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CN116239684B - 针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116239684B CN202310127574.4A CN202310127574A CN116239684B CN 116239684 B CN116239684 B CN 116239684B CN 202310127574 A CN202310127574 A CN 202310127574A CN 116239684 B CN116239684 B CN 116239684B
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徐若
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Abstract

本发明提供针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。具体提供针对人钙网蛋白的高亲和力兔单克隆抗体对2G2和3B3，并利用该兔单克隆抗体对开发出双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点，检测灵敏度达1pg/mL。该双抗夹心ELISA检测能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人钙网蛋白，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

Description

针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
钙网蛋白(CALR)是一种滞留于内质网中的可溶性Ca2+结合蛋白，存在于大多数真核细胞中。CALR作为细胞内游离钙水平的关键调节剂，起到维持Ca2+稳态的作用。CALR也可作为内质网中的凝集素型分子伴侣，与新合成的糖蛋白上的寡糖残基结合，以确保正确折叠。
近年来，还有研究发现：CALR不仅仅是停留在内质网当中，还能定位到细胞膜和分泌到细胞外，行使其特定的功能。CALR在肿瘤细胞、凋亡的细胞、一些药物处理的细胞(如蒽环类药物)的表面表达量要高于正常的细胞，这些细胞表面的CALR能够与一些固有免疫细胞表面的受体CD91/LRP1结合，如巨噬细胞、树突状细胞等，以增强免疫系统对这些细胞的免疫应答。在内风湿性关节炎病人中，细胞表面的CALR能够和白细胞表面的HLA-DRΒ结合，刺激产生蛋白的自身抗体。也有研究表明：CALR的NDomain能够分泌到细胞外，被称为血管生成抑制素，能够抑制微血管的形成，对于肿瘤的形成起着重要作用。因此，CALR是一个治疗肿瘤、风湿性疾病以及其他自体免疫疾病的重要药物靶点。通过测定人体液或特定细胞培养上清液中的CALR水平，可以对其相关的疾病和预后做出诊断评估。
目前，市面上几乎所有的CALR ELISA检测试剂盒均采用鼠抗人CALR单克隆抗体，其亲和力和特异性普遍较低。例如，专利文献CN113960311A公开了一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法，采用的鼠源单克隆抗体的制备方法依赖杂交瘤细胞，制备工艺也相对复杂，批间差大。
因此开发一种针对人钙网蛋白蛋白具有高亲和力的检测方法，具有非常重要的意义。
发明内容
基于此，有必要提供针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供兔单克隆抗体对2G2和3B3，与人钙网蛋白的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强。
本发明采用如下技术方案：
本发明提针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体对，所述兔单克隆抗体对为兔单克隆抗体2G2、兔单克隆抗体3B3。
其中，兔单克隆抗体2G2的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，轻链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示；重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示，重链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
兔单克隆抗体3B3的全长序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的序列如SEQ IDNO.12所示，轻链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示，重链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。
本发明还可以提供针对人钙网蛋白兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对2G2和3B3的上清液；纯化，即得。
本发明还可以提供针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体在制备检测人钙网蛋白的试剂或者试剂盒中的应用。所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人钙网蛋白，其中所述兔单克隆抗体2G2作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体3B3用作标记抗体。
具体地，本发明还可以提供一种检测人钙网蛋白的试剂或者试剂盒，包含针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体2G2和3B3。所述人钙网蛋白选自重组人钙网蛋白、细胞分泌的人钙网蛋白中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的核心优势在于：
(1)本发明基于B细胞标记及分选技术，直接从免疫后的兔子脾脏中富集并分离能够识别人CALR蛋白的B淋巴细胞，大大提高了抗原特异性B细胞筛选的效率。并且分离的B淋巴细胞以单个细胞的形式进行培养，直接得到的就是单克隆抗体，省去了杂交瘤技术中多次亚克隆的繁琐步骤。
(2)本发明制备的单克隆抗体为重组抗体。从脾脏中筛选到阳性克隆后，直接从B细胞中扩增抗体VH/VL基因，并构建重组表达载体，所得到的抗体具有稳定性高、特异性好、批间差次小等特点。
(3)本发明制备的兔单克隆抗体对2G2和3B3具有不同的抗原结合位点。利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。
附图说明
