DE69917889T2

DE69917889T2 - Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen

Info

Publication number: DE69917889T2
Application number: DE69917889T
Authority: DE
Inventors: Milton J. Harris; Antoni Kozlowski
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 1998-03-12
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: ES2307865T3; EP1411075A3; US20060155059A1; US20010011115A1; ATE399809T1; US8003742B2; US7528202B2; CA2323048C; US20040059025A1; EP1411075B1; DE69917889D1; US20100184937A1; JP2002506087A; US6541543B2; DK1411075T3; EP1411075A2; JP4078032B2; US7030278B2; PT1411075E; US20020037949A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate von Polyethylenglykol und damit verwandten hydrophilen Polymeren, die für eine Kupplung mit einem anderen Molekül einschließlich beispielsweise Proteinen, Enzymen, kleinen Arzneimitteln und dergleichen geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die chemische Anbindung des hydrophilen Polymers Poly(ethylenglykol)(„PEG") an Moleküle und Oberflächen ist in der Biotechnologie von großem Nutzen. In seiner am häufigsten vorkommenden Form ist PEG ein geradkettiges Polymer, das an beiden Enden durch Hydroxylgruppen terminiert ist: HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH
Dieses Polymer läßt sich in Kurzform als HO-PEG-OH wiedergeben, wobei sich versteht, daß das -PEG-Symbol für die folgende Struktureinheit steht: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- n liegt typischerweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 2000.
PEG wird gewöhnlich als Methoxy-PEG-OH bzw. in Kurzschreibweise mPEg eingesetzt, wobei das eine Ende die relativ inerte Methoxygruppe ist, während das andere Ende eine Hydroxylgruppe ist, die sich leicht chemisch modifizieren läßt. CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH mPEG
PEG wird weiterhin gewöhnlich in verzweigten Formen eingesetzt, die sich durch die Addition von Ethylenoxid an verschiedene Polyole wie Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit darstellen lassen. Ein vierarmiges verzweigtes PEG beispielsweise, hergestellt aus Pentaerythrit, ist unten gezeigt: C(CH₂OH)₄ + n C₂H₂O → C[CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂OH]₄
Die verzweigten PEGs lassen sich in allgemeiner Form als R-(-PEG-OH)_n wiedergeben, wobei R für das zentrale „Kern"molekül wie z.B. Glycerin oder Pentaerythrit und n die Anzahl von Armen wiedergibt.
Weiterhin lassen sich verzweigte PEGs darstellen, in denen die beiden PEG-„Arme" an eine zentrale Verbindungseinheit gebunden sind, die über eine einzelne funktionelle Gruppe verfügt, die dazu in der Lage ist, sich an andere Moleküle zu binden; Matsushima et al., (Chem. Lett., 773, 1980), beispielsweise haben zwei PEGs an eine zentrale Cyanursäurechlorideinheit gekuppelt.
Bei PEG handelt es sich um ein gut bekanntes Polymer, das in Wasser und vielen organischen Lösungsmitteln löslich ist, nichttoxisch und nichtimmunogen ist. Eine Anwendung von PEG ist die kovalente Verbindung des Polymers mit unlöslichen Molekülen, wodurch das erhaltene PEG-Molekül-„Konjugat" löslich wird. Es wurde beispielsweise gezeigt, daß das wasserunlösliche Arzneimittel Paclitaxel wasserlöslich wird, wenn man es mit PEG kuppelt. Greenwald, et al., J. Org. Chem, 60: 331–336 (1995).
In einer damit verwandten Arbeit wird in dem an Davis et al. vergebenen US-Patent 4,179,337 offenbart, daß an PEG gekuppelte Proteine länger im Blutkreislauf verbleiben, da die Nieren-Clearancerate und die Immunogenität reduziert sind. Diese und andere Anwendungen sind auch in Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry, J. M. Harris, Hrsg., Plenum, New York (1992) und Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris und S. Zalipsky, Hrsg., ACS, Washington DC (1997) beschrieben.
Zur Kupplung von PEG mit einem Molekül wie einem Protein ist es häufig erforderlich, das PEG zu „aktivieren" und so ein Derivat des PEGs mit funktioneller Gruppe am Ende herzustellen. Die funktionelle Gruppe kann mit bestimmten Einheiten am Protein wie z.B. einer Aminogruppe reagieren und so ein PEG-Protein-Konjugat bilden. Viele aktivierte PEG-Derivate sind beschrieben worden. Ein Beispiel eines solchen aktivierten Derivats ist der „aktive" Succinimidylsuccinatester: CH₃O-PEG-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS wobei NS =
ist.
Im folgenden wird die aktive Succinimidylestereinheit in den chemischen Zeichnungen als -CO₂-NS wiedergegeben.
Bei dem aktiven Succinimidylester handelt es sich um eine nützliche Verbindung, da er schnell mit Aminogruppen an Proteinen und anderen Molekülen unter Bildung einer Amidbindung (-CO-NH-) reagiert. Die Kupplung dieses Derivats an Proteine (als PRO-NH₂ wiedergegeben) ist beispielsweise im US-Patent 4,179,337, das an Davis et al. vergeben wurde, beschrieben: mPEG-O₂CCH₂CH₂CO₂NS + PRO-NH₂ → mPEG-O₂C-CH₂CH₂-CONH-PRO
Bifunktionelle PEGs mit aktiven Gruppen an beiden Enden der linearen Polymerkette sind Verbindungen, die auch dann von Nutzen sind, wenn man ein quervernetztes unlösliches Netzwerk bilden will. Im Stand der Technik sind viele solcher bifunktionellen PEGs bekannt. Im US-Patent 5,162,430 von Rhee et al. beispielsweise ist die Verwendung von solchen bifunktionellen PEGs zum Quervernetzen von Collagen offenbart.
Weiterhin wurden reaktive PEGs synthetisiert, in denen entlang des Polymerskeletts mehrere aktive funktionelle Gruppen angeordnet sind. So wurden im Stand der Technik Lysin-PEG-Konjugate hergestellt, in denen eine Reihe aktivierter Gruppen entlang des Polymerskeletts angeordnet sind. Zalipsky et al Bioconjugate Chemistry, 4: 54–62(1993).
Im US-Patent 5,283,339 von Arnold et al sind PEG-Verbindungen offenbart, die dazu fähig sind, Metalle zu chelatisieren. Die PEG-Verbindungen weisen eine terminale metallchelatisierende Gruppe auf, die über zwei freie Carbonsäure- oder Aminogruppen verfügt, die typischerweise an ein Stickstoffatom gebunden sind. Die PEG-Verbindungen werden dazu verwendet, Proteine aus Lösungen zu extrahieren und auszufällen, wobei die Carbonsäure- bzw. Aminogruppen zusammen mit dem Stickstoffatom dazu in der Lage sind, mit Metallionen ionische Komplexe zu bilden. Die in dem Patent offenbarten metallchelatisierenden Gruppen sind jedoch im allgemeinen nicht dafür geeignet, die PEG-Verbindungen kovalent an Proteine, Peptide oder kleine Arzneimittel, die funktionelle Gruppen wie Amine tragen, zu kuppeln. In dem Patent wird nicht gelehrt, wie man ein aktiviertes PEG-Derivat zur kovalenten Kupplung an ein anderes Molekül unter Bildung eines Konjugats bildet.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die hier beschriebene Erfindung stellt ein wasserlösliches Polymer wie Poly(ethylenglykol) oder verwandte Polymere mit einer verzweigten Einheit an einem Ende der Polymerkette und, mit der verzweigten Einheit verbunden, zwei freien reaktiven Gruppen zur kovalenten Anbindung an ein anderes Molekül bereit. Jede reaktive Einheit kann mit einer anbindenden Gruppe wie beispielsweise einer Alkylkette versehen sein, die eine reaktive Gruppe mit der verzweigten Einheit verbindet. Durch die verzweigte Endgruppe ist der aktivierte wasserlösliche erfindungsgemäße Polymer somit in der Lage, mit zwei Molekülen unter Bildung von Konjugaten zu reagieren.
