CN102740873B

CN102740873B - 泌酸调节肽类似物

Info

Publication number: CN102740873B
Application number: CN201080058417.3A
Authority: CN
Inventors: J·阿尔西纳-费尔南德斯; W·D·科恩
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2030-12-15
Also published as: PL2515928T3; DOP2012000176A; KR20120096022A; WO2011087672A1; CA2784671A1; JP2013515057A; BR112012017348B1; TN2012000302A1; MY160773A; DK2515928T3; MA33825B1; TW201143793A; MX2012007438A; SI2515928T1; US20110152182A1; RS53505B1; IL220161A0; SG181430A1; NZ600731A; CO6551738A2

Abstract

本发明提供可以用于治疗糖尿病和/或肥胖的泌酸调节肽类似物。

Description

泌酸调节肽类似物

技术领域

本发明涉及用于在治疗糖尿病和/或肥胖中使用的泌酸调节肽(Oxyntomodulin peptide)类似物及其聚乙二醇化衍生物。

背景技术

泌酸调节肽（OXM）是一种37个氨基酸的肽激素，其与胰高血糖素样肽1（GLP-1）一起，与营养摄入成比例地自小肠的L细胞释放。它由胰高血糖素（Gcg）的29残基全长序列加上C末端上的8肽延伸所组成，是前胰高血糖素原的组织特异性可变剪接的结果。内源OXM在体内通过二肽基肽酶IV和其他肽酶快速降解。

OXM的确切受体仍未得到鉴定。OXM在体外结合且充分活化GLP-1受体（GLP-1R）和胰高血糖素受体（GcgR），在2种受体上具有相似效力。

OXM涉及食物摄入和体重的调节。OXM急性施用于正常体重的人受试者降低饥饿且使进餐量减少19％。在对超重和肥胖受试者的4周研究中，OXM的每天3次餐前皮下施用产生了2.3kg的重量减轻，相对地，安慰剂组中的重量减轻为0.5kg。在这个试验中，与基于GLP-1的治疗（例如依泽那太（exenatide）和利拉鲁肽(liraglutide)）相关的最常见副作用――恶心——显著地不太普遍。OXM通过在超重和肥胖人中促进增加的体力活动而增加了能量使用，尽管该效应的机制并不明了。

对于开发成为商业上可行的治疗剂，OXM存在几个挑战。如上所述，它在体内快速降解并且由于其小尺寸而发生快速地肾清除。因此，希望鉴定具有改善的代谢稳定性和降低的清除率的OXM肽类似物。此外，OXM固有的GcgR激动剂活性是负面影响血糖控制(glycemic control)的一个危险因素。因此，还希望优化设计用于治疗用途的OXM肽类似物的效力，而在GLP-1R和GcgR的活性之间维持合适的平衡。GLP-1R的活化负责促胰岛素效应，而GLP-1R和GcgR两者的活化可以在减重效应中起作用。因此，希望产生具有有力的促胰岛素活性且促进重量减轻的OXM肽类似物，从而使得它可以用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病和/或肥胖。

具有氨基酸置换以促进稳定性和具有另外修饰（例如聚乙二醇化或脂质化）以减慢清除的OXM肽，公开于WO 2008101017、WO2006134340、WO2007100535和Pocai等人Diabetes 58:2258-2266，2009中。虽然这些OXM衍生的肽可能是超过野生型肽的潜在改善，但是在饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠模型中达到相当大的重量减少所需的剂量典型地高于对于药物的商品化而言可以视为可行的剂量。例如，Pocai等人（2009）报道了在用1900nmol/kg（~8mg/kg）每隔一天（QOD）给药13天后平均11g（~25％）的重量减轻。

尽管有多种OXM肽及其类似物可得，但仍需要更有力、稳定、长效和充分耐受的OXM肽类似物，其具有已优化的GcgR/GLP-1R活性比，从而使得肽的效力和促胰岛素活性可以提供对糖尿病，优选2型糖尿病，和相关病症的有效治疗。也期望提供其OXM肽类似物，所述类似物提供有效治疗以减轻体重。因此，本发明寻求提供用于糖尿病和/或肥胖的有效疗法。

发明内容

本发明包括具有氨基酸置换的OXM肽类似物，所述氨基酸置换被引入以优化代谢活性和调节相对的GcgR/GLP-1R活性，同时优化总体效力。此外，本发明的OXM肽类似物是在所选位置上聚乙二醇化的，以增强作用时间，从而允许频率较低的给药。

本发明提供了包含如下氨基酸序列的泌酸调节肽类似物：

1 5 10

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-

15 20 25

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-VaL-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-

30 35

(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa₃₈-Xaa₃₉(SEQ ID NO：5)

其中Xaa₃₈是Cys、Cys-PEG或不存在，Xaa₃₉是Cys、Cys-PEG或不存在，

并且其中C末端氨基酸是任选酰胺化的。

本发明提供了包含氨基酸序列的泌酸调节肽类似物：

1 5 1O

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-

15 20 25

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-

30 35

(Aib)-Gly-Arq-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO：1).

此外，本发明提供了包含氨基酸序列的泌酸调节肽类似物：

1 5 10

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-

15 20 25

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-

30 35

(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO：2)

其中在位置38上的Cys残基是任选聚乙二醇化的，并且其中在位置39上的Cys残基是任选聚乙二醇化的，且在位置39上的Cys的羧基基团是任选酰胺化的。

优选地，SEQ ID NO：2的OXM肽类似物在位置38的Cys残基或在位置39的Cys上或在两者上被聚乙二醇化，其中40kDa PEG分子共价连接到这些位置上的Cys残基的巯基基团。更优选地，泌酸调节肽类似物在位置38和位置39的每个Cys残基上都发生聚乙二醇化，其中20kDa PEG分子与在这些位置上的每个Cys残基的各巯基基团共价连接。任选地，在位置39上的Cys残基可以从SEQ ID NO：2中缺失，留下在位置38上的用于聚乙二醇化的单个位点。

更优选的泌酸调节肽类似物包含氨基酸序列：

1 5 10

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-

15 20 25

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-

30 35

(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(20kDa PEG)-Cys

(20kDa PEG)(SEQ ID NO：3)

