CN116925230B - 一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段及其应用，涉及生物工程技术领域。该抗体及其抗原结合片段与PLA2R具有较高的亲和力，可以特异性结合PLA2R蛋白，且能靶向PLA2R 的包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的片段。因此，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；也可用于开发膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段及其应用。
背景技术
膜性肾病（membranous nephropathy, MN）即膜性肾小球肾炎，具体是指免疫复合物在肾小球毛细血管中过度沉积导致的肾病综合征，是成人肾病综合征中最常见的病理类型之一。临床上MN主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症。
根据病因的不同，MN可分为特发性膜性肾病(idiopathic membranousnephropathy, IMN)与继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy, SMN)。其中，IMN是MN的主要类型，占比约70%～80%，其病因尚不明确，又名原发性膜性肾病（primarymembranous nephropathy, PMN）。大多数学者认为PMN是一种抗体介导的自身免疫性肾小球疾病，位于足细胞的靶抗原被自身抗体识别，并与之结合形成免疫复合物沉积于基底膜足细胞下，激活补体系统引起足细胞损伤脱落，导致基底膜通透性增加，进而出现大量蛋白尿。
2009年Beck等首次报道磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor, PLA2R)是导致PMN发生的主要抗原之一，在70%的PMN患者血液和肾组织洗脱液中可检测出抗磷脂酶A2受体抗体(phospholipase-A2 receptor antibody, PLA2R-Ab)，这引起了医学界对PLA2R的广泛关注。PLA2R-Ab能够特异性地与肾脏组织中足细胞上的靶抗原(即PLA2R)结合，可在70%～80%的PMN患者血清中表达(Bobart SA, De Vriese AS, Pawar AS, et al.Kidney Int. 2019; 95(2): 429-438)，而在健康人群、SMN及其他肾小球疾病患者的血清中PLA2R-Ab抗体阳性表达率极低，故PLA2R-Ab诊断MN的特异性较高。最新的一项Meta分析显示(练明建, 卢榕, 张加勤, 等. 临床检验杂志, 2017, 35 (7)：545-549)，血清PLA2R-Ab检测对诊断PMN的总敏感度为69%，总特异度为97%，进一步说明血清PLA2R-Ab对PMN有较好的敏感性和很高的特异性，可以作为诊断PMN的特异性生物标志物。
PLA2R由多个结构域构成（图1），研究显示导致PLA2R-Ab产生的结构域主要包括CysR, FnII, CTLD1这三个结构域（Liyo Kao, Vinson Lam, et al. J Am Soc Nephrol.2015 Feb; 26(2): 291-301）。因此，靶向这三个结构域的单克隆抗体对于PLA2R型膜性肾病的细胞及动物模型建立、机制研究、诊断以及药物开发具有重要意义。然而，目前没有商品化小鼠单克隆抗体可靶向这三个结构域。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段以解决上述技术问题。本发明提供的抗人PLA2R单克隆抗体可靶向PLA2R 的包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的片段，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域。本发明还提供了编码抗人PLA2R抗体及其抗原结合片段的核酸分子、重组载体及该抗体在PLA2R蛋白检测方法或产品中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区；
重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3-5所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
轻链互补决定区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的CDR-L1、氨基酸序列为WAS的CDR-L2和氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的CDR-L3。
CDR-H1的氨基酸序列SEQ ID NO.3为GYSFTGYY；
CDR-H2的氨基酸序列SEQ ID NO.4为FNPYNGAT；
CDR-H3的氨基酸序列SEQ ID NO.5为AKEGPYYGNYGYFDY；
CDR-L1的氨基酸序列SEQ ID NO.6为QSLLNSRTRKNY；
CDR-L2的氨基酸序列为WAS；
CDR-L3的氨基酸序列SEQ ID NO.7为KQSYNLYT。