Da man bei der Herstellung eines aktivierten Polymers eine anbindende Gruppe mit einer gewünschten Länge auswählen kann, können die beiden reaktiven Gruppen in einem vorherbestimmten Abstand voneinander gehalten werden. Auch die beiden über die zwei reaktiven Gruppen mit dem aktivierten Polymer konjugierten Moleküle können in einem vorherbestimmten Abstand voneinander gehalten werden. Gemäß der Erfindung wird somit ein aktiviertes PEG bereitgestellt, das über zwei reaktive Einheiten verfügt, die in einer PEG-Kette bei einer verzweigten Einheit ihren Ursprung haben. Die beiden freien reaktiven Einheiten können mit biologisch aktiven Mitteln wie z.B. Proteinen reagieren und somit das aktivierte Polymer mit den biologisch wirksamen Mitteln verbinden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein aktiviertes wasserlösliches Polymer der Formel:
bereitgestellt, wobei POLY für ein wasserlösliches, im wesentlichen nicht immunogenes Polymerskelett steht, Y für eine hydrolytisch stabile Bindung steht und X und X' für reaktive Gruppen stehen, die dazu in der Lage sind, mit einer Einheit in einem anderen Molekül wie z.B. einem Protein zu reagieren. Typischerweise ist das Polymerskelett aus der aus geradkettigem und verzweigtem Poly(ethylenglykol), geradkettigem und verzweigtem Poly(alkylenoxid), geradkettigem und verzweigtem Poly(vinylpyrrolidon), geradkettigem und verzweigtem Poly(vinylalkohol), geradkettigem und verzweigtem Polyoxazolin, geradkettigem und verzweigtem Poly(acryloylmorpholin) und Derivaten davon bestehenden Gruppe ausgewählt. Bevorzugt besteht das Polymerskelett aus Poly(ethylenglycol) oder einem Derivat davon. Das Polymerskelett POLY kann mit einer aus der aus -OH, -O-Alkyl und -Y-CHXX', wobei Y, X und X' wie oben beschrieben sind, bestehenden Gruppe ausgewählten Abschlußgruppe versehen sein, wobei die Abschlußgruppen an den Endgruppen des PEG jeweils gleich oder verschieden sein können.
X und X' werden durch -W-Z bzw. -W'-Z' wiedergegeben, wobei Z und Z' für reaktive Einheiten zum Konjugieren des Polymers mit einem anderen Molekül stehen. W und W' stehen für anbindende Gruppen, die eine im wesentlichen geradkettige Kette von Atomen umfassen, z.B. Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon. Zu den reaktiven Einheiten zählen beispielsweise aktive Ester, aktive Carbonate, Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate, Epoxide, Alkohole, Maleimide, Vinylsulfone, Hydrazide, Dithiopyridine und Iodacetamide, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Bei einer anderen Ausführungsform des aktivierten erfindungsgemäßen Polymers hat das aktivierte wasserlösliche Polymer die Formel:
wobei
R für einen zentralen verzweigten Kern,
POLY für ein wasserlösliches, im wesentlichen nicht immunogenes Polymer,
Y für eine hydrolytisch stabile Bindung und
n für 2 bis 200 steht;
X und X' für reaktive Gruppen stehen, die mit einer Einheit in einem anderen Molekül wie z.B. einem Protein reagieren können.
Viele zentrale verzweigte Kernmoleküle zur Herstellung verzweigter bzw. dendritischer PEGs sind bekannt, und alle lassen sich für R verwenden. Typischerweise kann es sich bei R um eine von Lysin, Glycerin, Pentaerythrit oder Sorbit abgeleitete Einheit handeln. Geeignete Polymerskeletts sind beispielsweise geradkettiges und verzweigtes Poly(ethylenglykol), geradkettiges und verzweigtes Poly(alkylenoxid), geradkettiges und verzweigtes Poly(vinylpyrrolidon), geradkettiger und verzweigter Poly(vinylalkohol), geradkettiges und verzweigtes Polyoxazolin, geradkettiges und verzweigtes Poly(acryloylmorpholin) und deren Derivate, jedoch ist die Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Vorzugsweise handelt es sich bei POLY um Poly(ethylenglykol) oder ein Derivat davon, das als Polymerskelett verwendet wird.
Bei den reaktiven Gruppen X und X' kann es sich um reaktive Einheiten handeln, die direkt mit der verzweigenden Einheit-CH verbunden sind, oder X und X' können weiterhin eine anbindende Gruppe umfassen und werden durch -W-Z bzw. -W'-Z' wiedergegeben, wobei Z und Z' für reaktive Gruppen stehen, mit denen das Polymer mit einem anderen Molekül konjugiert werden kann. W und W' stehen für anbindende Gruppen, die eine im wesentlichen geradkettige Kette von Atomen umfassen, z.B. Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon. Zu den reaktiven Gruppen zählen beispielsweise aktive Ester, aktive Carbonate, Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate, Epoxide, Alkohole, Maleimide, Vinylsulfone, Hydrazide, Dithiopyridine und Iodacetamide, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
Das aktivierte wasserlösliche Polymer kann unter Bildung eines Konjugats kovalent mit einem biologisch aktiven Mittel verbunden sein. Geeignete biologisch aktive Mittel sind alle Mittel, die eine Einheit aufweisen, die mit wenigstens einer der beiden reaktiven Gruppen in der Endgruppe des aktivierten Polymers reagieren kann. Das biologisch aktive Mittel kann zwei solcher Einheiten aufweisen, die jeweils mit einer der beiden reaktiven Gruppen verbunden sein können. Alternativ dazu kann das Konjugat zwei biologisch aktive Mittel umfassen, die jeweils an eine der beiden reaktiven Einheiten des aktivierten Polymers gebunden sind. Da erfindungsgemäß auch aktivierte Polymere mit verschiedenen anbindenden Gruppen hergestellt werden können, kann man ein aktiviertes Polymer bereitstellen, in dem die beiden reaktiven Gruppen in einer Endgruppe des aktivierten Polymers sich in einem gewünschten Abstand voneinander befinden. Ist ein solches aktiviertes Polymer mit zwei Molekülen eines biologisch aktiven Mittels konjugiert, so können die beiden Moleküle in einem gewünschten Abstand voneinander gehalten werden.
Demgemäß läßt sich das aktivierte PEG, verglichen mit anderen, bereits im Stand der Technik bekannten PEG-Derivaten zur Bildung verschiedener Konjugate mit Molekülen wie Proteinen oder Peptiden, vielseitiger einsetzen. Da mit einem anderen Molekül konjugierte PEG-Moleküle dem anderen Molekül Wasserlöslichkeit und reduzierte Immunogenität verleihen können, ist es durch die aktivierten erfindungsgemäßen PEG-Derivate möglich, diese Eigenschaften in einem Konjugat besser zu steuern und genauer zu modifizieren.
Es wird somit ein aktiviertes wasserlösliches Polymer mit proximalen reaktiven Gruppen bereitgestellt. Das Polymerskelett weist wenigstens eine Endgruppe mit zwei reaktiven Gruppen auf. Die Endgruppe hat eine verzweigende Einheit und zwei mit der verzweigenden Einheit verbundene freie reaktive Einheiten. Die verzweigende Einheit wiederum ist über eine stabile Verbindung mit dem Polymerskelett verbunden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ausdrücke „Gruppe", „funktionelle Gruppe", „Einheit", „aktive Einheit", „reaktive Stelle", „reaktive Gruppe" und „reaktive Einheit" beziehen sich im Stand der Technik und hier auf unabhängige, definierbare Portionen bzw. Teile eines Moleküls. Die Ausdrücke werden im Stand der chemischen Technik in gewisser Weise synonym verwendet; hier bezeichnen sie die Portionen von Molekülen, die eine Funktion erfüllen bzw. Aktivität aufweisen und mit anderen Portionen von Molekülen reagieren.
