
吸附研究-磷酸铝
还研究化合物1、2和5与磷酸铝(Al-P)佐剂的吸附。Al-P佐剂在化学上是羟基磷酸盐，PO4/Al摩尔比为约0.9且PZC为约5.7。所述佐剂以‘纯(plain)’形式或用增加浓度的磷酸盐缓冲液(10mM、50mM、100mM、250mM和500mM)预处理后进行测试，尝试使佐剂上的吸附位点饱和。孵育在10mM组氨酸缓冲液中持续8小时，有0.4mg/ml所述化合物和3mg/mlAl-P。
结果如下，显示每化合物2个实验的％吸附：
因此，化合物2和5以良好效率(>90％)吸附Al-P，而化合物5以较低效率(60％)吸附。用磷酸盐溶液预处理Al-P抑制所有化合物的吸附，吸附度取决于预处理溶液中的磷酸盐浓度。对于化合物5，10mMPi溶液足以完全抑制吸附，而对于化合物1，50mM溶液使吸附降低到20％，对于化合物2，100mM溶液使吸附降低到～60％。
用化合物1的单独实验显示用10mM磷酸钾预处理磷酸铝佐剂使吸附从79.8％降低到23.5％，用50mM或100mM预处理完全抑制吸附。
吸附研究-磷酸钙
化合物2与市售可得磷酸钙佐剂的吸附在pH6.4研究，没有组氨酸缓冲液。制备2种制剂，都有1.12mg/mlCa++但有0.25mg/mL或0.125mg/ml化合物2。就2种制剂而言吸附都约90％。
高压灭菌
化合物2吸附Al-H并通过HPLC在高压灭菌前后进行分析。图22显示色谱概况没有变化。还使用质谱且高压灭菌之前和之后材料中的MS峰也没有变化。因此，SMIP甚至在吸附时通过高压灭菌消毒。
式(C)-腺嘌呤化合物
根据参考文献3、11-17、21和23-25(特别是参考文献3和24)公开的母体腺嘌呤化合物，合成下列磷酸-化合物：
化合物6能根据下示方案合成，参考数字指下面方案所示化合物，且不涉及本申请他处所确立的化合物编号。下面方案中用参考数字29鉴定的化合物是本发明的化合物6。
参考上面方案，市售可得腺嘌呤24与苄基溴10(描述于参考文献88实施例25步骤1)的烷基化提供中间物25。然后，25的芳基氯用2-甲氧基乙醇取代以提供中间物26。26的溴化随后提供中间物27。然后，用甲醇钠处理27提供28。中间物28随之用三甲基溴硅烷水解以递送膦酸29。
上述化合物6合成的实验细节如下。
步骤1：二乙基4-((6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦酸酯
向市售可得2-氯-9H-嘌呤-6-胺(1当量)的DMF溶液(0.50M)中加入碳酸钾(1.2当量)和二乙基4-(溴甲基)苯甲基膦酸酯(1当量)(描述于参考文献88实施例25步骤1)。然后，反应混合物加热至60℃持续5小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统(ISCO)用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(18％)。
步骤2：二乙基4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦 酸酯
向二乙基4-((6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦酸酯(1当量)的2-甲氧基乙醇(0.10M)溶液中加入氢化钠(1.3当量)。然后，反应混合物加热至120℃持续18小时。此点时，反应混合物能冷却至室温。所述混合物随后用水和EtOAc稀释。此混合物转移至分液漏斗并用水洗3次。然后分离有机层，无水Na2SO4上干燥，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供定量产量的固体标题化合物。
步骤3：二乙基4-((6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲 基膦酸酯
向二乙基4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦酸酯(1当量)的乙酸(0.20M)溶液中加入乙酸钠(15当量)和溴(13当量)。然后，反应混合物能室温搅拌18小时。此点时，反应通过加入硫代硫酸钠来淬灭。所述混合物随后用水和DCM稀释。此混合物转移至分液漏斗并用DCM洗3次。然后，合并的有机层在无水Na2SO4上干燥且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(14％)。
步骤4：二乙基4-((6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基) 苯甲基膦酸酯
向二乙基4-((6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦酸酯的甲醇(0.10M)溶液中加入甲醇钠(20当量)。然后，反应混合物能在70℃搅拌18小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且随之通过加入氯化铵来淬灭。所述混合物随后用DCM稀释，转移至分液漏并用DCM洗3次。然后，合并的有机层在无水Na2SO4上干燥且挥发物真空内移出。得到的固体化合物(38％)在下一步上实施而不需进一步纯化。
步骤5：(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苄基) 膦酸
向二乙基4-((6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基膦酸酯(1当量)的CH2Cl2(0.10M)溶液中0℃缓慢加入三甲基溴甲硅烷(10当量)。1小时后移出冰浴且反应混合物能在22℃搅拌2小时。此点时，挥发物真空内移出且得到的残留物通过反相HPLC用20-90％0.5mMNH4OAc(MeCN中)-10mMNH4OAc(水中)梯度纯化以递送固体的标题化合物(29％)。
1HNMR(二甲亚砜-d6):(br,4H),6.58(br,2H),4.77(s,2H),4.25(t,2H,J＝4.0Hz),3.58(t,2H,J＝4.0Hz),3.27(s,3H),2.73(s,1H),2.67(s,1H).LRMS[M+H]＝410.1
此化合物活性在用HEK293细胞的试验中评价，所述细胞稳定转染有人TLR7和NF-κB-驱动荧光酶报道载体(pNifty-荧光酶)。作为对照试验，使用转染有pNifty-Luc的正常HEK293。细胞在补充有2mML-谷氨酰胺、10％热灭活FBS、1％青霉素和链霉素、2μg/ml嘌呤霉素和5μg/ml杀稻瘟菌素的DMEM中培养。Bright-GloTM荧光酶试验缓冲液和底物由(普洛麦格(Promega))供应。细胞以25,000个细胞/孔接种于384孔板的50μl总体积培养基中。细胞在37℃和5％CO2过夜(18小时)培养后能粘附于所述板。然后，连续稀释的实验和阳性对照化合物分布到到各孔并在37℃和5％CO2孵育7小时。用单独DMSO刺激的细胞用作阴性对照。孵育后，根据生产商说明书向各孔加入30μl预混合试验缓冲液和底物缓冲液。发光信号在CLIPR机器上读取，积分时间为每板20秒。就各化合物产生剂量响应曲线且EC50值测定为产生50％最大信号的浓度。EC50值还与瑞喹莫德的活性(设为100％)作比较。
化合物6显示EC50为0.41μM或93％。脾细胞中，其显示EC50为0.98μM(210％)。人PBMC中，其显示EC5＝为1.0(35％)。其在pH6.8可溶于组氨酸缓冲液。
式(C)-氮杂嘌呤化合物
根据参考文献18-20公开的母体氮杂嘌呤化合物，合成下列磷酸-化合物67(腺嘌呤化合物6的氮杂嘌呤类似物)。
化合物67能根据下示方案合成，参考数字指下面方案所示化合物，且不涉及本申请他处所确立的化合物编号。下面方案中用参考数字16鉴定的化合物是本发明的化合物67。
参考上面方案，吡啶9(描述于参考文献18制备67)与苄基溴10(描述于参考文献88实施例25步骤1)的烷基化提供中间物11。然后，11与氨的胺化递送吡啶12。12的芳基溴随后用2-甲氧基乙醇取代以提供中间物13。13的氢化随之提供二胺14。然后，微波条件下用乙酸处理14来递送氮杂嘌呤15。中间物15随后用三甲基溴硅烷水解以递送膦酸16。