经过筛选，发现具有特定重链互补决定区和轻链互补决定区的抗体及其抗原结合片段与PLA2R具有较高的亲和力，可以特异性结合PLA2R蛋白，且能靶向PLA2R 的包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的片段。因此，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；也可用于开发膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品。
本发明中，“PLA2R”，“磷脂酶A2受体”均为指代相同的含义。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体及其抗原结合片段还包括重链骨架区和/或轻链骨架区，重链骨架区包括依次如SEQ ID NO.17-20所示的FR-VH1、FR-VH2、FR-VH3和FR-VH4；和/或；轻链骨架区包括依次如SEQ ID NO.21-24所示的FR-VL1、FR-VL2、FR-VL3和FR-VL4。
其重链可变区+重链骨架区的结构为：
FR-VH1-CDR1-FR-VH2-CDR2-FR-VH3-CDR3-FR-VH4。
其轻链可变区+轻链骨架区的结构为：
FR-VL1-CDR1-FR-VL2-CDR2-FR-VL3-CDR3-FR-VL4。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗原结合片段选自抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。
上述抗原结合片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性，选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的抗原结合片段。
上述抗体或抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体选自多特异性抗体、融合型抗体和嵌合抗体中的至少一种。在其他实施方式中，上述抗体选自一种单克隆抗体。
名词解释：
多特异性抗体是识别不同表位的单克隆抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单独的一种单克隆抗体具有更高的抗原识别能力。
融合型抗体：本发明提供的抗体或其抗原结合片段很容易通过基因工程技术与其他结构（如BSA、IgG-Fc等）结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，抗体与其靶抗原定向结合，与抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将抗体和寿命较长的分子融合在一起，可以提高抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
本发明所述的“嵌合抗体”包括不限于将人源性抗体的可变区与人抗体（或其他来源的抗体）的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。在其他实施方式，也可根据需要将不同来源或不同类型的恒定区进行自适应重组或优化。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，恒定区的包括轻链恒定区和重链恒定区，轻链恒定区的类型为κ型或λ型轻链恒定区；重链恒定区的类型为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE重链恒定区。
IgG选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的重链恒定区。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
在本发明应用较佳的实施方式中，轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。
进一步地，上述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明还提供了抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段在制备PLA2R检测产品中的应用；
PLA2R检测产品选自试剂、试剂盒或芯片；
检测产品包括抗体或其抗原结合片段，且抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物。
在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括载体，且载体带有抗体或其抗原结合片段；在本发明应用较佳的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。
载体与抗体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。
在其他实施方式中，多孔材料选自ELISA板或其他的固相支持物。
例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。
乳胶微球是由无定形聚合物（通常是聚苯乙烯）形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5µm的颗粒，或者粒径超过1µm的颗粒。
乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。
在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、阳性对照、清洗液。