Mit dem Ausdruck „Verbindung" bzw. „Bindung" werden hier Gruppen bzw. Bindungen bezeichnet, die normalerweise als Ergebnis einer chemischen Umsetzung gebildet werden und bei denen es sich typischerweise um kovalente Bindungen handelt. „Hydrolytisch stabile Bindungen" bedeutet, daß die Bindungen in Wasser im wesentlichen stabil sind und bei brauchbaren pH-Werten, z.B. unter physiologischen Bedingungen, über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise auf unbestimmte Zeit, nicht mit Wasser reagieren.
Mit dem hier verwendeten Ausdruck „biologisch aktives Mittel" sind alle Substanzen gemeint, die eine physikalische oder biochemische Eigenschaft eines biologischen Organismus einschließlich Viren, Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Tieren und Menschen, wobei diese Aufzählung jedoch nicht hierauf beschränkt ist, bewirken können. Wie hier verwendet schließt biologisch aktives Mittel insbesondere alle für die Diagnose, Heilung, Linderung, Behandlung oder Prävention von Erkrankungen in Menschen oder anderen Tieren oder anderweitig zur Verbesserung des physikalischen oder geistigen Wohlbefindens von Menschen oder Tieren bestimmte Substanzen ein. Zu den biologisch aktiven Mitteln zählen beispielsweise organische und anorganische Verbindungen, Proteine, Peptide, Lipide, Polysaccharide, Nukleotide, DNAs, RNAs, andere Polymere und Derivate davon, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Zu den biologisch aktiven Mitteln zählen beispielsweise Antibiotika, Fungizide, Mittel gegen Viren, entzündungshemmende Mittel, Antitumormittel, Herzkreislaufmittel, Mittel gegen Angst, Hormone, Wachstumsfaktoren, steroidale Mittel und dergleichen. Andere Beispiele schließen Mikroorganismen wie Bakterien und Hefezellen, Virenpartikel, Pflanzenzellen, Tierzellen oder menschliche Zellen und dergleichen ein.
Bei dem Polymerskelett handelt es sich um ein wasserlösliches, im wesentlichen nicht immunogenes Polymer, vorzugsweise um Poly(ethylenglykol) (PEG). Es versteht sich jedoch, daß auch andere verwandte Polymer sich für eine Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen, und daß die Verwendung des Ausdrucks „PEG" bzw. „Poly(ethylenglykol)" in dieser Hinsicht einschließend und nicht ausschließend ist.
Poly(ethylenglykol) bzw. PEG eignet sich für biologische Anwendungen, da es Eigenschaften hat, die für biologische oder biotechnische Anwendungen hoch wünschenswert und allgemein anerkannt sind. PEG ist typischerweise klar, farblos, geruchslos, in Wasser löslich, stabil gegenüber Hitze und inert gegenüber vielen chemischen Mitteln, hydrolysiert nicht und verdirbt nicht und ist allgemein nichttoxisch. Poly(ethylenglykol) wird als biokompatibel angesehen, das heißt, daß PEG dazu fähig ist, mit lebenden Geweben oder Organismen zu koextisieren, ohne Schädigungen zu verursachen. PEG ist insbesondere nicht immunogen, was bedeutet, daß PEG nicht dazu neigt, im Körper eine Immunreaktion hervorzurufen. Wird PEG unter Bildung eines Konjugats an ein Molekül mit einer wünschenswerten Funktion im Körper wie z.B. einem biologisch aktiven Mittel gebunden, so tendiert PEG dazu, das Mittel zu maskieren, so daß eine etwaige Immunreaktion reduziert oder eliminiert wird und ein Organismus die Gegenwart des Mittels tolerieren kann. Demgemäß ist das Konjugat im wesentlichen nichttoxisch. PEG-Konjugate neigen nicht dazu, eine wesentliche Immunreaktion hervorzurufen oder Gerinnung oder andere unerwünschte Wirkungen zu verursachen. Ein für die Durchführung der Erfindung nützliches Polymer ist PEG mit der Formel -CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-, wobei n für eine Zahl von etwa 8 bis etwa 4000 steht. Vorzugsweise verwendet man als ein Polymerskelett PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 100000 Da.
Das Polymerskelett kann geradkettig oder verzweigt sein. Verzweigte Polymerskelette sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Typischerweise hat ein verzweigtes Polymer eine zentrale Zweigkerneinheit und eine Mehrzahl mit dem zentralen Zweigkern verbundene geradkettige Polymerketten. PEG wird herkömmlicherweise in verzweigten Formen verwendet, die sich durch Addition von Ethylenoxid an verschiedene Polyole wie Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit darstellen lassen. Das aus Pentaerythrit hergestellte vierarmige, verzweigte PEG beispielsweise ist unten gezeigt: C(CH₂-OH)₄ + n C₂H₄O → C[CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH]₄
Die zentrale Zweigeinheit kann sich auch von mehreren Aminosäuren, z.B. Lysin, ableiten.
Die verzweigten Polyethylenglykole lassen sich in allgemeiner Form als R(-PEG-OH)_n wiedergeben, wobei R für die Kerneinheit wie z.B. Glycerin oder Pentaerythrit und n für die Anzahl an Armen steht. Geeignete verzweigte PEGs lassen sich gemäß der internationalen Patentschrift Nr. WO 96/21469 mit dem Titel Multi-Armed, Monofunctional, and Hydrolytically Stable Derivatives of Poly(Ethylen Glycol) and Related Polymers for Modification of Surfaces and Molecules, die am 11. Januar 1996 eingereicht wurde, herstellen. Diese verzweigten PEGs können dann nach dem hier Gelehrten modifiziert werden.
Für die vorliegende Erfindung eignen sich neben PEG auch viele andere wasserlösliche, im wesentlichen nicht immunogene Polymere. Diese anderen Polymere können entweder in geradkettiger oder verzweigter Form vorliegen und schließen andere Poly(alkylenoxide) wie Poly(propylenglykol)(„PPG"), Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol und dergleichen; Poly(vinylakohol)(„PVA") und dergleichen ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Es kann sich bei den Polymeren um Homopolymere oder statistische Copolymere oder Blockcopolymere und Terpolymere, denen die Monomore der obigen Polymere, geradkettig oder verzweigt, zugrunde liegen, handeln.
Konkrete Beispiele geeigneter zusätzlicher Polymere schließen difunktionelles Poly(acryloylmorpholin)(„PAcM") und Poly(vinylpyrrolidon)(„PVP") ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. PVP und Poly(oxazolin) sind im Stand der Technik gut bekannte Polymere, und ihre Herstellung sollte dem Fachmann geläufig sein. PAcM und dessen Synthese und Verwendung sind in den US-Patenten Nr. 5,629,384 und 5,631,322 beschrieben.
Wenngleich das Molekulargewicht der jeweiligen Ketten des Polymerskeletts variieren kann, liegt es typischerweise im Bereich von etwa 100 bis 100000, vorzugsweise von etwa 6000 bis etwa 80000.
Dem Durchschnittsfachmann wird einleuchten, daß die obige Aufzählung im wesentlichen wasserlöslicher, nicht immunogener Polymerskelette keinesfalls erschöpfend und lediglich zur Veranschaulichung ist, und daß alle polymeren Materialien mit den oben beschriebenen Qualitäten in Betracht gezogen werden.
Das aktivierte erfindungsgemäße Polymer weist weiterhin proximate reaktive Gruppen auf, die an wenigstens einen Arm des Polymerskeletts gebunden sind. Es wird einleuchten, daß der Ausdruck „proximal" hier verwendet wird, um eine Endgruppe zu bezeichnen, die über zwei freie reaktive Einheiten verfügt, die dazu in der Lage sind, mit zwei anderen Einheiten in einem anderen Molekül oder zwei anderen Molekülen, die gleich oder verschieden sein können, zu reagieren.