其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是任选酰胺化的。

最优选的泌酸调节肽类似物包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是酰胺化的。

在本发明中使用的PEG分子可以是线性或分支的，并且优选是线性PEG分子。

本发明提供了包含如上定义的泌酸调节肽类似物和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。另外，本发明提供了包含如上定义的泌酸调节肽类似物，连同药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂和任选地其他治疗成分的药物组合物。

此外，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗非胰岛素依赖性（2型）糖尿病的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。

另外，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗胰岛素依赖性（1型）糖尿病的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。

本发明包括在有需要的受试者中治疗肥胖的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。

此外，本发明包括治疗有需要的受试者中的非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。

本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用作药物。

另外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在非胰岛素依赖性糖尿病治疗中使用。

此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在胰岛素依赖性糖尿病治疗中使用。

此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在肥胖治疗中使用。

本发明包括如上定义的泌酸调节肽类似物用于在非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖治疗中使用。

本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。

另外，本发明包括如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。

此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗肥胖的药物中的用途。

此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖的药物中的用途。

本发明的OXM肽类似物有效结合且活化GLP-1受体（GLP-1R）和胰高血糖素受体（GcgR）两者。

还已发现本发明的OXM肽类似物对肽酶,特别是二肽基肽酶IV,的降解比天然人OXM更有抵抗力。因此，本发明的OXM肽类似物具有与天然人OXM比较改善的体内稳定性。

根据本发明的多个实施方案能够在超重和肥胖受试者中引起食物摄入的减少。

本发明的一个特别优点是，与基于GLP-1的治疗，例如依泽那太和利拉鲁肽，通常相关的副作用，例如恶心，的频率被减少或消除。本发明因此具有与基于GLP-1的治疗比较减少的副作用。

本发明的OXM肽类似物还具有与野生型人OXM比较更好的重量减轻效应。

根据本发明的一个实施方案，泌酸调节肽类似物在具有2型糖尿病和/或相关代谢紊乱的受试者上具有改善的葡萄糖耐量和脂质谱，并且比野生型人OXM更有效地实现这一点。

发明详述

泌酸调节肽（OXM）是对hGLP-1R和hGcgR具有完全功效和平衡效力的弱共激动剂，其在稳定超表达相应受体的HEK293细胞中分别具有约6.7±2.7nM和4.1±1.7nM的EC₅₀值。天然人OXM的序列在下文给出：

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-

Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ IDNO：4)

其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物是完全有效和有力的泌酸调节肽类似物，其针对hGcgR和hGLP-1R分别具有59.9±4.14nM和2.75±0.55nM的EC₅₀。因此，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物具有平衡的体外功能活性，与hGcgR比较，其对hGLP-1R具有大~22倍的选择性。对于结合亲和力Ki，观察到相当的结果，其中与hGcgR比较，位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对于hGLP-1R具有大28倍的选择性，Ki值分别为73±23nM和2050±70nM。

一个或多个PEG分子与OXM肽类似物的特定残基的共价附着导致聚乙二醇化的OXM肽类似物，该聚乙二醇化的OXM肽类似物，当与非聚乙二醇化的OXM肽类似物比较时，具有延长的半衰期和降低的清除率，并且对GLP-1R的体外效力类似于天然人OXM的。考虑到OXM肽类似物的小尺寸以及PEG分子（一个或多个）的相对大尺寸，预期OXM肽类似物，一旦聚乙二醇化后，将由于空间位阻而丧失活性。然而，已发现，如果置于泌酸调节肽类似物的末端而不是中间，那么肽类似物的活性可以更大程度地保留。在序列中的几个置换可以增强效力，从而抵消由于聚乙二醇化而引起的效力丧失，同时维持对GLP-1R和GcgR的合适活性比。此外，已发现，在OXM肽类似物的C末端上2个PEG分子的存在比单个PEG更优选。

本发明的序列含有用于20种天然存在的氨基酸的标准单字母或三字母代码。使用的其他代码如下定义：

Aib=α氨基异丁酸

PEG=聚乙二醇

PEG20K=具有20,000Da的平均分子量的PEG分子

如本文使用的，术语“PEG”意指聚乙二醇分子。以其典型形式，PEG是具有末端羟基的线性聚合物且具有式HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH，其中n是约8至约4000。一般地，n不是离散值，而是构成一个在平均值周围具有近似高斯分布的范围。末端氢可以由封端基团例如烷基或烷醇基团置换。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选它是末端羟基。该羟基优选附着至接头部分，所述接头部分可以与肽反应以形成共价连接。本领域中存在PEG的众多衍生物。（参见例如，美国专利号：5,445,090；5,900,461；5,932,462；6,436,386；6,448,369；6,437,025；6,448,369；6,495,659；6,515,100和6,514,491和Zalipsky，S.Bioconjugate Chem.6:150-165，1995）。与本发明的OXM肽共价连接的PEG分子可以是约10,000、20,000、30,000或40,000道尔顿平均分子量。PEG分子优选是18,000-22,000道尔顿。更优选地，它是19,000-21,000道尔顿。最优选地，它是20,000-21,000道尔顿。它甚至更加优选是约20,000道尔顿。聚乙二醇化试剂可以是线性或分支分子，并且可以单个地或串联地存在。本发明的聚乙二醇化OXM肽类似物优选具有附着至肽的C末端的串联PEG分子。PEG分子优选通过mPEG-20kDa马来酰亚胺（图1）或mPEG-20kDa碘乙酰胺（图2），附着至位于肽C末端的2个半胱氨酸残基上。在图1和图2中，n是10至2500。优选地，n是350至600。更优选地，n是425至475。

特别地，PEG分子优选是mPEG-20kDa马来酰亚胺(CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-马来酰亚胺)(NOF SunbrightME-200MA)，并且附着至肽的C末端上的2个半胱氨酸残基。最优选的泌酸调节肽类似物包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中PEG分子是mPEG-20kDa马来酰亚胺(CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-马来酰亚胺)(NOF Sunbright ME-200MA)，并且其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是酰胺化的(图3)。图3，除了加框区域外，含有标准单字母氨基酸代码，在加框区域中这些氨基酸残基的结构已被展开。

