TWI423812B

TWI423812B - 調酸素肽類似物

Info

Publication number: TWI423812B
Application number: TW099143356A
Authority: TW
Inventors: Jorge Alsina-Fernandez; Wayne David Kohn
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2014-01-21
Also published as: IL220161A0; NZ600731A; PH12012501263B1; EP2515928A1; CN102740873B; WO2011087672A1; EA022820B1; KR101399671B1; AU2010341651A1; JP2013515057A; IL220161B; CA2784671C; KR20120096022A; EA201290549A1; EP2515928B1; SG181430A1; CO6551738A2; PH12012501263A1; PT2515928E; HN2012001321A

Description

調酸素肽類似物

本發明係關於一種用於治療糖尿病及/或肥胖症之調酸素肽類似物或係關於其PEG化衍生物。

調酸素(oxyntomodulin；OXM)係一種具有37個胺基酸肽激素，其係隨著胰高血糖素樣肽1(Glucagon-Like-Peptide 1；GLP-1)從小腸L-細胞釋放出來的，其與營養攝取成比例。調酸素係由胰高血糖素(Gcg)完整的29個殘基序列與因胰高血糖素前體之組織特異性交替加工導致在C-末端延伸8胺基酸肽所組成。內生性OXM會在活體內藉由二肽基肽酶IV及其他肽酶快速降解。

迄今仍未識別出OXM之不同的受體。OXM在活體外會以對GLP-1受體(GLP-1R)及胰臟高血糖素受體(GcgR)具有類似效力結合至GLP-1R及GcgR二者上並使其等完全活化。

OXM與食物攝取及體重之調節相關。正常體重人個體經急性投與OXM會減少飢餓並使進餐量減少19%。在超重及肥胖個體之4-周研究中，每天三次在餐前以皮下方式投與OXM後體重會減輕2.3公斤，相較於安慰劑組體重只減輕0.5公斤。在此試驗中，與以GLP-1為主的治療(諸如衣森泰德(exenatide)及利戈魯泰(liraglutide))相關之最常見的副作用(噁心)明顯較少出現。雖然並不清楚作用機制，但OXM可經由促進超重及肥胖人生理活性增加而提高能量的利用。

就開發成市售治療試劑而言，OXM存在若干挑戰。如上所提及，由於其分子小，OXM在活體內會被快速地降解及經受腎臟快速清除。因此希望識別出具有經改良的代謝穩定性及較低清除速率之OXM肽類似物。此外，OXM與生俱來的GcgR激動劑活性存在著負面影響血糖控制之風險。因此，亦希望在保持GLP-1R與GcgR之間的活性適當平衡的同時，使經設計用於治療用途之OXM肽類似物的效力達到最佳狀態。GLP-1R之活化作用係負責促胰島素分泌作用，然而GLP-1R及GcgR二者之活化作用卻在減重效果上起了作用。因此咸欲產生具有促胰島素分泌活性及促進減重之OXM肽類似物，以使得其可用於治療非胰島素依賴性糖尿病及/或肥胖症。

經胺基酸取代以改善穩定性及經歷其他的改質(諸如PEG化及脂化)以減緩清除率之OXM肽揭示於WO 2008101017、WO 2006134340、WO 2007100535、及Pocai等人之Diabetes 58:2258-2266，2009中。雖然此等OXM-衍生肽較野生型肽具有效性的改良，但要使經飲食誘導肥胖(diet-induced obese；DIO)小鼠模型中達到減輕相當大重量所需要之劑量通常係高於醫藥商業化可行性所考慮之劑量。例如，Pocai等人(2009)報告每隔1天投與1900 nmol/kg(~8 mg/kg)的劑量(QOD)達13天之後，重量平均減少11 g(~25%)。

儘管不同的OXM肽及其類似物具有實用性，但仍然需要具最佳GcgR/GLP-1R活性比率之更有效力、更穩定、更長效及良好耐受性之OXM肽類似物，以使得該肽之效力及促胰島素分泌活性可有效地治療糖尿病，較佳為2型糖尿病及相關的失調症。咸欲希望提供具有效治療之OXM肽類似物以減少體重。因此，本發明致力於提供糖尿病及/或肥胖症之有效的治療。

本發明包括一種具有經引入胺基酸取代物之OXM肽類似物，以便在保持整體效力最佳的同時，能最佳化代謝穩定性及調節相對GcgR/GLP-1R活性。此外，本發明OXM肽類似物在所選位置上經PEG化，以便增強時間作用，藉此降低投藥頻率。

本發明提供一種包括下列胺基酸序列之調酸素肽類似物：

其中Xaa₃₈ 係Cys、Cys-PEG或不存在，Xaa₃₉ 係Cys、Cys-PEG或不存在，及其中該C-末端胺基酸視需要經醯胺化。

本發明提供一種包括下列胺基酸序列之調酸素肽類似物：

此外，本發明提供一種包括下列胺基酸序列之調酸素肽類似物：

其中位置38處Cys視需要經PEG化，及其中位置39處Cys視需要經PEG化及位置39處Cys之羧基視需要經醯胺化。

較佳地，SEQ ID NO: 2之調酸素肽類似物係經PEG化，其係將40 kDa PEG分子以共價連接至位置38處或位置39處或此二處之Cys的硫醇基上。更佳地，該調酸素肽類似物係經PEG化，其係將20 kDa PEG分子以共價連接至位置38及位置39二處之每一Cys殘基之每一硫醇基團上。視需要而定，SEQ ID NO: 2可不含位置39處之Cys殘基，僅在位置38處留下單一位點進行PEG化。

更佳的調酸素肽類似物包括以下胺基酸序列：

其中位置39處經PEG化Cys的羧基視需要經醯胺化。

最佳的調酸素肽類似物包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，其中位置39處經PEG化Cys的羧基經醯胺化。

用於本發明PEG分子可為直鏈或分支鏈，及較佳為直鏈PEG分子。

本發明提供一種包括以上所定義之調酸素肽類似物、及醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。此外，本發明提供一種包括如上所定義之調酸素肽類似物，併同醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑及視需要包括其他治療成分之醫藥組合物。

此外，本發明提供一種治療有其需要個體中非胰島素依賴性(2型)糖尿病之方法，其包括投與有其需要個體有效量的如上所定義之調酸素肽類似物。

此外，本發明提供一種治療有其需要個體中胰島素依賴性(1型)糖尿病之方法，其包括投與有其需要個體有效量的如上所定義之調酸素肽類似物。

本發明包括一種治療有其需要個體中肥胖症之方法，其包括投與有其需要個體有效量的如上所定義之調酸素肽類似物。

此外，本發明包括一種治療有其需要個體中非胰島素依賴性糖尿病及肥胖症之方法，其包括投與有其需要個體有效量的如上所定義之調酸素肽類似物。

本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物，以作為藥劑之用。

此外，本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物，以作為治療非胰島素依賴性糖尿病之用。

此外，本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物，以作為治療胰島素依賴性糖尿病之用。

此外，本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物，以作為治療肥胖症之用。

本發明包括一種如上所定義之調酸素肽類似物，以作為治療非胰島素依賴性糖尿病及肥胖症肥之用。

本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造治療非胰島素依賴性糖尿病之藥劑。

此外，本發明包括一種如上所定義之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造治療胰島素依賴性糖尿病之藥劑。