Die Endgruppe weist typischerweise eine verzweigende Einheit auf, die kovalent über eine hydrolytisch stabile Bindung mit einer Polymerkette des Polymerskeletts verbunden ist. Typischerweise befinden sich zwei frei reaktive Gruppen als Zweige an der verzweigenden Einheit. Der Ausdruck „freie", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß jede der beiden freien reaktiven Gruppen zwei Enden hat, von denen das eine kovalent mit der verzweigenden Einheit und das andere Ende nicht über eine kovalente Bindung mit einer anderen Einheit oder Gruppe verbunden ist und (für eine Reaktion mit einer anderen Einheit bzw. Gruppe, z.B. eines anderen Moleküls zur Verfügung steht).
Typischerweise handelt es sich bei der verzweigenden Einheit um eine stabile, nicht reaktive und inerte Einheit, die kovalent mit einer Polymerkette und den beiden reaktiven Gruppen verbundnen ist. Die verzweigende Einheit sollte mit Metallionen oder Einheiten oder Molekülen keine Wasserstoffbrückenbindung oder ionische Bindung bilden. Es wird angenommen, daß die Fähigkeit zur Ausbildung starker Wasserstoffbrückenbindungen oder ionischer Bindungen die Funktion der verzweigenden Einheit stören würde. Bei dem verzweigenden Atom, d.h. dem Atom, an das die beiden freien reaktiven Gruppen gebunden sind, handelt es sich nicht um ein Stickstoffatom (N), typischerweise ist dieses Atom jedoch ein Kohlenstoffatom (C).
Wenigstens eine der beiden freien reaktiven Gruppen kann aus zwei Portionen bestehen: einer reaktiven Einheit am freien Ende und einer anbindenden Gruppe, die die reaktive Einheit mit der verzweigenden Einheit verbindet. Bei der reaktiven Einheit handelt es sich um eine Einheit, die dazu fähig ist, mit einer Einheit in einem anderen Molekül, z.B. einem biologisch aktiven Mittel wie einem Protein, einem Peptid, usw., zu reagieren. Geeignete reaktive Einheiten schließen beispielsweise aktive Ester, aktive Carbonate, Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate, Epoxide, Alkohole, Maleimide, Vinylsulfone, Hydrazide, Dithiopyridine, N-Succinimidyl und Iodacetamide ein, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Die Wahl einer freien reaktiven Einheit richtet sich nach der Einheit in einem anderen Molekül, mit dem die freie reaktive Einheit reagieren soll. Handelt es sich bei der Einheit in einem anderen Molekül beispielsweise um eine Thioleinheit, so wird eine Vinylsulfoneinheit als freie reaktive Einheit des aktivierten Polymers bevorzugt. Andererseits reagiert eine N-Succinimidyleinheit vorzugsweise mit einer Aminoeinheit in einem biologisch aktiven Mittel.
Die anbindende Gruppe kann eine vorbestimmte Länge haben, so daß die mit ihr verbundene reaktive Einheit sich in einem vorbestimmten Abstand von der verzweigenden Einheit und somit in einem vorbestimmten Abstand von der anderen reaktiven Einheit der Endgruppe befindet. Typischerweise ist die anbindende Gruppe nicht reaktiv und im wesentlichen eine geradkettige Kette von Atomen, z.B. Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das aktivierte erfindungsgemäße Polymer durch die Formel I:
oder die Formel II:
wiedergegeben werden.
In der obigen Formel steht POLY für eine geradkettige Polymerkette eines wasserlöslichen, im wesentlichen nicht immunogenen Polymerskeletts, vorzugsweise für Poly(ethylenglykol) oder ein Derivat davon. In dem durch Formel I wiedergegebenen aktivierten Polymer hat das Polymerskelett nur eine Polymerkette. Y steht für eine hydrolytisch stabile Bindung, die aus einem Atom oder einer Gruppe wie -O-, -S- und -CO-NH- bestehen kann. Dem Fachmann wird bekannt sein, daß man bei dieser Ausführungsform auch andere hydrolytisch stabile Bindungen einsetzen kann.
X und X' sind freie reaktive Gruppen, die gleich oder verschieden sein können und jeweils eine reaktive Einheit aufweisen, die mit einer Einheit in einem anderen Molekül wie einem Protein reagieren kann. In dem durch Formel I wiedergegebenen aktivierten Polymer kann das Polymerskelett POLY am dem Terminus mit den proximalen reaktiven Gruppen gegenüberliegenden Ende eine Abschlußgruppe aufweisen. Bei der Abschlußgruppe kann es sich beispielsweise um -OH oder verschiedene Alkylgruppen handeln, und sie kann auch proximale reaktive Gruppen -Y-CHXX' enthalten, wobei Y, X und X' wie oben beschrieben sind. Das aktivierte Polymer kann dementsprechend zwei Endgruppen mit proximalen reaktiven Gruppen, eine an jedem Ende des Polymerskeletts, aufweisen.
In Formel II ist R der wie oben beschriebene zentrale Kern. POLY steht für eine Polymerkette des wasserlöslichen, im wesentlichen nicht immunogenen Polymerskeletts. Y steht für eine hydrolytisch stabile Bindung und n steht für eine Zahl von 2 bis 200, die die Anzahl von Polymerketten bzw. Armen im Polymerskelett angibt, wie oben beschrieben.
Es wird einleuchten, daß es sich bei der wie oben beschriebenen verzweigenden Einheit bei dieser Ausführungsform des aktivierten Polymers um CH handelt. Typischerweise wird diese Einheit unter normalen Bedingungen nicht geladen und bildet mit einem Metallion keine ionische Bindung.
X und X' können zusätzlich zur reaktiven Einheit eine anbindende Gruppe aufweisen und als -W-Z bzw. -W'-Z' dargstellt werden, wobei Z und Z' für freie reaktive Einheiten stehen, mit denen das Polymer mit einem anderen Molekül konjugiert werden kann. W und W' stehen für anbindende Gruppen. Bei Z und Z' kann es sich um gleiche oder verschiedene reaktive Einheiten handeln.
Im folgenden sind einige Beispiele von bevorzugten Ausführungen der aktivierten erfindungsgemäßen Polymere angeführt: CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-OCO₂-NS)₂ CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS)₂ CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-CO₂-NS)₂ CH₃O-PEG-O-CH(CH₂-OCO₂-NS)₂ CH₃O-PEG-O-CH(CH₂-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS)₂ (OHC-CH₂CH₂-O-CH₂)₂-CH-NHCO-PEG-CONH-CH(OCH₂CN₂-CHO)₂ PEG-[CONH-CH(OCH₂CH₂-CHO)₂]₄ CH₃O-PEG-CO-NH(CO₂-NS)(CH₂CH₂CO₂-NS)
In diesen Beispielen steht -NS für die N-Succinimidyleinheit.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung des aktivierten wasserlöslichen erfindungsgemäßen Polymers bereitgestellt.
Typischerweise wird im ersten Schritt ein erstes Polymerzwischenprodukt mit einem Polymerskelett und einer reaktiven Endgruppe, die kovalent mit dem Polymerskelett verbunden ist, bereitgestellt.