在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素（FAM）、四氯光素（TET）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等或其类似物）、Cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物）、Alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（preCP）等）。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。
胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
第三方面，本发明还提供了抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段在制备膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品中的应用，膜性肾病的检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测的标志物为PLA2R；
膜性肾病为原发性膜性肾病或继发性膜性肾病。
通过检测目标样本的血液或血清PLA2R的水平，可以诊断目标样本是否患有膜性肾病或评估膜性肾病风险，也可为膜性肾病的不良预后提供参考。
此外，PLA2R变化也可了解患者病情进展状态。治疗后病人血液中PLA2R浓度的下降预示着治疗的成功，而浓度上升提示膜性肾病的残留或复发。因此，本发明提供的抗PLA2R的抗体可以用于膜性肾病的疗效评估或复发监测。
膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品选自试剂、试剂盒或芯片；
膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品包括抗体或其抗原结合片段，且抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物。
在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括载体，且载体带有抗体或其抗原结合片段；在本发明应用较佳的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。
载体与抗体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。
在其他实施方式中，多孔材料选自ELISA板或其他的固相支持物。
例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。
乳胶微球是由无定形聚合物（通常是聚苯乙烯）形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5µm的颗粒，或者粒径超过1µm的颗粒。
乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。
在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、阳性对照、清洗液。
在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
第四方面，本发明还提供了一种检测试剂或试剂盒，其包括抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段。
第五方面，本发明还提供了含有抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
免疫偶联缀合物例如选自抗体-药物缀合物，将抗体与具有特定接头的药物进行反应制得相应的抗体-药物缀合物。本领域的技术人员可以根据工程化抗体使得抗体上的某个位点作为药物缀合位点，这均在本发明的保护范围内。
双特异性分子例如选自双特异性抗体。
嵌和抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
第六方面，本发明还提供了一种载体，其包括核酸分子，核酸分子编码上述的抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段。
核酸分子包括如SEQ ID No .8所示的DNA序列，用于编码抗人PLA2R抗体的重链；以及如SEQ ID No .9所示的DNA序列用于编码抗人PLA2R抗体的轻链。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接（如包装成病毒）导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。
第七方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括上述的载体。
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
第八方面，本发明还提供了一种抗人PLA2R的抗体或其抗原结合片段在检测表达PLA2R的细胞模型中人PLA2R水平或药物活性检测中的用途，用途以非诊断和治疗为目的。