图3

如本文使用的，术语“聚乙二醇化”意指如上所述的一个或多个PEG分子共价连接至分子，例如本发明的OXM肽类似物。

“促胰岛素活性”指响应升高的葡萄糖水平刺激胰岛素分泌的能力，从而造成细胞对葡萄糖的摄取和减少的血浆葡萄糖水平。促胰岛素活性可以通过本领域已知的方法进行评估，包括测量胰岛素瘤细胞系或胰岛的胰岛素分泌的体外实验，或体内实验例如静脉内葡萄糖耐量测试(IVGTT)、腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)、和口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。促胰岛素活性可以常规地通过测量胰岛素水平或C肽水平，在人中进行测量。本发明的OXM肽类似物具有强促胰岛素活性。

如本文使用的，“体外效力”是在基于细胞的测定中OXM肽类似物活化GLP-1R或GcgR的能力的量度。体外效力表示为“EC₅₀”，其是在剂量应答实验中导致测量的应答(在这种情况下，环状AMP生产)的半数最大增加的化合物有效浓度。

术语“血浆半衰期”指半数的相关分子从血浆中被清除所需的时间。可替代使用的术语是“消除半衰期”。在血浆半衰期或消除半衰期的背景中使用的术语“延长的”或“更长的”指，按照在相当的条件下的测定，聚乙二醇化OXM肽类似物，相对于参考分子(例如该肽的非聚乙二醇化形式或天然肽)，半衰期显著增加。例如，在猴中天然OXM的半衰期预期小于1小时。本发明的聚乙二醇化OXM肽类似物在猴中具有至少24小时的消除半衰期，且优选至少48小时。本文报道的半衰期是消除半衰期，其对应于终末对数线性消除率。本领域技术人员理解，半衰期是根据清除率和分布容量改变的衍生参数。

如本文使用的，术语“长效GLP-1R激动剂”指共价附着至一个或多个聚乙二醇(PEG)分子的GLP-1肽类似物。聚乙二醇化的GLP-1化合物公开于美国专利7,557,183中。

清除率是机体从循环中消除药物的能力的量度。当清除率由于例如对药物的修饰而下降时，半衰期将预期增加。然而，这个倒数关系仅在分布容量不变时是确切的。在终末对数线性半衰期(t_1/2)、清除率(C)和分布容量(V)之间的有用近似关系可以通过等式给出：t_1/2≈0.693(V/C)。清除率不是指多少药物被去除，而是指为了构成消除而不得不完全除去药物的生物学液体例如血液或血浆的体积。清除率表示为体积/单位时间。本发明的聚乙二醇化的OXM肽类似物在猴中优选具有200ml/h/kg或更少，更优选180、150、120、100、80、60ml/h/kg或更少，且最优选50、40或20ml/h/kg或更少的清除率值。

本发明的OXM肽类似物典型地肠胃外施用。肠胃外施用包括例如全身施用，例如通过肌内、静脉内、皮下、真皮内或腹膜内注射。将OXM肽类似物与（作为药物组合物的部分）的可接受药学载体、稀释剂或赋形剂结合施用于受试者，用于治疗非胰岛素依赖性(2型)糖尿病、NIDDM或下文讨论的相关病症。药物组合物可以是溶液或悬液，例如其中OXM肽类似物与二价金属阳离子例如锌复合。肽类似物还可以例如通过冷冻干燥或喷雾干燥以固体制剂配制，随后在施用前在合适的稀释剂溶液中重构。合适的药学载体可以含有不与肽或肽衍生物相互作用的惰性成分。用于肠胃外施用的合适药学载体包括例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含有约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank氏溶液、Ringer氏乳酸盐等。合适赋形剂的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和甘露醇和防腐剂例如苯酚和间甲酚。

可以采用标准药物配制技术，例如Remington's PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company，Easton，PA)中所述的那些。本发明的OXM肽类似物可以可替代地配制为用于经颊、经口、经皮、鼻或肺途径施用。本发明的OXM肽类似物可以配制用于延长释放，从而使得血浆水平在施用后在延长的时间段维持在有效范围中。

本发明的OXM肽类似物可以用于治疗糖尿病，特别是2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病，NIDDM)。可以获益于用本发明的OXM肽类似物治疗的另外受试者包括具有葡萄糖耐量异常或空腹葡萄糖受损的那些，体重超过对于该受试者的身高和体格而言的正常体重约25％或更多的受试者，父母的一个或多个患有NIDDM的受试者，已具有妊娠糖尿病的受试者，和具有代谢病症例如起因于减少的内源胰岛素分泌的病症的受试者。OXM肽类似物可以用于预防具有葡萄糖耐量异常的受试者进展至发生2型糖尿病，防止胰腺β细胞恶化，诱导β细胞增殖，改善β细胞功能，活化休眠β细胞，促进细胞分化成β细胞，刺激β细胞复制和抑制β细胞凋亡。可以在本发明的方法中使用本发明的化合物治疗或预防的其他疾病和状况包括：青春晚期糖尿病(MODY)(Herman，等人，Diabetes 43:40，1994)；成人隐性自身免疫型糖尿病(LADA)(Zimmet，等人，Diabetes Med.11:299，1994)；葡萄糖耐量异常(IGT)(Expert Committee on Classification ofDiabetes Mellitus，Diabetes Care 22(Supp.1):S5，1999)；空腹葡萄糖受损(IFG)(Charles，等人，Diabetes 40:796，1991)；妊娠糖尿病(Metzger，Diabetes，40:197，1991)；代谢综合征X、血脂异常、高血糖症、高胰岛素血症、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗。

本发明的OXM肽类似物还可以在本发明的方法中用于治疗糖尿病的继发性原因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus，Diabetes Care 22(Supp.l):S5，1999)。此类继发性原因包括糖皮质激素过量、生长激素过量、嗜铬细胞瘤和药物诱发性糖尿病。可以诱导糖尿病的药物包括但不限于灭鼠优(pyriminil)、烟酸、糖皮质激素、苯妥英（phenytoin）、甲状腺激素、β-肾上腺素能药、α-干扰素和用于治疗HIV感染的药物。

