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CN1772766A - 抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶单克隆抗体及其用途 Download PDF

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CN1772766A
CN1772766A CNA2004100681470A CN200410068147A CN1772766A CN 1772766 A CN1772766 A CN 1772766A CN A2004100681470 A CNA2004100681470 A CN A2004100681470A CN 200410068147 A CN200410068147 A CN 200410068147A CN 1772766 A CN1772766 A CN 1772766A
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Abstract

本发明在发现细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR－AChE)的基础上，以纯化的人AR－AChE为抗原，免疫小鼠，细胞融合，获得杂交瘤，尤其是获得表达分泌抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR－AChE)单克隆抗体及其杂交瘤细胞系ARA－M1，ARA－M5和ARA－M7，扩增生产抗体ARA－M1，ARA－M5和ARA－M7。这些抗体可用于抗肿瘤药物筛选，肿瘤病人化疗效果判断，制备诊断和/或治疗退行性神经疾病的药物，如AD的凋亡分析以及细胞凋亡的基础和临床研究和诊断，检测急性器官损害中细胞凋亡表达水平。本发明还提供了对AR－AChE进行半定量和/或定量分析的免疫测定法和试剂盒等。

Description

抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，AChE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶，属于糖蛋白。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut-H；et al：J-Clin-Invest.1990，86(3)：900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches to cholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。AChE以所在位置可分为神经肌肉型和红细胞型。按照分子结构可分为不同亚单位多聚体型(heteromeric class)和相同亚单位多聚体型(homomericclass)。不同亚单位多聚体型的催化亚单位与三螺旋胶原亚单位连接或与脂类连接。相同亚单位多聚体型又分为亲水性(hydrophilic)和亲脂性(glycophospholipid-linked)等亚型。红细胞膜上的AChE四聚体分子量约260KDa。AChE的功能，在胆碱能神经系统是水解神经递质乙酰胆碱，使之生成胆碱和乙酸。也有报道认为AChE具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性。近年来，由于体外培养的肿瘤细胞株中也检测到AChE mRNA的转录和在化疗后的卵巢癌患者的血清中检测到AChE活性，有作者认为AChE与肿瘤发生有关(Lev-Lehman-E，et al：Blood.1997，89(10)：3644-53)。
发明人首先发现哺乳动物细胞在凋亡过程中表达AChE(Zhang XJ，Yang L，Zhao Q，CaenJP，He HY，Jin QH，Guo LH，Alemany M，Zhang LY，Shi YF.，Induction ofAcetylcholinesterase Expression during Apoptosis in Various Cell Types. Cell Death and Differentiation 9(8)：790-800，2002.)，神经系统来源的细胞株(Yang L，Heng-Yi He，Xue-Jun Zhang Increased expression of intranuclear AChE involved in apoptosis ofSK-N-SH cells. Neuroscience research 42(4)：261-268，2002.)也有同样的现象。为了进一步研究AChE在凋亡中的作用，发明人建立了该酶的分离方法(“从哺乳类细胞中获得脑型AChE的方法”，已经授权。专利号：ZL 97 1 25216.5；Qi-Huang JIN，Yu-Fang SHI，Heng-YiHE，Kelvin KW Ng，Hua JIANG，Lei YANG，Zi-Qing JIANG and Xue-Jun Zhang Isolation ofAChE from Apoptotic Human Lung Fibroblast Cells by Antibody Affinity Chromatography.BioTechniques 33(4)：S92-S97，2002.)。由于该酶表达的细胞，出现的时间，执行的功能，翻译后修饰甚至mRNA的剪切(“一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-AChE)及基因编码序列”，申请号：01105781.5，申请日期，2001/3/23。)，完全不同于已经报道的神经肌肉型和红细胞型AChE，发明人将凋亡细胞表达的AChE称为细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)(Xue-Jun Zhang，Lei Yang，Qi-Huang Jin，Yu-Fang Shi*，Hua Jiang，Heng-YiHe，Kelvin NG and Zi-Qing Jiang.Various apoptotic mammalian cells expressapoptosis-related acetylcholinesterase(AR-AChE). Acta biochimica et biophysica sinica35(2)：pp213，2003.)。利用凋亡细胞表达AR-AChE的特点，发明人可以用检测该酶活性的方法筛选抗肿瘤药物(“抗肿瘤药物筛选方法”，CN 1186859已经授权。专利号：ZL 97125220.3)以及用作凋亡细胞标记。
针对神经肌肉型和红细胞型以及电鳐AChE，人们已经制备了多克隆抗体和单克隆抗体(polyclonal anti-AChE antibody(Institute of Pharmacology and Toxicology，Academyof Military Medical Sciences，Beijing，PR China)；Antibody to AChE(C-16)(catalognumber，sc-6430，Santa Cruz Biotechnology)is an affinity-purified goat anti-thecarboxy terminus of human acetylchol inesterase；AChE-antibody(BD Biosciences，SanJose，CA，USA))，其中识别神经肌肉型的抗体也能识别凋亡细胞表达的AchE(Zhang XJ，YangL，Zhao Q，Caen JP，He HY，Jin QH，Guo LH，Alemany M，Zhang LY，Shi YF，Inductionof Acetylchol inesterase Expression during Apoptosis in Various Cell Types. Cell Death and Differentiation 9(8)：790-800，2002.)。由于目前没有特异性针对AR-AChE的抗体(它不识别正常神经突触上的AChE)，要用免疫学方法，通过识别AChE去判断凋亡细胞还很困难。