药物活性检测包括构建稳定表达人PLA2R或表达包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的膜蛋白的细胞，以抗人PLA2R抗体引发抗体诱导的细胞杀伤作用（包括CDC、ADCC、ADCP）以建立细胞损伤模型，检测药物对这一杀伤作用的抑制，以此作为定量活性检测以及药物质量控制的方法。本发明提供的抗人PLA2R抗体可有两方面的用途，一是确定稳定表达人PLA2R或表达包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的膜蛋白的细胞成功建立，并检测表达水平。二是引发抗体诱导的细胞杀伤作用以建立损伤模型。
本发明具有以下有益效果：
经过筛选，发现具有特定重链互补决定区和轻链互补决定区的抗体及其抗原结合片段与PLA2R具有较高的亲和力，可以特异性结合PLA2R蛋白，且能靶向PLA2R 的包含CysR、FnII、CTLD1这三个结构域的片段。因此，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；也可用于开发膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为PLA2R的结构示意图。
图2为本发明实施例1中表达框架的结构示意图。
图3为本发明实施例2中CC1H SDS-PAGE分析；泳道1（图中标识M）: 分子量参照；泳道2（图中标识CC1h-非还原）: 纯化CC1H非还原；泳道3（图中标识CC1h-还原）: 纯化CC1H还原。
图4为本发明实施例3中抗体的SDS-PAGE鉴定图；泳道1（图中标识M）: marker；泳道2（图中标识1）: 抗体非还原；泳道3（图中标识2）:抗体还原。
图5为本发明实施例4中鼠抗人单抗拟合曲线。
图6为本发明实施例5中Bradford法测定的蛋白标准曲线图（y = 0.6849x +0.6325，R² = 0.9925）。
图7为本发明实施例5中SDS-PAGE检测CC1H-Biotin的纯化效果图，泳道1为marker；泳道2图中标识1：含DTT的还原上样缓冲液的CC1H-Biotin；泳道3图中标识2：非还原上样缓冲液的CC1H-Biotin。
图8为本发明实施例5中不同浓度鼠抗人实测或拟合曲线。
图9为本发明实施例6中为表达膜蛋白mCC1的质粒图谱。
图10为本发明实施例6中表达膜蛋白mCC2的质粒图谱。
图11为本发明实施例6中CC1H、mCC1、mCC2、质粒HEK293电泳图；泳道1（图中标识M）: marker；泳道2: CC1H；泳道3: mCC2；泳道4： mCC1；泳道5：质粒HEK293。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了PLA2R主要抗原区重组蛋白的构建方法
质粒载体采用的是pcDNA3.4瞬时表达载体，该载体包含原生的全长CMV启动子和克隆位点下游的WPRE元件，基于CMV启动子的载体通常对CHO细胞瞬时表达系统具有良好的表达水平，WPRE元件位于多克隆位点下游，可以有效提高基因的转录和表达，在大肠杆菌中，具有氨苄抗性基因。然后，利用PCR技术扩增载体基因pcDNA3.4，与目的基因（gene ofinterest）和信号肽（signal peptide）相连的基因序列进行连接。PCR模板经过基因合成得到，通过同源重组试剂盒将pcDNA3.4载体片段和合成基因连接（目的基因和信号肽序列连接后所得基因片段简称合成基因），DH5α感受态转化得到单克隆，将单克隆扩增后进行测序，经测序确认后，提取质粒得到合成基因重组表达质粒。其中，合成基因克隆于质粒pcDNA3.4的CMV promoter和WPRE基因之间，具体参见图2。
其中，信号肽的氨基酸序列（SEQ ID NO.10）为：
MLLSPSLLLLLLLGAPRGCA；
信号肽的核苷酸序列（SEQ ID NO.11）为：
ATGCTGCTGTCGCCGTCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGCGCCGCGGGGCTGCGCC。
PLA2R的结构示意图如图1所示，其中，目的基因为PLA2R全长蛋白序列（UniProt序列登录号：Q13018）的21至367（Glu）氨基酸序列对应的基因序列）。构建的瞬时表达质粒命名为pcDNA3.4-CC1H。
合成基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，合成基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
实施例2
本实施例针对实施例1的瞬时表达质粒pcDNA3.4-CC1H进行CC1H的瞬时表达、纯化与鉴定。
（1）CC1H的瞬时表达
转染前约24小时，取FreeStyle™ CHO-S®细胞（细胞密度为5-6×105/mL，来自于美国Gibco公司FreeStyle™ MAX CHO 表达系统，货号：K900020），在37°C、5% CO2和120-135 rpm条件下培养。
转染当日，稀释细胞至细胞密度为1×106/mL，每个摇瓶中加入10 mL细胞（细胞的存活率在95%以上）。
轻轻混合FreeStyle™ MAX Reagent几次，注意不能漩涡震荡。
取pcDNA3.4-CC1H 12.5 μg，加入OptiPRO™ SFM至总体积0.2 mL并轻轻混合。
取12.5 μL的FreeStyle™ MAX Reagent，加入Opti-Pro™ SFM至总体积0.2 mL，轻轻混合。混合均匀后加入质粒混合液中，轻轻混合以获得0.4 mL DNA-FreeStyle™ MAX混合物，并在室温下孵育10分钟，使复合物形成。
慢慢将上述0.4 mL DNA-FreeStyle™ MAX复合物加入到细胞中，同时缓慢旋转摇瓶。