本发明的OXM肽类似物可以有效地抑制食物摄入和治疗肥胖。

OXM肽类似物的“有效量”是当施用于受试者时，导致期望的治疗和/或预防效应，而不引起无法接受的副作用的量。“期望的治疗效应”包括下述中的一种或多种：1)与疾病或病况相关的一种或多种症状的改善；2)与疾病或病况相关的症状的发作的延迟；3)与不存在治疗比较，增加的寿命；和4)与不存在治疗比较，更高的生活质量。例如，用于治疗NIDDM的OXM肽类似物的“有效量”是这样的量，其导致比在不存在治疗的情况下更大的血液葡萄糖浓度控制，从而导致糖尿病并发症例如视网膜病、神经病变或肾疾病的发作的延迟。例如在具有葡萄糖耐量异常或空腹葡萄糖受损的受试者中，用于预防NIDDM的OXM肽类似物的“有效量”是这样的量，即，与不存在治疗比较，其将延迟需要用抗高血糖药（例如磺酰脲、噻唑啉二酮、胰岛素和/或双胍类药(bisguanidines)）治疗的升高血糖水平的出现。

施用于受试者的OXM肽类似物的“有效量”还将依赖于疾病的类型和严重度，以及受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受。有效地使受试者的血液葡萄糖正常化的OXM肽类似物剂量将依赖于许多因素，其中包括但不限于受试者的性别、重量和年龄，不能调节血糖的严重度，施用途径和生物利用度，肽的药物代谢动力学谱，效力和制剂。

关于本发明的聚乙二醇化的OXM肽类似物，典型的每周一次剂量优选范围为约0.1mg–约1000mg(缀合物的总重量)。更优选地，每周一次剂量范围为约1mg–约100mg，或约1mg–约30mg。最优选地，每周一次剂量范围为约5mg–约30mg，或约1mg–约5mg。

受试者是哺乳动物，优选人，但也可以是动物，包括伴侣动物(例如犬、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。

本发明的多个优选特征和实施方案现在将通过实施例加以描述。

实施例1：肽合成

根据本发明的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的肽类似物通过固体肽合成在Protein Technologies Inc.Symphony或Applied Biosystems 433A自动化肽合成仪上生成。合成在具有约0.7mmol/g取代率的Fmoc-Rink酰胺聚苯乙烯树脂(Rapp Polymere Tubingen，德国)上执行。使用Fmoc主链保护基团策略执行合成。使用的氨基酸侧链衍生物是：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(OtBu)、Thr(OtBu)、Trp(Boc)和Tyr(OtBu)。在二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中用由二异丙基碳化二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑(HOBt)活化的氨基酸(1:1:1摩尔比)约10当量执行偶联。偶联在室温执行45–90分钟。

在含有三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷：3,6-二氧杂-1,8-辛烷-二硫醇：甲醇：茴香醚90:4:2:2:2(v/v)的溶液中在室温1.5-2小时，同时进行从树脂上切割和侧链保护基团去除。将溶液过滤且浓缩至<2mL，并且用冷乙醚沉淀肽，再溶解于30-40mL 10％乙腈中且在C18反相高效液相色谱(HPLC)柱(一般为Waters SymmetryPrep 7um，19x 300mm)上以12-15mL/分钟的流速纯化。用2阶段线性AB梯度——20分钟0-25％B，随后为100分钟25-75％B——洗脱样品，其中A=0.05％TFA/水，并且B=0.05％TFA/乙腈。产物一般在30-35％乙腈洗脱。肽纯度和分子量在具有单四极杆MS检测器的Agilent 1100 Series液相色谱-质谱(LC-MS)系统上加以证实。分析型HPLC分离在Zorbax Eclipse XDB-C8，5微米，4.6mm i.d.x 15cm柱上用线性AB梯度——经过15分钟6-60％B——完成，其中A=0.05％ TFA/H2O和B=0.05％ TFA/乙腈，并且流速是1ml/分钟。将肽类似物纯化至>95％纯度，且证实具有在1原子质量单位(amu)内相应于计算值的分子量。

实施例2：含有2个Cys残基的肽由mPEG-MAL-20kDa聚乙二醇化

将根据实施例1生成的冻干的肽类似物(SEQ ID NO：2)称出(一般为30-50mg)。将2.1倍摩尔当量的mPEG-20kDa马来酰亚胺(CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-马来酰亚胺)(NOF SunbrightME-200MA)称出且与肽组合。将反应物在50/50(v/v)水/乙腈混合物中溶解至约20mg/mL的肽浓度。用100mM乙酸铵、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7将肽类似物溶液稀释2倍。随后将所得到的混合物在室温搅拌。通过分析型反相HPLC监控反应混合物(分析型HPLC分离在Waters SymmetryShield C18，3.5微米，4.6mm i.d.x 10cm柱上在50℃进行，其中使用2阶段线性AB梯度——5分钟0-30％B和后续30分钟30-90％B，其中A=0.05％TFA/H2O和B=0.05％TFA/乙腈，并且流速是1ml/分钟)，一般在1-2小时反应时间后，反应混合物显示肽峰的几乎完全消失。出现由于单和二聚乙二醇化肽引起的2个峰，其中二聚乙二醇化肽一般构成总峰面积的90-95％。随后用水将样品稀释至约20mL，并且如实施例1中，用2阶段线性AB梯度——经过20分钟0-30％B，随后为经过100分钟30-80％B，进行纯化。产物一般在35–40％乙腈洗脱。纯化的肽，使用基于肽序列的计算摩尔消光系数，通过280nm紫外(UV)吸光度，进行定量。纯化后的得率，基于起始肽的量，为70-80％范围中。

实施例3：胰高血糖素受体(hGcgR)结合测定

胰高血糖素受体结合测定利用从293HEK膜中分离的克隆的人胰高血糖素受体(hGcgR)(Lok S，Kuijper JL，Jelinek LJ，Kramer JM，WhitmoreTE，Sprecher CA，Mathewes S，Grant FJ，Biggs SH，Rosenberg GB，等人Gene 140(2)，203-209(1994))。将hGlucR cDNA亚克隆到表达质粒phD内(Trans-activated expression of fully gamma-carboxylatedrecombinant human protein C，an antithrombotic factor.Grinnell，B.W.，Berg，D.T.，Walls，J.和Yan，S.B.Bio/Technology 5：1189-1192(1987))。将此质粒DNA转染到293HEK细胞内，并且用200μg/ml潮霉素选择。