此外，本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造治療肥胖症之藥劑。

此外，本發明提供一種如上所定義之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造治療非胰島素依賴性糖尿病及肥胖症之藥劑。

本發明OXM肽類似物可有效地結合至GLP-1受體(GLP-1R)與胰高血糖素受體(GcgR)二者上，並使該等受體活化。

咸亦已發現本發明OXM肽類似物比人類天然OXM更能耐受肽酶降解作用，特定言之二肽基肽酶IV。因此，本發明OXM肽類似物相對於人類天然OXM具有經改良的活體內穩定性。

根據本發明各式實施例能夠造成超重及肥胖個體減少食物攝入量。

本發明特定優勢係副作用頻率減少或沒有副作用，該等副作用通常係與以GLP-1為主的治療相關(諸如衣森泰德(exenatide)及利戈魯泰(liraglutide))，諸如噁心。因此，本發明相較於以GLP-1為主的治療而言副作用會減少。

本發明OXM肽類似物相對於人類野生型OXM亦具有較優的減重作用。

根據本發明一個實施例，該調酸素肽類似物對罹患2型糖尿病及/或相關新陳代謝障礙之個體具有經改良的葡萄糖耐受性及脂質特性，及據此比人類野生型OXM更加有效。

調酸素(OXM)係一種微弱的共激動劑，其在穩定性過表現各自受體之HEK293細胞中對hGLP-1R及hGcgR具有完全效力及平衡效力，其EC₅₀ 值分別約6.7±2.7 nM及4.1±1.7 nM之。人類天然OXM序列如下所示：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO: 4)。

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物係一種完全有效及藥效大的調酸素肽類似物，其對hGcgR及hGLP-1R分別具有59.9±4.14 nM及2.75±0.55 nM之EC₅₀ 。因此，其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物在活體外具有功能活性之平衡，其對hGLP-1R具有比hGcgR高~22倍的選擇性。對於結合親和力Ki可觀察到類似的結果，其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對hGLP-1R具有比hGcgR高28倍之選擇性，且分別具有73±23 nM及2050±70 nM之Ki值。

當與非PEG化OXM肽類似物相比較，一或多個PEG分子共價結合至OXM特定殘基後可產生出具有較長半衰期及清除率降低且GLP-1R活體外效力類似於人類天然OXM活體外效力者之PEG化OXM肽類似物。如果是在OXM肽類似物分子尺寸小而PEG分子尺寸相對大的條件下，則預期OXM肽類似物一旦經PEG化後會因立體阻礙而失去活性。然而，已發現若將PEG置於調酸素類似物末端而非中間處，則該肽類似物之活性會保持在更高程度。序列中若干取代可增強效力，藉此在保持對GLP-1R與GcgR的活性比率適當的同時，可抵消因為PEG化作用導致之效力損失。此外，咸已發現在OXM肽類似物C-末端存在兩個PEG分子是比單一PEG分子更好。

本發明序列含有用以代表二十種天然胺基酸之標準單一字母或三個字母碼。所用其他編碼係根據以下定義：

Aib=α胺基異丁酸

PEG=聚乙二醇

PEG20K=具有20,000 Da平均分子量之PEG分子。

文中所用之術語「PEG」意指聚乙二醇分子。在其典型形式中，PEG係一種具有末端羥基基團且具有式HO-CH₂ CH₂ -(CH₂ CH₂ O)n-CH₂ CH₂ -OH之線性聚合物，其中n係約8至約4000。通常，n並非為不連續的數值，但會構成平均值附近之近乎高斯分布(Gaussian distribution)之範圍。末端氫可以封端基團(諸如烷基或烷醇基)取代。較佳地，PEG具有至少一個羥基，其更佳係末端羥基。此羥基較佳附接至連接基團上，該連接基團可與肽反應以形成共價連接。技藝中存在為數眾多的PEG衍生物。(參見例如美國專利第5,445,090號；第5,900,461號；第5,932,462號；第6,436,386號；第6,448,369號；第6,437,025號；第6,448,369號；第6,495,659號；第6,515,100號；及第6,514,491號；及Zalipsky,S. Bioconjugate Chem. 6:150-165,1995)。經共價附接至本發明OXM肽之PEG分子的平均分子量約10,000、20,000、30,000、或40,000道爾頓。PEG分子較佳為18,000至22,000道爾頓。更佳地，其係19,000至21,000道爾頓，最佳為20,000至21,000道爾頓，甚至更佳為約20,000道爾頓。PEG化試劑可為直鏈或分支鏈分子，且可單獨或以串聯方式存在。本發明經PEG化OXM肽類似物較佳具有附接至肽的C-末端之串聯PEG分子。PEG分子較佳在肽之C-末端藉由mPEG-20kDa馬來醯亞胺(式1)或mPEG-20kDa碘乙醯胺(式2)附接至兩個半胱胺酸殘基上。在式1及式2中，n係10至2500。較佳地，n係350至600。更佳地，n係425至475。

特定言之，PEG分子較佳為mPEG-20kDa馬來醯亞胺(CH₃ O(CH₂ CH₂ O)_n -(CH₂ )₃ NHCO(CH₂ )₂ -馬來醯亞胺)(NOF Sunbright ME-200MA)，且係在肽之C末端附接至兩個半胱氨酸殘基上。最佳的調酸素肽類似物包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，其中該PEG分子係mPEG-20kDa馬來醯亞胺(CH₃ O(CH₂ CH₂ O)_n -(CH₂ )₃ NHCO(CH₂ )₂ -馬來醯亞胺)(NOF Sunbright ME-200MA)，及其中位置39處經PEG化Cys之羧基經醯胺化(式3)。除了方框區域之外，式3包含標準單一字母胺基酸碼，其中該等胺基酸殘基之結構已經延長。

文中所用術語「PEG化」意指如上所述之一或多個PEG分子共價連接至諸如本發明OXM肽類似物之分子上。

「促胰島素分泌活性」係指對高葡萄糖濃度反應而刺激胰島素分泌之能力，藉此造成細胞攝入葡萄糖及血漿葡萄糖濃度降低。促胰島素分泌活性可藉由技藝中已知方法評估，其包括藉由胰島瘤細胞株或胰島測量胰島素分泌之活體外試驗，或諸如靜脈內葡萄糖耐受性測試(IVGTT)、腹膜內葡萄糖耐受性測試(IPGTT)、及口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)之活體內試驗。通常，人類中促胰島素分泌活性係藉由測量血漿胰島素或C-肽濃度而測定。本發明OXM肽類似物具有穩定的促胰島素分泌活性。