发明人发现不表达AChE的细胞在细胞凋亡过程中大量表达AChE，主要集中到细胞核内，随着细胞核被形成凋亡小体，AChE就存在于凋亡小体内。发明人建立了用检测AChE活性的方法，识别凋亡细胞和判断化疗效果的方法(抗肿瘤药物筛选和临床化疗效果判断的方法，中国专利号97 1 25220.3)。由于活性检测，只能对蛋白质定性分析，而且，血清中有丁酰胆碱酯酶(BuChE)存在会干扰AChE的活性，影响AChE的活性检测。
如果有特异的抗AR-AChE的单克隆抗体，就可以从各种类型的AChE中区分出AR-AChE。有了这个特异性，就可以用来识别凋亡细胞，凋亡现象，用于基础研究，老年痴呆症(AD)的理论和临床研究，AD辅助诊断和治疗；化疗效果的判断等等，并可进行半定量和定量分析。因此有必要研制出特异的抗AR-AChE的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)的单克隆抗体及产生这种抗体的小鼠杂交瘤细胞系。
本发明的另一目的是提供抗AR-AChE的单克隆抗体的用途，本发明抗体可以用于测定细胞凋亡时AR-AChE的活性和表达量。进一步的，本抗体可以制备成试剂盒，筛选抗肿瘤药物，测定抗肿瘤药物治疗的效果，辅助诊断AD等神经退行性疾病，以及检测急性器官损害中细胞凋亡表达水平，为医生提供病人发病与愈后的参考数据。
本发明的再一目的是提供一种筛选抗肿瘤化疗药物的方法和检测细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的免疫测定法。
本发明的第一方面提供了一种单克隆抗体，所述抗体特异性识别细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶。
优选的，上述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCCNO：-C200415的小鼠杂交瘤细胞系分泌。
上述单克隆抗体包括人源化抗体。优选的，上述抗体是包括非人可变区和人的轻链和重链恒定区的一种嵌合单克隆抗体。
本发明的第二方面提供了一种杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系产生上述单克隆抗体。较佳的，上述杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系。优选的，上述杂交瘤细胞系为保藏号CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCC NO：-C200415的小鼠杂交瘤细胞系。本发明还提供了上述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。
本发明的第三方面提供了一种免疫测定法，所述方法是用至少一种上述单克隆抗体进行的。上述免疫测定法中的标本是血液，组织或脑脊液，优选血液上清。上述免疫测定法可使用ELISA技术或免疫层析技术进行。优选的，上述单克隆抗体为保藏号CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCC NO：-C200415的小鼠杂交瘤细胞系分泌的一种或两种以上亚型的单抗。
本发明的第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有至少一种上述单克隆抗体。优选的，上述单克隆抗体选自ARA-M1，ARA-M5，ARA-M7(杂交瘤细胞系，见第7页说明)中任一种。本发明试剂盒可以用于筛选抗肿瘤药物、判断抗肿瘤药物治疗效果，诊断神经退行性疾病和检测细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶表达水平，尤其是急性器官损害中AR-AChE的表达水平等。
本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括至少一种上述单克隆抗体以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。优选的，上述组合物包括保藏号CCTCC NO：-C200413，CCTCCN0：-C200414，CCTCC NO：-C200415的小鼠杂交瘤细胞系分泌的一种或两种以上亚型的单抗。本发明组合物用于治疗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶异常表达所引起的疾病，包括神经退行性疾病。
本发明的第五方面提供了上述单克隆抗体在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第六方面提供了一种筛选抗肿瘤药物的方法，它包括以下步骤：
(1)培养人肿瘤细胞株；
(2)向步骤(1)中的细胞株培养液中加入候选药物，用上述单克隆抗体检测细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量；促进细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶出现或表达量增加的候选药物就是促进肿瘤凋亡的药物，反之，所述候选药物无效。
优选的，上述单克隆抗体选自ARA-M1，ARA-M5，ARA-M7中任一种。
优选的，在加入候选药物后18-24小时内检测AR-AChE。
本发明的第七方面提供了上述单克隆抗体在判断抗肿瘤药物治疗效果中的应用。
本发明的第八方面提供了一种判断抗肿瘤药物治疗效果的方法，它包括步骤：检测肿瘤患者使用抗肿瘤药物治疗后8-168小时外周血中细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量，并与治疗前比较；细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量增加，表明抗肿瘤药物有效，无变化或表达量不增加，则抗肿瘤药物无效。
优选的检测时间为12-120小时。
本方面的第九方面提供了上述单克隆抗体在制备诊断或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
本方面的第十方面提供了上述单克隆抗体在制备检测急性器官损害中细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶表达水平的试剂盒中的应用。