上述化合物67合成的实验细节如下。
步骤1：乙基(2,6-二溴-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基)氨 基甲酸酯
向乙基(2,6-二溴-3-硝基吡啶-4-基)氨基甲酸酯(1当量)(描述于参考文献18制备67)的乙腈(0.40M)溶液中加入三乙胺(1.5当量)和二乙基4-(溴甲基)苯甲基膦酸酯(1.3当量)(描述于参考文献88实施例25步骤1)。然后，反应混合物加热至60℃持续18小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(38％)。
步骤2:乙基(2-氨基-6-溴-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基) 氨基甲酸酯
向乙基(2,6-二溴-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(1当量)的THF(0.40M)溶液中加入溶于甲醇的氨(5当量)。然后，反应混合物能室温搅拌48小时。此点时，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(68％)。
步骤3:乙基(2-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷 酰基)甲基)苄基)氨基甲酸酯
向乙基(2-氨基-6-溴-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(1当量)的THF(0.30M)溶液中加入氢化钠(5当量)的2-甲氧基乙醇(0.50M)溶液。然后，反应混合物能室温搅拌2小时。此点时，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(68％)。
步骤4：乙基(2,3-二氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰 基)甲基)苄基)氨基甲酸酯
在Paar摇瓶中向乙基(2-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-3-硝基吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(1当量)的EtOH(0.05M)溶液加入10％Pd/C(50％重量当量)。将反应混合物在55psi置于Paar摇瓶4小时。此点时，反应混合物通过硅藻土垫，用CHCl3:MeOH的2:1混合物洗涤。合并的有机层在无水Na2SO4上干燥且挥发物真空内移出。得到的残留物用于下一步而不需进一步纯化。
步骤5：二乙基4-((4-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4, 5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基膦酸酯
乙基(2,3-二氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)吡啶-4-基)(4-((二乙氧基磷酰基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(1当量)的AcOH(0.15M)溶液在100℃微波加热5分钟。1小时后移出冰浴且反应混合物能在22℃搅拌2小时。此点时，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(2步中63％)。
步骤6：(4-((4-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡 啶-1-基)甲基)苄基)膦酸
向二乙基4-((4-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基膦酸酯(1当量)的CH2Cl2(0.10M)溶液中0℃缓慢加入三甲基溴甲硅烷(10当量)。1小时后移出冰浴且反应混合物能在22℃搅拌18小时。此点时，挥发物真空内移出且得到的残留物通过反相HPLC用20-90％0.5mMNH4OAc(MeCN中)-10mMNH4OAc(水中)梯度纯化以递送固体的标题化合物(41％)。
1HNMR(二甲亚砜-d6):(br,4H),5.79(s,1H),5.63(br,2H),4.78(s,2H),4.17(t,2H,J＝4.8Hz),3.55(t,2H,J＝4.8Hz),3.23(s,3H),2.71(s,1H),2.66(s,1H).LRMS[M+H]＝409.1
化合物6显示HEK293细胞中的EC50为6.5μM或103％。脾细胞中，其显示EC50为9.3μM(142％)。人PBMC中，其显示EC5＝为0.8(59％)。其在pH6.8可溶于组氨酸缓冲液。
式(D)
根据参考文献2和22公开的母体取代咪唑喹啉化合物，合成下列磷酸-化合物：
化合物7在上面公开的HEK293试验中具有66μM(55％)的EC50，但在脾细胞和PBMC中失活。其在pH6.8不溶于组氨酸缓冲液。
还制备有较长乙二醇接头的化合物7经修饰形式(化合物37和68)。化合物68在HEK293细胞中具有28μM(75％)的EC50，但再次在脾细胞和PBMC中失活。不同于化合物(7)，其在pH6.8可溶于组氨酸缓冲液。
化合物68能根据下示方案合成，参考数字指下面方案所示化合物，且不涉及本申请他处所确立的化合物编号。下面方案中用参考数字23鉴定的化合物是本发明的化合物68。
参考上面方案，市售可得喹啉17用胺18取代以递送中间物19。然后，19中的硝基还原提供中间物20。中间物20与2-乙氧基乙酸的偶联随后提供中间物21。然后，中间物21与氨的胺化提供咪唑喹啉22。22随之用三甲基溴硅烷水解提供膦酸23。
上述化合物68合成的实验细节如下。
步骤1：二乙基(2-(2-(2-(2-((2-氯-3-硝基喹啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯
向市售可得2,4-二氯-3-硝基喹啉(1当量)的三乙胺溶液(0.30M)中加入市售可得二乙基(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯(1.3当量)(由康龙化成(PHARMARON)提供)。得到的反应混合物在70℃搅拌2小时。此点时，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(63％)。
步骤2：二乙基(2-(2-(2-(2-((3-氨基-2-氯喹啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯
在Paar摇瓶中向二乙基(2-(2-(2-(2-((2-氯-3-硝基喹啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯(1当量)的EtOAc(0.10M)溶液加入10％Pd/C(50％重量当量)和MgSO4(2当量)。将反应混合物在40psi置于Paar摇瓶7小时。此点时，反应混合物通过硅藻土垫，用CHCl3:MeOH的2:1混合物洗涤。合并的有机层在无水Na2SO4上干燥且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(97％)。
步骤3：二乙基(2-(2-(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯
向二乙基(2-(2-(2-(2-((3-氨基-2-氯喹啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯(1当量)的DMF(0.25M)溶液加入(2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(1当量)和2-乙氧基乙酸21(1.2当量)。得到的反应混合物加热至50℃持续18小时。此点时，反应混合物能冷却至室温。所述混合物随后用水和EtOAc稀释。此混合物转移至分液漏斗并用水洗3次。然后分离有机层，无水Na2SO4上干燥，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的偶联中间物(19％)。然后，溶于异丙醇中2M氨的此中间物溶液(1当量)在100℃加热3天。此点时，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASH系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物物(62％)。
步骤4：(2-(2-(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸
向二乙基(2-(2-(2-(2-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸酯(1当量)的CH2Cl2(0.10M)溶液中0℃缓慢加入三甲基溴甲硅烷(10当量)。1小时后移出冰浴且反应混合物能在22℃搅拌18小时。此点时，挥发物真空内移出且得到的残留物通过反相HPLC用20-90％0.5mMNH4OAc(MeCN中)-10mMNH4OAc(水中)梯度纯化以递送固体的标题化合物(26％)。
1HNMR(CDCl3):(m,2H),(m,2H),(m,4H),(m,2H),(m,4H),(m,2H),(m,2H),(m,2H),(m,2H),(m,3H).LRMS[M+H]＝483.1
式(E)
根据参考文献5公开的母体嘧啶化合物如实施例21的酯，合成下列磷酸-化合物：
化合物8在上面公开的HEK293试验中具有7.3μM(81％)的EC50。脾细胞中，其显示EC50为3.1μM(184％)。人PBMC中，其显示EC50为10.4(50％)。其在pH6.8不溶于组氨酸缓冲液。
制备其他式(E)化合物：
化合物(69)显示HEK293细胞中的EC50为47.4μM(36％)，但在脾细胞和PBMC中失活。其在pH6.8不溶于组氨酸缓冲液。化合物70也具有弱溶解度。
化合物71显示HEK293中的EC50为2.7μM(53％)。脾细胞中，其显示EC50为10.5μM(239％)。hPBMC中，其显示EC50为9.5(50％)。其在pH6.8可溶于组氨酸缓冲液。
化合物71能根据下示方案合成，参考数字指下面方案所示化合物，且不涉及本申请他处所确立的化合物编号。下面方案中用参考数字8鉴定的化合物是本发明的化合物71。
参考上面方案，市售可得苯酚1用溴化物2烷基化(描述于参考文献88实施例7步骤1)以递送中间物3。然后，中间物3与乙酰乙酸乙酯的缩合提供烯酸乙酯4。随后，4与碳酸胍的环化提供嘧啶5。中间物5随之转变成用戊胺取代的砜6以递送嘧啶7。7随之用三甲基溴硅烷水解提供膦酸8。
步骤1：二乙基(1,1-二氟-3-(2-(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)丙基)膦酸酯
向4-羟基-2-甲氧苯甲醛(1当量)的DMF(0.25M)溶液加入碳酸铯(2当量)、碘化钠(0.20当量)和二乙基(3-(2-溴甲氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸酯(1.2当量)(描述于参考文献88实施例7步骤1)。反应混合物在100℃搅拌3小时，之后能冷却至室温。得到的反应混合物随后用水和EtOAc稀释。此混合物转移至分液漏斗并用水洗3次。然后分离有机层，无水Na2SO4上干燥，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物(79％)。
步骤2：(E)-乙基2-(4-(2-(3-(二乙氧基磷酰基)-3,3-二氟丙氧基)乙氧基)-2-甲氧苯亚甲基)-3-氧桥丁酸
向二乙基(1,1-二氟-3-(2-(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)丙基)膦酸酯(1当量)的甲苯(0.5M)溶液加入哌啶(0.10当量)、乙酸(0.50当量)和乙酰乙酸乙酯(1.2当量)。然后，反应混合物加热至110℃持续18小时。此点时，向反应混合物额外加入哌啶(0.10当量)、乙酸(0.50当量)和乙酰乙酸乙酯(0.50当量)且110℃加热持续4小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物物(78％)。
步骤3：二乙基(3-(2-(4-((2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸酯
向(E)-乙基2-(4-(2-(3-(二乙氧基磷酰基)-3,3-二氟丙氧基)乙氧基)-2-甲氧苯亚甲基)-3-氧桥丁酸(1当量)的MeOH(0.20M)溶液加入碳酸胍(1.1当量)且反应混合物加热至80℃持续3小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且随后用水和EtOAc稀释。得到的混合物转移至分液漏斗并用EtOAc洗3次。合并的有机层在无水Na2SO4上干燥，挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物物(15％)。
步骤4：2-氨基-5-(4-(2-(3-(二乙氧基磷酰基)-3,3-二氟丙氧基)乙氧基)-2-甲氧基苄基)-6-甲基嘧啶-4-基2,4,6-三甲基苯磺酸盐
向二乙基(3-(2-(4-((2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸酯(1当量)的THF(0.40M)溶液加入1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(1.8当量)和2,4,6-三甲基苯-1-磺酰氯(1.3当量)。反应混合物转移至分液漏斗并用氯仿洗3次。合并的有机层在无水Na2SO4上干燥且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物物(41％)。
步骤5：二乙基(3-(2-(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸酯
向2-氨基-5-(4-(2-(3-(二乙氧基磷酰基)-3,3-二氟丙氧基)乙氧基)-2-甲氧基苄基)-6-甲基嘧啶-4-基2,4,6-三甲基苯磺酸盐(1当量)的EtOAc(0.20M)溶液加入TFA(1.1当量)和戊胺(3.3当量)。然后，反应混合物加热至100℃持续18小时。此点时，反应混合物能冷却至室温且挥发物真空内移出。得到的残留物通过COMBIFLASHTM系统用0-10％MeOH/DCM梯度纯化以提供固体的标题化合物物(76％)。
步骤6：(3-(2-(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸
向二乙基(3-(2-(4-((2-氨基-4-甲基-6-(戊基氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯氧基)乙氧基)-1,1-二氟丙基)膦酸酯(1当量)的CH2Cl2(0.10M)溶液中0℃缓慢加入三甲基溴甲硅烷(10当量)。1小时后移出冰浴且反应混合物能在22℃搅拌18小时。此点时，挥发物真空内移出且得到的残留物通过反相HPLC用20-90％0.5mMNH4OAc(MeCN中)-10mMNH4OAc(水中)梯度纯化以递送固体的标题化合物(70％)。
1HNMR(甲醇-d4):6.81(d,1H,J＝8.4Hz),6.62(s,1H),6.48(d,1H,J＝8.4Hz),4.09(t,2H,J＝4.4Hz),3.90(s,3H),3.86(t,2H,J＝7.6Hz),3.79(t,2H,J＝4.4Hz),3.67(s,2H),3.43(t,2H,J＝7.2Hz),2.30(s,3H),2.22(t,2H,J＝7.6Hz),(m,2H),(m,4H),0.88(t,3H,J＝7.6Hz).LRMS[M+H]＝533.3.