文中所用「活體外效力」係測量以細胞為基礎，分析OXM肽類似物活化GLP-1R或GcgR之能力。活體外效力係以「EC₅₀ 」表示，其係指會使劑量反應試驗中增加最大量的半數(在此情況中，指產生環狀AMP)的化合物有效濃度。

術語「血漿半衰期」係指自清除血漿中相關分子半數所需之時間。所用另一術語係「消除半衰期」。在血漿半衰期或消除半衰期之背景下所用之術語「延長」或「更長」係指，在相當條件下所測定之PEG化OXM肽類似物之半衰期相對於參考分子(例如該肽或天然肽之非PEG化形式)之半衰期明顯增加。例如，猴子天然OXM之半衰期預期是小於1 hr。本發明經PEG化OXM肽類似物在猴中具有至少24 hr的消除半衰期，及較佳為至少48小時。文中所報告之半衰期係消除半衰期，其相當於消除之終末對數線性速率。熟悉此項技術者明瞭半衰期係隨著清除率及分佈體積二者的函數變化所衍生之參數。

文中所用術語「長期作用GLP-1R激動劑」係指共價連接至一或多個聚乙二醇(PEG)分子之GLP-1肽類似物。經PEG化GLP-1化合物係揭示於美國專利第7,557,183號中。

清除率係測量自循環系統消除藥物之身體能力。當清除率因為(例如)藥物之改質而降低，則預期半衰期會增加。然而，此互反關係僅在體積分佈中沒有發生變化時才精確。適用於最終對數線性半衰期()、清除率(C)與分佈體積(V)之間的近似關係是根據方程式(V/C)設定。清除率並非指有多少藥物被移除，而係指生物流體(諸如血液或血漿)體積中必需完全不含藥物才表示清除。清除率係以每單位時間之體積表示。本發明經PEG化OXM肽類似物較佳在猴子中具有200 ml/h/kg或更小，更佳為180、150、120、100、80、60 ml/h/kg或更小及最佳為50、40或20 ml/h/kg或更小的清除率。

本發明OXM肽類似物通常可進行非經腸投藥。非經腸投藥包括(例如)全身性投藥，諸如藉由肌內、靜脈內、皮下、皮內或腹膜內注射。該OXM肽類似物係與作為醫藥組合物之一部份的可接受醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑結合投與至個體，以用於治療非胰島素依賴性(2型)糖尿病、NIDDM或以下所論述之相關失調症。該醫藥組合物可為諸如其中由OXM肽類似物與二價金屬陽離子(諸如鋅)之錯合物所形成之溶液或懸浮液。該肽類似物亦可(諸如)藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥調配成固體調配物，隨後在投藥之前才於適宜的稀釋劑溶液中復水。適宜的醫藥載劑可包含不與肽或肽衍生物交互反應之惰性成分。用於非經腸投與之適宜的醫藥載劑包括(例如)無菌水、生理鹽水、抑制細菌之鹽水(包含約0.9% mg/ml苄基醇之鹽水)、磷酸鹽緩衝鹽水、漢克溶液(Hank's solution)、林格乳酸鹽(Ringer's-lactate)及類似物。適宜的賦形劑之某些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇及甘露醇及防腐劑(諸如苯酚及間甲苯酚)。

可利用標準醫藥調配技術，諸如彼等Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,Easton，PA)中所述者。本發明OXM肽類似物亦可調配用於經由頰內、口服、經皮、鼻腔或肺路徑投藥。本發明OXM肽類似物可經調配用於延長釋放，以使血漿濃度在投藥之後保持在有效範圍中更長的時間。

本發明OXM肽類似物可用於治療糖尿病，特定言之2型糖尿病(非胰島素依賴性糖尿病或NIDDM)。用本發明OXM肽類似物治療受益之另外個體包括彼等葡萄糖耐受性不良或空腹葡萄糖不佳者、彼等就個體高度及體形而言，體重比正常體重高約25%或更多之個體、具有一或多位親代罹患NIDDM之個體、患有妊娠期糖尿病之個體及具有新陳代謝失調症(諸如彼等由於內生性胰島素分泌降低而引起者)之個體。OXM肽類似物可用於預防罹患葡萄糖耐受性不良之個體發展成2型糖尿病、防止胰腺β-細胞惡化、誘導β-細胞增殖、改善β-細胞功能、活化休眠β-細胞、促進細胞分化成β-細胞、刺激β-細胞複製及抑制β-細胞凋亡。可利用本發明化合物以本發明方法治療或預防之其他疾病及病症包括：青少年之成人型糖尿病(MODY)(Herman等人，Diabetes 43:40,1994)；成人遲發型自體免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等人，Diabetes Med. 11:299,1994)；葡萄糖耐受性不良(IGT)(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus,Diabetes Care 22(Supp. 1):S5,1999)；空腹葡萄糖不佳(IFG)(Charles等人，Diabetes 40:796,1991)；妊娠期糖尿病(Metzger,Diabetes,40:197,1991)；新陳代謝症候群X、血脂障礙、高血糖症、高胰島素血、高甘油三酯血症及抗胰島素性。

本發明OXM肽類似物亦可用於本發明方法中，以治療糖尿病之繼發性病因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus,Diabetes Care 22(Supp. 1):S5,1999)。該繼發性病因包括糖皮質激素過量、生長激素過量、嗜鉻細胞瘤及藥物誘導的糖尿病。可誘導糖尿病之藥物包括(但不限於)滅鼠優(pyriminil)、菸鹼酸、糖皮質激素、苯妥英(phenytoin)、甲狀腺激素、β-腎上腺素能藥、α-干擾素及用於治療HIV感染之藥物。

本發明OXM肽類似物可有效地抑制食物攝入及治療肥胖症。

OXM肽類似物之「有效量」係指投與至個體時，在不引起不能接受的副作用下產生所希望之治療及/或預防作用之量。┌所希望之治療作用」包括以下一或多種情況：1)改善與疾病或病症相關之症狀；2)延遲與疾病或病症相關之症狀的發作；3)相較於未經治療而言，增加壽命；及4)相較於未經治療而言，提高生活品質。舉例而言，用於治療NIDDM之OXM肽類似物之「有效量」係比未經治療者可更好地控制血糖濃度之量，藉此可延遲糖尿病併發症(諸如視網膜病、神經病、或腎臟疾病)之發作。(例如)罹患葡萄糖耐受性不良或空腹葡萄糖不佳之個體中用於預防NIDDM之OXM肽類似物之「有效量」係相較於未經治療者而言，用諸如磺醯脲、噻唑烷二酮、胰島素及/或雙胍之降血糖藥物治療來延遲高血糖濃度發作所需要之量。

投與至個體之OXM肽類似物之「有效量」係視疾病的類型及嚴重度及個體之特徵(諸如一般健康、年齡、性別、體重及耐藥物性)而定。可有效地使個體血糖標準化之OXM肽類似物之劑量視一些因素而定，其包括(但不限於)個體性別、體重及年齡、不能調節血糖之嚴重度、投藥路徑及生物利用度、肽之藥物動力學特性、效力及配方。

