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CN119242071A - 含侧基发色团的水溶性聚合染料 - Google Patents

含侧基发色团的水溶性聚合染料 Download PDF

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CN119242071A
CN119242071A CN202411308075.6A CN202411308075A CN119242071A CN 119242071 A CN119242071 A CN 119242071A CN 202411308075 A CN202411308075 A CN 202411308075A CN 119242071 A CN119242071 A CN 119242071A
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Application number
CN202411308075.6A
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格伦·P·巴塞洛缪
梁永超
布莱恩·沃尔
大卫·穆罗
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Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
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Abstract

本发明提供含侧基供体荧光团的水溶性聚合物串联染料。所述水溶性聚合物串联染料具有多肽骨架、多个与聚合物骨架的氨基酸残基各自独立连接的侧基供体荧光团以及与多肽骨架的氨基酸残基连接的受体荧光团。侧基供体荧光团可以是被一个或多个水溶性基团取代的BODIPY基团。本发明也提供基于水溶性聚合物串联染料的已标记的特异性结合成员，其还包括与聚合物串联染料连接的特异性结合成员，所述特异性结合成员是抗体或其结合片段。此外，本发明也提供评估样品中靶标分析物的方法以及标记靶分子的方法，其中可在所述靶分子中使用聚合物串联染料。本发明还提供用于实施所述方法的体系和试剂盒。

Description

含侧基发色团的水溶性聚合染料
本申请是申请日为2019年3月28日，申请号为201980024229.X，发明名称为“含侧基发色团的水溶性聚合染料”的发明专利申请的分案申请。
本专利申请案主张于2018年3月30日提交的编号为62/650,935的美国临时专利申请案以及于2018年8月7日提交的编号为62/715,722的美国临时专利申请案提交日期的优先权；这些专利中的内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及含侧基供体荧光团的水溶性聚合物串联染料与基于水溶性聚合物串联染料的已标记的特异性结合成员。本发明提供了评估样品中靶标分析物的方法、标记靶分子的方法以及用于实施标的方法的体系和试剂盒。
背景技术
荧光染料是用其所吸收的波长的光辐照时会发射出(通常)不同波长的光的化合物。荧光染料可用于各种生物化学、生物学和医学应用中，例如，用于诊断试剂盒、显微镜检查或药物筛选中。荧光染料的特征在于有许多参数，以便用户根据预期用途来选择合适的染料。目的参数包括最大激发波长、最大发射波长、斯托克斯位移、消光系数、荧光量子产率和荧光寿命。例如，为了使激发辐射穿透生物样品、最大限度地减少背景荧光和/或获得高信噪比，可以根据目的应用来选择染料。
分子识别涉及两个分子的特异性结合。对靶标生物分子具有结合特异性的分子可用于各种研究和诊断应用中，例如，分析物标记和分离、流式细胞术、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选和色谱分析。靶标生物分子可以通过用荧光染料标记来加以检测。
发明内容
本发明提供含多个侧基发色基团的水溶性捕光多发色团。所述捕光多发色团具有包括非共轭重复单元的聚合物骨架以及多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团。侧基发色基团可以是被一个或多个水溶性基团取代的BODIPY基团。本发明也提供基于标的多发色团的聚合物串联染料，其进一步包括与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的受体荧光团，所述受体荧光团被配置成在能量接收时接近所述捕光多发色团的至少一个侧基供体发色基团。本发明还提供包括标的聚合物串联染料的已标记的特异性结合成员。此外，本发明也提供评估样品中靶标分析物存在情况的方法以及标记靶分子的方法，其中可在所述靶分子中使用标的聚合物串联染料。本发明还提供用于实施标的方法的体系和试剂盒。
附图说明
应当理解，下述附图仅用于说明之目的，无意以任何方式限制本发明传授内容的范围。
图1描述了示例性聚合物串联染料的通用结构，其中“染料”是受体荧光团。
图2显示了示例性多发色团的标准化吸收光谱以及包括所述多发色团在内的一系列聚合物串联染料的发射光谱。
图3显示了示例性多发色团以及包括所述多发色团在内的一系列聚合物串联染料的发射光谱，所有均在0.04OD(吸收)下得出。
图4描述了具有肽骨架的示例性聚合物串联染料的结构。D是BODIPY供体侧基，A是受体染料，而生物连接子是包括化学选择性官能团的连接子，用于使所述串联染料附着在生物分子上。
图5A显示了用于制备图4所示的多发色团的BODIPY供体侧基的吸收和发射光谱。图5B显示了用于制备图4所示的多发色团的受体染料的吸收和发射光谱。图5C显示了图4所示的示例性聚合物串联染料的吸收和发射光谱。