图1为兔单克隆抗体对2G2和3B3的VH和VL序列比对图。
图2为抗体轻重链表达载体图谱。
图3为兔单克隆抗体对2G2和3B3与Human CALR的亲和力测试图。
图4为兔单克隆抗体对2G2和3B3与重组Human CALR的抗原决定簇测试图。
图5为基于兔单克隆抗体对2G2和3B3建立的双抗夹心酶联免疫(ELISA)检测HumanCALR的方法的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的技术构思在于提供针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，包括兔单克隆抗体2G2和兔单克隆抗体3B3。利用该兔单克隆抗体对2G2和3B3开发出双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。
具体筛选的兔单克隆抗体2G2的序列如下：
轻链全长序列如下：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASESVYGNNRLAWYQQKPGQPPKRLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGKQFTLTMSGVQCDDAATYYCIGHFYSGINSISFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:1)。
轻链可变区的序列如下：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASESVYGNNRLAWYQQKPGQPPKRLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGKQFTLTMSGVQCDDAATYYCIGHFYSGINSISFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:2)。
轻链互补决定区LCDR1的序列为：
ESVYGNNRLAW(SEQ ID NO:3)。
轻链互补决定区LCDR2的序列为：
LIYDASTLASGV(SEQ ID NO:4)。
轻链互补决定区LCDR3的序列为：
IGHFYSGINSISF(SEQ ID NO:5)。
重链全长序列如下：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSINNNYWICWVRQAPGKGLEWVGCISIADNSNTYYATWAKGRVTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGPAVISFNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:6)。
重链可变区的序列如下：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSINNNYWICWVRQAPGKGLEWVGCISIADNSNTYYATWAKGRVTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGPAVISFNLWGPGTLVTVSS(SEQ IDNO:7)。
重链互补决定区LCDR1的序列为：
FSINNNYWIC(SEQ ID NO:8)。
重链互补决定区LCDR2的序列为：
WVGCISIADNSNTYYATWAK(SEQ ID NO:9)。
重链互补决定区LCDR3的序列为：
YFCARGPAVISFNL(SEQ ID NO:10)。
具体筛选的兔单克隆抗体3B3的序列如下：
轻链全长序列如下：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASESVYNNNRLAWYQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSRFKGSGSGKQFTLTMSGVQCDDAATYYCIGHFYTSINSVTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:11)。
轻链可变区的序列如下：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASESVYNNNRLAWYQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSRFKGSGSGKQFTLTMSGVQCDDAATYYCIGHFYTSINSVTFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:12)。
轻链互补决定区LCDR1的序列为：
ESVYNNNRLAW(SEQ ID NO:13)。
轻链互补决定区LCDR2的序列为：
LIYDASKLASGV(SEQ ID NO:14)。
轻链互补决定区LCDR3的序列为：
IGHFYTSINSVTF(SEQ ID NO:15)。
重链全长序列如下：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIGCISIDDNSNTYYASWAKGRVTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGPGIIFYNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:16)。
重链可变区的序列如下：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIGCISIDDNSNTYYASWAKGRVTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGPGIIFYNLWGPGTLVTVSS(SEQ IDNO:17)。
重链互补决定区LCDR1的序列为：
FSFSSSYWIC(SEQ ID NO:18)。
重链互补决定区LCDR2的序列为：
WIGCISIDDNSNTYYASWAK(SEQ ID NO:19)。
重链互补决定区LCDR3的序列为：
YFCARGPGIIFYNL(SEQ ID NO:20)。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供重组人CALR融合蛋白的体外表达制备方法，包括如下步骤：
从NCBI下载人CALR基因全长序列(NP_004334.1)，调取18～203aa对应的序列，设计引物并引入酶切位点EcoRI和XhoI，其中引物序列为：
F:GAATTCGAGCCTGCCGTCTACTTCAAG；
R:CTCGAGCAGGAAGTCCCAATCGTCTTC。
以人cDNA为模板，通过上述引物进行PCR扩增，扩增体系和程序如下：
反应体系：
扩增程序为：