式(III)
制备化合物19的起始化合物是(5R,9R)-9-(十二烷酰氧基)-1-(9H-芴-9-基)-3,12-二氧-2,11-二氧杂-7-硫-4-氮二十三烷-5-羧酸(“TLR2-pre”)，如下制备：
步骤1：(R)-叔丁基2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-巯基丙酸酯(8)
(N-Fmoc-Cys-OtBu)2(7,1当量)、NEt3(3当量)和DTE(1,4-二硫赤藓糖醇,2.5当量)的DCM(0.1M)溶液在室温搅拌直到完全还原(1.5小时)。反应混合物在DCM中稀释，用5％柠檬酸洗3次、水洗2次和卤水洗1次。有机层在无水Na2SO4上干燥并真空浓缩。得到的粗产物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统(ISCO)上用0-5％MeOH/DCM梯度纯化以产生无色粘性油产品。
步骤2：(R)-叔丁基2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-((R)-2,3-二羟丙基 硫代)丙酸酯(10)
(2S)-(+)-环氧丙基-4-硝基苯甲酸盐(9,1.1当量)和1MNaOH(1.1当量)的tBuOH(0.1M)溶液在室温搅拌直到硝基苯甲酸盐完全水解(30分钟)。向所得混合物中引入(R)-叔丁基2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-巯基丙酸酯(8,1当量)的tBuOH(1M)溶液。所述反应在室温搅拌15小时。反应混合物真空浓缩以移出tBuOH并溶于EtOAc。EtOAc溶液用水洗3次，卤水洗1次。得到的粗产物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统(ISCO)上用0-90％EtOAc/Hex纯化以产生无色粘性油的标题产品。
步骤3：(R)-3-((R)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-叔丁氧基-3-氧代丙 基硫)丙-1,2-二醇二月桂酸酯(11)
(R)-叔丁基2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-((R)-2,3-二羟丙基硫代)丙酸酯(10,1当量)的DCM(0.1M)溶液在冰浴中冷却。加入吡啶(3.7当量)，然后是十二酰氯(3.7当量)。反应混合物搅拌10分钟，随后升温至室温，搅拌2小时。反应混合物用DCM稀释，用饱和水性NH4Cl洗涤。水相用DCM回提取。合并的有机相用H2O洗涤，水相用DCM回提取。合并的有机相用卤水洗涤，无水Na2SO4上干燥并真空浓缩。得到的粗产物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统(ISCO)上用0-30％EtOAc/Hex纯化以产生白色固体的标题产品。
步骤4：(5R,9R)-9-(十二烷酰氧基)-1-(9H-芴-9-基)-3,12-二氧-2,11-二氧杂- 7-硫-4-氮二十三烷-5-羧酸(“TLR2-pre”)
(R)-3-((R)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-叔丁氧基-3-氧代丙基硫)丙-1,2-二醇二月桂酸酯(11)的DCM中40％TFA(0.3M)溶液室温搅拌，直到叔丁基完全去保护(2小时)。反应混合物在MTBE中稀释，用1M柠檬酸(调至pH3)洗3次、1:21NHCl/卤水洗1次。有机层在无水Na2SO4上干燥并真空浓缩。使用得到的蜡状固体而不需进一步纯化。
此材料用于制备化合物17、19和22。例如，化合物19如下制备：
步骤1：二乙基2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯
1,2-双(2-碘乙氧基)乙烷(1.0当量)与磷酸三乙酯(1当量)混合，然后微波加热至160℃持续20分钟。粗混合物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统上用85-100％EtOAc/Hex纯化以产生无色油的二乙基2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯。
步骤2：二乙基2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯
向二乙基2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯(1当量)的EtOH(0.2M)溶液加入溶于水(1.4M)的叠氮化钠(5当量)。反应混合物回流加热过夜。然后，所述混合物用水稀释，EtOAc提取(3次)。合并的有机层用卤水洗涤，无水Na2SO4上干燥并真空浓缩。粗材料通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统上用0-5％MeOH/DCM纯化以产生无色油的二乙基2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯。
步骤3：二乙基2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯
二乙基2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯(1当量)溶于EtOH(0.1M)。将Pd(OH)2(0.05当量)加入反应。氢气经球囊引入；所述反应在室温搅拌2小时。所述混合物经硅藻土过滤并用MeOH洗涤。所述溶剂真空移出且粗材料通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统上用0-10％MeOH/DCM纯化以产生无色油的二乙基2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯。
步骤4：(11R,15R)-11-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-15-(十二烷酰氧基)- 10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯
向TLR2-pre(1当量)的DCM(0.1M)溶液加入二乙基2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基磷酸酯(1.3当量)、DIEA(2.5当量)和HBTU(1.2当量)。所述反应在室温搅拌2小时。粗混合物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统上用70-100％EtOAc/Hex纯化以产生(11R,15R)-11-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯。
步骤5：(11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂- 13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯
向(11R,15R)-11-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯(1当量)溶液加入含20％哌啶(50当量)的乙腈。得到的混合物用DCM稀释并超声波处理3分钟。向混合物中加入甲苯且随后真空浓缩。粗混合物通过快速色谱在COMBIFLASHTM系统上纯化，使用100％EA然后是含0-10％MeOH的DCM，产生(11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯。
步骤6：(11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂- 13-硫-9-氮二十九烷膦酸.
