CN103087154A - 一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽及其应用 - Google Patents
一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，包含SEQ IDNo：1或2所示的氨基酸序列，所述SEQ ID No：1的氨基酸序列为NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH，所述SEQ ID No：2的氨基酸序列为NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH。该多肽可特异性的与乙酰胆碱酯酶抗体结合。本发明提供的用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽亲和性高、效价高，利用该多肽制备得到的单克隆抗体应用于压电免疫传感器，对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度高、准确率高。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，特别涉及一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，还涉及该多肽在制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体中的应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键酶，是主要的信号传递分子，主要存在于多细胞动物的神经元间、神经元与肌肉细胞间的化学突触上，为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。乙酰胆碱酯酶是生物体内反应最快的酶之一，降解一个分子约80微秒。
由于在周围神经中，运动神经束和感觉神经束乙酰胆碱酯酶的含量相差数十倍，定量分析手术断端神经束的乙酰胆碱酯酶含量能够在临床上快速、准确地分辨感觉神经和运动神经，在临床上有巨大的应用潜力。
现有乙酰胆碱酯酶的含量通常采用技术成熟稳定的压电免疫传感器测定，该方法快速、准确，具有在线分析的功能。压电免疫传感器的检测区间主要取决于检测乙酰胆碱酯酶的芯片，而该芯片的检测区间主要取决于其中所用的单克隆抗体的亲和性和效价。现有市售的抗体制备的抗体芯片，其检测浓度值的线性区间在0.5-2μg/ml，和夹心ELISA检测区间相似。然而，由于手术切除标本断面较小，溶解于细胞裂解液中的蛋白含量较低，其中含有的乙酰胆碱酯酶在夹心ELISA检测的线性范围之外（小于1ng/ml）。因此，将免疫压电传感器检测乙酰胆碱酯酶的含量的方法应用于临床，迫切需要制备更高亲和性和高效价的单克隆抗体。
现有用于压电免疫传感器的单克隆抗体，主要选取乙酰胆碱酯酶抗原蛋白质内免疫原性较高的多肽，藕联大分子（如BSA、BTG）为抗原，免疫后用多肽氨基酸序列相同而藕联的大分子不同的抗原筛选出单克隆抗体；然而，免疫原性较高的多肽往往处于抗原蛋白质的疏水端，导致现有乙酰胆碱酯酶抗体的亲和性和效价较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲和性高、效价高的多肽即其制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述SEQ ID No：1的氨基酸序列为NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH，所述SEQ ID No：2的氨基酸序列为NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH。该多肽可特异性的与乙酰胆碱酯酶抗体结合。
在本发明的第二方面，提供了一种多肽偶联物，所述多肽偶联物由多肽、交联剂和大分子物质构成，其中所述多肽包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述交联剂为甲醛和乙酸钠的混合物，所述大分子为牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔虫戚血蓝蛋白（LKH）或甲状腺球蛋白（BTG）。
在本发明的第三方面，提供了一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的抗体，所述抗体特异性地与权利要求1所述的多肽结合。
作为优选，本发明的第三方面所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的第四方面，提供了上述多肽在制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体中的应用。
所述应用，包括以下步骤：
（1）将包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列的多肽偶联大分子获得全抗原；
（2）将所述全抗原通过免疫制得用于检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体；
（3）将所述单克隆抗体应用于压电免疫传感器检测乙酰胆碱酯酶。
有益效果：本发明提供的用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽亲和性高、效价高，利用该多肽制备得到的单克隆抗体应用于压电免疫传感器，对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度高、准确率高。
本发明通过对乙酰胆碱酯酶的蛋白质结构中每个氨基酸的亲水性、抗原性分析，找寻和设计了2个亲水性和抗原性较高氨基酸序列；再将这两个亲水性和抗原性较高的氨基酸序列偶联大分子获得全抗原，通过免疫制得用于检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，制得的单克隆抗体亲和性高、效价高。并将该单克隆抗体应用于检测乙酰胆碱酯酶的压电免疫传感器，可显著提高检测灵敏度与准确率。
附图说明
图1为实施例3制得的鼠单抗在人白血病细胞中AChE的免疫共沉淀图。
图2为实施例3制得的鼠单抗在鼠脑组织中AChE的免疫共沉淀图。
图3为鼠脑组织AChE单抗免疫组化图。
图4为人脊髓前根AChE单抗免疫组化图。
图5为实施例3制得的鼠单抗应用于压电免疫传感器检测结果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1多肽合成
按表1所示的多肽的氨基酸序列，利用MultiPep RS多肽合成仪，采用固相合成法，合成多肽。
表1用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽的氨基酸序列
| SEQ ID No： | 序列 |