图6A阐明了侧基供体发色团之间的同质能量转移过程，这倾向于使相同发色团之间出现连续可逆能量转移，而非使单个发色团发射。所述能量转移过程可能导致自猝灭，而且可能导致量子产率显著低于在单个分离发色团中所观察到的量子产率。图6B阐明了异质能量转移，这主要使不同发色团之间出现一种能量转移方式。能量转移至次要发色团倾向于引起发射，这受受体和单个供体发色团的量子产率限制。
图7A-7B阐明了采用点击聚合法制备含已连接的BODIPY染料(“染料”)(图7A)和聚合物串联染料(图7B)的示例性多发色团的合成示意图。“染料”和“供体”可以指供体染料，例如BODIPY，而“受体”是指受体荧光团。
图8显示了图7所示的示例性多发色团的吸收和发射光谱，其中所述示例性多发色团包括已连接的侧基BODIPY染料。
图9A-9B显示了一系列示例性聚合物串联染料的吸收(图9A)和发射光谱(图9B)，其中所述示例性聚合物串联染料包括已连接的侧基BODIPY供体染料以及具有不同最大发射波长的各种受体染料。
定义
在更详细地描述示例性实施例之前，阐述了以下定义，以便说明及定义本说明书中所使用的术语的含义和范围。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管如此，为清楚起见，也为了便于参考，某些术语的定义如下。
必须注意的是，如本专利和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。例如，术语“染料”是指一种或多种染料，即，单种染料和多种染料。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。
本文中使用的术语“化学选择性官能团”和“化学选择性标签”可互换使用，是指在一些情况下，在任选地活化其中一个官能团后，可选择性地与另一个相容官能团反应以形成共价键的官能团。目的化学选择性官能团包括但不限于：硫醇和马来酰亚胺或碘乙酰胺；胺和羧酸或其活化酯；可以通过点击化学法相互反应的基团，例如，叠氮基和炔基基团(例如，环辛炔基)；四嗪、反式环辛烯、二烯烃、亲二烯体、叠氮化物、六价硫氟交换化学(SuFEX)、氟化磺酰；以及羟基、酰肼基、肼基、醛类、酮类、叠氮基、炔烃、磷化氢、环氧化物等。
本文中使用的术语“样品”涉及含有一种或多种目的分析物的材料或材料混合物，所述材料在一些情况下为液态。在一些实施例中，在广义上，“样品”是指含有细胞或产生细胞代谢物的任何植物、动物或细菌，例如，从个体(包括但不限于血浆、血清、脑脊液、淋巴、泪液、唾液和组织切片)或体外细胞培养成分以及来自环境的样品中分离出来的组织或液体。术语“样品”也可以指“生物样品”。本文中使用的术语“生物样品”是指整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。“生物样品”也可以指用整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其碎片或部分(包括但不限于血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外层切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤和器官)制备的匀浆、裂解物或提取物。在某些实施例中，样品已从动物或植物中取出。生物样品可以包括细胞。依照常规含义，术语“细胞”是指至少具有细胞核和细胞膜的真核生物和原核生物的基本结构单位。在某些实施例中，细胞包括原核细胞，例如，来自细菌的原核细胞。在其他实施例中，细胞包括真核细胞，例如，获取自动物、植物或真菌的生物样品的细胞。
术语“支持物结合”和“与支持物连接”可互换使用，是指与目的支持物共价或非共价连接的部分(例如，特异性结合成员)。共价连接可能涉及两个相容官能团(例如，两个化学选择性官能团、一个亲电体和一个亲核体等)的化学反应，以在两个目的部分(例如，支持物和特异性结合成员)之间形成共价键。在一些情况下，非共价连接可能涉及两个目的部分(例如，两个亲和部分，例如半抗原和抗体或生物素部分和链霉亲和素等)之间的特异性结合。在某些情况下，非共价连接可能涉及对底物的吸收。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，包括长度为2-50个氨基酸的肽和长度大于50个氨基酸的多肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“多肽”包括编码和非编码氨基酸的聚合物、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽，其中常规骨架已被非天然存在或合成的骨架替代。多肽可以具有任何合适的长度，例如，2个或以上的氨基酸，例如4个或以上的氨基酸、10个或以上的氨基酸、20个或以上的氨基酸、50个或以上的氨基酸、100个或以上的氨基酸、300个或以上的氨基酸，例如至多500个或1000个或以上的氨基酸。“肽”可以是2个或以上的氨基酸，例如4个或以上的氨基酸、10个或以上的氨基酸、20个或以上的氨基酸，例如至多50个氨基酸。在一些实施例中，肽的长度介于5至30个氨基酸之间。
本文中使用的术语“分离的”是指与其他组分(即，纯化前与目的部分相关联的组分)至少60％分离、至少75％分离、至少90％分离、至少95％分离、至少98％分离甚至99％分离的目的部分。
“多个”至少含有2个成员。在某些情况下，多个可以具有5个或以上的成员，例如6个或以上、7个或以上、8个或以上、9个或以上、10个或以上、20个或以上、30个或以上、40个或以上、50个或以上、60个或以上、70个或以上、80个或以上、90个或以上、100个或以上、300个或以上、1000个或以上、3000个或以上、10,000个或以上、100,000个或以上的成员。
数值范围包括定义所述范围的数字。
术语“特异性结合”是指捕获剂(或特异性结合对的第一成员)优先结合存在于，例如，不同分析物的均匀混合物中的特定分析物(或特异性结合对的第二成员)的能力。在一些情况下，特异性结合相互作用将区分样品中合乎需求的与不合需求的分析物，其中与不合需求的分析物相比，合乎需求的分析物的特异性高出10倍或以上，例如100倍或以上，或1000倍或以上。在一些情况下，当捕获剂与分析物以捕获剂/分析物复合物的形式特异性结合时，它们之间的亲和力为至少10-8M、至少10-9M，例如至多10-10M。