在37°C、5% CO2，120-135 rpm培养细胞，不需要更换或补充培养基，7天后收取细胞培养上清。
（2）CC1H的纯化与鉴定
样品：步骤（1）中的细胞培养上清25 mL。样品4℃，7000 rpm离心10 min，过0.22 μm针头滤器。上Ni sepharose 6FF柱，2 mL/min。用20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑，pH6.8洗平。5倍柱体积0-100% 20mM磷酸缓冲液，1M NaCl，500mM咪唑，pH6.8洗脱。部分收集2 mL/管。
将洗脱峰30 kD超滤离心管中超滤3遍，溶液更换为50mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4。采用Bradford法定量。测得CC1H的表达量为37mg/L。CC1H重组蛋白的蛋白大小如表1。
表1：CC1H重组蛋白的分子量
对CC1H进行SDS-PAGE分析，分析结果如图3所示，可见CC1H蛋白分子量大小正确、没有杂带，蛋白较纯。
实施例3
将实施例纯化的CC1H蛋白免疫小鼠，筛选获得单克隆抗体，并测序。
免疫小鼠，杂交瘤筛选及测序由北京义翘神州科技股份有限公司完成。
具体以抗原CC1H免疫 5 只小鼠。包被抗原CC1H，进行血清效价 ELISA 检测，血清稀释倍数为 8000 和 16000。血清效价 ELISA 检测合格后进行融合。
根据血清效价结果，选取最优的 1 只小鼠进行杂交瘤融合筛选及有限稀释，取免疫后小鼠脾细胞，按 1：1 比例与 SP2/0 骨髓瘤细胞混合，利用电融合法进行融合，获得杂交瘤细胞。全脾铺板，使用免疫原作为筛选抗原，用间接ELISA 法测定细胞上清液，选取与免疫原结合的阳性孔作为阳性主克隆，通过有限稀释进行亚克隆化，直至得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得阳性杂交瘤细胞，进行细胞冻存及培养抗体生产。
将筛选获得的阳性克隆进行适当规模的杂交瘤细胞培养，收获上清后用ProteinA纯化获得0.1-0.5mg 抗体，抗体进行 UV、SDS-PAGE（图4） 鉴定。
将阳性杂交瘤细胞测序获得鼠单抗序列。
表2：鼠单抗蛋白的分子量
鼠单抗氨基酸序列如下：
重链SEQ ID NO.1所示，轻链SEQ ID NO.2所示。
其中，重链包括互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链包括互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
CDR-H1的氨基酸序列SEQ ID NO.3为GYSFTGYY；
CDR-H2的氨基酸序列SEQ ID NO.4为FNPYNGAT；
CDR-H3的氨基酸序列SEQ IDNO.5为AKEGPYYGNYGYFDY；
CDR-L1的氨基酸序列SEQ ID NO.6为QSLLNSRTRKNY；
CDR-L2的氨基酸序列为WAS；
CDR-L3的氨基酸序列SEQ ID NO.7为KQSYNLYT。
FR-VH1的氨基酸序列SEQ ID NO.17 为EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS；
FR-VH2的氨基酸序列SEQ ID NO.18 为MHWVRQSHVKSLEWIGR；
FR-VH3的氨基酸序列SEQ ID NO.19 为NYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYC；
FR-VH4的氨基酸序列SEQ ID NO.20 为WGQGTTLTVSS；
FR-VL1的氨基酸序列SEQ ID NO.21 为DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSS；
FR-VL2的氨基酸序列SEQ ID NO.22 为LAWYQQKPGQFPKLLIY；
FR-VL3的氨基酸序列SEQ ID NO.23 为TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFC；
FR-VL4的氨基酸序列SEQ ID NO.24为FGGGTKLEIK。
对单克隆抗体基因测序，得到该鼠单抗DNA序列如下：
重链SEQ ID NO.8所示，轻链SEQ ID NO.9所示。
实施例 4
用ELISA检测实施例3筛选获得的抗体与人PLA2R CC1H的结合效果。
除特殊说明外，本实施例的试剂来自索莱宝。
10 μg/mL CC1H铺板，加入梯度稀释的鼠抗人PLA2R单抗（实施例3制备），加羊抗鼠HRP二抗，显色检测；
[1]100 μL/孔含10 μg/mL CC1H包被液封板，4℃过夜；
[2]弃液，用PBST洗板，洗板机洗4轮，甩板机甩干，拍板；
[3]加入100 μL/孔封闭液，37℃温育60 min；
[4]弃液，加入100 μL/孔鼠抗人PLA2R单抗（PBST稀释），封板，室温温育30 min；
[5]重复[2]洗板；
[6]每孔加入100 μL检测抗体（EASYBIO，BE0102，1：2000用PBST稀释），封板，室温温育30 min；
[7]重复[2]洗板；
[8]每孔加入100 μL TMB底物显色液，25℃避光温育5 min后，每孔加入100 μL终止液，测OD450。
通过测量值绘制鼠抗人单抗拟合曲线，参照图5所示。
ELISA 实验结果表明，实施例3制备得到的纯化抗体与免疫原 ELISA 结合阳性。
实施例5