发明人曾经从凋亡的细胞中发现乙酰胆碱酯酶(AChE)的异构体(isoform)，命名为AR-AChE，并且申请了专利(一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-AChE)及基因编码序列。申请号：01105781.5，申请日期，2001/3/23。)。后来发明人发现很多细胞株在凋亡时表达AChE(Zhang XJ，Yang L，Zhao Q，Caen JP，He HY，Jin QH，Guo LH，Alemany M，Zhang LY，Shi YF.，Induction of Acetylcholinesterase Expression during Apoptosis in VariousCell Types. Cell Death and Differentiation 9(8)：790-800，2002.)，由于该酶表达的时间、细胞的类型、细胞内分布、翻译后修饰以及功能特征不同于神经元上的突触型和运动终板上的AChE、红细胞膜上的AChE、巨核细胞内的AChE，因此，发明人将凋亡细胞表达的AChE称做细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(apoptosis-related acetylcholinesterase，AR-AChE)。发明人把针对凋亡细胞表达的AR-AChE的抗体，叫抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶抗体(antiapoptosis-related acetylcholinesterase antibody)。针对AR-AChE，发明人可以制备单克隆抗体和多克隆抗体。
现在市场上抗神经突型AChE抗体，也不同于抗红细胞膜上AChE的抗体。本发明抗体只识别凋亡细胞表达的AChE，发明人称之为(细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶，apoptosis-relatedacetylchol inesterase，缩写AR-AChE)，而市场上抗神经突型AChE抗体虽然可能识别AR-AChE，但是没有特异性，他们没有识别凋亡细胞的特异性，因此不能作为凋亡的标记。发明人已经获得了作为抗原的细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)(Xue-Jun Zhang，Lei Yang，Qi-HuangJin，Yu-Fang Shi*，Hua Jiang，Heng-Yi He，Kelvin NG and Zi-Qing Jiang.Variousapoptotic mammalian cells express apoptosis-related acetylcholinesterase(AR-AChE).Acta biochimica et biophysica sinica_35(2)：pp213，2003.)。在这个基础上发明人制备了抗AR-AChE的单克隆抗体。有了特异产生抗AR-AChE单克隆抗体，就可以从各种类型的AChE中区分出AR-AChE。有了这个特异性，就可以用来识别凋亡细胞，凋亡现象，用于基础研究，AD研究，AD辅助诊断和治疗；化疗效果的判断等等。这是世界上首次发明的特异性识别凋亡细胞表达的AR-AChE的单克隆抗体。
因此，发明人用中国专利(ZL 97 1 25216.5，从哺乳类细胞中获得脑型AChE的方法)从凋亡细胞中分离出AR-AChE，(Qi-Huang JIN，Yu-Fang SHI，Heng-Yi HE，Kelvin KW Ng，HuaJIANG，Lei YANG，Zi-Qing JIANG and Xue-Jun Zhang Isolation of AChE from ApoptoticHuman Lung Fibroblast Cells by Antibody Affinity Chromatography. BioTechniques33(4)：S92-S97，2002.)。用它免疫BaLb/c小鼠，筛选出3个克隆，特异产生抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生，因此是可以从培养本发明的杂交瘤的培养液中获得的。然而，产生本发明的单克隆抗体的方法不受特别限制，但如果基因工程化的抗体能与AR-AChE蛋白特异性结合，它也在本发明的范围内。
本发明的杂交瘤产生识别AR-AChE的单克隆抗体，并可通过经AR-AChE蛋白免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
本发明的杂交瘤细胞系ARA-M1，ARA-M5，ARA-M7已根据《用于专利程序的微生物保存布达佩斯公约》于2004年9月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉)，保藏号依次分别为CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCC NO：-C200415。
本发明的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。因此，用AR-AChE作为免疫原免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，从其中选出产生识别AR-AChE的单克隆抗体的杂交瘤，从而获得了本发明的杂交瘤。
上述制备杂交瘤的免疫原不受特别限制，可以是重组AR-AChE，纯化的AR-AChE蛋白或含AR-AChE的肿瘤细胞。例如可以通过在合适的培养基上培养表达AR-AChE蛋白或者含有AR-AChE蛋白的融合蛋白的工程菌株。
当治疗上将非人被试者所产生的抗体或来源于非人抗体基因表达的抗体用于人体时，它们在不同程度上被识别为外来抗体，患者体内可能产生免疫应答。使这种免疫反应最小化或消除这种免疫反应的一种方法是产生嵌合抗体衍生物，即联合非人的动物可变区和人的恒定区的抗体分子。因此，本发明也包括人源化抗体，以及人源化抗体在制备治疗神经退行性疾病(如AD)的药物中的应用。本领域技业人员可以利用本发明单克隆抗体制备人源化抗体。
这些抗体保留有原始的单克隆抗体的表位结合特异性，但当对人给药时可能较少致免疫性，因此更可能为患者所忍受。
可以用本领域已知的重组DNA技术制备嵌合单克隆抗体。例如，用编码人恒定区的基因置换编码非人抗体分子恒定区的基因(参见，Robinson等，PCT专利公开文本PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184，187；或Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496)。可以通过用人的可变区的等同部分代替不涉及结合抗原的可变区部分来进一步使嵌合抗体“人源化”。
本发明的单克隆抗体的应用领域不受特别限制，如能用于免疫测定，包括定量或半定量检测。本发明的单克隆抗体可以检测AR-AChE的存在与否，作为判断肿瘤化疗结果的依据。
本发明抗体的抗原结合片段是指能与细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的抗原表位结合的抗体片段。
经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制，包括例如：山羊、绵羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。在其中优选的是小鼠。
本发明的免疫测定法用至少一种本发明的单克隆抗体进行，方法可仅用一种抗体进行，也可与AR-AChE多克隆抗体结合进行，或同时使用两种以上单克隆抗体(如ARA-M1和ARA-M5)。
作为本发明的免疫测定法，包括酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫层析等技术。上述各种免疫测定法可用于以竞争法或夹心法，用标记物标记的抗原或抗体测定靶抗原或抗体。在上述各种免疫测定法中，ELISA和免疫层析技术是优选的。