Darüber hinaus wird eine Verbindung mit drei an eine verzweigende Einheit verbundenen reaktiven Gruppen bereitgestellt. Diese Verbindung weist typischerweise eine verzweigende Einheit auf, die einen zentralen Kern bildet, und drei freie Gruppen, die Zweige am zentralen Kern sind. Sind die drei freien Gruppen an das gleiche Atom in der verzweigenden Einheit gebunden, so handelt es sich bei dem Atom nicht um ein Stickstoffatom. Eine der drei freien Gruppen kann mit der reaktiven Endgruppe des ersten Polymerzwischenprodukts unter Ausbildung einer hydrolytisch stabilen Verbindung reagieren. Die anderen beiden freien Gruppen können letztendlich in die beiden freien reaktiven Gruppen an der Endgruppe des aktivierten erfindungsgemäßen Polymers umgewandelt werden. Bei diesen Verbindungen handelt es sich beispielsweise um H₂NCH(CH₂-OH)₂, NaO-CH(CH₂-O-Bz)₂, H₂N-CH(CH₂CO₂H)₂ und dergleichen. Es leuchtet ein, daß es sich bei der verzweigenden Einheit in diesen Beispielen um CH handelt. Die H₂N- und NaO-Einheiten können dazu verwendet werden, die Verbindung unter Ausbildung einer hydrolytisch stabilen Bindung mit dem ersten Polymerzwischenprodukt zu verbinden, während die Hydroxylgruppen, die Carbonsäuregruppen und die -CH₂-O-Bz-Gruppen letzendlich in die freien reaktiven Einheiten des aktivierten erfindungsgemäßen Polymers umgewandelt werden können.
Im zweiten Schritt des Verfahrens wird somit die Verbindung mit den drei reaktiven Gruppen mit dem ersten Polymerzwischenprodukt umgesetzt, wodurch ein zweites Polymerzwischenprodukt gebildet wird, das eine hydrolytisch stabile Bindung um faßt, die das erste Polymerzwischenprodukt und die Verbindung mit den drei reaktiven Gruppen miteinander verbindet, so daß an der Endgruppe der Polymerkette nur noch zwei freie Gruppen verbleiben.
Im dritten Schritt werden die beiden freien Gruppen der Verbindung in die beiden mit der verzweigenden Einheit verbundenen freien reaktiven Einheiten umgewandelt. Für diese Umwandlung lassen sich eine Reihe von im Stand der Technik bekannten Verfahren anwenden. So kann man die freien Gruppen beispielsweise zu einer Verbindung umsetzen, die eine freie reaktive Einheit verleiht. Alternativ dazu kann man die beiden freien Gruppen im zweiten Polymerzwischenprodukt unter Bildung zweier neuer freier reaktiver Einheiten oxidieren oder reduzieren oder substituieren. Solche Verfahren werden dem Fachmann angesichts der unten angeführten Beispiele einleuchten.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat bereitgestellt, das durch kovalente Bindung des aktivierten wasserlöslichen erfindungsgemäßen Polymers an ein anderes Molekül, z.B. ein biologisch aktives Mittel, gebildet wird. Typischerweise kann es sich bei einem geeigneten biologisch aktiven Mittel um ein beliebiges biologisch aktives Mittel mit einer zur Reaktion mit wenigstens einer der beiden proximalen reaktiven Gruppen in der Endgruppe des aktivierten Polymers fähigen Einheit handeln.
Das biologisch aktive Mittel kann zwei solcher Einheiten aufweisen, die jeweils an eine der beiden reaktiven Gruppen gebunden sein können. Alternativ dazu kann das Konjugat zwei biologisch aktive Mittel aufweisen, die jeweils an einer der beiden reaktiven Einheiten des aktivierten Polymers gebunden sind. Bei den reaktiven Einheiten im aktivierten Polymer kann es sich beispielsweise um Vinylsulfoneinheiten handeln, die mit einer Thioleinheit reagieren können. Weist ein Protein lediglich eine Thioleinheit auf, dann können zwei dieser Proteinmoleküle über die beiden Vinylsulfoneinheiten an das aktivierte Polymer gebunden werden. Weist ein Protein zwei Thioleinheiten auf, so kann man die Umsetzung zwischen Protein und aktiviertem Polymer so steuern, daß daß jedes aktivierte Polymermolekül mit zwei Proteinmolekülen konjugiert ist. Alternativ dazu kann man die Reaktion auch so steuern, daß die beiden Vinylsulfoneinheiten eines aktivierten Polymers mit zwei Thioleinheiten im gleichen Proteinmolekül umgesetzt werden.
Andere Einheiten in biologisch aktiven Mitteln, die sich für eine Umsetzung mit den freien reaktiven Einheiten der zweiwertigen Endgruppen eines aktivierten erfindungsgemäßen Polymers eignen, sind beispielsweise Aminogruppen, Carbonsäuregruppen, usw. In Kenntnis der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann wissen, welche freien reaktiven Einheiten in einem aktivierten Polymer für die Reaktion mit einer vorgegebenen Einheit in einem biologisch aktiven Mittel zu wählen sind. Erfolgt die Konjugation beispielsweise durch Umsetzung mit einer Aminogruppe in einem biologisch aktiven Mittel, so wird man vorzugsweise für die Konjugation Einheiten wie -CO₂ NS oder Aldehyd als freie reaktive Einheit im aktivierten Polymer einsetzen.
Da es gemäß der Erfindung möglich ist, aktivierte Polymere mit verschiedenen anbindenden Gruppen herzustellen, kann man ein aktiviertes Polymer bereitstellen, in dem die beiden reaktiven Gruppen in einer zweiwertigen Endgruppe des aktivierten Polymers sich in einem gewünschten Abstand voneinander befinden. Wird ein solches aktiviertes Polymer mit zwei Molekülen eines biologisch aktiven Mittels konjugiert, so können die beiden Moleküle in einem gewünschten Abstand voneinander gehalten werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der Erfindung angeführt, sollen jedoch die Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1. Synthese von mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂O₂CCH₂CH₂CO₂NS)₂ (NS = N-Succinimidyl)
Beispiel 2. Synthese von mPEG_20K-OCH(CH₂-SO₂CH=CH₂)₂
Beispiel 3. Synthese von mPEG_5K-O₂CNH-CH(CH₂CO₂NS)₂
Beispiel 4. Synthese von mPEG_5K-O-CH₂CH₂(CO₂H)₂

BEISPIEL 1
Umsetzung:

1. mPEG_20K-OCH₂CH₂CO₂NS + H₂NCH(CH₂-OH)₂ mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂OH)₂ + NHS NS = N-Succinimidyl; NHS = N-Hydroxysuccinimid
2. mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-OH)₂ + 2SA mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-O₂CCH₂CH₂CO₂H)₂ SA = Bernsteinsäureanhydrid
3. mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-O₂CCH₂CH₂CO₂H)₂ + NHS + DCC mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-O₂CCH₂CH₂CONS)₂ DCC = Dicyclohexylcarbodiimid

Darstellung:
1. mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂OH)₂
Eine Lösung von mPEG_20K-OCH₂CH₂CO₂NS (mSPA 20K, 20 g, 0,001 mol), H₂NCH(CH₂-OH)₂ (Serinol, 0,14 g, 0,00154 mol) und Triethylamin (0,3 ml) in Acetonitril (100 ml) wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt, und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Das Produkt wurde an DEAE-Sepharose unter Verwendung von Wasser als Laufmittel chromatographiert, und das Eluat wurde mit NaCl gesättigt und mit Chloroform extrahiert. Die so erhaltene Chloroformphase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man 20 g Produkt als weißen Feststoff erhielt, der bei der Gelpermeationschromatographie (Ultrahydrogel 250, pH-Wert des Puffers 7,2) einen einzelnen Peak zeigte.
2. mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-O₂CCH₂CH₂CO₂H)₂
Eine Lösung des Produkts aus (1) (20 g, 0,002 mol) und 2,6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol (0,02 g) in 220 ml Chloroform wurde destilliert, bis etwa 150 ml des Lösungsmittels überdestilliert waren. Bernsteinsäureanhydrid (2,0 g, 0,02 mol), Pyridin (1,62 ml, 0,02 mol) und 40 ml Toluol wurden zugesetzt und die so erhaltene Mischung wurde bei 84°C 20 h unter Stickstoff gerührt. Das Produkt wurde mit 850 ml Ether ausgefällt und abfiltriert. Nach dem Trocknen wurde das Produkt in 200 ml Wasser gelöst und mit 20 g NaCl versetzt, und der pH-Wert wurde mit wäßriger Phosphorsäure auf 3 eingestellt. Das Produkt wurde mit Chloroform (200 + 150 + 100 ml) extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Eindampfen der getrockneten Lösung lieferte das Produkt als einen weißen Feststoff (16 g). Das Molekulargewicht wurde durch potentiometrische Titration als 20940 Da bestimmt.