通常用每週一次投與本發明經PEG化OXM肽類似物之劑量較佳約0.1 mg至約1000 mg(共軛物之總重量)的範圍內。更佳地，每週一次之劑量約1 mg至約100 mg，或約1 mg至約30 mg的範圍內。最佳地，每週一次的劑量約5 mg至約30 mg，或約1 mg至約5 mg的範圍內。

「個體」係哺乳動物，較佳為人類，但亦可為動物，其包括伴侶動物(例如犬、貓及類似動物)、家畜(例如母牛、綿羊、豬、馬及類似動物)及實驗動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠及類似動物)。

現將以實例之方式闡述本發明各種較佳特徵及實施例。

實例1：肽合成

根據本發明SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之肽類似物係以Protein Technologies Inc. Symphony或Applied Biosystems 433A自動化肽合成器上藉由固相肽合成而產生。合成作用係以大約0.7 mmol/g的替代作用於Fmoc-Rink醯胺聚苯乙烯樹脂(Rapp Polymere Tubingen，德國)上進行。該合成作用係使用Fmoc主鏈保護基團策略進行。所使用之胺基酸側鏈衍生物係：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(OtBu)、Thr(OtBu)、Trp(Boc)及Tyr(OtBu)。用經含於二甲基甲醯胺(DMF)或N-甲基吡咯啶酮(NMP)中之二異丙基羰化二醯亞胺(DIC)及羥基苯并三唑(HOBt)(1:1:1莫耳比率)活化之約10當量的胺基酸實施偶合。在室溫下實施偶合45至90分鐘。

來自樹脂及側鏈保護基團移除之伴隨裂解作用係在室溫下於包含三氟乙酸(TFA)：三異丙基矽烷：3,6-二氧雜-1,8-辛烷-二硫醇：甲醇：茴香醚90:4:2:2:2(v/v)之溶液中實施1.5至2個小時。將溶液過濾並濃縮至<2 mL，並將肽用冷二乙醚沉澱，再溶於30至40 mL 10%乙腈中及於C₁₈ 反相高效液相層析(HPLC)管柱(通常係Waters SymmetryPrep 7 um，19×300 mm)上，以12-15 mL/min的流速純化。將樣品以20分鐘、用0至25% B之兩階段線性AB梯度洗提，繼而以100分鐘用25至75% B之兩階段線性AB梯度洗提，其中A=0.05% TFA/水及B=0.05% TFA/乙腈。一般係以30至35%乙腈洗提產物。肽純度及分子量係於具有單四極MS探測器之Agilent 1100系列液相層析質譜儀(LC-MS)系統上測定。分析HPLC分離係於Zorbax Eclipse XDB-C8，5 micron,4.6 mm i.d.×15 cm管柱上經6至60% B之線性AB梯度歷時15分鐘完成，其中A=0.05% TFA/H₂ O及B=0.05% TFA/乙腈及流速係1 ml/min。該肽類似物係經純化至>95%純度及經證實具有與在1個原子質量單位(amu)內之計算值相對應之分子量。

實例2：包含兩種Cys殘基之肽經mPEG-MAL-20kDa之PEG化作用

稱取根據實例1所產生之冷凍乾燥肽類似物(SEQ ID NO: 2)(通常為30-50 mg)。稱取2.1倍莫耳當量的mPEG-20kDa馬來醯亞胺(CH₃ O(CH₂ CH₂ O)_n -(CH₂ )₃ NHCO(CH₂ )₂ -馬來醯亞胺)(NOF Sunbright ME-200MA)並使其與肽結合。將反應物溶於50/50(v/v)水/乙腈混合物中至大約20 mg/mL的肽濃度。將肽類似物溶液用100 mM乙酸銨、10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 7)稀釋2倍。隨後室溫下攪拌所產生之混合物。藉由分析反向HPLC(分析HPLC分離係在50℃下於Waters SymmetryShield C18，3.5 micron，4.6 mm i.d.×10 cm管柱上經0至30% B之兩階段線性AB梯度歷時5分鐘及隨後經30至90% B之兩階段線性AB梯度歷時30分鐘完成，其中A=0.05% TFA/H₂ O及B=0.05% TFA/乙腈及流速為1 ml/min)監測反應混合物，且通常在1-2 hr反應時間之後，顯示肽峰值幾乎完全消失。此係因為單-及二-PEG化肽之兩個峰值係隨著二-PEG化肽出現，其構成總峰值面積之90至95%。隨後將該樣品用水稀釋至約20 mL及根據實例1中以0至30% B之兩階段線性AB梯度歷時20分鐘，繼而以30至80% B之兩階段線性AB梯度歷時100分鐘而純化。一般係以35至40%乙腈洗提產物。利用所計算之莫耳消光係數以肽序列為基礎計，藉由280 nm處之紫外線(UV)吸光率而測定經純化之肽含量。在純化之後，產率以起始肽之含量為基礎計係在70至80%的範圍內。

實例3：胰高血糖素受體(hGcgR)結合分析

胰高血糖素受體結合分析係採用分離自293HEK薄膜之經選殖人類胰高血糖素受體(hGcgR)(Lok S，Kuijper JL，Jelinek LJ，Kramer JM，Whitmore TE，Sprecher CA，Mathewes S，Grant FJ，Biggs SH，Rosenberg GB等人Gene 140(2),203-209(1994))。hGcgR cDNA經次選殖至表現質粒phD上(Trans-activated expression of fully γ-carboxylated recombinant human protein C,an antithrombotic factor. Grinnell,B.W.,Berg,D.T.,Walls,J. and Yan,S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192(1987))。將此質粒DNA轉染至293HEK細胞，並以200 μg/ml潮黴素(Hygromycin)篩選。

使用來自懸浮培養之細胞製備粗血漿膜。將該等細胞置於包含25 mM Tris HCl(pH 7.5)，1 mM MgCl₂ ，DNAsel(20 ug/ml)及不含EDTA之Roche Complete抑制劑之低滲緩衝液之冰上進行細胞溶解。將細胞懸浮液用鐵氟龍杵經玻璃杜恩斯均質器均質化25次衝程。將勻漿在4℃、1800×g下離心15分鐘。收集上清液，並將沉澱物再懸浮於低滲緩衝液中並再次均質化。將混合物在1800×g下離心15分鐘。將第二上清液與第一上清液合併。將經合併上清液在1800×g下離心15分鐘以使其澄清。將澄清的上清液轉移至高速管中並在4℃、25000×g下離心30分鐘。將膜沉澱物再懸浮於均質化緩衝液中，並等量分裝冰凍儲存於-80℃冷藏室中直至使用。