98℃，30s；35×(98℃，10s+55℃，30s+72℃，30s)；72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳后，选择目标片段进行凝胶切割和回收，获得目的PCR产物；将目的PCR产物和载体pGEX-4T-1分别进行双酶切，凝胶电泳后切胶回收得到粘性端的DNA片段；将酶切后的DNA片段和载体通过T4连接酶进行连接；将连接的靶片段转化到感受态大肠杆菌中，并在LB平板上培养过夜。挑取平板上的单斑至LB培养基中摇瓶培养过夜，取菌液进行PCR验证，验证合格后取相应的菌液进行测序，测序正确后保存种子。
取验证合格的菌液进行扩大培养过夜，离心得到上清；培养上清通过固定金属离子亲和层析(IMAC)的方法纯化，经验证，得到的重组人CALR融合蛋白的纯度在90％以上。
实施例2
本实施例提供针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
以实施例1制备的重组人CALR融合蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，再用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
将血清效价高的兔子脾脏置于含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RMPI基础培养基中，用手术刀片切为碎块后转移到100μm的细胞筛网中研磨。将所得细胞悬浊液滤去大的细胞团块和组织包膜，在400g条件下离心5分钟，去上清，保留脾脏细胞团。脾脏细胞团用低渗溶液重悬，并裂解红细胞后再次于400g条件下离心5分钟，保留脾脏细胞。脾脏细胞用100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的RMPI基础培养基重悬，400g条件下离心5分钟，所得脾脏细胞再用完全培养基(含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mLl链霉素的RMPI基础培养基)重悬备用。
再从获取的脾脏细胞中进行B淋巴细胞分选，方法参见专利文献201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞上清。
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆，具体步骤为：使用重组人CALR融合蛋白包被96孔板过夜；加入培养后的B细胞上清，37℃孵育1h；洗板3次后，加入HRP标记的Goat anti Rabbit IgG二抗，37℃孵育1h；洗板3次后，加入100μLTMB显色液，37℃孵育15min；加入终止液，酶标仪检测OD450nm和OD630nm波长下吸光度，以OD值>0.7以上鉴定为阳性克隆。通过以上方法鉴定出阳性克隆8个，克隆号为1B11、2D12、2G2、3B3、4E3、4G3、5C11、7H2。最终通过后续试验筛选得到配对效果优异的2G2和3B3。
收集阳性克隆的细胞，使用裂解液裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体的轻、重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列，2G2抗体和3B3抗体的序列比对参见图1。
其中，2G2抗体基因序列为：
2G2-FL轻链基因序列为：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGCCTGCTCCTGCTCTGGTTGCCCGGTGCAACATTCGCCCAAGTTCTGACGCAGACTCCCAGTTCAACATCAGCAGCCGTTGGGGGTACCGTGACCATCAACTGTCAGGCGAGTGAAAGCGTGTATGGCAATAATAGATTGGCATGGTACCAACAAAAGCCTGGACAGCCGCCAAAGCGGTTGATCTACGATGCTAGCACGCTGGCCTCTGGAGTGCCTTCCAGATTTAGTGGATCCGGTTCCGGCAAGCAATTCACATTGACGATGTCTGGAGTGCAGTGCGATGATGCAGCTACATACTATTGTATTGGTCACTTTTACTCAGGGATAAACAGCATTTCTTTCGGAGGCGGGACTGAGGTCGTGGTCAAAGGTGACCCGGTGGCACCCACAGTCCTGATTTTTCCCCCAGCCGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG。
2G2-VL轻链可变区的基因序列为：
GGCCTGCTCCTGCTCTGGTTGCCCGGTGCAACATTCGCCCAAGTTCTGACGCAGACTCCCAGTTCAACATCAGCAGCCGTTGGGGGTACCGTGACCATCAACTGTCAGGCGAGTGAAAGCGTGTATGGCAATAATAGATTGGCATGGTACCAACAAAAGCCTGGACAGCCGCCAAAGCGGTTGATCTACGATGCTAGCACGCTGGCCTCTGGAGTGCCTTCCAGATTTAGTGGATCCGGTTCCGGCAAGCAATTCACATTGACGATGTCTGGAGTGCAGTGCGATGATGCAGCTACATACTATTGTATTGGTCACTTTTACTCAGGGATAAACAGCATTTCTTTCGGAGGCGGGACTGAGGTCGTGGTCAAAGGTGACCCGGTGGCACCCACAGTCCTGATTTTTCCCCCAGCC。
2G2-FH重链链基因序列为：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTTGCAGTTCTGAAGGGGGTCCAATGCCAAGAACAGCTCGAGGAAAGCGGTGGGGGGTTGGTGCAGCCTGAGGGGAGCCTGACCCTGACGTGTACGGCAAGTGGTTTCTCTATCAATAATAACTACTGGATCTGTTGGGTGAGACAAGCCCCTGGGAAGGGCCTCGAATGGGTTGGTTGTATCTCTATTGCCGACAATTCTAATACATACTATGCAACATGGGCAAAAGGCCGCGTCACAATCTCTAAGACCAGTAGCACTACAGTCACCCTGCAAATGACCTCTTTGACAGCAGCCGATACTGCAACATATTTTTGTGCCAGGGGACCTGCGGTCATTTCTTTTAATCTGTGGGGACCGGGGACGCTGGTGACCGTTTCCAGCGGGCAACCAAAGGCGCCATCAGTCTTTCCTCTCGCGCCTTGCTGTGGCGACACTCCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA。
2G2-VH重链可变区的基因序列为：