| 1 | NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH |
| 2 | NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH |
实施例2偶联物的制备
（1）KLH多肽偶联物的制备
将15mg KLH溶于0.5ml的去离子水，1mg SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列的多肽溶于0.5ml去离子水与乙醇的混合液(其中去离子水与乙醇的体积比为2：1)；将KLH溶液与多肽溶液混合，加入0.3ml 3mol/L的乙酸钠和0.5ml 7.5％的甲醛，于暗处搅拌反应24h；用0.05mol/L pH7.4PBS于4℃透析24h以上，冻干分装，即得KLH多肽偶联物，－20℃保存。
（2）BSA多肽偶联物、BTG多肽偶联物和OVA多肽偶联物的制备方法同（1）。
实施例3抗原多肽免疫动物制备单克隆抗体
抗原多肽免疫动物制备单克隆抗体，包括以下步骤：
1.真核表达的AChE蛋白的制备：
（1）从流产胎儿脑组织中提取并纯化RNA，反转录成cDNA；
（2）设计带有EcoRI酶切位点的引物（P15`-tagaattcggccggctgcggggcattcgc-3`，AChE全长序列292-312，包含有编码AChE多肽前体的序列；P2
5`-gtcgaattctcacaggtctgag cagcgatcctgcttgct-3`AChE CDS第1971-2001)，PCR扩增后的产物经测序证实与乙酰胆碱酯酶的mRNA序列（E4-E6,NM_000665）一致，克隆至pGEM-T载体，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中；
（3）将真核表达载体转染至293T细胞内，G418筛选出稳定的重组hAChE表达细胞株，AChE蛋白表达量可达到25微克/毫升。
2.免疫：
以实施例2得到的KLH多肽偶联物为抗原常规免疫小鼠，每两周免疫一次；每只小鼠注射KLH多肽偶联物抗原0.8ml，分别注射动物两足垫、颈部、背部多点注射；免疫三次后，收集抗血清，用甲状腺球蛋白偶联的多肽ELASA法测定小鼠血清中抗血清效价，当效价达到1:10000后，再次免疫两次。
3.制备单克隆抗体：
取步骤2免疫后的小鼠脾脏，制成悬液，和杂交瘤细胞融合；培养融合细胞，用真核表达的AChE蛋白，筛选阳性克隆细胞。测定阳性克隆细胞的培养上清的效价，选取效价最高的3-4个阳性克隆细胞株（大于1:10000），注射至小鼠腹腔，抽取腹水，精制纯化后得到AChE鼠单抗，克隆号为：AP0691。
采用上述方法可制备鸡单抗、兔单抗。
利用上述方法制得AChE鼠单抗，克隆号为：AP0692；其中，偶联物抗原包含SEQ IDNo：3所示的氨基酸序列，所述SEQ ID No：3的氨基酸序列为：
NH2-CKLLSATDTLDEAERQWKH-COOH。
实施例4亲和性测定
1.实施例3制得的AChE鼠单抗在人白血病细胞（Hela细胞）中AChE的免疫共沉淀实验
将实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号为：AP0691）、AChE鼠单抗（克隆号为：AP0692）、Abcam公司AChE抗体ab78228在人白血病细胞（Hela细胞）中分别进行AChE的免疫共沉淀实验。
采用本领域常规方法进行免疫共沉淀实验，并利用蛋白质印迹法（western blot）显色，检测抗体与AChE的亲和性，结果见图1。
其中，
1号带：Hela细胞的裂解液，用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，在分子量68kd处有特异性条带；
2号带：人IgG与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明人IgG与AChE无亲和性；
3号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，在分子量68kd处有特异性条带，表明AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与AChE有亲和性；
4号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）不能识别AChE；
5号带：Abcam公司AChE抗体ab78228与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，显示抗体ab78228与AChE无亲和性；
6号带：巴傲德公司抗体BS3694与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，显示抗体BS3694与AChE无亲和性；
7号带：巴傲德公司抗体BS3694与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot结果，无特异性条带，表明抗体BS3694与AChE无亲和性；
8号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228不能识别AChE；
9号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228不能识别AChE；
10号带：Abcam公司AChE抗体ab78228与Hela细胞裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228与AChE无亲和性；
11号带：Hela细胞的裂解液用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot结果，无特异性条带，表明Abcam公司AChE抗体ab78228无法识别人AChE。
上述结果表明，实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）能够特异性结合人AChE，其亲和性显著优于市售产品。
2.实施例3制得的鼠单抗在鼠脑组织中AChE的免疫共沉淀实验
将AChE鼠单抗（克隆号为：AP0691）、AChE鼠单抗（克隆号为：AP0692）、Abcam公司AChE抗体ab78228在鼠脑组织中分别进行AChE的免疫共沉淀实验。
采用本领域常规方法进行免疫共沉淀实验，并利用蛋白质印迹法（western blot）显色，检测抗体与AChE的亲和性，结果见图2。
其中，
1`号带：小鼠脑组织裂解液用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，在分子量68kd处有特异性条带；
2`号带：用鼠IgG与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明鼠IgG与AChE无亲和性。