向(11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷磷酰二乙酯(1当量)的DCM(0.1M)溶液加入三甲基溴甲硅烷(10当量)。反应混合物室温搅拌过夜并浓缩。粗混合物通过反相高效液相色谱(HPLC)用C4柱纯化，用含40-100％MeCN/10mMNH4OAc(95:5)的10mMNH4OAc(pH9)洗脱，产生白色固体的(11R,15R)-11-氨基-15-(十二烷酰氧基)-10,18-二氧-3,6,17-三氧杂-13-硫-9-氮二十九烷膦酸。
就结合pH6.5的100mM组氨酸缓冲液中Al-H来测试化合物17、19和22。所有3种情况中与Al-H的结合>80％。用于吸附Al-H的其他化合物是上面提及的“TLR2p”化合物。这4种(化合物63-66)与Al-H的相互作用以与化合物17、19和22相同的方法测试；所有情况中结合再次>80％。
吸附对免疫增强剂性能的影响
细胞摄入
化合物1的自体荧光用于跟踪吸附Al-H后人PBMC对其的摄入。FACS用于监控摄入。
多种浓度的化合物1与细胞在有或没有Al-H情况下37℃孵育过夜。存在吸附化合物1的Al-H会产生FACS模式中的大移动，有剂量响应，在单核细胞中特异检测到增加的荧光。因此，Al-H颗粒能增强已吸附化合物1相较溶液中游离化合物的细胞摄入。此外，结果显示已吸附化合物在进入后于细胞中保持更久。
相同的摄入也在其他细胞类型中观察到。
用细胞松弛素D预处理细胞使得与化合物2相关的荧光强度低于未处理细胞，表明已吸附化合物的相互作用和内化过程可由单核细胞活性调节。
加入台盼蓝能“淬灭”化合物2的荧光，但台盼蓝不能透过活细胞。不用细胞松弛素D预处理的细胞在台盼蓝处理后保持高荧光，意味着化合物2位于细胞内。细胞摄入是时间依赖性的。
研究响应化合物1、2和5的单核细胞活化标记CD40和CD80，所述化合物单独或吸附Al-H、或LPS(阳性对照)。已吸附化合物以5个不同浓度测试，采用固定Al+++剂量或简单稀释。图20显示CD40活化且图21显示用化合物2的CD80活化；2个标记都表明已吸附SMIP存在下的活化大于可溶性SMIP。用化合物1和5观察到同一趋势。
化合物2的细胞因子活化概况以可溶和吸附形式作比较。IL-8、IL-6、TNF-α或IL-1β反应中没有显著可观察到的差异。
因此，与用未吸附SMIP孵育作比较时，化合物2吸附Al-H引起细胞中SMIP摄入增加、且细胞活化程度更高。细胞摄入SMIP通过活性内化过程调节，所述过程是时间和剂量依赖性的。
体内递送后的系统性暴露
化合物1、2、3和5通过100μg(4mg/kg)肌肉内注射给予Balb/C小鼠，用单独缓冲液或在吸附Al-H佐剂后。对化合物的系统血清暴露跟踪24小时。如图1-4所示，未吸附化合物具有迅速下降的高初始血清浓度，已吸附化合物显示持续更长时间段的更为平坦反应。在大鼠中观察到类似系统血清暴露概况。
尽管暴露时间段更长，就这些化合物而言，总系统暴露能通过吸附减少，如由化合物2和5的AUC分开测量。
2 5
化合物 8846 9834
+Al-H 4553 13908
与图1-4类似，图23显示注射24小时后化合物(A)6(B)67(C)68和(D)71的血清暴露。AUC如下(nM·hr)，这4种化合物当吸附时在所有情况中更高：
6 67 68 71
化合物 7176 3573 1391 2093
+Al-H 13424 8110 2759 4219
图16显示就TLR2激动剂(化合物74)而言的类似数据。此化合物和化合物80的AUC通过吸附Al-H而下降，这2种化合物都是感兴趣的TLR2激动剂：
74 80
化合物 37425 20749
+Al-H 3389 7264
Cmax值(nM)如下，一般显示吸附时的下降：
血清细胞因子在用化合物1免疫后24小时进行测量，有或没有Al-H、或有单独缓冲液。IL-6和mKC的水平在给予化合物1(没有Al-H)后高～4倍，MCP-1的水平高～20倍(相较单独载剂)。相反，与Al-H联合给予时，所述水平增加到更低程度，<2倍更高(参见图10；还参见图11的化合物2结果)。对于化合物67、68和71，系统性细胞因子一般通过吸附Al-H而下降或未受影响，而就化合物6而言数种细胞因子(如IFN-γ、IL1-β、IL12-p40))水平提高。
化合物1吸附Al-H会减少CD4+T细胞(其也是CD69+)比例和CD19+B细胞(其也是CD86+)比例，此影响在脾和引流淋巴结中都观察到。例如，吸附使CD86+B细胞比例从～75％减少到～15％。化合物6、67和68吸附Al-H时观察到类似的B细胞活化减少(图25，如比较组f与组c)。因此，对于所有测试的TLR7激动剂，吸附Al-H减少B细胞的一般活化。
化合物1、2、3、4、5和13的肌肉水平在联合蛋白抗原肌肉内注射(100μg)Balb/C小鼠(每组3只)后24小时进行测量，有或没有Al-H。除了化合物13，如果没有Al-H注射则所述磷酸-化合物不能检测，但如果注射Al-H则易检测(参见图5)。化合物13在组氨酸缓冲液,pH6.8中弱溶解，这解释了其不同的表现。不修改有利吸附的可溶性‘母体’化合物还从肌肉中很快清除。
用化合物67、68和71的类似实验结果示于图24；所述化合物在以游离形式(箭头)注射后24小时不能检测，但如果注射Al-H则易检测。就化合物6获得类似结果，24小时后其再次在肌肉中不能检测，在腹股沟淋巴结或肝中也不能检测。就多种化合物注射24小时后，肌肉中的化合物水平如下(nM)：
因此，对于所有测试的化合物，吸附Al-H在局部注射位点保持更高水平的可溶性膦酸盐。
总之，这些SMIP吸附Al-H会体内修饰其局部和系统性递送后性能。吸附显示：(i)增加SMIP的细胞摄入；(ii)增加肌肉内注射位点的SMIP驻留时间，所述位点中其能继续施加免疫刺激效果；(iii)降低一般B细胞活化水平，因此宜使一般和非特异性免疫刺激最小化；(iv)减少Cmax；和(v)修饰血清暴露概况，有增加或减少总体系统暴露的潜能，因此实现所需的有用体内性质，如对于广泛预防性免疫，吸附能用于减少系统性暴露和细胞因子刺激，或对于紧急免疫治疗情况，其能用于增加系统性暴露。先前没有报道以此方式使用吸附修饰SMIP体内性能。
体内解吸模型
已知抗原能在暴露于组织或淋巴液后从铝盐中解吸[89,90]。Al-H吸附膦酸盐化合物用组氨酸缓冲液、血浆和组氨酸缓冲液的混合物、或用经刺激模拟组织液(SIF)37℃孵育，跟踪吸附5小时。图13显示示例性解析概况(化合物3)。对于6个测试的化合物，5小时后解吸抗原比例如下：
*用化合物13的结果不可靠。
单独组氨酸缓冲液中，所有膦酸盐显示强结合Al-H，仅2-6％在5小时后未结合。然而，所述膦酸盐在血浆中迅速从Al-H解离，且解离在SIF中甚至更迅速。此外，在SIF中，解离率与化合物系统性暴露在定性上相关联，如肌肉内注射所见。因此，例如，化合物3和4在SIF中具有最高血清暴露和最快解离。
毒理学
就吸附Al-H的化合物2而言，没有涉及下列雄性大鼠中的重复剂量局部耐受性和毒性研究。所述制剂与体重下降、体温升高或不良临床观察不相关。
吸附对免疫原性的效果–B群脑膜炎球菌
参考文献40公开了用于B群脑膜炎球菌(‘MenB’)的疫苗，其从3种单独多肽(‘5CVMB’)制备。这些多肽能吸附Al-H，SDS-PAGE用于检测此吸附是否在化合物1吸附Al-H后仍能发生。