胰高血糖素以¹²⁵ I-乳過氧化酶程序進行放射性碘標記，並以反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN(NEX207)進行純化。比活性約2200 Ci/mmol。由於¹²⁵ I-標記的胰高血糖素材料中高丙醇含量，因此K_D 測定係藉由同源競爭替代飽和結合而進行。經估計K_D 為2.62 nM，及其可用於計算所有待測化合物之Ki值。

受體結合分析係利用閃爍近似分析法(SPA)以預先經1%無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)封阻之麥胚凝集素(WGA)珠粒實施。該結合緩衝液包含25 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)、2.5 mM CaCl₂ 、1 mM MgCl₂ 、0.1%無脂肪酸BSA、0.003% Tween 20及不含EDTA之Roche Complete抑制劑。將胰高血糖素以1 mg/ml濃度溶於0.01 N HCl中並立即分裝30 μl等份在-80℃下冰凍。稀釋胰高血糖素等份並在1 hr內用於結合分析中。將OXM肽類似物溶於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中並連續地用結合緩衝液稀釋。繼而，將10 μl稀釋化合物或PBS轉移至含有40 μl分析結合緩衝液或冷胰高血糖素(最終以1 μM非特異性結合(NSB))之Corning 3632透明底分析板中。隨後，添加90 μl薄膜(3 μg/孔)、50 μl¹²⁵ I-標記胰高血糖素(在反應中最終濃度為0.15 nM)及50 μl WGA珠粒(150 μg/孔)。將板密封、翻來覆去地混合，並在室溫下靜置12 hr後，以用MicroBeta閃爍計數器讀數。

結果係以在化合物存在下之特異性¹²⁵ I-標記胰高血糖素結合之百分比計算。化合物之絕對IC₅₀ 濃度係藉由¹²⁵ I-標記的胰高血糖素之特異性結合百分比對所添加化合物之濃度之非線性回歸而獲得。IC₅₀ 劑量係利用Cheng-Prusoff方程式轉化成Ki(Cheng Y.,Prusoff W. H.,Biochem. Pharmacol. 22,3099-3108,1973)。其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對於hGcgR結合的Ki係2050±70 nM。

實例4：胰高血糖素樣肽1(hGLP-1-R)受體結合分析

GLP-1受體結合分析係利用分離自293HEK薄膜之經選殖人類胰高血糖素樣肽1受體(hGLP-1R)(Graziano MP,Hey PJ,Borkowski D,Chicchi GG,Strader CD,Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15;196(1):141-6)。hGLP-1R cDNA係經次選殖至表現質粒phD(Trans-activated expression of fully γ-carboxylated recombinant human protein C,an antithrombotic factor. Grinnell,B.W.,Berg,D.T.,Walls,J. and Yan,S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192(1987))。將此質粒DNA轉染至293HEK細胞，並用200 μg/ml潮黴素篩選。

使用來自懸浮培養之細胞製備粗血漿膜。將該等細胞置於包含25 mM Tris HCl(pH 7.5)，1 mM MgCl₂ ，DNAse1(20 ug/ml)及不含EDTA之Roche Complete抑制劑之低滲緩衝液中之冰上進行細胞溶解。將細胞懸浮液用鐵氟龍杵經玻璃杜恩斯均質器均質化25次衝程。將勻漿在4℃、1800×g下離心15分鐘。收集上清液及將沉澱物再懸浮於低滲緩衝液中並再次均質化。將混合物在1800×g下離心15分鐘。將第二上清液與第一上清液合併。將經合併上清液在1800×g下離心15分鐘以使其澄清。將澄清的上清液轉移至高速管中並在4℃、25000×g下離心30分鐘。將膜沉澱物再懸浮於均質化緩衝液中，並等量分裝冰凍儲存於-80℃直至使用。

胰高血糖素樣肽1(GLP-1)係以¹²⁵ I-乳過氧化酶程序進行放射性碘標記，並以反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN(NEX308)下進行純化。比活性係約2200 Ci/mmol。由於¹²⁵ I-標記的GLP-1高丙醇含量，因此K_D 測定係藉由同源競爭替代飽和結合而進行。經估計K_D 為0.96 nM，且其可用於計算所有待測化合物之Ki值。

受體結合分析係利用閃爍近似分析法(SPA)以預前經1%無脂肪酸BSA(ICN)封阻之麥胚凝集素(WGA)珠粒實施。該結合緩衝液包含25 mM HEPES(pH 7.4)、2.5 mM CaCl₂ 、1 mM MgCl₂ 、0.1%無脂肪酸BSA、0.003% Tween 20及不含EDTA之Roche Complete抑制劑。將GLP-1以1 mg/ml溶於PBS中並立即分裝30 μl等份在-80℃下冰凍。將GLP-1等份解凍、稀釋並於1 hr內用於結合分析。將OXM肽類似物溶於PBS中並連續地用結合緩衝液稀釋。繼而，將10 μl稀釋化合物或PBS轉移至包含40 μl分析結合緩衝液或冷GLP-1(最終以1 μM之NSB)之Corning 3632透明底分析板中。隨後，添加90 μl薄膜(1 μg/孔)、50 μl¹²⁵ I-標記的GLP-1(在反應中最終濃度為0.15 nM)及50 μl WGA珠粒(150 μg/孔)。將板密封、翻來覆去地混合，並在室溫下靜置12 hr後，用MicroBeta閃爍計數器讀數。

結果係以在化合物存在下之¹²⁵ I-GLP-1特異性結合百分比計算。化合物之絕對IC₅₀ 濃度係藉由¹²⁵ I-標記的GLP-1之特異性結合百分比對所添加化合物之濃度之非線性回歸而獲得。IC₅₀ 濃度係利用Cheng-Prusoff方程式轉化成Ki(Cheng Y.,Prusoff W. H.,Biochem. Pharmacol. 22,3099-3108,1973)。其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對於hGLP-1R結合之Ki係73±23 nM。

實例5：胰高血糖素受體(hGcgR)刺激cAMP功能性分析

胰高血糖素刺激cAMP功能性分析是利用與用於上述實例3所述之hGcgR結合分析相同的經選殖hGcgR表現細胞株。使用OXM肽類似物刺激細胞，並使用來自Perkin Elmer(6760625R)之訊號放大發光近似均質分析法(Alpha Screen)測定在該細胞內產生之cAMP。簡言之，細胞內所誘發之cAMP會與套組中之生物素化cAMP競爭結合至經包覆抗cAMP抗體之受體珠粒及經包覆鏈黴親和素之供體珠粒上。當細胞內cAMP含量的增加，受體珠粒-生物素化cAMP-供體珠粒複合物會出現裂解，且所觀察到的信號會減少。