上述夹心法包括例如：使AR-AChE夹在固定的一种亚型的本发明单克隆抗体和用标记剂标记的另一亚型的本发明单克隆抗体或抗AR-AChE多克隆抗体之间，然后加入针对标记物(例如酶)的底物等，显示颜色等，从而检测了标本中的AR-AChE。通常考虑灵敏度高超的单克隆抗体作为优选的标记抗体，因为与特异性低而背景噪声高的多克隆抗体相比较，单克隆抗体的特异性高而背景噪声低，使检测更为准确。
上述竞争性方法基于例如：测试标本中AR-AChE和已知量的标记的AR-AChE与本发明的单克隆抗体定量竞争性结合反应。在上述特别提到的竞争性方法中，在含有AR-AChE的标本溶液中加入预定量的固定在载体上的抗体和预定量的用标记剂标记的AR-AChE。然后，测定保留在载体上的标记剂活性或未保留在载体上的标记剂活性。对此，优选几乎同时加入抗体和标记抗原。
对于上述标记剂，可使用放射性同位素，例如125I、酶、酶底物、磷光物质、荧光物质、生物素和着色物质。在将这些标记剂与抗原或抗体结合中，可使用马来酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)，活化生物素法(J.Am.Chem.SOC.(1978)，100，3585)或疏水键法。
对于上述提到的酶，包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于用于该场合的底物，可选择适合该场合所用的酶的底物，包括例如：ABTS、鲁米诺-H2O2、o-苯二胺-H2O2(针对过氧化物酶)、磷酸对硝基苯酯、磷酸甲基缴形酯、3-(2’-螺环金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，，2-二氧杂环丁烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯基-BETA-D-半乳糖(针对β-半乳糖苷酶)。
可在4-40℃反应1分钟-18小时，然后测定结果显示的颜色或荧光、磷光或显色量，进行上述试验。另外，可使用所谓的速率试验，它在4-40℃范围内保温进行。
用市售的Bolton-Hunter试剂可方便的进行对上述抗原或抗体的放射性标记。例如，可通过将Bolton-Hunter试剂加到溶液中(该溶剂是通过将抗原或抗体溶于0.1M碳酸氢钠水溶液中制备的)，然后经过1-2小时，用G-25脱盐柱等除去未反应的Bolton-Hunter试剂部分。
另外，可使用氯亚明T法、碘原法等，方便的进行125I放射性标记。
上述荧光物质，如荧光素和罗达明，可方便的使用活化酯法或异氰酸酯法(“酶免疫测定技术”，Igaku Shoin 1987年出版)进行标记。对于上述着色物质，可使用着色乳胶颗粒和胶体金。
本发明的免疫测定法使用本发明的单克隆抗体，因此具有杰出的特性，仅识别存在于所有凋亡细胞(包括肿瘤或神经细胞)中的AR-AChE，而不会由于交叉反应而错误检测其他物质和正常的AChE，因此可进行特异性非常高的测定。
为了实施本发明的免疫测定法，可使用本发明的试剂盒。本发明的试剂盒含有至少一种本发明的单克隆抗体，并可只含一种单克隆抗体。要用于本发明试剂盒的本发明的单克隆抗体不受特别限制，但可以是任何识别AR-AChE的单克隆抗体，还可以是本发明的单克隆抗体的分解产物或其抗原结合片段，如F(ab’)2、Fab’、Fab等。
在本发明的试剂盒中，本发明的单克隆抗体可预先固定在固相上，本发明的单克隆抗体还可以用上述标记剂标记。
本发明的试剂盒可用免疫学方法检测含AR-AChE的标本，如血液，组织或脑脊液，因此可以判断AR-AChE的存在与否以及表达量的变化。
用于本发明的试剂盒的固相不受特别限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃珠、磁性颗粒、微量滴定板、免疫层析用滤纸、玻璃滤器或其他不溶性载体。
本发明的试剂盒还可含有其他组件。上述其他组件不受特别限制，但包括例如标记用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物质、荧光物质、着色物质、缓冲液和培养皿，以及上述提到的成分。
本发明的试剂盒可以是用于实施上述竞争性方法或上述夹心法的试剂盒。然而优选的是使用夹心法的试剂盒。上述夹心法具有优点，即灵敏度高，需要的反应时间短，准确率高，操作方便。用上述免疫层析技术，可以制备一种试剂盒，它使得测试方法方便而简单，而且用它可以简单的通过肉眼观察判断结果。当以ELISA技术并使用上述夹心法时，酶反应产物的形成由试验目标物质的量决定，因此可建立一种系统，可方便的通过显色等，以肉眼观察确定AR-AChE的存在与否，也可用仪器测试其O.D值，进行定量和半定量的检测。
本发明试剂盒所用的标本不受特别限制，但包括例如：血液和脑脊液或组织，优选血液。
本发明单克隆抗体和本发明试剂盒可用于筛选抗肿瘤药物，辅助判断抗肿瘤药物治疗效果，制备诊断或治疗神经退行性疾病的药物，检测急性器官损害中细胞凋亡产生的AR-AChE的表达水平及变化。
上述筛选抗肿瘤药物的方法包括以下步骤：
(1)培养人肿瘤细胞株；
(2)向步骤(1)中的细胞株培养液中加入候选药物，用上述单克隆抗体或上述试剂盒检测细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量；促进细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶出现或表达量增加的候选药物就是促进肿瘤细胞凋亡的药物，反之，所述候选药物无效。
根据本发明，用单克隆抗体识别AR-AChE，可消除存在于样品中的其它物质的影响，从而可以非常高的灵敏度和特异性检测AR-AChE的存在。由于已建立了产生针对AR-AChE的单克隆抗体的杂交瘤，现在可以几乎永久性的产生同一单克隆抗体。
本发明的诊断试剂盒使用单克隆抗体，具有高水平的检测灵敏度，不产生假阴性或假阳性问题，在批与批之间没有任何差异。如标记的抗体优选使用与固相载体上单抗不同亚型的单克隆抗体，则更便于控制产品质量，和制定统一的标准。
AR-AChE检测试剂盒检测原理，用抗AR-AChE的单克隆抗体和抗AR-AChE的多克隆抗体或另一亚型的抗AR-AChE单克隆抗体作为固相化抗体和酶标抗体，如果待测样品中存在AR-AChE，则形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入TMB(酶免显色系列产品)底物产生显色反应，反之则无显色反应。双抗体夹心ELISA法是一种非常灵敏的检测技术，并且ELISA敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，从而进一步提高了稳定性。
本发明提供特异产生抗AR-AChE单克隆抗体的杂交瘤细胞系，由这些细胞系可以产生抗人AR-AChE单克隆抗体，用该抗体可以制备试剂盒，用于基础研究，AD研究，AD辅助诊断和治疗；化疗效果的判断等等。
到目前为止，利用血清学方法判断化疗效果的试剂，只有M30抗体。目前有两家公司，ALEXIS Biochemicals Corporation公司和DiaPhqrma Group Inc.推出了试剂盒-M30-ApoptosenseTMELISA Kit。这个试剂盒主要成分就是M30抗体，一种小鼠杂交瘤单克隆抗体，亚型为IgG2b，它识别的是角蛋白(Cytokeratin)18(CK18)C端的一个小片段。CK18是上皮细胞的中等纤维，上皮凋亡时，激活的激酶(Caspase)3，6，7，9将CK18的C端切下一个小片段。由于这个小片段只出现在凋亡细胞中，因此，成为上皮细胞凋亡的特异性标记。用M30抗体，可识别组织细胞和培养细胞的凋亡，也可以用ELISA检测血清中M30的变化，判断化疗效果。但它仅针对上皮相关的肿瘤，而且价格昂贵。