3`号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，在分子量68kd处有特异性条带，表明AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与AChE有亲和性。
4`号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）不能识别AChE。
5`号带：Abcam公司AChE抗体ab78228与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明抗体ab78228与AChE无亲和性。
6`号带：巴傲德公司抗体BS3694与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）的westernblot显色结果，无特异性条带，表明抗体BS3694与AChE无亲和性。
7`号带：巴傲德公司抗体BS3694与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明抗体BS3694与AChE无亲和性。
8`号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228不能识别AChE。
9`号带：AChE鼠单抗（克隆号：AP0692）与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228不能识别AChE。
10`号带：Abcam公司AChE抗体ab78228与小鼠脑组织裂解液进行免疫共沉淀后，再用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot显色结果，无特异性条带，表明AChE抗体ab78228与AChE无亲和性。
11`号带：小鼠脑组织裂解液用Abcam公司AChE抗体ab78228的westernblot结果，无特异性条带，表明Abcam公司AChE抗体ab78228无法识别AChE。
上述结果表明，实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）能够特异性结合小鼠脑组织裂解液中AChE，其亲和性显著优于市售产品。
3.鼠脑组织AChE单抗免疫组化结果
脑组织中AChE含量较高，因此取小鼠大脑皮层常规固定、包埋后切片，进行本领域常规免疫组化染色，DAB发色后拍片，见图3。
由图3可见，小鼠大脑皮层经实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）免疫组化染色后，形成较多的棕褐色颗粒，即为阳性细胞。
由此可见，实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）能够特异性识别鼠脑组织中的AChE。
4.人脊髓前根AChE单抗免疫组化结果
人脊神经前根中AChE含量较高，因此取人脊神经前根常规固定、包埋后切片，进行本领域常规免疫组化染色，DAB发色后拍片，见图4。
由图4可见，人脊神经前根切片经实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）免疫组化染色后，形成较多的棕黄色颗粒，即为阳性细胞。
由此可见，实施例3制得的AChE鼠单抗（克隆号：AP0691）能够特异性的识别人脊神经前根中的AChE。
5.实施例3制得的鼠单抗（克隆号：AP0691）应用于压电免疫传感器检测
利用实施例3制得的鼠单抗（克隆号：AP0691）在线检测AChE的含量，并将Abcam公司AChE抗体ab78228作为对比例在线检测AChE的含量，结果见图5。
其中：
图5a为实施例3制得的鼠单抗（克隆号：AP0691）对脊髓前根洗脱液的一次检测结果，显示振动频率下降了9.8Hz；
图5b为Abcam公司AChE抗体ab78228对脊髓前根洗脱液的一次检测结果，显示振动频率下降了4.8Hz；
图5c为实施例3制得的鼠单抗（克隆号：AP0691）对红细胞悬液的一次检测结果，显示振动频率下降了1.2Hz；
图5d为Abcam公司AChE抗体ab78228对红细胞悬液的一次检测结果，显示振动频率下降了0.2Hz。
图5e为3次不同重复的检测脊髓前后根频率变化的统计图；其中，
图中各英文意义为：
Frequency频率；
Injection进样；
Reaction反应；
Time时间；
ΔF频率变化率；
Ventiral root前根；
Dornal root后根。
结果显示实施例3制得的鼠单抗（克隆号：AP0691）对脊髓前根洗脱液、红细胞悬液的检测更准确、灵敏。
Claims (5)
1.一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述SEQ ID No：1的氨基酸序列为
NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH，所述SEQ ID No：2的氨基酸序列为NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH。
2.一种多肽偶联物，其特征在于：所述多肽偶联物由多肽、交联剂和大分子物质构成，其中所述多肽包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述交联剂为甲醛和乙酸钠的混合物，所述大分子为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
3.一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的抗体，其特征在于：所述抗体特异性地与权利要求1所述的多肽结合。
4.根据权利要求3所述的一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的抗体，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求1所述的多肽在制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体中的应用。
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| CN1376798A (zh) * | 2001-03-23 | 2002-10-30 | 中国科学院上海细胞生物学研究所 | 一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(ar－ache)及基因编码序列 |
| CN1772766A (zh) * | 2004-11-12 | 2006-05-17 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶单克隆抗体及其用途 |
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2012
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