3. mPEG_20K-OCH₂CH₂CONHCH(CH₂-O₂CCH₂CH₂CONS)₂
Eine Lösung des Produkts aus (2) (15 g, 0,0015 mol), N-Hydroxysuccinimid (0,21 g, 0,00179 mol) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,37 g, 0,00177 mol) in Methylenchlorid (100 ml) wurde unter Stickstoff über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wurde filtriert und das Produkt wurde zweimals aus Methylenchlorid durch Zugabe von Ether (850 ml) ausgefällt und abfiltriert, wodurch man einen weißen Feststoff (13,0 g) erhielt, dessen Substitutionsgrad gemäß Protonen-NMR 97,7% betrug. Das Protonen-NMR zeigte ein breites Multiplett bei 3,50 ppm (Methylengruppen des PEG-Skeletts), ein Singulett bei 3,23 ppm (PEG-Methyl), ein Singulett bei 2,80 ppm (NS-Methylengruppen) und Multipletts bei 2,68 und 2,95 ppm (Succinat-Methylengruppen).
BEISPIEL 2
Umsetzung:

1. HO-CH(CH₂-O-Bz)₂ + NaH(Toluol) NaO-CH(CH₂ OBz)₂ Bz = Benzyl
2. NaO-CH(CH₂-O-Bz)₂ + mPEG_20K-O-Ms mPEG_20KO-CH(CH₂OBz)₂ Ms = Mesylat
3. mPBG_20KO-CH(CH₂OBz)₂ + HCO₂H/MeOH/H₂O/Pd/C mPEG_20KO-CH(CH₂OH)₂
4. mPEG_20KO-CH(CH₂pH)₂ + MsCl/Et₃N mPEG_20KO-CH(CH₂OMs)₂
5. mPEG_20KO-CH(CH₂OMs)₂ + HSCH₂CH₂OH mPEG_20KO-CH(CH₂SCH₂CH₂OH)₂
6. mPEG_20KO-CH(CH₂SCH₂CH₂OH)₂ + H₂WO₄ mPEG_20KO-CH(CH₂SO₂CH₂CH₂OH)₂
7. mPEG_20KO-CH(CH₂SO₂CH₂CH₂OH)₂ + MsCl/ET₃N mPEG_20KO-CH(CH₂SO₂CH=CH₂)₂

Darstellung:
1. mPEG_20KO-CH(CH₂OBz)₂
Eine Lösung von 18 g (0,0641 mol) 1,3-Dibenzyloxy-2-propanol in 80 ml Toluol wurde destilliert, bis 15 ml Toluol abdestilliert waren. Die azeotrop getrocknete Lösung wurde dann zu einer Suspension von 2,56 g (0,064 mol) NaH in 80 ml Toluol gegeben, und die so erhaltene Mischung wurde unter Erhitzen auf 37–40°C gerührt und dann gefiltert. Das Filtrat wurde dann zu einer Lösung von azeotrop getrocknetem mPEG_20K Mesylat in etwa 350 ml Toluol gegeben, und die so erhaltene Mischung wurde unter N₂ 20 h auf 125°C erhitzt. Das Produkt wurde mit kaltem Ether gefällt, auf dem Filter mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch man 70,4 g eines weißen Feststoffs erhielt, der nach Protonen-NMR rein war.
2. mPEG_20KO-CH(CH₂OH)₂
Eine Lösung von 15 g (0,00075 mol) des Produkts aus (1) in 9,2 ml Ameisensäure und 0,8 ml Wasser wurde mit 2,0 g Pd/C (10%) versetzt, und die Mischung wurde 2 h unter Stickstoff gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert, und der der pH-Wert des Filtrats wurde auf 7,2 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert, und der Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet. Durch Eindampfen der Lösung erhielt man 12,9 g Produkt, das im Protonen-NMR keine Benzylgruppen zeigte.
3. mPEG_20KO-CH(CH₂OMs)₂
Eine azeotrop getrocknete Lösung des Produkts aus (2) (8,0 g, 0,000889 mol) in Toluol (100 ml) mit 0,008 g 2,6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol wurde zu einer Lösung von Mesylchlorid (0,090 ml, 0,00116 mol) und Triethylamin (0,210 ml, 0,0011 mol) in 10 ml Et₃N gegeben, und die so erhaltene Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Ethanol (1 ml) wurde zugegeben, und 50 ml des Lösungsmittels wurde abdestilliert, worauf 500 ml Ether zum Ausfällen des Produkts zugesetzt wurden. Das Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch man 7,6 g des Mesylatderivats erhielt, das gemäß NMR zu 100% substituiert war.
4. mPEG_20KO-CH(CH₂SCH₂CH₂OH)₂
Eine Lösung des Produkts von (3) (7,0 g, 0,00035 mol), Mercaptomethanol (0,56 ml, 0,0080 mol) und NaOH (0,22 g) in Toluol (30 ml) und Ethanol (60 ml) wurde unter N₂ 2 h auf 60°C erhitzt. Der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt, das Produkt wurde mit Methylenchlorid (3 × 100 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen des Extrakts über MgSO₄ wurde das Lösungsmittel entfernt und das Produkt mit 250 ml Ethylether ausgefällt. Das Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch man 6,6 g eines weißen Feststoffs erhielt, der gemäß NMR zu 97,3% substituiert war.
5. mPEG_20KO-CH(CH₂SO₂CH₂CH₂OH)₂
Ein das Produkt aus (4) (6,5 g, 0,00065 mol) und Wolframsäure (0,16 g) in Wasser (14 ml) enthaltene Lösung wurde hergestellt, und der pH-Wert wurde auf 6,6 eingestellt. Es wurde mit Wasserstoffperoxyd (30%, 0,65 ml) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt, und die Mischung wurde 1 h gerührt und dann mit CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) extrahiert. Die Mischung wurde über MgSO₄ getrocknet und filtriert, und das Filtrat wurde auf 25 ml eingeengt. Das Produkt wurde mit 200 ml Ether gefällt und abfiltriert, wodurch man nach Trocknen im Vakuum 5,3 g Produkt erhielt. Gemäß NMR war das Produkt zu 86% substituiert.
6. mPEG_20KO-CH(CH₂SO₂CH=CH₂)₂
Eine Lösung des Produkts aus (5) (5,2 g, 0,00052 mol), Et₃N (0,63 ml, 0,00452 mol), 2,6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol (0,005 g) und MsCl (0,15 ml, 0,001938 mol) in CH₂Cl₂ (25 ml) wurde bei Raumtemperatur 42 h gerührt. Ethanol (1 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt. Methylenchlorid (50 ml) wurde zugegeben, und die so erhaltene Lösung wurde mit wäßriger 1 M HCl und dann mit 5%iger wäßriger Na₂HPO₄ gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO₄ wurde die Lösung auf 30 ml eingeengt und das Produkt mit 300 ml Ether ausgefällt. Das Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch man das Produkt (4,6 g) als einen weißen Feststoff erhielt. Gemäß NMR betrug der Substitutionsgrad 92,5%. Das ¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d6) zeigte Absorption bei 3,51 ppm (CH₂ des PEG-Skeletts), 3,23 ppm (CH₃O) und 6,2 und 7,0 ppm (m, Vinyl-H). Man beachte, daß in diesem Beispiel Y = 0, W = CH₂ und Z = SO₂CH=CH₂.