本发明单克隆抗体的用途为：
1.体外实验筛选抗肿瘤药物：
研究抗肿瘤新药，要在众多的候选药物中进行筛选，能否诱导肿瘤细胞凋亡是一个重要指标。本发明方法可用以体外实验筛选抗肿瘤新药。体外培养的人肿瘤细胞株，加入所要检测的不同剂量的抗肿瘤候选药物，在18-20小时后，检测细胞或培育液，通过AR-AChE出现和量的改变，来判断被筛选的药物的有效与否，如果AR-AChE增加，说明该药物已经诱导了细胞凋亡，它就是有效的抗肿瘤药物。
2.临床肿瘤患者化疗效果判断
对于不同的肿瘤(包括白血病)，不同的患者，对各种化疗药物的反应是不同的，有的抗肿瘤药物在这个患者身上疗效很好，而对另一个患者疗效就不好。本发明方法，能帮助临床医生有针对性选择肿瘤化疗药物，有的放矢，在最短时间内找到最佳药物，给患者带来福音。
化疗药物主要是针对肿瘤细胞(也有正常细胞)，使之发生凋亡，从而达到治疗的目的。本发明建立在科学研究新发现的基础之上。其原理是正常情况下不表达AChE的细胞在细胞凋亡过程中大量表达AR-AChE，而这个酶比较稳定地存在于凋亡细胞中。正常人或肿瘤患者在没有治疗的情况下，体内虽然不断有细胞凋亡，但数量少，凋亡细胞很快被周围的巨噬细胞吞噬，凋亡细胞内的AR-AChE不释放到血流中。但是，如果有效的化疗药物，使得肿瘤细胞大量凋亡，巨噬细胞还不能很快吞噬所有的凋亡细胞，或者受药物影响，巨噬细胞吞噬能力降低，不能很快吞噬凋亡细胞，这时大量的AR-AChE随凋亡细胞及凋亡小体进入血液中。此时取患者血清测定血清AR-AChE的蛋白质含量，就会发现治疗开始后72小时(第三天)的AR-AChE的蛋白质含量比治疗前高出1倍以上。重要的是发明人发现脐带血CD34+的造血干细胞凋亡时不表达AR-AChE，测定血AR-AChE更有代表性意义。因此，测定患者治疗前后血清AR-AChE蛋白质含量，就知道化疗效果如何，帮助临床医生在最短时间内找到有针对性最佳的肿瘤化疗药物，有的放矢，为挽救病人的生命，争取宝贵的时间。如果化疗无效，可以及时更换药物，从而给医生提供了一种快速有效的检测化疗效果的手段，真正实现个体化治疗。当然，用本发明单抗也能够分析其他抗肿瘤药物的治疗效果。
3.研究神经退行性疾病，特别是AD，可能有利于诊断和治疗
通过脑组织切片和脑脊液分析，可以得到脑细胞凋亡的证据。AChE能加速β淀粉样肽的沉淀，这种作用与经典的酶催化作用无关(Inestrosa NC，Alvarez A，Perez CA，Moreno RD，Vicente M，Linker C，Casanueva OI，Soto C，Garrido J，Acetylcholinesteraseaccelerates assembly of amyloid-beta-peptides into Alzheimer’s fibrils：possiblerole of the peripheral site of the enzyme，Neuron，199616(4)；881-891.)，并且能与β淀粉样肽形成复合物，而复合物毒性比单一β淀粉样肽毒性更大(Alvarez A，Alarcon R，Opazo C，Campos EO，Munoz FJ，Calderon FH，Dajas F，Gentry MK，Doctor BP，De MelloFG，Inestrosa NC，Stable complexes involving acetylchol inesterase and amyloid-betapeptide change the biochemical properties of the enzyme and increase theneurotoxicity of Alzheimer’s fibrils，J Neurosci，199818(9)；3213-3223.)。有关AChE反义核酸的实验直接说明AChE在神经元丢失中起作用(Shohami E，Kaufer D，Chen Y，Seidman S，Cohen O，Ginzberg D，Melamed-Book N，Yirmiya R，Soreq H，Antisenseprevention of neuronal damages following head injury in mice，J Mol Med，200078(4)；228-236.)。本单克隆抗体，除了可以用来识别脑组织切片和脑脊液中细胞凋亡证据，作为诊断试剂外，还可能用于作为药物(特别是制备成人源化抗体后)，如用于防止AChE加速β淀粉样肽的沉淀，从而达到阻止AD进行性发展的作用。所述的药物包括本发明单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
4.检测急性器官损害的发展与愈后
例如爆发型肝炎等疾病。这些急性器官损害发生时有大量的细胞凋亡，血清中含数倍甚至数十倍高的AR-AChE，通过检测它的变化，可以判断病情的发展变化和预后情况。
本发明的优点：本发明方法是通过检测由抗肿瘤药物体外作用于不表达AChE的细胞后，检测细胞表达的AR-AChE活性，或测定血清AR-AChE含量来鉴定是否发生凋亡，凋亡细胞AChE反应阳性，说明该药物已经诱导了细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物，籍此能方便有效地筛选抗肿瘤药物，还可帮助医生选择针对病人特别敏感的化疗药物，以提高治疗效果。用本发明方法检测AR-AChE含量来鉴定体外培养的凋亡细胞的结果与经典方法是一致的。而且定位准确，方法简单易行，不需要昂贵的设备，也不需要太昂贵的试剂，可以做半定量和定量分析。
附图说明
图1.引产的五个月人胎儿脑组织冰冻切片(放大800倍，×800)
A.是免疫荧光，1抗体为小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体，2抗为羊抗小鼠IgG抗体，罗达明(Rhodamine)标记，2个凋亡的细胞显示阳性。
B.是Hoechst No.33258染色，显示所有的细胞核。
C.是A和B的重叠。
D.是可见光照片。本照片显示2个凋亡的细胞显示阳性，其它没有阳性。
图2.脐带血涂片的照片(×800)
A.是免疫荧光，1抗体为小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体，2抗为羊抗小鼠IgG抗体，罗达明标记，凋亡的有核细胞显示阳性，红细胞为阴性；
B.是Hoechst No.33258染色，显示细胞核物质，全视野只有一个有核细胞其余都是红细胞；
C.是可见光照片，可见大量的红细胞，中间有1个有核细胞。本图说明本发明单克隆抗体特异地识别凋亡细胞的AR-AChE，而不识别红细胞膜上的AChE。
图3.裂解的凋亡HELA实验
图中从左向右为凋亡HELA裂解液分别a.不加底物，但以等量的PBS代替；b.不加抗体，做底物反应，结果阳性；c.和d.为加过量抗体，形成复合物，离心，取上清(c)与沉淀(d)分别做底物反应，结果两者全阴性。
图4.用本发明单抗检测HELA细胞
培养的HELA细胞，抗体是发明人制备的小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体(ARA-M5)，1抗体直接连接HRP，DAB反应，正常HELA细胞阴性，凋亡细胞阳性。
图5.WESTERN BLOT
A.用买来的抗体(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)做WESTERN BLOT，抗原来自凋亡的HELA细胞；
B.用ARA-M5做WESTERN BLOT，抗原来自凋亡的HELA细胞；
C.用ARA-M5做WESTERN BLOT，抗原来自电鳐乙酰胆碱酯酶(Sigma).