“亲和力”是指结合强度，结合亲和力增加与Kd降低有关。
本文所述的方法包括多个步骤。根据需要，可以在步骤之间经过预定量的时间之后执行每个步骤。因此，执行每个步骤之间的时间可以是1秒或以上、10秒或以上、30秒或以上、60秒或以上、5分钟或以上、10分钟或以上、60分钟或以上，包括5小时或以上。在某些实施例中，每个后续步骤均在前一步骤完成之后立即执行。在其他实施例中，一个步骤可以在前一步骤完成后的孵育或等待时间过后执行，例如，在几分钟至过夜等待时间之后执行。
本文中使用的术语“评价”、“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，且包括定量和定性测定。
本文中使用的术语“分离”是指两种元素的物理分离(例如，按照尺寸或亲和力等分离)以及一种元素降解而另一种元素保持完整。
术语“连接子”或“键”是指连接两个基团且具有长度为100或以下个原子的骨架的连接部分。连接子或键可以是连接两个基团的共价键或长度为1至100个原子的链，例如，长度为1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20或以上个碳原子的链，其中连接子可以是直链状、分支状、环状或单个原子。在一些情况下，连接子是分支型连接子，即指连接三个或以上个基团的连接部分。在某些情况下，连接子骨架的一个、两个、三个、四个或五个或以上个碳原子可以任选地被硫、氮或氧杂原子取代。在一些情况下，连接子骨架包括连接官能团，例如，乙醚、硫醚、氨基、酰胺、磺酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、酯、硫酯或亚胺。骨架原子之间的键可以是饱和键，也可以是不饱和键；在一些情况下，连接子骨架中的不饱和键数量不超过一个、两个或三个。连接子可以包括一个或多个取代基，例如，被烷基、芳基或烯基基团取代。连接子可以包括但不限于聚乙二醇；乙醚；硫醚；叔胺；烷基，其可以是直链状或分支状，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。连接子骨架可以包括环状基团，例如，芳基、杂环或环烷基基团，其中骨架包括环状基团的2个或以上的原子，例如，2个、3个或4个原子。连接子可以是可裂解的，也可以是不可裂解的。
术语“聚环氧乙烷”、“PEO”、“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用，是指包括如化学式--(CH2--CH2--O--)n-所示的链的聚合物基团或其衍生物。在一些实施例中，“n”是5000或以下，例如，1000或以下、500或以下、200或以下、100或以下、50或以下、40或以下、30或以下、20或以下、15或以下，例如3至15或10至15。应当理解，PEG聚合物基团可以具有任何合适的长度，而且可以包括各种端基和/或其他取代基，包括但不限于烷基、芳基、羟基、氨基、酰基、酰氧基和胺基端基和/或取代基。适用于标的多发色团的PEG基团包括以下出版物中所述的PEG：S.Zalipsky，用于制备生物相关共轭物的官能化聚(乙二醇)，生物共轭化学，1995年，6(2)，第150-165页；以及Zhu等人，用于成像、诊断和治疗的水溶性共轭聚合物，化学评论，2012年，112(8)，第4687–4735页。
术语“烷基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除母体烷烃中单个碳原子的一个氢原子后衍生得到的饱和分支状或直链状单价烃基。目的烷基基团包括但不限于甲基；乙基、丙基，例如，丙-1-基或丙-2-基；以及丁基，例如，丁-1-基、丁-2-基、2-甲基丙-1-基或2-甲基丙-2-基。在一些实施例中，烷基基团包括1至20个碳原子。在一些实施例中，烷基基团包括1至10个碳原子。在某些实施例中，低级烷基基团包括1至6个碳原子，例如，1至4个碳原子。举例来说，所述术语包括直链状和分支状烃基基团，例如，甲基(CH3)、乙基(CH3CH2)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2)、异丁基((CH3)2CHCH2)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“被取代的烷基”是指本文所定义的烷基基团，其中烷基链中的一个或多个碳原子已任选地被杂原子(例如，O-、N-、S-、-S(O)n-(其中n介于0至2之间)、-NR-(其中R是氢或烷基))取代，且具有1至5个选自所述基团的取代基，其中所述基团由以下各项组成：烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和-NRaRb，其中R’和R”可以是相同的，也可以是不同的，其选自氢、任选被取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环。
“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。举例来说，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。术语“烷氧基”也指基团烯基-O-、环烷基-O-、环烯基-O-和炔基-O-，其中烯基、环烷基、环烯基和炔基如本文所定义。
术语“被取代的烷氧基”是指基团被取代的烷基-O-、被取代的烯基-O-、被取代的环烷基-O-、被取代的环烯基-O-和被取代的炔基-O-，其中被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的环烷基、被取代的环烯基和被取代的炔基如本文所定义。