自近匯合之組織培養皿，使用無酶之細胞裂解溶液(Specialty Media 5-004-B)收穫hGcgR-HEK293細胞。將該等細胞以低速離心集結成塊並用分析緩衝液[25 mM HEPES之漢克(Hank's)緩衝鹽溶液(HBSS)，其包含Mg及Ca(GIBCO，14025-092)及0.1%無脂肪酸BSA]沖洗3次，隨後稀釋成每毫升含有125,000個細胞之最終濃度。將來自Alpha Screen套組之生物素化cAMP，以1單位/0.04 ml的最終濃度添加至經稀釋之細胞中。亦將磷酸二酯酶抑制劑(IBMX，250 mM二甲亞碸(DMSO)溶液)添加至經稀釋之細胞中，直至最終濃度為500 uM。先將胰高血糖素以濃度1 mg/ml溶於0.01 N HCl中並立即在-80℃下冰凍。一旦解凍，則應在1小時內使用該胰高血糖素。將胰高血糖素、cAMP標準物及OXM肽類似物在分析緩衝液中連續稀釋，直至6X最終濃度。在96孔、小體積、白色、聚苯乙烯Costar Plate(3688)中進行功能性分析。藉由將0.01 ml經稀釋之OXM肽類似物、胰高血糖素或cAMP添加至0.04 ml細胞混合物中而開始反應。在室溫下1小時之後，藉由添加0.03 ml溶胞緩衝液[10 mM HEPES(pH 7.4)，1% NP40，及0.01%無脂肪酸BSA(其中包含各1單位/0.03 ml來自Alpha Screen Kit之受體及供體珠粒)]而中止反應。在黑暗中添加溶胞緩衝液，以防止探測珠漂白。使用箔片包裹該等分析板，溫和搖晃1分鐘，隨後在室溫下平衡過夜。將該等分析板於Perkin-Elmer Envision儀器上讀數。以cAMP標準曲線為基礎，將α-讀數(Alpha screen)單位轉換成每孔所產生之cAMP皮莫耳數。各孔中所產生之cAMP皮莫耳數再換算成相對於胰高血糖素對照組所觀察到最大反應之百分比。EC₅₀ 值係利用最大反應相對於所添加肽之濃度，由非線性回歸分析獲得。其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物，如同野生型OXM，係完全有效且藥效大，其對hGcgR具有59.9±4.14 nM的EC₅₀ 。

實例6：胰高血糖素樣肽1受體(hGLP-1R)刺激cAMP功能性分析。

GLP-1刺激cAMP功能性分析是利用與用於上述實例4中所述之hGLP-1R結合分析相同的經選殖hGLP-1R表現細胞株。用OXM肽類似物刺激細胞，並使用來自Perkin Elmer(6760625R)之訊號放大發光近似均質分析法(Alpha Screen)測定在該細胞內產生之cAMP。簡言之，細胞內所誘發之cAMP會與套組中之生物素化cAMP競爭結合至經包覆抗cAMP抗體之受體珠粒及經包覆鏈黴親和素之供體珠粒上。當細胞內cAMP含量增加，受體珠粒-生物素化cAMP-供體珠粒複合物會出現裂解，且所觀察到的信號會減少。

自近匯合組織培養器皿，使用無酶之細胞裂解溶液(Specialty Media 5-004-B)收穫hGLP-1R-HEK293細胞。將該等細胞以低速離心集結成塊並用分析緩衝液[25 mM HEPES之漢克緩衝鹽溶液(HBSS)，其包含Mg及Ca(GIBCO，14025-092)及0.1%無脂肪酸BSA]沖洗3次，隨後稀釋成每ml 125,000個細胞之最終濃度。將來自Alpha Screen套組之生物素化cAMP，以1單位/0.04 ml的最終濃度添加至經稀釋之細胞中。亦將磷酸二酯酶抑制劑(IBMX，250 mM DMSO)添加至稀釋細胞中，直至最終濃度為500 μM。將GLP-1形成1 mg/ml PBS溶液，等量分裝在-80℃下冰凍儲存。將GLP-1、cAMP標準物及OXM肽類似物在分析緩衝液中連續稀釋，直至6X最終濃度。在96孔、小體積、白色、聚苯乙烯Costar Plate(3688)中進行功能性分析。藉由將0.01 ml經稀釋之OXM肽類似物、GLP-1或cAMP添加至0.04 ml細胞混合物中而開始反應。在室溫下1小時之後，藉由添加0.03 ml溶胞緩衝液[10 mM HEPES(pH 7.4)，1% NP40，及0.01%無脂肪酸BSA(其中包含來自Alpha Screen Kit之各1單位/0.03 ml受體及供體珠粒)]而中止反應。在黑暗中添加溶胞緩衝液，以防止探測珠漂白。用箔片包裹該等分析板，溫和搖晃1分鐘，隨後在室溫下平衡過夜。將該等分析板於Perkin-Elmer Envision儀器上讀數。以cAMP標準曲線為基礎，將α-讀數(Alpha screen)單位轉換成每孔所產生之cAMP皮莫耳數。各孔中所產生之cAMP皮莫耳數再換算成相對於GLP-1對照組所觀察到最大反應之百分比。EC₅₀ 值係利用最大反應相對於所添加肽之濃度，由非線性回歸分析而獲得。其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物，如同野生型OXM，係完全有效且藥效大，其對hGLP-1R具有2.75±0.55 nM的EC₅₀ 。

實例7：對飲食誘導肥胖(DIO)小鼠之食物攝入、體重及身體組成之作用

使用3至4個月大的雄性飲食誘導肥胖(DIO)C57BL/6小鼠。將動物分別飼養於具有12小時白天/黑夜循環(在22：00時光照)之溫控(24℃)設備且可隨意取食及取水之室中。適應環境2周後，將小鼠隨機分配成治療組(n=8至10/組)，各組具有類似地平均體重及脂肪質量。實驗之前，以皮下注射方式(sc)注射媒劑溶液並稱重2天，以便讓小鼠適應程序。

每3天開始黑夜循環之前，隨意餵食DIO小鼠30-90分鐘達2至4周，將媒劑或溶於媒劑中之OXM肽類似物(劑量範圍6.7-20 nmole/kg)藉由皮下注射投藥。同時測量體重及食物與加料斗重量。在前面的24小時中所消耗之食物係藉由將前一天的食物與加料斗重量減去目前的食物與加料斗重量來計算。體重之絕對變化係藉由減去第一次注射之前動物體重來計算。利用回聲醫療系統(Houston，TX)儀器藉由核磁共振(NMR)測量第1、14及28天總脂肪質量係。脫脂質量係藉由將總體重減去脂肪質量而計算。

研究1：兩周處理

其中位置39處Cys(PEG20k)活體內經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物經皮下注射投與至4個月大雄性飲食誘導肥胖(DIO)小鼠C57BL/6。每3天注射OXM肽類似物一次，歷時2周，劑量為7.5及15 nmole/kg，並與經媒劑處理之小鼠及正對照組(每3天注射7.5 nmole/kg長期作用GLP-1R激動劑)處理之動物相比較。

經其中位置39處Cys(PEG20k)醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物之治療可造成食物攝取及體重之劑量依賴性減少。在2周研究階段結束時，與媒劑組相比，15 nmole/kg組中累積食物攝取減少27%。7.5 nmole/kg組之累積減重係與正對照組所觀察到的類似，與媒劑組相比，其減少約9%。15 nmole/kg組經媒劑對照之累積減重係18%。身體組成分析顯示減重的主要原因的脂肪質量減少(表1)。