使用来自悬浮培养的细胞制备粗质膜。将细胞在冰上在低渗缓冲液中裂解，所述低渗缓冲液含有25mM Tris HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，DNAse1，20ug/ml，和Roche完全抑制剂，不含EDTA。用玻璃杜恩斯匀浆器，使用Teflon研棒进行25次击打，将细胞悬液匀浆化。将匀浆物在4℃以1800xg离心15分钟。收集上清液并且将沉淀重悬浮于低渗缓冲液中且再匀浆化。将混合物以1800xg离心15分钟。将第二份上清液与第一份上清液组合。将组合的上清液以1800xg离心15分钟以澄清。将澄清的上清液转移至高速管，且以25000xg在4℃离心30分钟。将膜沉淀物重悬浮于匀浆化缓冲液中，且作为冷冻等分试样贮存于-80℃直至使用时。

通过¹²⁵I-乳过氧化物酶程序将胰高血糖素放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN(NEX207)上纯化。比活性是约2200Ci/mmol。由于在¹²⁵I标记的胰高血糖素材料中的高丙醇含量，故通过同源竞争代替饱和结合来进行K_D测定。K_D估计为2.62nM，并且对于测试的所有化合物用于计算Ki值。

使用闪烁亲近测定法(SPA)执行受体结合测定试验，其中用先由1％无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)封闭的麦胚凝集素(WGA)珠。结合缓冲液含有25mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH 7.4，2.5mM CaCl2，1mMMgCl2，0.1％无脂肪酸BSA，0.003％Tween20，和Roche完全抑制剂，不含EDTA。将胰高血糖素以1mg/ml溶解于0.01N HCl中，并且立即以30μl等分试样冷冻于-80℃。将胰高血糖素等分试样稀释且在1小时内在结合测定试验中使用。将OXM肽类似物溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并且在结合缓冲液中系列稀释。接下来，将10μl稀释的化合物或PBS转移到含有40μl测定结合缓冲液或冷胰高血糖素(非特异性结合(NSB)，1μM最终)的Corning 3632透明底部测定板内。随后，加入90μl膜(3μg/孔)、50μl¹²⁵I-胰高血糖素(在反应中0.15nM终浓度)和50μl WGA珠(150μg/孔)。将板密封，颠倒混合且在室温12小时放置时间后用MicroBeta闪烁计数器读数。

结果计算为在化合物的存在下的特异性¹²⁵I-标记的胰高血糖素结合百分比。化合物的绝对IC50浓度通过¹²⁵I-标记的胰高血糖素特异性结合百分比相对于加入的化合物浓度的非线性回归来获得。使用Cheng-Prusoff公式(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.22，3099-3108，1973)，将IC50剂量转换为Ki。对于hGcgR结合，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物的Ki是2050±70nM。

实施例4：胰高血糖素样肽1受体(hGLP-1-R)结合测定

GLP-1受体结合测定使用从293HEK膜中分离的克隆的人胰高血糖素样肽1受体(hGLP-1R)(Graziano MP，Hey PJ，Borkowski D，Chicchi GG，Strader CD，Biochem Biophys Res Commun.1993Oct 15；196(1):141-6)。将hGLP-1R cDNA亚克隆到表达质粒phD内(Trans-activated expressionof fully gamma-carboxylated recombinant human protein C，anantithrombotic factor.Grinnell，B.W.，Berg，D.T.，Walls，J.和Yan，S.B.Bio/Technology 5：1189-1192(1987))。将此质粒DNA转染到293HEK细胞内，并且用200μg/ml潮霉素选择。

通过¹²⁵I-乳过氧化物酶程序将胰高血糖素样肽1（GLP-1）放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN(NEX308)上纯化。比活性是约2200Ci/mmol。由于在¹²⁵I-GLP-1材料中的高丙醇含量，故通过同源竞争代替饱和结合来进行K_D测定。K_D估计为0.96nM，并且对于测试的所有化合物用于计算Ki值。

使用闪烁亲近测定法(SPA)执行受体结合测定试验，其中用先由1％无脂肪酸BSA(ICN)封闭的麦胚凝集素(WGA)珠。结合缓冲液含有25mMHEPES，pH 7.4，2.5mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％无脂肪酸BSA，0.003％Tween20，和Roche完全抑制剂，不含EDTA。将GLP-1以1mg/ml溶解于PBS中，并且立即以30μl等分试样冷冻于-80℃。将GLP-1等分试样融化、稀释且在1小时内在结合测定试验中使用。将OXM肽类似物溶解于PBS中，并且在结合缓冲液中系列稀释。接下来，将10μl稀释的化合物或PBS转移到含有40μl测定结合缓冲液或冷GLP-1(NSB，1μM最终)的Corning 3632透明底部测定板内。随后，加入90μl膜(1μg/孔)、50μl¹²⁵I-标记的GLP-1(在反应中0.15nM终浓度)和50μl WGA珠(150μg/孔)。将板密封，颠倒混合且在室温12小时放置时间后用MicroBeta闪烁计数器读数。

结果计算为在化合物的存在下的特异性¹²⁵I标记的GLP-1结合百分比。化合物的绝对IC50浓度通过¹²⁵I-GLP-1特异性结合百分比相对于加入的化合物浓度的非线性回归来获得。使用Cheng-Prusoff等式(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.22，3099-3108，1973)，将IC50浓度转换为Ki。对于hGLP-1R结合，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物的Ki是73±23nM。

实施例5：胰高血糖素受体(hGcgR)刺激的cAMP功能测定

胰高血糖素刺激的cAMP功能测定试验，与上文实施例3中所述的hGcgR结合测定，使用相同的克隆的hGcgR表达细胞系。用OXM肽类似物刺激细胞，并且使用来自Perkin Elmer(6760625R)的放大的发光邻近均相测定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)(α筛选)定量在细胞内生成的cAMP。简言之，在细胞内诱导的cAMP与来自试剂盒的生物素化的cAMP竞争结合包被的抗cAMP抗体受体珠和链霉亲和素包被的供体珠。随着细胞内的cAMP水平增加，出现受体珠-生物素化的cAMP-供体珠复合物的破裂，并且降低观察到的信号。