GTTGCAGTTCTGAAGGGGGTCCAATGCCAAGAACAGCTCGAGGAAAGCGGTGGGGGGTTGGTGCAGCCTGAGGGGAGCCTGACCCTGACGTGTACGGCAAGTGGTTTCTCTATCAATAATAACTACTGGATCTGTTGGGTGAGACAAGCCCCTGGGAAGGGCCTCGAATGGGTTGGTTGTATCTCTATTGCCGACAATTCTAATACATACTATGCAACATGGGCAAAAGGCCGCGTCACAATCTCTAAGACCAGTAGCACTACAGTCACCCTGCAAATGACCTCTTTGACAGCAGCCGATACTGCAACATATTTTTGTGCCAGGGGACCTGCGGTCATTTCTTTTAATCTGTGGGGACCGGGGACGCTGGTGACCGTTTCCAGCGGGCAACCAAAGGCGCCATCAGTCTTTCCTCTCGCGCCTTGCTGTGGCGACACT。
其中，3B3抗体基因序列为：
3B3-FL的轻链基因序列为：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGACTCTTGCTCCTCTGGCTGCCAGGCGCCACATTTGCACAGGTTCTCACACAAACACCGAGCAGCACGTCTGCGGCCGTGGGGGGCACGGTGACGATAAACTGCCAGGCGTCTGAAAGCGTTTACAATAACAACCGCCTCGCATGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCTCCTAAACGCCTCATTTATGACGCGAGTAAACTGGCCTCTGGGGTTCCCTCAAGATTCAAGGGTTCTGGTAGTGGAAAGCAGTTCACCTTGACGATGAGTGGTGTCCAATGCGACGACGCAGCAACCTACTACTGCATTGGGCACTTTTATACCAGCATCAACAGCGTTACTTTTGGTGGCGGGACCGAAGTTGTTGTTAAAGGAGATCCCGTTGCGCCTACAGTCTTGATCTTTCCTCCGGCCGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG。
3B3-VL的轻链可变区基因序列为：
GGACTCTTGCTCCTCTGGCTGCCAGGCGCCACATTTGCACAGGTTCTCACACAAACACCGAGCAGCACGTCTGCGGCCGTGGGGGGCACGGTGACGATAAACTGCCAGGCGTCTGAAAGCGTTTACAATAACAACCGCCTCGCATGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCTCCTAAACGCCTCATTTATGACGCGAGTAAACTGGCCTCTGGGGTTCCCTCAAGATTCAAGGGTTCTGGTAGTGGAAAGCAGTTCACCTTGACGATGAGTGGTGTCCAATGCGACGACGCAGCAACCTACTACTGCATTGGGCACTTTTATACCAGCATCAACAGCGTTACTTTTGGTGGCGGGACCGAAGTTGTTGTTAAAGGAGATCCCGTTGCGCCTACAGTCTTGATCTTTCCTCCGGCC。
3B3-FH的重链基因序列为：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCAGTTTTGAAAGGAGTCCAATGCCAGAGTCTGGAAGAGAGTGGTGGTGGCTTGGTCCAACCTGAGGGGAGCTTGACATTGACATGCACCGCGTCCGGCTTTAGTTTCTCTAGTTCTTATTGGATCTGTTGGGTTCGGCAAGCACCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTGTATAAGCATTGACGATAACAGTAATACTTACTACGCGTCTTGGGCTAAAGGCCGCGTCACCATTAGCAAAACATCTTCCACGACTGTTACGCTCCAGATGACCTCACTGACAGCCGCTGACACTGCGACTTACTTTTGCGCGAGAGGCCCTGGCATCATATTCTATAACTTGTGGGGTCCAGGGACCCTGGTTACGGTTTCCTCTGGACAACCAAAAGCGCCCAGTGTTTTTCCCTTGGCTCCTTGTTGTGGGGATACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA。
3B3-VH的重链可变区基因序列为：
GTCGCAGTTTTGAAAGGAGTCCAATGCCAGAGTCTGGAAGAGAGTGGTGGTGGCTTGGTCCAACCTGAGGGGAGCTTGACATTGACATGCACCGCGTCCGGCTTTAGTTTCTCTAGTTCTTATTGGATCTGTTGGGTTCGGCAAGCACCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTGTATAAGCATTGACGATAACAGTAATACTTACTACGCGTCTTGGGCTAAAGGCCGCGTCACCATTAGCAAAACATCTTCCACGACTGTTACGCTCCAGATGACCTCACTGACAGCCGCTGACACTGCGACTTACTTTTGCGCGAGAGGCCCTGGCATCATATTCTATAACTTGTGGGGTCCAGGGACCCTGGTTACGGTTTCCTCTGGACAACCAAAAGCGCCCAGTGTTTTTCCCTTGGCTCCTTGTTGTGGGGATACA。
进一步将兔单克隆抗体2G2和3B3重链、轻链基因分别装载在表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体见图2。其中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promoter为转录启动子，SV 40PAterminator是加尾信号，Heavy chain constant(图2a)和Light chain constant(图2b)分别为兔的重链不变区和轻链不变区序列。
将含兔重链不变区和轻链不变区序列的哺乳动物表达质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，采用同源重组的方式分别将重链可变区和轻链可变区基因连接到相应的哺乳动物表达载体上，并经测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
将质粒转染293F细胞；转染72～96小时后收取培养上清；通过亲和层析的方法纯化出重组的识别人CALR蛋白的兔单克隆抗体2G2和3B3，抗体鉴定后分装，于-20℃低温保存备用。