图6.脐带血有核细胞涂片的照片(×400)
A.为可见光照片，黑箭头指向凋亡细胞，白箭头指向正常细胞；
B.是Hoechst No.33258染色，显示细胞核物质，凋亡细胞的核已经形成了凋亡小体，而正常细胞的细胞核完整；
C.是免疫荧光，1抗体为小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体，2抗为羊抗小鼠IgG抗体，罗达明标记，仅有凋亡小体的细胞显示阳性，而正常细胞为阴性，说明该单克隆抗体特异性识别凋亡细胞。
图7.大鼠脑组织切片
A.抗体是发明人制备的小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体(ARA-M1)，1抗体直接连接Rhodamine，红色为阳性细胞(与大鼠AR-AChE有交叉反应)；大片的神经组织没有阳性，那里有胆碱能神经存在，突触的乙酰胆碱酯酶没有显示阳性。
B.TUNEL染色，阳性为凋亡细胞。
C.是A，B的重叠。TUNEL染色与抗AR-AChE阳性区域吻合得很好，说明本单可隆抗体特异地识别凋亡细胞的AR-AChE，而不识别大鼠脑组织表达的神经突触型的AChE。
图8.引产的五个月人胎儿脑组织冰冻切片(×800)照片均为同一视野
A.是Hoechst No.33258染色，显示细胞核；
B.是cytochemical Ache staining(Konovsky and Root方法)，褐黄色(图中为深灰色)为AChE阳性，可见较均匀而没有显示细胞或细胞核的轮廓，说明生成物没有集中在细胞浆或细胞核内，这与发明人发现的凋亡中的分布完全不同；
C.是可见光照片与Hoechst No.33258染色同时拍照的结果，进一步证明AChE阳性不在细胞核内。
图9.体外培养的人SK-N-SH细胞的照片(×800)
照片分A，B，C，D，E五部分，均为同一视野。
A.TUNEL染色，阳性为凋亡细胞；
B.是可见光照片，细胞团的右下方有一个没有细胞突起的固缩细胞；
C.是免疫荧光，1抗体为小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体，2抗为羊抗小鼠IgG抗体，罗达明标记，右下方有一个凋亡的细胞显示阳性；
D.是hoechest染色，显示细胞核；
E.是A，C，D的重叠。体外培养的人SK-N-SH细胞，正常可以表达少量的神经突触型AChE，本照片显示1个凋亡的细胞显示阳性，其它没有阳性，TUNEL染色与抗AR-AChE阳性吻合得很好，说明本单可隆抗体特异地识别凋亡细胞的AR-AChE，而不识别SK-N-SH细胞表达的神经突触型的AChE。
图10.肿瘤病人化疗前后血清中AR-AChE半定量检测
图11.大鼠PC12细胞的照片
A.可见光照片。凋亡的PC12细胞，底物反应阳性，分布在细胞浆和核内。
B.正常PC12细胞，共聚焦(CONFOCAL)照片。FITC显示AChE在正常活细胞中表达，分布在细胞浆和膜上，细胞核中没有阳性，兰色是HOECHST染色，显示细胞核。
C.可见光照片。抗AR-AChE抗体(ARA-M5)，DAB反应，褐色为阳性，苏木精背景染色，显示细胞核；贴壁生长的活PC12阴性，固缩的凋亡细胞阳性。
图12.30例正常新生儿脐带血和一例肿瘤病人血清AR-AChE。
正常新生儿脐带血AR-AChE的OD值都在0.2以下，接近空白对照。一例肿瘤病人化疗第3天的血清AR-AChE的OD值在3.1。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明中未特别说明的试剂、仪器等为市售的常规产品。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook、Russell等人，分子克隆：实验室手册III(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1  抗细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶单克隆抗体和杂交瘤的制备
I、细胞融合前的准备
(一)免疫方案
A，抗原：按照发明人专利的方法(专利号：ZL 97 1 25216.5；Qi-Huang JIN，Yu-Fang SHI，Heng-Yi HE，Kelvin KW Ng，Hua JIANG，Lei YANG，Zi-Qing JIANG and Xue-Jun ZhangIsolation of AChE from Apoptotic Human Lung Fibroblast Cells by Antibody AffinityChromatography. BioTechniques  i33(4)：S92-S97，2002)获得HELA细胞表达的AR-AChE。
B，小鼠：BaLb/c小鼠，6～10周龄雄鼠3只.