表1

14-天治療期間DIO小鼠之重量變化(平均值±SEM；n=8)

此等數據顯示相較於經媒劑處理之小鼠而言，在14天DIO小鼠研究中，其中位置39處Cys(PEG20k)醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可減少累積食物攝入及體重。體重減少主要係因為脂肪質量減少。*p<0.05對媒劑(Dunnett's測試)

研 究2：四周處理

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物(6.7或20 nmole/kg)及正對照組(7.5或22.5 nmole/kg長期作用GLP-1R激動劑)係藉由每3天一次皮下注射投與至4個月大雄性飲食誘導肥胖(DIO)C57BL/6，歷時4周。

用高劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物之治療可明顯減少累積食物攝入。較低劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可將體重減少至與正對照組中類似的程度。與正對照組之22.5 nmole/kg劑量相比，以20 nmole/kg劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物會明顯增加減重。最大減重(最初體重之約25%)係在治療15天之後達成。身體組成分析證實與OXM肽類似物及正性對照相關之減重主要係因為脂肪減少(表2)。

在第21至23天藉由間接熱量測定法進一步分析其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物之作用。經其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物(20 nmole/kg)處理之動物比經媒劑處理之對照具有明顯更高的能量消耗(在第21天之24小時能量消耗平均增加18%)。其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物相對於媒劑對照並未產生明顯的運動活性水平變化。

在完成研究時，所有處理組中血漿胰島素及膽固醇濃度明顯低於經媒劑處理之對照組，然而僅有經高劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物處理之組的瘦體素濃度明顯降低。所有經肽處理之組具有比經媒劑處理之組更高的血漿脂聯素濃度，但僅有經高劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物處理之組具有統計學顯著差異。

表2

28-天治療期間DIO小鼠之重量變化(平均值±SEM；n=10)

此等數據顯示相較於經媒劑處理之小鼠而言，在28天DIO小鼠研究中，其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可減少累積食物攝入及體重。體重減少主要係因為脂肪質量減少。*p<0.05對媒劑(Dunnett's測試)

實例8：在治療DIO小鼠2周或4周之後分別對口服葡萄糖耐受性測試或腹膜內葡萄糖耐受性測試期間血糖波動之作用

在根據實例7中所述最後一次注射DIO小鼠56小時之後，在開始葡萄糖耐受性測試之前將小鼠禁食16小時。在0時間時，藉由口服強飼或腹膜內(IP)注射給予動物2 g/kg葡萄糖。葡萄糖激發之後，在0、15、30、60及120分鐘以尾部靜脈出血採集血液。藉由血糖儀測量葡萄糖濃度。與經媒劑處理之對照相比，其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物以及正對照組之所有劑量可明顯降低在口服葡萄糖激發之前及之後所有的時間點所測量的血糖(表3)。

在如實例7(研究2)中所述最後一次注射DIO小鼠3天之後，第29天進行腹膜內葡萄糖耐受性測試(IPGTT)。低劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化的SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物相對於經媒劑處理之對照可減少空腹血糖，但在IP葡萄糖激發之後對葡萄糖濃度作用很小。與經媒劑處理之對照相比，高劑量其中位置39處Cys(PEG20k)係經醯胺化的SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物以及兩種劑量的正對照組可明顯降低在IP葡萄糖激發之前及之後所有的時間點所測量的血糖(表4)。

表3

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對在口服進食投與葡萄糖後血糖波動之作用

所給數據係葡萄糖曲線下之面積(=自t+0至120分鐘之積分值)(n=8)

此等數據表明在用其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物治療DIO小鼠2周之後，血糖波動在口服進食葡萄糖之後明顯減少。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性(*p<0.05對媒劑)。

表4

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對腹膜內(ip)進食葡萄糖後的血糖波動之作用

所給數據係葡萄糖曲線下之面積(=自t+0至120分鐘之積分值)(n=6)

此等數據顯示在用其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物治療DIO小鼠4周之後，血糖波動在腹膜內(ip)進食葡萄糖之後明顯減少。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性(*p<0.05對媒劑)。

實例9：在腹膜內葡萄糖耐受性測試期間對瘦小鼠中血糖波動之作用

將9周大雄性C57BL/6小鼠用於研究。以餵食體重為基礎將動物隨機分配成組。開始測試之前16小時，用媒劑或OXM肽類似物(劑量5.0-15.0 nmole/kg)注射動物。一旦注射肽或媒劑，則移除食物。在0時間時，藉由IP注射給予動物2 g/kg葡萄糖。葡萄糖激發之後0、3、6、12及30分鐘，以尾部靜脈出血而採集血液。藉由血糖儀測量葡萄糖濃度。藉由中尺度(Mesoscale)測量胰島素。

與經媒劑處理之對照相比，高劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可明顯減少血糖波動(表5)。與經媒劑處理之對照相比，兩種劑量其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可明顯提高胰島素濃度(表6)。

表5

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對瘦小鼠在腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試後血糖波動之作用

所給數據係葡萄糖曲線下之面積(=自t+0至30分鐘之積分值)(n=6)

此等數據顯示其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可使瘦小鼠經腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試之後明顯減少血糖波動。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性。(*p<0.05對媒劑)

表6

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對瘦小鼠在腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試之後血漿胰島素濃度之作用

所給數據係胰島素曲線下之面積(=自t+0至30分鐘之血漿胰島素積分值)(n=6)

此等數據顯示其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可使瘦小鼠經腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試之後明顯增加血漿胰島素AUC。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性。(*p<0.05對媒劑)

實例10：在口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)或腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試(IPGTT)期間對肥胖(ob/ob)小鼠中血糖波動之作用

將2至3個月大雄性ob/ob小鼠分別置於具有12小時白天/黑夜循環(照明2200小時)之溫控(24℃)設備且可隨意取食及取水之室中。在適應該設備至少2周之後，在上午9點，以尾部靜脈血液測量3小時空腹血糖。血糖在180 mg/dL以下之小鼠不採用。所剩動物隨機分配成治療組(N=6至7/組)，各組具有類似的平均血糖濃度。讓小鼠可容易取食直至注射時為止。在同一天下午4點時，用媒劑或7.5 nmole/kg OXM肽類似物注射動物。注射的時候移除食物。肽注射16小時之後進行OGTT(表7)或IPGTT(表8)。在0時間時，以經口強飼(表7)或腹膜內注射(表8)給予動物2 g/kg葡萄糖。葡萄糖激發之後，在0、15、30、60及120分鐘以尾部靜脈出血採集血液。藉由血糖儀測量血糖濃度。

單次注射其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物以使ob/ob小鼠中血糖標準化。葡萄糖激發之後所測量之所有時間點之葡萄糖濃度明顯低於煤劑對照組。