用无酶细胞解离溶液(专门培养基5-004-B)从亚汇合的组织培养皿中收获hGcgR-HEK293细胞。将细胞以低速沉淀，并且用测定缓冲液[在Hank氏缓冲盐溶液(HBSS)中的25mM HEPES，含有Mg和Ca(GIBCO，14025-092)和0.1％无脂肪酸BSA]洗涤3次，并且随后稀释至125,000个细胞/ml的终浓度。将来自α筛选试剂盒的生物素化的cAMP以1单位/0.04ml的终浓度加入稀释的细胞中。还将磷酸二酯酶抑制剂IBMX(在二甲基亚砜(DMSO)中250mM)加入稀释的细胞中至500uM的终浓度。胰高血糖素最初以1mg/ml溶解于0.01N HCl中，并且立即冷冻于-80℃。在解冻后，胰高血糖素应在1小时内使用。将胰高血糖素、cAMP标准和OXM肽类似物系列稀释到测定缓冲液中至6X终浓度。功能测定在96孔、低容量、白色、聚苯乙烯Costar板(3688)中执行。通过将0.01ml稀释的肽、胰高血糖素或cAMP加入0.04ml细胞混合物内起始反应。在室温1小时后，通过加入0.03ml裂解缓冲液[10mM HEPES，pH 7.4，1％NP40，和0.01％无脂肪酸BSA，含有来自α筛选试剂盒的各1单位/0.03ml受体和供体珠]停止反应。裂解缓冲液的添加在黑暗中进行，以防止这些检测珠的漂白。将板在箔中包裹，轻轻振荡1分钟，随后留置以在室温过夜平衡。在Perkin-Elmer Envision仪器上阅读板。基于cAMP标准曲线，将α筛选单位转换为生成的pmoles cAMP/孔。将在每个孔中生成的pmoles cAMP转换为用胰高血糖素对照观察到的最大应答的百分比。使用最大应答百分比相对于加入的肽浓度，通过非线性回归分析，得到EC50值。如同野生型OXM，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对于hGcgR是完全有效且有力的，具有59.9±4.14nM的EC50。

实施例6：胰高血糖素样肽1受体(hGLP-1R)刺激的cAMP功能测定

GLP-1刺激的cAMP功能测定，与上文实施例4中所述的hGLP-1R结合测定，使用相同的克隆的hGLP-1R表达细胞系。用OXM肽类似物刺激细胞，并且使用来自Perkin Elmer(6760625R)的放大的发光邻近均相测定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)(α筛选)定量在细胞内生成的cAMP。简言之，在细胞内诱导的cAMP与来自试剂盒的生物素化的cAMP竞争结合包被的抗cAMP抗体受体珠和链霉亲和素包被的供体珠。随着细胞内的cAMP水平增加，出现受体珠-生物素化的cAMP-供体珠复合物的破裂，并且减少观察到的信号。

用无酶细胞解离溶液(专门培养基5-004-B)从亚汇合的组织培养皿中收获hGLP-1R-HEK293细胞。将细胞以低速沉淀，并且用测定缓冲液[在HBSS中的25mM HEPES，含有Mg和Ca(GIBCO，14025-092)和0.1％无脂肪酸BSA]洗涤3次，并且随后稀释至125,000个细胞/ml的终浓度。将来自α筛选试剂盒的生物素化的cAMP以1单位/0.04ml的终浓度加入稀释的细胞中。还将磷酸二酯酶抑制剂IBMX(在二甲基亚砜(DMSO)中250mM)加入稀释的细胞中至500μM的终浓度。GLP-1以1mg/ml在PBS中等分冷冻于-80℃。将GLP-1、cAMP标准和OXM肽类似物系列稀释到测定缓冲液中至6X终浓度。功能测定在96孔、低容量、白色、聚苯乙烯Costar板(3688)中执行。通过将0.01ml稀释的OXM肽类似物、GLP-1或cAMP加入0.04ml细胞混合物内起始反应。在室温1小时后，通过加入0.03ml裂解缓冲液[10mM HEPES，pH 7.4，1％NP40，和0.01％无脂肪酸BSA，含有来自α筛选试剂盒的各1单位/0.03ml受体和供体珠]停止反应。裂解缓冲液的添加在黑暗中进行，以防止这些检测珠的漂白。将板在箔中包裹，轻轻振荡1分钟，随后留置以在室温过夜平衡。在Perkin-Elmer Envision仪器上阅读板。基于cAMP标准曲线，将α筛选单位转换为生成的pmoles cAMP/孔。将在每个孔中生成的pmoles cAMP转换为用GLP-1对照观察到的最大应答的百分比。使用最大应答百分比相对于加入的肽浓度，通过非线性回归分析，得到EC50值。如同野生型OXM，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对于hGLP-1R是完全有效且有力的，具有2.75±0.55nM的EC50。

实施例7：在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中对食物摄入、体重和机体组成的影响

使用3–4月龄的雄性饮食诱导肥胖(DIO)C57BL/6小鼠。动物单个地饲养在具有12小时光/暗周期(照明在22:00时)的温度控制(24℃)设施中，并且自由获取食物和水。在适应设施2周后，将小鼠随机分到处理组(n=8-10只/组)，每个组具有相似的平均体重和脂肪质量。在试验前，将小鼠用媒介物溶液皮下(sc)注射且称重2天以使其适应程序。

通过sc注射将媒介物或在媒介物中溶解的OXM肽类似物(剂量范围6.7-20nmole/kg)施用于随意进食的DIO小鼠，30-90分钟后开始黑暗周期，每3天一次，进行2-4周。同时测量体重和食物加上给料斗的重量。通过从前一天的食物加上给料斗重量中扣除食物加上给料斗的目前重量，计算在先前24小时中消耗的食物。通过扣除在第一次注射前的动物体重，计算体重中的绝对变化。在第1、14和28天时，使用Echo MedicalSystem(Houston，TX)仪器，通过核磁共振(NMR)测量总脂肪质量。通过从总体重中扣除脂肪质量，计算无脂肪质量。