本实施例针对实施例3筛选出的抗体进行与CC1H相互作用的动力学、热力学分析。
利用基于生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry，BLI）的赛多利斯（Sartorius） Octet ® N1分子相互作用仪，检测鼠抗人PLA2R单抗与生物素（Biotin）标记的CC1H相互作用的结合常数（Ka）、解离常数（Kd）和亲和力常数（KD）。
具体实验步骤如下：
（1）CC1H的Biotin标记
纯化好的CC1H蛋白使用 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin （Thermo Scientific，21335）试剂盒进行生物素（Biotin）标记：
将试剂盒平衡至室温；然后现制10 mM生物素试剂溶液。每0.5 mg生物素试剂，加入无菌双蒸水90 µL充分溶解；向CC1H蛋白质溶液中加入蛋白质20倍摩尔数的生物素试剂溶液；再将体系置于冰上孵育反应2小时，期间颠倒数次使之充分混匀。
（2）CC1H-Biotin的纯化
利用G-25预装填脱盐柱（博格隆，EG001），纯化生物素标记好的CC1H-Biotin：
按照表3配制pH 7.2的20 mM PBS缓冲液；
表3 PBS缓冲液配制表
平衡：用10 mL注射器抽取PBS缓冲液，每次都“滴对滴”的连接柱和注射器，防止气泡；然后剪除出口端；共过25 mL PBS缓冲液，5 mL/min（120滴/min）去除柱体中的乙醇，弃柱流出液。
上样：用3 mL注射器以5 mL/min上样1.5 mL（不足1.5 mL用PBS缓冲液补足），弃柱流出液；继续注射3 mL PBS缓冲液；共收集约2 mL。
柱清洗及保存：用10 mL注射器过25 mL PBS缓冲液，再过25 mL水，弃柱流出液；用10 mL注射器过25 mL 20%乙醇，4°C保存。
样品储存：收集的样品用0.2 µm孔径滤器抽滤除菌，分装保存。
（3） Bradfod法（碧云天，P0060）测CC1H-Biotin蛋白浓度：
蛋白标准（5 mg/ml BSA） 在完全融化并混匀后用PBS缓冲液稀释，配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/ml蛋白标准并充分混匀；
取5μL不同浓度蛋白标准加入96孔免疫板（Thermo Scientific，468667）的标准孔中；
取5μL样品到96孔免疫板的样品孔中（不足5μL加PBS缓冲液补足）；各孔加入250 μLG250染色液；用酶标仪测定A595；
根据标准曲线计算样品中的蛋白浓度，标准曲线如图6所示。其中y=0.6849x+0.6325，R²=0.9925。
经计算，CC1H-Biotin蛋白浓度为2.36 mg/mL。
（4）还原/非还原SDS-PAGE鉴定样品纯度、浓度：
通过还原/非还原SDS-PAGE鉴定样品纯度、浓度。其中，CC1H-Biotin的纯化效果如图7所示，其中从左到右的泳道依次为含DTT的还原上样缓冲液的CC1H-Biotin、非还原上样缓冲液的CC1H-Biotin。
CC1H-Biotin的分子量约41 KDa，纯度>98%。
（5）用Pierce™ Biotin Quantitation Kit （HABA assay）（Thermo Scientific™，28005）试剂盒检测生物素掺入水平：
将ABA/Avidin预混料平衡至室温；然后加100 μL超纯水到HABA/Avidin预混料管中，用枪头吹匀。
加160 μL PBS缓冲液至96孔免疫板（Thermo Scientific，468667）的孔中；再加20μL的HABA/Avidin预混溶液到含PBS缓冲液的孔中，震荡混匀后测A500。
加20 μL生物素化样品到含有HABA/Avidin的孔中，震荡混匀后再测A500保持恒定至少15秒。
据比尔定律计算生物素掺入水平。结果如表4所示。经计算，CC1H-Biotin的生物素掺入水平为1.80 mol Biotin/ mol protein。
表4生物素掺入水平
（6）CC1H-Biotin与实施例3筛选的鼠抗人PLA2R单抗的相互作用测定。
利用赛多利斯（Sartorius） Octet ® N1分子相互作用仪，选择SA传感器（Sartorius，Octet® Streptavidin（SA）Biosensor，18-5019）：
将传感器浸入PBSTB缓冲液（PBS缓冲液中加入0.02% 吐温-20和0.1% BSA）中预湿，>10 min，装载至分子相互作用仪上；
陆续将传感器浸入不同缓冲液中用5步法检测：
基线1（PBSTB缓冲液 300 μL，1 min）->固化（CC1H-biotin，20 μg/mL 300 μL，2min）->基线2（PBSTB缓冲液，3 min）->结合（用PBSTB缓冲液梯度稀释的鼠抗人PLA2R单抗300 μL，2 min）->解离（PBSTB缓冲液300 μL，5 min）；
绘制不同浓度鼠抗人实测或拟合曲线（图8）。
计算结合常数（Ka）、解离常数（Kd）和亲和力常数（KD），结果如表5所示。表5结果显示，CC1H-Biotin与鼠抗人PLA2R单抗具有高亲和力。
表5 CC1H-Biotin与鼠抗人PLA2R单抗的Ka、Kd、KD值
实施例6
采用western blot检测包含CysR, FnII, CTLD1这三个结构域的膜蛋白。
（1）构建质粒稳定表达包含CysR, FnII, CTLD1结构域的膜蛋白。