人AR-AChE，加福氏完全佐剂(限第一次使用)或福氏不完全佐剂，等体积混合在一起，用两注射器，经过三通阀，反复推注，使二者形成油包水的乳糜状。
初次免疫             抗原(Ag)     1～50μg   加福氏完全佐剂皮下多点注射
    |                    (0.8～1ml 0.2ml/点)
    ↓3周后
第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下
    ↓3周后
第三次免疫剂量同上，不加佐剂，腹膜腔内注射(ip)
    |(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
    ↓2～3周后
加强免疫，剂量100μg，ip
    ↓3天后
  取脾融合
(二)饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞
在融合前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞
采用BaLb/c小鼠6～10周龄
  ↓
拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟
  ↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
  ↓
用无菌注射器注入6～8ml培养液
  ↓
反复冲洗，吸出冲洗液
  ↓
放入10ml离心管，1200转/分离心5～6分钟
  ↓
用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml
       ↓
     加入96孔板，100μl/孔
       ↓
     放入37℃ CO2孵箱培养
(三)骨髓瘤细胞
在准备融合前的两周，复苏骨髓瘤细胞。发明人采用骨髓瘤SP2/0细胞系，RPMI1640培养基，小牛血清的浓度20％，细胞的最大密度不超过106/ml，扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
(四)免疫脾细胞
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
II、细胞融合，选择杂交瘤
(一)细胞融合流程
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。
(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6)在室温下融合：
①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。
②作用100秒钟。
③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7)离心，800rpm，6分钟。
(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬。
(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
一块96孔板含有1×107脾细胞。
(二)HAT选择杂交瘤
在融合24小时后，加HAT选择培养液。将贮存的50×HT和HAT试剂，用1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
50×HAT
H：5×10-3M
A：2×10-5M
T：8×10-4M
HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
III、抗体的检测
发明人采用ELISA筛选方法。
IV、杂交瘤的克隆化和冻存
(一)克隆化方案
用有限稀释法克隆，程序如下：
①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103/ml
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
(二)杂交瘤细胞的冻存
杂交瘤细胞在每支安瓿含1×106以上。
细胞冻存液：50％小牛血清；40％不完全培养液；10％DMSO(二甲亚砜)
V、单克隆抗体的大量生产
1.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。
腹水的制备先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后，处死小鼠，用滴管收集腹水。
实施例2  AR-AChE抗体的鉴定
1.抗体特异性的鉴定：用ELISA法，除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与人白蛋白，肌动蛋白，电鳐AChE进行交叉试验，结果与人AR-AChE反应强烈，与电鳐AChE有弱阳性，与人白蛋白，肌动蛋白呈阴性反应(见图5)，免疫组织和细胞化学检测，不识别人脑AChE(见图1)和人红细胞AChE(见图2)。
2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：用酶标的第二抗体进行筛选，已经基本上确定了抗体的Ig类型。用(BioRed)公司的试剂盒(Mouse Typer sub-isotyping Kit catalog number 172-2051)分析，ARA-M1号(保藏号CCTCC-C200413)是IgG；ARA-M5号(保藏号CCTCC-C200414)是IgG2α，ARA-M7号(保藏号CCTCC-C200415)是IgG1。
3.McAb中和活性的鉴定：用抗体加入到AR-AChE中，可以阻断该酶催化活性。为了鉴别发明人的单抗是否特异识别凋亡细胞表达的AR-AChE，以及抗体与抗原形成复合物后，是否酯酶活性发生改变，发明人做了免疫抑制实验，发明人用Karnovsky，MJRoots，L.A方法检测乙酰胆碱酯酶活性(Karnovsky，MJRoots，L.A″Direct-Coloring″Thiocholine Methodfor Cholinesterases.J Histochem Cytochem 1964；12：219-21.)，然后在96孔中，用酶标仪在405nm下检测酶活性.
用裂解的凋亡HELA，分3大组
A.凋亡HELA裂解液，不加底物，但以等量的PBS代替
B.不加抗体，做底物反应，结果阳性
C.加过量抗体，形成复合物，离心，上清与沉淀分别做底物反应，结果两者全阴性(图3)。发明人C中将上清与沉淀做WESTERN BLOT，显示上清中无AChE，而沉淀的抗原抗体复合物中，有AChE阳性带。
实施例3    AR-AChE抗体与市售抗体性能的比较
共性：1.识别AChE(与已经商品化的AChE抗体有共性)
AR-AChE抗体：正常HELA细胞阴性，凋亡细胞阳性(商品的结果见下段所引论文，单抗见图4)。AR-AChE抗体与商品AChE抗体识别同一条带(见图5)
发明人已经报道(Zhang XJ，Yang L，Zhao Q，Caen JP，He HY，Jin QH，Guo LH，AlemanyM，Zhang LY，Shi YF.，Induction of Acetylcholinesterase Expression during Apoptosisin Various Cell Types. Cell Death and Differentiation 9(8)：790-800，2002.)，正常活HELA细胞不表达AChE，而凋亡的HELA细胞表达AChE，而不是丁酰胆碱酯酶(BuChE)。发明人用两个亲和柱(concanavalin A-Sepharose和edrophonium-Sepharose)(Ji Young Son，Sook Shin，Kwang Ho Choi，and In Kook Park.Purification of solubleacetylcholinesterase from Japanese quail brain by affinity chromatography.Theinternational journal of biochemistry & cell biology.34(2)：204-210，2002)从凋亡的HELA细胞中分离出AChE。发明人用分离得到的蛋白质做WESTERN BLOT，结果显示，买来的抗体和发明人的单抗识别的是同一条带(66kDa)。(图5)
2.抑制酶活性，凋亡HELA的AChE活性可被发明人的单抗阻断(McAb中和活性的鉴定，图3)，发明人将上清和沉淀做WESTERN BLOT，显示上清中无AChE，而沉淀中，有AChE阳性带。与现有的抗体不同点：特异性。
本发明抗体只识别凋亡细胞表达的AR-AChE，不同于现商品化的抗体，细胞免疫分析，该单抗只识别凋亡细胞表达的AR-AChE，具体证据(图1，6)。图6是将从脐带血分离的有核细胞被放置室温下18小时，部分细胞发生凋亡。照片均为同一视野。
1.不识别人和大鼠突触型(脑)AChE(图1，图7)。图7中大鼠脑组织切片，AR-AChE免疫组织化学和TUNEL双重染色。该大鼠经过大脑中动脉缺血处理(Longa EZ，Weinstein PR，CarlsonS.Cummins R.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke.1989 Jan；20(1)：84-91.)，取自损伤周边组织。照片A，B，C均为同一视野。