BEISPIEL 3
Umsetzung:

1. mPEG_5KBTC + H₂N-CH(CH₂CO₂H)₂ mPEG_5KO₂CNHCH (CH₂CO₂H)₂ BTC = 1-Benzotriazolylcarbonat
2. mPEG_5KO₂CNHCH(CH₂CO₂H)₂ + NHS/DCC mPEG_5KO₂CNHCH(CH₂CO₂H)₂

Darstellung:
1. mPEG_5KO₂CNHCH(CH₂CO₂H)₂
Eine Lösung von β-Glutaminsäure (0,10 g, 0,00068 mol) und Borsäure (0,1 g) in 10 ml Wasser wurde bei einem pH-Wert von 8 im Verlauf von 15 min mit mPEG_5KBTC versetzt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge auf 8,15–8,25 gehalten wurde. NaCl (6 g) wurde zugegeben, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 10%iger H₃PO₄ auf 2 eingestellt. Das Produkt wurde mit CH₂Cl₂ (100 + 80 + 50 ml) extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft, wodurch man 7,8 g Produkt erhielt. Es wurde gefunden, daß die Mischung 75,5% des mPEG-Glutaminsäurederivats und 24,5% mPEG enthielt. Diese Mischung wurde durch Chromatographie und DEAE-Sepharose gereinigt, wobei zunächst mit Wasser eluiert wurde und dann das gewünschte Produkt mit 0,5 M NaCl eluiert wurde. Extrahieren des Produkts aus der NaCl-Lösung (pH 2) mit Methylenchlorid und anschließendes Trocknen des Extrakts über MgSO₄ und Abdampfen des Lösungsmittels lieferte 6,1 g Material, das gemäß GPC 100% rein war.
2. mPEG_5KO₂CNHCH(CH₂CO₂NS)₂
Eine Lösung von mPEG_5KO₂CNHCH(CH₂CO₂H)₂ (6,0 g, 0,00116 mol), NHS (0,385 g, 0,001627 mol, DCC (0,676 g, 0,00162 mol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die so erhaltene Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde zu 500 ml kaltem Ethylether gegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch man 5,5 g Produkt erhielt, das gemäß NMR zu 100% substituiert war. Das ¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d6) zeigte Absorptionen bei 3,51 ppm (CH₂ des PEG-Skeletts), 3,23 ppm (CH₃O), 4,29 ppm (-NHCH-), 4,05 ppm (-CH ₂-O-CONH-), 3,24 ppm (CH ₂CO₂NS) und 2,81 (NS CH ₂).
BEISPIEL 4 Umsetzung:
Darstellung:
1. Darstellung von CH₃-O-PEG-O-CH₂CH₂CH(CO₂H)₂ (Schritte 1 und 2 oben)
Malonsäurediethylester (8,8 ml) in 150 ml trockenem Dioxan wurde unter Argon zu NaH (2,4 g) in 60 ml Toluol getropft. MPEG₅₀₀₀-Mesylat (30 g) in 250 ml Toluol azeotrop destilliert, wobei 150 ml wurde Toluol entfernt wurden, und der Rückstand wurde zu der obigen Malonsäurediethylesterlösung gegeben. Die Mischung wurde 3–4 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft und über Nach im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Material wurde dann in 200 ml 1 N NaOH gelöst, die Lösung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt und der pH-Wert wurde mit 1 N HCl auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde mit NaCl bis zu einer Konzentration von etwa 15% versetzt, und die Mischung wurde dann in mehreren Portionen mit 350 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, und das Produkt wurde durch Zugabe von Isopropanol/Ether (1:1) ausgefällt. Das Produkt wurde abfiltriert und über Nacht im Vakuum getrocknet, wodurch man 24,7 g Produkt als weißes Pulver erhielt. GPC (Ultrahydrogel 250) zeigte, daß das Produkt 98% rein war.
¹H-NMR (DMSO-d6, ppm): 1,96 (t, CH₂CH ₂-C); 3,51 (br m, PEG -CH₂CH₂-O-).
2. Darstellung von CH₃O-PEG₅₀₀₀-O-CH₂CH₂CH(CH₂OH)₂
CH₃-O-PEG₅₀₀₀-O-CH₂CH₂CH(CH₂OH)₂ (5 g) wurde in 50 ml Toluol gelöst und mit 9,8 ml LiAlH₄ (1 M in THF) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft und mit 150 ml Wasser und 22,5 g NaCl versetzt. Der pH-Wert wurde mit wäßriger HCl auf 6,5 eingestellt, und die so erhaltene Lösung wurde mit 3 × 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Na₂SO₄ getrocknet, und die Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mit Ethylether gefällt und abfiltriert. Nach Chromatographie an DEAE-Sepharose war das Produkt gemäß GPC (Ultrahydrogel 250) 90% rein.
¹H-NMR (DMSO-d6, ppm): 3,51 (br m, PEG-CH₂CH₂-O-); 1,5 (br m, CH); 4,32 (t, OH).

Claims

Wasserlösliches Polymer der Struktur:
wobei POLY für ein geradkettiges oder verzweigtes, wasserlösliches Polymerskelett steht, Y für eine hydrolytisch stabile Bindung, W und W' für gegebenenfalls anbindende Gruppen, unabhängig voneinander ausgewählt aus der aus Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon bestehenden Gruppe sowie Z und Z' für reaktive Gruppen stehen.
Polymer nach Anspruch 1, wobei W und W' jeweils für eine Alkylkette stehen.
Polymer nach Anspruch 1, wobei W und W' unabhängig voneinander aus der aus -(CH₂)_m, -(CH₂)_m-O-, -O-(CH₂)_m-O₂C-CH₂CH₂ und -(CH₂)_m-O-(CH₂)_r bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei m und r unabhängig voneinander für 1–10 stehen.
Polymer nach Anspruch 1, wobei POLY aus der aus Poly(alkylenoxid), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Polyoxazolin und Poly(acryloylmorpholin) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei es sich bei POLY um Poly(ethylenglykol) handelt.
Polymer nach Anspruch 5, wobei das Poly(ethylenglykol) die Formel -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- aufweist, wobei n für eine Zahl von etwa 8 bis etwa 4000 steht.
Polymer nach Anspruch 5, wobei das Poly(ethylenglykol) ein Molekulargewicht von etwa 200 Da bis etwa 100000 Da aufweist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei Z und Z' unabhängig voneinander aus der aus aktiven Estern, aktiven Carbonaten, Aldehyden, Isocyanaten, Isothiocyanaten, Epoxiden, Alkoholen, Maleimiden, Vinylsulfonen, Hydraziden, Dithiopyidinen und Iodacetamiden stehenden Gruppe ausgewählt sind.
Polymer nach Anspruch 1, wobei Z und Z' jeweils unabhängig voneinander für eine reaktive Gruppe stehen, die dazu in der Lage ist, mit einer reaktiven Gruppe an einem Protein zu reagieren.
Polymer nach Anspruch 9, wobei Z und Z' jeweils unabhängig voneinander für eine reaktive Gruppe stehen, die dazu in der Lage ist, mit einer Aminogruppe oder einer Thiolgruppe an einem Protein zu reagieren.
Polymer nach Anspruch 1, wobei Y aus der aus -O-, -S- und -CO-NH- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei POLY für Methoxy-PEG steht.
Polymer nach Anspruch 1, wobei POLY für ein geradkettiges Polymerskelett mit einer aus der aus -OH, Alkyl, Methoxy und -Y- CH(W-Z)(W'-Z') bestehenden Gruppe ausgewählten Endgruppe steht.