构建两种膜蛋白，mCC1蛋白编码区包括人PLA2R CysR, FnII, CTLD1结构域及跨膜区，即包括PLA2R全长蛋白序列（UniProt 序列登录号：Q13018）的1至367（Glu）氨基酸序列及PLA2R全长蛋白序列的1386至1463跨膜区氨基酸序列；mCC2蛋白编码区包括人PLA2RCysR, FnII, CTLD1, CTLD2结构域及跨膜区，即包括PLA2R全长蛋白序列（UniProt 序列登录号：Q13018）的1至510（Asp）氨基酸序列及PLA2R全长蛋白序列的1386至1463跨膜区氨基酸序列。
其中，表达膜蛋白mCC1的质粒图谱如图9，表达膜蛋白mCC2的质粒图谱如图10。
以pNEO为质粒载体
mCC1和mCC2信号肽（SEQ ID NO.14）；
Atgctgctgtcgccgtcgctgctgctgctgctgctgctgggggcgccgcggggctgcgcc。
mCC1序列（SEQ ID NO.15）：48.5kD。
编码mCC1序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
mCC2序列（SEQ ID NO.16）：65.0kD。
编码mCC2序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
（2）筛选稳定表达mCC1或mCC2的细胞株
HEK293细胞转染pNeo-mCC1或pNeo-mCC2，以G418（碧云天，ST081-1g）筛选至基本无漂浮细胞且细胞活力>95%。
（3）鼠抗人PLA2R单抗western blot检测mCC1或mCC2
稳定转染pNeo-mCC1或pNeo-mCC2的HEK293细胞，以及未转染的HEK293细胞以RIPA裂解液（生工，C500005-0050）裂解，进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜。常规western blot。抗体按照表6添加。
表6 抗体添加表
Western blot图（图11）显示CC1H, mCC1, mCC2泳道均在预期分子量位置出现条带，且阴性对照未转染质粒HEK293细胞泳道无条带，显示鼠抗人PLA2R单抗可用于包含CysR, FnII, CTLD1结构域的蛋白进行western blot检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区；
所述重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3-5所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述轻链互补决定区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的CDR-L1、氨基酸序列为WAS的CDR-L2和氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体及其抗原结合片段还包括重链骨架区和/或轻链骨架区，所述重链骨架区包括依次如SEQID NO.17-20所示的FR-VH1、FR-VH2、FR-VH3和FR-VH4；和/或；所述轻链骨架区包括依次如SEQ ID NO.21-24所示的FR-VL1、FR-VL2、FR-VL3和FR-VL4。
3.根据权利要求2所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区的类型为κ型或λ型轻链恒定区；所述重链恒定区的类型为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE重链恒定区。
5.根据权利要求4所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
6.根据权利要求4所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段在制备PLA2R检测产品中的应用；
所述PLA2R检测产品选自试剂、试剂盒或芯片；
所述检测产品包括所述抗体或其抗原结合片段，且所述抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物，所述应用以非诊断和治疗为目的。
8.如权利要求1-6任一项所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段在制备膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品中的应用，其特征在于，所述膜性肾病的检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测标志物为PLA2R；
所述膜性肾病为原发性膜性肾病。
9.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段。
10.一种载体，其特征在于，其包括核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段。
11.一种重组细胞，其特征在于，其包括权利要求10所述的载体。
12.一种如权利要求1-6任一项所述的抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段在检测表达PLA2R的细胞模型中人PLA2R水平或药物活性检测中的用途，其特征在于，所述用途以非诊断和治疗为目的，所述药物活性检测是检测：药物对抗人PLA2R的抗体引发抗体诱导的细胞杀伤作用的抑制活性。
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