表7

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對ob/ob小鼠經口服葡萄糖耐受性測試後血

糖波動之作用所給數據係葡萄糖曲線下之面積(=自t+0至120分鐘之積分值)(n=7)

此等數據顯示其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可使ob/ob小鼠經口服葡萄糖耐受性測試後明顯減少血糖波動。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性。(*p<0.05對媒劑)

表8

其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物對ob/ob小鼠在腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試之後血糖波動之作用

此等數據顯示其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物可使ob/ob小鼠經腹膜內(ip)葡萄糖耐受性測試之後明顯減少血糖波動。藉由Dunnett's測試評估統計學顯著性。(*p<0.05對媒劑)

實例11：對雄性飲食誘導肥胖C57BL/6小鼠中血漿FGF21、三酸甘油酯濃度及肝基因表現之急性作用

為調查以其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物處理來調節新陳代謝途徑係與重量減輕獨立相關性，以皮下注射投與OXM肽類似物及正對照組(長期作用GLP-1R激動劑)至3個月大雄性飲食誘導肥胖(DIO)小鼠。在研究的前一天，將小鼠隨機分配成治療組(N=7/組)，各組具有類似地平均體重。在同一晚(約晚上10點)，將動物置於潔淨籠中，並藉由皮下注射定量投與煤劑或OXM肽類似物。OXM肽類似物及對照之投與量係22.5 nmole/kg。在注射肽或媒劑的同時移除食物。在接下來的早晨(約上午10點)，將動物殺死以收集血漿及肝臟組織。使用Hitachi血液化學分析儀測量血漿葡萄糖及三酸甘油酯濃度。以RT-PCR測定基因表現。藉由HPLC測量丙二醯基-CoA及乙醯基-CoA含量。

單次注射之後，所有治療組中之血漿葡萄糖相對於媒劑對照組明顯減少。血漿三酸甘油酯相對於媒劑對照組僅在經其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物處理之小鼠中減少，但在經長期作用GLP-1R激動劑處理之小鼠中未見減少。繼用其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物治療之後，肝臟丙二醯基-CoA及乙醯基-CoA濃度相對媒劑對照組分別明顯減少63%及39%。用其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物治療可改變若干肝基因之表現，其分別包括pgc-1α基因表現增加7倍及ChREBP及PCSK9基因表現分別減少52%及61%。此外，在用其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物急性治療之後，肝FGF21基因表現被誘發17倍，相對循環FGF21是增加6倍。所有此等變化對於經其中位置39處Cys(PEG20k)經醯胺化之SEQ ID NO: 3之OXM肽類似物處理之小鼠係具有專一性的。

序列表

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala　(SEQ ID NO:1)His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys　(SEQ ID NO: 2)His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K)　(SEQ ID NO: 3)其中位置39處Cys(PEG20K)視需要經醯胺化。

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala　(SEQ ID NO: 4)His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39　(SEQ ID NO: 5)其中Xaa₃₈ 係Cys、Cys-PEG、或不存在；及Xaa₃₉ 係Cys、Cys-PEG、或不存在。

<110>　美國禮來大藥廠

<120>　調酸素肽類似物

<130>　X-18946

<140>　099143356

<141>　2010-12-10

<150>　61/288,888;61/352,576

<151>　2009-12-22;2010-06-08

<160>　5

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　37

<212>　PRT

<213>　人工化序列

<220>

<223>　合成構築體

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(2)..(2)

<223>　位置2處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(29)..(29)

<223>　位置29處之Xaa係Aib

<400>　1

<210>　2

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工化序列

<220>

<223>　合成構築體

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(2)..(2)

<223>　位置2處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(29)..(29)

<223>　位置29處之Xaa係Aib

<400>　2

<210>　3

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工化序列

<220>

<223>　合成構築體

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(2)..(2)

<223>　位置2處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(29)..(29)

<223>　位置29處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(38)..(38)

<223>　位置38處之Xaa係Cys

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(38)..(38)

<223>　位置38處之Xaa係經20kDa PEG改質

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa係Cys

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa可經20kDa PEG改質

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa可經醯胺化

<400>　3

<210>　4

<211>　37

<212>　PRT

<213>　人工化序列

<220>

<223>　合成構築體

<400>　4

<210>　5

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工化序列

<220>

<223>　合成構築體

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(2)..(2)

<223>　位置2處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(29)..(29)

<223>　位置29處之Xaa係Aib

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(38)..(38)

<223>　位置38處之Xaa係Cys或不存在

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(38)..(38)

<223>　位置38處之Xaa可經20kDa PEG或40kDa PEG改質

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa係Cys或不存在

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa可經20kDa PEG或40kDa PEG改質

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　位置39處之Xaa可經醯胺化

<400>　5

Claims

一種包括以下胺基酸序列之調酸素肽類似物：His-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa₃₈ -Xaa₃₉ (SEQ ID NO：5)其中Xaa₃ 8係Cys、Cys-PEG或不存在；Xaa₃₉ 係Cys、Cys-PEG、或不存在；及其中該C-末端胺基酸係視需要經醯胺化。
如請求項1之調酸素肽類似物，其包括以下胺基酸序列：His-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO：2)其中該位置38處之Cys殘基係視需要經PEG化；及其中該位置39處之Cys殘基係視需要經PEG化；及該位置39處之Cys之羧基係視需要經醯胺化。
如請求項2之調酸素肽類似物，其中該類似物係以大約40kDa PEG分子附接至位置38或位置39處Cys殘基之硫醇上加以PEG化。
如請求項1或2之調酸素肽類似物，其中該類似物係以大約20kDa PEG分子在每一情況下將位置38及位置39兩處之Cys殘基之硫醇上加以PEG化，且其包括以下胺基酸序列：His-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-[Aib(α胺基異丁酸)]-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K)(SEQ ID NO：3)其中該位置39處之Cys之羧基係視需要經醯胺化。
如請求項1至3中任一項之調酸素肽類似物，其中該PEG分子係線性。
如請求項1至3中任一項之調酸素肽類似物，其中該位置39處之Cys殘基之羧基係經醯胺化。
如請求項1之調酸素肽類似物，其中該位置39處之Cys殘基不存在，及該位置38處之Cys殘基係經大約40kDa PEG分子PEG化及視需要經醯胺化。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至7中任一項之調酸素肽類似物，併與醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至7中任一項之調酸素肽類似物以及醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑及視需要包括其他治療成分。
一種如請求項1至7中任一項之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造為有此需要之個體治療非胰島素依賴性糖尿病之藥劑。
一種如請求項1至7中任一項之調酸素肽類似物之用途，其係用於製造為有此需要之個體治療肥胖症之藥劑。
如請求項1至3及7中任一項之調酸素肽類似物，其係用作藥劑。
如請求項1至3及7中任一項之調酸素肽類似物，其係用於治療非胰島素依賴性糖尿病。
如請求項1至3及7中任一項之調酸素肽類似物，其係用於治療肥胖症。