研究1：两周处理

其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物在体内通过皮下注射施用于4月龄的雄性饮食诱导肥胖(DIO)小鼠C57BL/6。将OXM肽类似物以7.5和15nmole/kg的剂量每3天注射1次，共2周，并且与媒介物处理的小鼠和阳性对照(每3天注射一次7.5nmole/kg长效GLP-1R激动剂)处理的动物比较。

用其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理，在食物摄入和体重中产生剂量依赖性降低。在2周研究期结束时，当与媒介物组比较时，在15nmole/kg组中的累积食物摄入减少27％。7.5nmole/kg组的累积重量减轻类似于以阳性对照观察到的减轻，当与媒介物组比较时，其为约9％减轻。15nmole/kg处理组的媒介物对照的累积重量减轻为18％。机体组成分析显示重量减轻主要是由于脂肪质量的丧失(表1)。

表1

经过14天处理期在DIO小鼠中的重量变化

(平均值±SEM；n=8)

这些数据显示，与媒介物处理的小鼠比较，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物在14天DIO小鼠研究中减少累积食物摄入和体重。减少的体重主要是由于脂肪重量的减少所致。与媒介物比较，^*p<0.05（Dunnett氏检验）

研究2：四周处理

其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物(6.7或20nmole/kg)和阳性对照(7.5或22.5nmole/kg长效GLP-1R激动剂)每3天一次通过皮下注射施用于4月龄的雄性饮食诱导肥胖(DIO)C57BL/6，共4周。

用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物高剂量处理，显著减少累积食物摄入。在较低剂量时，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物降低体重，程度类似于在阳性对照组中观察到的。在20nmole/kg剂量时，当与22.5nmole/kg剂量的阳性对照比较时，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物引起显著更大的重量减轻。在处理15天后达到最大重量减少（约25％的起始体重）。机体组成分析证实与OXM肽类似物和阳性对照相关的重量减轻主要是由于脂肪质量的丧失引起的（表2）。

在第21–23天时，用间接量热法进一步评估其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物的作用。用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物（20nmole/kg）处理的动物，具有比媒介物处理的对照显著更高的能量消耗（在第21天时的平均24小时能量消耗增加18％）。其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物相对于媒介物对照不导致在运动活动水平上的显著变化。

在研究完成时，血浆胰岛素和胆固醇水平在所有治疗组中显著低于媒介物处理的对照，而仅有用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物高剂量处理的组具有显著减少的瘦素水平。所有肽处理的组都具有比媒介物处理的对照更高的血浆脂连蛋白水平，但仅有用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物高剂量处理的组具有统计上的显著差异。

表2

经过28天处理期在DIO小鼠中的重量变化

（平均值±SEM；n=9）

这些数据显示，与媒介物处理的小鼠比较，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物在28天DIO小鼠研究中减少累积食物摄入和体重。减少的体重主要是由于脂肪重量的减少。与媒介物比较，^*p<0.05(Dunnett氏检验)

实施例8：在DIO小鼠中在2周或4周处理后对在腹膜内葡萄糖耐量测试或口服葡萄糖耐量测试过程中血糖波动(excursion)的影响

在DIO小鼠中如实施例7（研究1）中所述的最后一次注射后56小时，在葡萄糖耐量测试开始前将小鼠禁食16小时。在时间0时，动物通过经口管饲法或腹膜内(IP)注射，给予2g/kg葡萄糖。在葡萄糖攻击后0、15、30、60和120分钟时，通过尾静脉放血，收集血液。通过血糖仪测量葡萄糖浓度。当与媒介物处理的对照比较时，在口服葡萄糖攻击前和后测量的所有时间点上，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物以及阳性对照的所有剂量均显著降低了血液葡萄糖（表3）。

在DIO小鼠中如实施例7（研究2）中所述的末次注射后3天，在第29天时执行腹膜内葡萄糖耐量测试（IPGTT）。低剂量的其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物，相对于媒介物处理的对照，降低空腹血液葡萄糖，但对在IP葡萄糖攻击后的葡萄糖水平具有很少作用。当与媒介物处理的对照比较时，在IP葡萄糖攻击前和后测量的所有时间点上，高剂量的其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物以及阳性对照的两个剂量都显著降低血液葡萄糖（表4）。

表3

其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对口服葡萄糖负荷施用后血糖波动的影响数据作为葡萄糖曲线下面积给出（=从t+0到120分钟的积分值）（n=8）

这些数据显示，用其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQID NO：3的OXM肽类似物在DIO小鼠中进行2周处理后，口服葡萄糖负荷后血糖波动显著减少。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

表4

其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对腹膜内（ip）葡萄糖负荷后血糖波动的影响数据作为葡萄糖曲线下面积给出（=从t+0到120分钟的积分值）（n=6）

这些数据显示，用其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQID NO：3的OXM肽类似物在DIO小鼠中进行4周处理后，腹膜内(ip)葡萄糖负荷后血糖波动显著减少。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

实施例9：在消瘦小鼠中对在腹膜内葡萄糖耐量测试过程中血糖波动的影响

在该研究中使用9周龄的雄性C57BL/6小鼠。基于摄食体重，将动物随机分成组。在测试开始前16小时，用媒介物或OXM肽类似物(剂量5.0-15.0nmole/kg)注射动物。在肽或媒介物注射时移除食物。在时间0时，动物通过IP注射给予2g/kg葡萄糖。在葡萄糖攻击后0、3、6、12和30分钟时，通过尾静脉放血，收集血液。通过血糖仪测量葡萄糖浓度。通过Mesoscale测量胰岛素。

当与媒介物处理的对照比较时，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物的高剂量显著降低血液葡萄糖波动(表5)。当与媒介物处理的对照比较时，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物的两种剂量都显著增加了血浆胰岛素浓度(表6)。

表5

在消瘦小鼠中，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物对腹膜内（ip）葡萄糖耐量测试后血糖波动的影响数据作为葡萄糖曲线下面积给出（=从t+0到30分钟的积分值）（n=6）

这些数据显示在消瘦小鼠中，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物显著减少腹膜内(ip)葡萄糖耐量测试后血糖波动。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

表6

在消瘦小鼠中，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物

对腹膜内（ip）葡萄糖耐量测试后血浆胰岛素浓度的影响数据作为胰岛素曲线下面积给出（=从t+0到30分钟的血浆胰岛素积分值）（n=6）

这些数据显示在消瘦小鼠中，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物显著增加在腹膜内(ip)葡萄糖耐量测试后血浆胰岛素AUC。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