2.不识别人红细胞膜AChE(图2C)。脐带血被放置室温下18小时，部分细胞发生凋亡。图2中A、B、C照片均为同一视野。
现在市场上抗神经突型AChE抗体，也不同于抗红细胞膜上AChE的抗体。本发明抗体只识别凋亡细胞表达的AChE，发明人称之为(细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶，apoptosis-relatedacetylcholinesterase，缩写AR-AChE)，而市场上抗神经突型AChE抗体能识别AR-AChE，但是，没有特异性，他们没有识别凋亡细胞的特异性，因此不能作为凋亡的标记。发明人已经获得了作为抗原的细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶(AR-AChE)(Xue-Jun Zhang，Lei Yang，Qi-Huang Jin，Yu-Fang Shi*，Hua Jiang，Heng-Yi He，Kelvin NG and Zi-Qing Jiang.Various apoptoticmammalian cells express apoptosis-related acetylcholinesterase(AR-AChE).Actabiochimica et biophysica sinica 35(2)：pp213，2003.)。在这个基础上发明人制备了抗AR-AChE的单克隆抗体。有了特异性抗AR-AChE单克隆抗体，就可以从各种类型的AChE中区分出AR-AChE。有了这个特异性，就可以用来识别凋亡细胞，凋亡现象，用于基础研究，AD研究，AD辅助诊断和治疗；化疗效果的判断等等。这是世界上首次发明的特异性识别凋亡细胞表达的AR-AChE的单克隆抗体。
实施例4  观察正常脑型AChE的分布以及酶与细胞核的关系
引产的五个月人胎儿脑组织(红房子医院，并经家属同意)冰冻切片，4％多聚甲醛固定，再作乙酰胆碱酯酶活性染色。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph 6.0150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)，进行酶反应。检测细胞乙酰胆碱酯酶活性时，使细胞在反应液中室温孵化3-4小时，呈黄褐色(图中深灰色)为阳性反应(见图8B)。可见较均匀而没有显示细胞或细胞核的轮廓，说明生成物没有集中在细胞浆或细胞核内，这与发明人发现的凋亡中的分布完全不同。图8C进一步证明AChE阳性不在细胞核内。
实施例5  观察发育过程中少量神经细胞凋亡现象
引产的五个月人胎儿脑组织冰冻切片，4％多聚甲醛固定，做免疫组织化学反应和Hoechst染色，分别显示细胞核和AR-AChE阳性细胞(见图1)，说明本发明抗体不识别大片存在的乙酰胆碱酯酶，而仅识别细胞凋亡相关的AChE。
实施例6  利用体外培养的人SK-N-SH细胞证明本发明单克隆抗体特异性
利用体外培养的人SK-N-SH细胞，说明本发明抗体只识别凋亡的细胞，而不识别正常的乙酰胆碱酯酶，因为SK-N-SH细胞会表达乙酰胆碱酯酶，分布在细胞膜上。见图9，照片分A，B，C，D，E五部分，均为同一视野。C中1抗体为小鼠抗人AR-AChE单克隆抗体(ARA-M7)，2抗为羊抗小鼠IgG抗体(1∶100 dilution，Rhodamine conjugated anti-mouse IgG-R，Santa Cruz)，右下方有一个凋亡的细胞显示阳性。体外培养的人SK-N-SH细胞，正常可以表达少量的神经突触型AChE，本照片1个凋亡的细胞显示阳性，其它没有阳性，TUNEL染色与抗AR-AChE阳性吻合得很好，说明本单克隆抗体特异地识别凋亡细胞的AR-AChE，而不识别SK-N-SH细胞表达的神经突触型的AChE。
实施例7  使用本发明单克隆抗体判断肿瘤化疗效果
用本发明抗体做人血清中乙酰胆碱酯酶的半定量分析，可以用来判断肿瘤化疗(包括白血病)效果的好坏。这是用本发明抗人AR-AChE的单克隆抗体(ARA-M5和ARA-M1配对)，用夹心面包法做ELISA，分别检测肿瘤患者PAD、TZH和GB化疗前后血清中AR-AChE含量。可见患者PAD和TZH在化疗后72小时血清中AR-AChE的含量比治疗前高出1倍以上，说明疗效较好。患者GB治疗前后血清中AR-ACHE的含量不改变，则疗效不佳(见图10)。
实施例8  本发明单克隆抗体识别凋亡细胞的特异性实验
利用体外培养的大鼠PC12细胞，说明本发明单抗只识别凋亡的细胞，而不识别正常的乙酰胆碱酯酶，因为大鼠PC12细胞会表达乙酰胆碱酯酶，分布在细胞膜上(见图11B)。正常PC12细胞，CONFOCAL照片FITC显示AChE在正常活细胞中表达，分布在细胞浆和膜上，细胞核中没有阳性；凋亡的PC12细胞，底物反应阳性，分布在细胞浆和核内(见图11)。
实施例9  使用本发明单克隆抗体半定量检测30例正常新生儿脐带血和一例肿瘤病人血清AR-AChE
用本发明抗体做30例正常新生儿脐带血血清中乙酰胆碱酯酶的半定量分析，可见OD值都在0.2以下，接近空白对照。一例肿瘤病人化疗第3天的血清AR-AChE的OD值在3.1以上。这是用本发明抗人AR-AChE的单克隆抗体(配对ARA-M5和ARA-M1)，用夹心面包法做ELISA，分别检测肿瘤患者和正常新生儿脐带血血清中AR-AChE含量。可见患者在化疗后72小时血清中AR-AChE的含量高出正常新生儿脐带血20倍以上。正常新生儿脐带血血清中AR-AChE的含量很低，OD值在0.2以下，接近空白对照(见图12)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述抗体特异性识别细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶。
2.权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体由保藏号为CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCC NO：-C200415的小鼠杂交瘤细胞系分泌。
3.权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。
4.权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体是包括非人可变区和人的轻链和重链恒定区的一种嵌合单克隆抗体。
5.一种杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系产生权利要求1所述的单克隆抗体。
6.权利要求5所述的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCC NO：-C200413，CCTCC NO：-C200414，CCTCC NO：-C200415。
7.一种免疫测定法，其特征在于，该方法是用至少一种权利要求1所述的单克隆抗体进行的。
8.权利要求7所述的免疫测定法，其特征在于，标本是血液，组织或脑脊液。
9.权利要求7所述的免疫测定法，其特征在于，所述测定法用ELISA技术进行。
10.权利要求7所述的免疫测定法，其特征在于，所述测定法用免疫层析技术进行。
11.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有至少一种权利要求1所述的单克隆抗体。
12.权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的任何一种单克隆抗体。
13.一种组合物，其特征在于，它包括至少一种权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
14.权利要求1所述的单克隆抗体在筛选抗肿瘤药物中的应用。
15.一种筛选抗肿瘤药物的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)培养人肿瘤细胞株；
(2)向步骤(1)中的细胞株培养液中加入候选药物，用权利要求1所述的单克隆抗体检测细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量；促进细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶出现或表达量增加的候选药物就是促进肿瘤细胞凋亡的药物，反之，所述候选药物无效。
16.权利要求1所述的单克隆抗体在判断抗肿瘤药物治疗效果中的应用。
17.一种判断抗肿瘤药物治疗效果的方法，其特征在于，它包括步骤：检测肿瘤患者抗肿瘤治疗后8-168小时外周血中细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量，并与治疗前比较；细胞凋亡相关乙酰胆碱酯酶的表达量增加，表明抗肿瘤药物有效，无变化或表达量不增加，则抗肿瘤药物无效。
18.权利要求1所述的单克隆抗体在制备诊断和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
19.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测急性器官损害中细胞凋亡表达水平的试剂盒中的应用。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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