Polymer nach Anspruch 1 mit einer aus der aus den folgenden Elementen bestehenden Gruppe ausgewählten Struktur: CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-OCO₂-NS)₂, CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS)₂, CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CH₂-CO₂-NS)₂, CH₃O-PEG-CO-CH(CH₂-OCO₂-NS)₂, CH₃O-PEG-CO-CH(CH₂O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS)₂, (OHC-CH₂CH₂-O-CH₂)₂-CH-NHCO-PEG-CONH-CH(OCH₂CH₂-CHO)₂, PEG-[CONH-CH(OCH₂CH₂-CHO)₂]₄, CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CO₂-NS)[CH₂CH₂CO₂-NS], CH₃O-PEG-O-CH₂CH₂, CH(CO₂H)₂, CH₃O-PEG-O-CH₂CH₂, CH(CH₂OH)₂ und CH₃O-PEG-O₂CNHC H(CH₂CO₂H)₂, wobei NS für N-Succinimidyl steht, PEG für CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂ und n für eine Zahl von etwa 8 bis etwa 4000.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃-PEG-CO-NH-CH[(CH₂)_m-OCO₂Q]₂ wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃O-PEG-CO-NH-CH[(CH₂)_m-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-Q]₂ wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃O-PEG-CO-NH-CH[(CH₂)_m-CO₂Q]₂ wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃O-PEG-O-CH[(CH₂)_m-O-CO₂-Q]₂ wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃O-PEG-O-CH[(CH₂)_m-O₂-CH₂CH₂-CO₂Q]₂ wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur CH₃O-PEG-CO-NH-CH(CO₂-Q)[(CH₂)_mCO₂Q] wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur: CH₃O-PEG-O-CH[(CH₂)_m-SO₂-CH-CH₂]₂ wobei m für 1–10 steht.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur: [OHC-(CH₂)_r-O-(CH₂)_m]₂-CH-NHCO-PEG-CONH-CH[(CH₂)_m-O-(CH₂)_r-CHO]₂ wobei r und m für 1–10 stehen.
Polymer nach Anspruch 1 mit der Struktur: R-[POLY-Y-CH(W-Z)(W'-Z')]_n wobei R für eine von einem Polyol oder einer Aminosäure abgeleitete Kerneinheit steht, POLY für ein wasserlösliches Polymerskelett und n für eine Zahl von 2 bis 200.
Polymer nach Anspruch 23, wobei POLY für Poly(ethylenglykol) steht.
Polymer nach Anspruch 23, wobei R für eine von einer Einheit ausgewählt aus der aus Lysin, Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit bestehenden Gruppe abgeleitete Kerneinheit steht.
Polymer nach Anspruch 23, wobei Y aus der aus -O-, -S- und -CO-NH- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 23 mit der Struktur: R-{PEG-CONH-CH[(CH₂)_m-O-(CH₂)_r-CHO]₂}₄ wobei r und m für 1–10 stehen.
Polymer nach Anspruch 23 mit der Struktur: R-{PEG-CO-N-CH(CO₂-Q)[(CH₂)_mCO₂-Q']}_n wobei m für 1–10 steht und Q aus der aus N-Succinimidyl, Sulfo-N-succinimidyl und 1-Benzotriazolyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei POLY einen verzweigten Poly(ethylenglykol) mit einer von einer Aminosäure abgeleiteten zentralen verzweigten Einheit umfaßt.
Polymer nach Anspruch 29, wobei es sich bei der Aminosäure um Lysin handelt.
Polymer nach Anspruch 29, wobei Z und Z' für Maleimid stehen.
Polymer nach Anspruch 1, wobei POLY einen verzweigten Poly(ethylenglykol) mit einer von Lysin abgeleiteten zentralen verzweigten Einheit und damit verbundene geradkettige Poly(ethylenglykol)ketten umfaßt.
Polymer nach Anspruch 32, wobei Z und Z' für Maleimid stehen.
Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polymers mit der Struktur
wobei POLY für ein geradkettiges oder verzweigtes, wasserlösliches Polymerskelett steht, Y für eine hydrolytisch stabile Bindung, W und W' für gegebenenfalls anbindende Gruppen, unabhängig voneinander ausgewählt aus der aus Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon bestehenden Gruppe sowie Z und Z' für reaktive Gruppen stehen, bei dem man: – ein erstes Polymerzwischenprodukt mit der Struktur POLY-A bereitstellt, wobei POLY für ein lineares oder verzweigtes, wasserlösliches Polymerskelett und A für eine reaktive Gruppe steht; – eine Verbindung mit drei unabhängig voneinander ausgewählten reaktiven Gruppen -B, -W-Z und -W'-Z' bereitstellt, die mit einer zentralen, auf -CH-basierenden verzweigten Einheit verbunden ist und die Struktur B-CH(W-Z)(W'-Z') aufweist, wobei B dazu in der Lage ist, mit A zu reagieren und – B von B-CH(W-Z)(W'-Z') mit A von POLY-A unter Bildung einer hydrolytisch stabilen Bindung Y umsetzt und so ein Produkt bildet mit der Struktur
Verfahren nach Anspruch 34, wobei POLY für Poly(ethylenglykol) steht.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Verbindung mit der Struktur B-CH(W-Z)(W'-Z') aus der aus H₂NCH(CH₂-OH)₂, NaO-CH(CH₂-O-Bz)₂ und H₂N-CH(CH₂CO₂H)₂ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei POLY-A aus der aus mPEG-OCH₂CH₂CO₂NS, mPEG-O-Ms und mPEG-BTC bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei mPEG für Methoxypoly(ethylenglykol) steht, NS für N-Succinimidyl, Ms für Mesylat und BTC für 1-Benzotriazolylcarbonat.
Verfahren zur Herstellung eines aktivierten wasserlöslichen Polymers der Formel mPEGO-CH(CH₂SO₂CH=CH₂)₂, wobei mPEG für Methylpoly(ethylenglykol) steht, bei dem man: mPEG-O-Ms bereitstellt, wobei Ms für Mesylat steht; NaO-CH(CH₂-O-Bz)₂ bereitstellt, wobei Bz für eine Benzyleinheit steht; mit mPEG-O-Ms mit NaO-CH(CH₂-O-Bz)₂ zu mPEGO-CH(CH₂OBz)₂ umsetzt; mPEGO-CH(CH₂OBz)₂ in mPEGO-CH(CH₂OH)₂ umwandelt; die beiden Hydroxylgruppen in mPEGO-CH(CH₂OH)₂ jeweils gegen eine Mesylatgruppe austauscht und so mPEGO-CH(CH₂OMs)₂ bildet; mPEGO-CH(CH₂OMs)₂ in mPEGO-CH(CH₂SCH₂CH₂OH)₂ umwandelt; das Schwefelatom zu einer Sulfongruppe oxidiert und die Sulfonalkoholgruppe in eine Vinylsulfongruppe umwandelt und so mPEGO-CH(CH₂SO₂CH=CH₂)₂ bildet.
Konjugat, enthaltend ein oder mehrere biologisch wirksame Mittel, die kovalent an ein wasserlösliches Polymer nach einem der Ansprüche 1–33 gebunden sind.
Konjugat, enthaltend ein wasserlösliches Polymer der Struktur:
wobei POLY für ein geradkettiges oder verzweigtes, wasserlösliches Polymerskelett steht, Y für eine hydrolytisch stabile Bindung, W und W' für gegebenenfalls anbindende Gruppen, unabhängig voneinander ausgewählt aus der aus Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon bestehenden Gruppe sowie Z und Z' für reaktive Gruppen stehen, und ein biologisch wirksames Mittel, das kovalent an wenigstens eine der reaktiven Gruppen gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 40, wobei das biologisch wirksame Mittel aus der aus Mikroorganismen, Proteinen, Peptiden, Lipiden, Polysacchariden, Nukleotiden, Oligonukleotiden, organischen und anorganischen Verbindungen und Pharmazeutika bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 40, wobei POLY aus der aus Poly(alkylenoxid), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Polyoxazolin und Poly(acryloylmorpholin) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 40, wobei es sich bei POLY Poly(ethylenglykol) handelt.
Konjugat nach Anspruch 40, wobei das Konjugat zwei getrennte biologisch aktive Mittel umfaßt, die gleich oder verschieden sein können und jeweils an einen der Reste Z und Z' gebunden sind.
Konjugat nach Anspruch 40, wobei Y aus der aus -O-, -S- und -CO-NH- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.