化合物1以0.5mg/ml终浓度溶于10mMNaOH，然后在10mM组氨酸(终浓度)存在下与过量Al-H以1:6重量比组合。pH调整至9.2且所述混合物在室温下温和搅拌3小时，从而使反应能发生。所述混合物在5000g离心10分钟并弃去上清。所述团块(吸附化合物1的Al-H)重悬于初始缓冲液以获得起始浓度的Al-H。pH调整至6.5。然后，经修饰Al-H用于有MenB抗原的制剂。为了比较，抗原还与‘纯(plain)’Al-H平行配制。
配制的抗原进行离心，上清通过SDS-PAGE测试所述3种多肽的存在。在其他测试中，上清用三氯乙酸(TCA)处理以沉淀蛋白。在其他测试中，配制的抗原在分析前用0.5M磷酸盐缓冲液处理，以解吸任何吸附抗原。图6显示上清的SDS-PAGE。化合物预吸附Al-H不防止MenB抗原吸附。其他研究显示甚至用5倍过量的TLR激动剂仍能发生抗原吸附。
用化合物3和4进行类似测试。HPLC分析显示没有一种化合物在混合氢氧化铝后于上清中观察到，但它们在用0.5MKH2PO4解吸处理后恢复。用化合物3或4预吸附后MenB抗原结合Al-H的SDS-PAGE分析再次显示该抗原完全吸附。
用血清细菌抗体(SBA)试验测试MenB抗原的体内免疫原性效力。图7显示针对用5CVMB以及(a)单独Al-H，(b)Al-H+25μg化合物1，(c)Al-H+100μg化合物1,(d)单独化合物1，或(e)Al-H和MenB外膜囊泡免疫后所得菌株NZ98血清的细菌效价。化合物1与Al-H预吸附使得SBA效价大幅增加，比根据单独化合物1所见结果预期的大许多。因此，尽管B细胞的一般刺激由吸附减少(见上)，MenB特异性抗体反应增强。
用本发明的其他磷酸修饰化合物观察到类似效果。例如，图8显示用化合物2的结果，图9显示用化合物5的结果(都是针对菌株NZ98测试血清)。选择这2种化合物用于进一步评估。
化合物2与Al-H预吸附以研究用修饰5CVMB免疫后所得血清的菌株覆盖，其中GNA2091/1870融合蛋白由参考文献91公开的‘936-10A-10A’蛋白取代(其中的SEQIDNO:126；本文的SEQIDNO:4)。下表显示用(a)单独Al-H，(b)Al-H+25μg外膜囊泡，(c)Al-H与100μg化合物2,(d)Al-H与25μg化合物2，(e)Al-H与5μg化合物2，或(f)Al-H+微粒TLR9激动剂配制3种多肽后针对5种不同菌株的效价：
MC58 NZ98 961-5945 UK355 599
(a) 16384 1024 16384 256 65536
(b) 32768 4096 8192 2048 >65536
(c) >65536 16384 32768 4096 >65536
(d) 32768 2048 16384 1024 >65536
(e) >65536 4096 8192 2048 >65536
(f) >65536 8192 16384 2048 >65536
因此，化合物2相较单独Al-H改善菌株覆盖。
用一组更广泛的17种菌株，效价>1024或>4096的覆盖百分数如下，用Al-H+化合物2观察到最佳覆盖：
(a) (b) (c) (f)
>4096 ～20％ ～60％ ～75％ ～50％
>1024 ～45％ ～80％ >95％ ～90％
还用TLR7激动剂化合物6、67、68和71在CD-1小鼠中测试5CVMB疫苗。所述抗原在第0和14天给予，用(a)缓冲液(b)所述激动剂化合物(c)单独Al-H(d)所述激动剂化合物+Al-H或(e)仅作为化合物6的阳性对照，瑞喹莫德+Al-H。第28天的SBA效价如下：
(a) (b) (c) (d) (e)
6 64 282 256 4016 1033
67 64 64 244 949 -
68 64 - 244 404 -
71 64 65 244 1653 -
因此，所有测试的TLR7激动剂化合物的活性通过吸附Al-H而大幅提高(所有情况中组(d)优于组(b))，反之亦然(组(d)优于组(c))。
除了改变体内药代动力学和保持SMIP外，一些情况中吸附不溶性金属盐能因此改善免疫刺激活性。
吸附对免疫原性的效果-金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
来自参考文献39的“Combo-1”疫苗包括4种多肽(EsxAB、Sta006、Sta011、和Hla-H35L)的混合物且此组合有效针对金黄色葡萄球菌(S.aureus)免疫。参考文献39测试Combo-1与Al-H佐剂，决定测试Al-H与已吸附化合物2的组合。实验使用Balb/C小鼠(3次肌肉内注射)并考虑IgG效价、T细胞反应和保护功效。
图19显示针对Combo-1中个体多肽的Combo-1。对于所有4种多肽，用Al-H/化合物2佐剂组合获得的效价高于用单独Al-H获得的效价(**,p<0.05)。用Al-H与1、5、25或50μg化合物2观察到类似结果。
为评价回忆特异性T细胞反应质量，来自小鼠的脾细胞用Combo-1多肽刺激。通过观察细胞因子释放来评价CD4+T辅助细胞中的细胞因子生成。使用Al-H/化合物2相较用无佐剂抗原或有单独Al-H佐剂的抗原免疫产生更多抗原特异性CD4+T细胞，所述细胞生成TNF-α、IL-2和IFN-γ。相较无佐剂的Combo-1，用Al-H时生成IL-4和IL-13的抗原特异性CD4+T细胞百分比更高(尽管不是统计学显著)，但用Al-H/化合物2组合免疫在所有剂量(除了最低剂量)降低此效果，表明Al-H的Th2极化效果被TLR7激动剂的Th1极化效果抵消。
针对金黄色葡萄球菌的保护功效用败血症模型评价，用Newman株攻击后监控15天。收集来自2个用各10μg多肽的实验结果。15天后存活的动物比例、中值存活长度为：
用Al-H/化合物2组合时，存活更佳，有统计学显著性。
因此，还用金黄色葡萄球菌观察到对B群脑膜炎球菌免疫原性的正效果。
吸附对免疫原性的效果-病毒抗原
呼吸道合胞体病毒(RSV)的三聚F糖蛋白用多种佐剂配制，包括化合物2、5和参考文献4的实施例161(每剂量25μg或100μg)，有或没有Al-H。Balb/C小鼠(每组6只)在第0和21天免疫且免疫应答在第35和42天评价。所述制剂在多种测试动物中良好耐受。图18显示用单剂2μg三聚F蛋白后3周的F特异性IgG效价(GMT,每组6只)。图15显示第35天的中和效价，包括与其他佐剂的比较。化合物2与Al-H相较单独Al-H会增加总IgG效价和中和效价，所述增加比就其他TLR激动剂观察到的更高。
上面公开的TLR激动剂还用于提高吸附Al-H时的HIVgp120免疫原性且随后给予猴。结果优于单独Al-H。
化合物2(10μg/剂)吸附于Al-H(100μgAl+++/剂)并作为佐剂测试，所述佐剂有来自南非HIV亚型C菌株TV1的o-gp140ΔV2。免疫使用第0和21天BALB/c小鼠(每组5只)中的10μg蛋白(单一股四头肌中50μl)。还测试其他佐剂。图26显示用吸附Al-H的化合物2获得最佳结果。
Al-H用作流感病毒血凝的佐剂，有或没有吸附化合物2。动物接受2剂有佐剂的抗原。如图17A所示，第一剂量后2组中的总IgG效价类似，但第二剂量后存在化合物2会产生更高效价。另外，图17B显示单独Al-H有利于IgG1同种型反应(Th2型)，而加入化合物2产生平衡的IgG1/IgG2a反应(Th1/Th2)。
因此，还用病毒观察有细菌抗原时对免疫原性的正效果。
与其他佐剂的比较
来自葛兰素史克(GlaxoSmithKline)的INFANRIXHEXATM产品包含≥30IU白喉类毒素、≥40IU破伤风类毒素、无细胞百日咳组分(25/25/8μgPT/FHA/百日咳杆菌粘附素)、10μgHBsAg、三价IPV组分(40/8/32DU的1/2/3型)、和10μgHib偶联物。所述疫苗呈现为用于从其冻干形式重建Hib偶联物的5价水性疫苗，以产生用于人婴儿的0.5ml水性单位剂量，其包含0.95mg氢氧化铝和1.45mg磷酸铝。