实施例3
本实施例针对制备获得的兔单克隆抗体2G2和3B3进行抗体亲和力测试和抗原识别表位测试。
利用GE公司的Biacore 3000生物分子相互作用分析仪对实施例2制备的兔单克隆抗体2G2和3B3分别进行亲和力进行精确测定，测试结果见图3。
通过亲和力曲线拟合和计算，兔单克隆抗体2G2针对重组人CALR蛋白(实施例1制备)的亲和力为4.88×10-9M，兔单克隆抗体3B3针对重组人CALR蛋白(实施例1制备)的亲和力4.34×10-9M。
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对实施例2制备的兔单克隆抗体2G2和3B3的抗原识别表位进行鉴定，测试结果见图4。
采用的兔抗人CALR单克隆抗体2G2和3B3的浓度分别为500nM和300nM，重组人CALR蛋白(实施例1制备)的浓度为100nM。通过分析两种抗体之间的配对数据可知，兔单克隆抗体2G2结合重组人CALR蛋白结合后，兔单克隆抗体3B3仍能够结合重组人CALR蛋白，证明兔单克隆抗体2G2和3B3结合在CALR蛋白表面不同的部位，且相互不干扰。
实施例4
本实施例基于兔单克隆抗体2G2和3B3建立双抗夹心法酶联免疫检测方法，包括如下步骤：
1)包被：将兔单克隆抗体2G2(捕获抗体，实施例2制备)用1×PBS缓冲液稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h。
2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
3)封闭：将封闭液(5％BSA)以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用。
4)加蛋白：将人CALR(实施例1制备)用稀释液(1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)稀释，稀释浓度：200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0ng/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
6)加检测抗体：将经生物素标记的兔单克隆抗体3B3(检测抗体)稀释成0.083μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。
7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
8)加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
10)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
11)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL草酸终止液，然后分别于450nm和630nm下测定吸光值，OD450nm减去OD630nm为校正后的吸光值。
统计结果绘制的线性曲线见图5。
由上述试验结果可以出，基于兔单克隆抗体对2G2和3B3建立针对针人钙网蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为第一兔单克隆抗体或第二兔单克隆抗体；
所述第一兔单克隆抗体的轻链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示，重链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10所示；
所述第二兔单克隆抗体的轻链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15所示，重链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一兔单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示；和/或
所述第一兔单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一兔单克隆抗体的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示；和/或
所述第一兔单克隆抗体的重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第二兔单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示；和/或
所述第二兔单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。
5.根据权利要求4所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第二兔单克隆抗体的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示；和/或
所述第二兔单克隆抗体的重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。
6.如权利要求1至5任一项所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体在制备检测人钙网蛋白的试剂或者试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人钙网蛋白，所述第一兔单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二兔单克隆抗体用作标记抗体。
8.一种检测人钙网蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至5任一项所述的针对人钙网蛋白的第一兔单克隆抗体和第二兔单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的检测人钙网蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述人钙网蛋白选自重组人钙网蛋白、细胞分泌的人钙网蛋白中的至少一种。
10.一种权利要求1至5任一项所述的针对人钙网蛋白兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1至5任一项所述的针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；
培养获得包含第一兔单克隆抗体和第二兔单克隆抗体的上清液；
纯化，即得。
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