实施例10：在肥胖(ob/ob)小鼠中对在口服葡萄糖耐量测试(OGTT)或腹膜内(ip)葡萄糖耐量测试(IPGTT)过程中血糖波动的影响

将2–3月龄的雄性ob/ob小鼠单个地饲养在具有12小时光/暗周期(照明在2200小时时)的温度控制(24℃)设施中，并且自由获取标准食物和水。在适应设施至少2周后，通过在9AM时的尾静脉放血，测量3小时空腹血糖。不使用具有在180mg/dL以下的血糖的小鼠。将剩余小鼠随机分到处理组(N=6-7只/组)，每个组具有相似的平均血糖水平。小鼠准许接近食物直至注射时。在同一天的4PM时，用媒介物或7.5nmole/kg OXM肽类似物注射动物。在注射时去除食物。在肽注射后16小时执行OGTT(表7)或IPGTT(表8)。在时间0时，动物通过经口管饲法(表7)或腹膜内注射(表8)给予2g/kg葡萄糖。在葡萄糖攻击后0、15、30、60和120分钟时，通过尾静脉放血，收集血液。通过血糖仪测量血糖浓度。

在ob/ob小鼠中单次注射其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物，使血液葡萄糖正常化。在葡萄糖攻击后测量的所有时间点上，血液葡萄糖水平显著低于媒介物对照组的水平。

表7

在ob/ob小鼠中，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ IDNO：3的OXM肽类似物对在口服葡萄糖耐量测试后血糖波动的影响数据作为葡萄糖曲线下面积给出（=从t+0到120分钟的积分值）（n=7）

这些数据显示在ob/ob小鼠中，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物显著减少在口服葡萄糖耐量测试后血糖波动。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

表8

在ob/ob小鼠中，其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物

对在腹膜内（ip）葡萄糖耐量测试后血糖波动的影响数据作为葡萄糖曲线下面积给出（=从t+0到120分钟的积分值）（n=6）

这些数据显示在ob/ob小鼠中，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物显著减少在腹膜内(ip)葡萄糖耐量测试后血糖波动。统计显著性通过Dunnett氏检验进行评价。(与媒介物比较，^*p<0.05)

实施例11：在雄性饮食诱导肥胖C57BL/6小鼠中对血浆FGF21、甘油三酯水平和肝脏基因表达的急性作用

为了独立于重量减轻，研究通过用其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理所调节的代谢途径，OXM肽类似物和阳性对照(长效GLP-1R激动剂)通过皮下注射施用于3月龄的雄性饮食诱导肥胖(DIO)小鼠。在研究前一天，将小鼠随机分到处理组(n=7只/组)，每个组具有相似的平均体重。同一晚(约10PM)，将动物置于清洁笼内，并且通过皮下注射用媒介物或OXM肽类似物给药。OXM肽类似物和对照以22.5nmole/kg施用。在肽或媒介物注射时去除食物。第二天早晨(约10AM)，将动物处死，以收集血浆和肝脏组织。使用Hitachi血液化学分析仪测量葡萄糖和甘油三酯浓度。通过RT-PCR测定基因表达。通过HPLC测量丙二酰-CoA水平和乙酰CoA水平。

在单次注射后，在所有处理组中血浆葡萄糖相对于媒介物对照是显著减少的。仅在用其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理的小鼠中，而不在用长效GLP-1R激动剂处理的小鼠中，血浆甘油三酯水平相对于媒介物对照是减少的。在用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理后，与媒介物对照比较，肝丙二酰-CoA和乙酰-CoA浓度分别显著减少63％和39％。用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理，改变了几种肝脏基因的表达，包括pgc-1α基因表达7倍的增加以及ChREBP和PCSK9基因表达分别52％和61％的减少。此外，在用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物急性处理后，肝脏FGF21基因表达被诱导17倍，对应于循环FGF21的6倍增加。所有这些变化特异于用其中在位置39上的Cys（PEG20k）是酰胺化的SEQ ID NO：3的OXM肽类似物处理的小鼠。

Claims

1.一种泌酸调节肽类似物，其具有氨基酸序列：

His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Aib-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa₃₈-Xaa₃₉(SEQ ID NO：5)

其中Xaa₃₈是Cys、Cys-PEG或不存在；Xaa₃₉是Cys、Cys-PEG或不存在；

并且其中C末端氨基酸是任选酰胺化的。

2.根据权利要求1的泌酸调节肽类似物，其具有氨基酸序列：

His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Aib-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO：2)

其中在位置38上的Cys残基是任选聚乙二醇化的；并且其中在位置39上的Cys残基是任选聚乙二醇化的；并且在位置39上的Cys的羧基是任选酰胺化的。

3.根据权利要求2的泌酸调节肽类似物，其中所述类似物在位置38或位置39的Cys残基的巯基上由40 kDa PEG分子进行聚乙二醇化。

4.根据权利要求2的泌酸调节肽类似物，其中所述类似物在位置38和39的2个Cys残基的巯基上各自由20 kDa PEG分子进行聚乙二醇化，并且具有氨基酸序列：

His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Aib-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(PEG20K)一Cys(PEG20K)(S EQ ID NO：3)

其中在位置39上的聚乙二醇化Cys残基的羧基是任选酰胺化的。

5.根据权利要求1-4中任一项的泌酸调节肽类似物，其中所述PEG分子是线性的。

6.根据权利要求1–4中任一项的泌酸调节肽类似物，其中在位置39上的Cys残基的羧基是酰胺化的。

7.根据权利要求1的泌酸调节肽类似物，其中在位置39上的Cys残基不存在，并且在位置38上的Cys残基由40kDa PEG分子聚乙二醇化，并且是任选酰胺化的。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1–7中任一项的泌酸调节肽类似物，和药学可接受的赋形剂。

9.根据权利要求1–7中任一项的泌酸调节肽类似物用于制备在非胰岛素依赖性糖尿病治疗中使用的药物中的用途。

10.根据权利要求1–7中任一项的泌酸调节肽类似物用于制备在肥胖治疗中使用的药物中的用途。