为研究替代佐剂，6价混合物有单独Al-H(2mg/ml,组氨酸缓冲液中)、吸附化合物1的Al-H(1mg/ml)、或MF59水包油乳液(与抗原等体积混合)作为佐剂。还制备无佐剂的对照。抗原浓度如下(每ml)：
还使用相同佐剂与3价D-T-Pa混合物(相同浓度)。
渗透压和pH在组合组分后测量以确保生理可接受性。对于所有3价组合物，pH为6.2-7.1且渗透压为290-320mOsm/kg。对于所有6价组合物，pH为5.5-6.8且渗透压为260-320mOsm/kg。缓冲液对照具有pH7.3和276mOsm/kg。
还测试组合抗原的完整性和免疫原性。没有一种抗原在作为组合配制后显示改变的分析概况，即抗原和佐剂共同物理相容。
用单独Al-H时所有抗原与佐剂吸附良好。用Al-H+化合物1的复合体时所有抗原吸附良好，除了百日咳杆菌粘附素部分解吸。
小鼠(雌性Balb/c,4周龄)在第0和28天用100μl各组分(即1/5人剂量)肌肉内免疫。各注射后14天收集血清。第二免疫后，IgG抗体效价如下：
因此，对于所有这些抗原，纳入佐剂会增加IgG抗体效价。用Al-h和化合物1的复合体时观察到最佳效价。次最佳是MF59，其产生比单独氢氧化铝更好的结果。就所有抗原而言用吸附复合体获得的效价优于InfanrixHexa(婴护宁六合一)所见，除了百日咳杆菌粘附素。
此外，数据显示用3价疫苗获得的良好结果甚至在加入IPV、Hib和HBsAg后仍维持。
IgG反应还通过亚类研究。对于6价疫苗中的大部分抗原，所述佐剂对IgG1效价的效果小，但其确实增加IgG2a和IgG2b效价。最佳IgG2a和IgG2b效价用吸附复合体获得，随后是MF59。
相较单独Al-H或InfanrixHexaTM中所见的铝盐混合物，用所述复合体观察到效价增加，意味着每剂量总体铝含量能减少而同时维持增强免疫应答。
减少抗原剂量
实验设计成研究所述佐剂复合体是否能用于减少每剂量抗原量。完成10倍、50倍和100倍稀释(相对于人剂量，即递送1μg、0.2μg或0.1μgHbsAg给各小鼠/100μl剂量)所述6价抗原组合而同时维持佐剂浓度。
对于所有6价组合物，pH为6.1-7.0且渗透压为275-320mOsm/kg。缓冲液对照具有pH7.3和285mOsm/kg。
小鼠用与上述相同的方法免疫。2次免疫后的总血清IgG效价如下：
因此，存在佐剂能使剂量减少5倍或10倍而同时维持IgG效价，其与无佐剂抗原相当或更高。MF59和特定的吸附复合体用于以此方式节省抗原剂量。
佐剂剂量
用100倍抗原稀释，佐剂量还减少。Al-H和化合物1的复合体以3种含量制备，所述含量有2mg/mlAl-H与5μg、25μg或100μg化合物1/剂。对于比较，以无佐剂形式或单独Al-H测试1:100抗原剂量。1:100稀释的INFANRIXHEXA((婴护宁六合一))还用于比较。
对于所有6价组合物，pH为6.2-7.3且渗透压为270-320mOsm/kg。缓冲液对照具有pH7.3和280mOsm/kg。
小鼠如前免疫。2次免疫后的总血清IgG效价如下：
因此，较低量的复合体仍保持良好佐剂性且能诱导比无佐剂6价抗原制剂更高的IgG抗体效价。通过减少佐剂量而同时维持免疫学功效，能改善疫苗的安全概况，这对于儿童情况尤为重要。
佐剂稀释
化合物2如上所公开吸附于Al-H。然后，此吸附材料混合纯Al-H。流式细胞术显示完整Al-H群的荧光变化，表明吸附化合物在新Al-H上的重分布。
为研究重分布的潜能，准备2室实验。所述2室由截留8-10kDa的膜分开。对照实验中，将Al-H置于室1且相同体积的PBS置于室2。没有观察到Al-H从室1漏到室2。测试实验中，将化合物2+Al-H置于室1且相同体积的Al-H置于室2。基于化合物2内在荧光的流式细胞术显示所述化合物从室1越过到室2。
用单磷酰脂A(MPL)合成类似物磷酸化六酰基二糖通过NMR进行类似实验。实验显示MPL能从室1穿过膜，吸附室2中的Al-H。
因此，能以高SMIP浓度制备Al-H和吸附SMIP的散装混合物，此散料能用纯Al-H稀释产生所需SMIP含量。此配置能简化从单一散料生产不同含量的每日佐剂。
抗原和佐剂的临时混合
经修饰5CVMB组合以冻干形式[92]制备，有10％蔗糖、3.84mg/mlNaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)。此材料用水性佐剂组分与500μg/ml化合物2、3mg/mlAl-H、2％蔗糖、6.25mg/mlNaCl和10mM组氨酸缓冲液(pH6.3)重建。
此材料与相同材料的水性制剂作比较(500μg/ml化合物2、10mM组氨酸缓冲液pH6.3、6.25mg/mlNaCl、2％蔗糖、3mg/mlAl-H)。
所述TLR7激动剂在混合冻干抗原后保持吸附Al-H。
在混合(时间0)和2-8℃或室温存储24小时后检测抗原吸附。冻干/重建制剂和完全水性制剂中的抗原吸附相当。2种制剂都稳定24小时。
因此，抗原和佐剂能分开保存以在使用时临时混合。
应理解本发明仅通过举例方式描述，能进行修改而仍保持在本发明范围和精神内。
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Claims (15)

1.一种选自任意式(C)、(D)、(E)或(H)所述化合物的TLR7激动剂：
其中：
(a)P3选自H、C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；前提是P3和P4中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，
(b)P5选自H、C1-C6烷基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P6选自H、C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，其中C1-C6烷基各任选取代有选自C1-C4烷基和OH的1-3个取代基；P7选自H、C1-C6烷基、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-,-NHC1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；前提是P5、P6和P7中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
(c)P8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基，其中C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基各任选取代有OH、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P9和P10各自独立选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，其中C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-NHC1-C6烷基各任选取代有OH和C1-C6烷基；前提是P8、P9或P10中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
(d)P16和各P18各自独立选自H、C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P17选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C1-C6烷基芳基、C1-C6烷基杂芳基、C1-C6烷基芳基-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，各任选取代有选自C1-C6烷基或杂环基的1-2个取代基，前提是P16、P17或P18中至少一个包含-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)部分；
RX和RY独立选自H和C1-C6烷基；
RC、RD和RH各自独立选自H和C1-C6烷基；
XC选自CH和N；
RE选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C(O)C1-C6烷基、卤素和-((CH2)pO)q(CH2)p-；
XE选自共价键、CRE2RE3和NRE4；
RE2、RE3和RE4独立选自H和C1-C6烷基；
XH1-XH2选自-CRH2RH3-、-CRH2RH3-CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-CRH2RH3C(O)-、-NRH4C(O)-、C(O)NRH4-、CRH2RH3S(O)2和–CRH2＝CRH2-；
RH2、RH3和RH4各自独立选自H、C1-C6烷基和P18；
XH3选自N和CN；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键、C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基；
m选自0或1；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4；和
s选自0或1。
2.如权利要求1所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(C)、(D)和(E)的化合物，其中所述化合物具有根据式(C`)、(D`)和(E`)的结构：
其中取代基P3、P4、xc、P5、P6、P7、P8、P9、P10、XE和RE如权利要求1所述。
3.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(C)或(C`)，其中P3选自C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；XC是CH；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；q是1或2。
4.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(C)或(C`)，其中P3选自C1-C6烷基、CF3、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；XC是N；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
5.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(D)或(D`)，其中P5选自C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
6.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(E)或(E`)，其中XE是CH2，P8是C1-C6烷氧基，任选取代有-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
7.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(E)或(E`)，其中P9选自-NHC1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)，其中-NHC1-C6烷基任选取代有OH和C1-C6烷基。
8.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(C)或(C`)，且不是其中P4为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)的化合物。
9.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂，所述激动剂选自式(C)或(C`)，其中P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基芳基。
10.一种下列化合物：
11.一种式(G)的化合物
其中：
P11选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NRVRW和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
P12选自H、C1-C6烷基、任选取代有–C(O)NRVRW的芳基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
P13、P14和P15独立选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
前提是P11、P12、P13、P14或P15中至少一个为-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RV和RW独立选自H、C1-C6烷基或与其结合的氮原子一起形成4-7元杂环；
XG选自C、CH和N；
代表任选的双键，其中如果是双键，则XG是C；和
RG选自H、C1-C6烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键、C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1-4个取代基；
各p独立选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4。
12.如权利要求11所述的化合物，其中式(G)化合物具有下述式(G')的结构：
其中取代基P11、P12、P13、P14、P15和XG如权利要求11所述。
13.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂或权利要求11或12所述的化合物，其中X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
14.如权利要求1或2所述的TLR7激动剂或权利要求11或12所述的化合物，其中X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，各任选取代有1-4个独立选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的取代基；各p独立选自1、2和3；且q选自1和2。
15.一种含上述权利要求中任一项所述的TLR激动剂或化合物以及不溶性金属盐的组合物。
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