“炔基”是指具有2至6个碳原子(优选地具有2至3个碳原子)且具有至少1个(优选地具有1至2个)三键不饱和位点的直链状或分支状单价烃基基团。所述炔基基团的示例包括乙炔基(C≡CH)和炔丙基(CH2C≡CH)。
术语“被取代的炔基”是指本文所定义的炔基基团，其具有选自以下各项的1至5个取代基或1至3个取代基：烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、被取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“氨基”是指基团–NH2。术语“被取代的氨基”是指基团-NRR，其中每个R独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、烯基、被取代的烯基、环烯基、被取代的环烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、杂芳基和杂环基，前提是至少有一个R不是氢。
“芳基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除芳环体系中单个碳原子的一个氢原子后衍生得到的单价芳烃基。目的芳基基团包括但不限于衍生自以下各项的基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、苣、蔻、荧蒽、芴、并六苯、己芬、己搭烯、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、戊搭烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽、玉红省、三亚苯、三萘等。在某些实施例中，芳基基团包括6至20个碳原子。在某些实施例中，芳基基团包括6至12个碳原子。芳基基团的示例是苯基和萘基。
除非另外受芳基取代基定义的限制，否则“被取代的芳基”是指被选自以下各项的1至5个取代基或1至3个取代基取代的芳基基团：酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、被取代的烷基、被取代的烷氧基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、氨基、被取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤甲基。
“杂芳基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除杂芳环体系中单个原子的一个氢原子后衍生得到的单价杂芳基。目的杂芳基基团包括但不限于衍生自以下各项的基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异恶唑、萘啶、恶二唑、恶唑、啶、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯里嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻二唑、噻唑、三唑、苯并三唑、噻吩、三唑、氧杂蒽、苯并二恶茂等。在某些实施例中，杂芳基基团是5-20元杂芳基。在某些实施例中，杂芳基基团是5-10元杂芳基。在某些实施例中，杂芳基基团是衍生自噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、吡啶、喹啉、咪唑、恶唑和吡嗪的基团。
“杂环”、“杂环的”、“杂环烷基”和“杂环基”是指具有单环或多个稠环(包括稠合桥环和螺环体系)且具有3至20个环原子(包括1至10个杂原子)的饱和或不饱和基团。所述环原子选自由氮、硫或氧组成的组，其中，在稠合环体系中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，前提是附着点通过非芳香环。在某些实施例中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化，以提供氮氧化物、-S(O)-或-SO2-部分。
杂环和杂芳基的示例包括但不限于吖丁啶、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异恶唑、吩恶嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为噻吗啉基)、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
除非另外取代基定义的限制，否则“被取代的杂芳基”是指被选自以下各项的1至5个取代基或1至3个取代基取代的杂芳基基团：酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、被取代的烷基、被取代的烷氧基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、氨基、被取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤甲基。
术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团-亚烷基-芳基和被取代的亚烷基-芳基，其中亚烷基、被取代的亚烷基和芳基如本文所定义。
“亚烷基”是指优选地具有1至6个(更优选地具有1至3个)直链状或分支状碳原子的二价脂肪族烃基基团，其任选地被一个或多个选自-O-、-NR10-、NR10C(O)-、-C(O)NR10-等的基团所中断。举例来说，所述术语包括亚甲基(CH2)、亚乙基(CH2CH2)、正亚丙基(CH2CH2CH2)、异亚丙基(CH2CH(CH3))、(C(CH3)2CH2CH2)、(C(CH3)2CH2C(O))、(C(CH3)2CH2C(O)NH)、(CH(CH3)CH2-)等。“被取代的亚烷基”是指如下文“被取代的”定义中有关碳的描述所示，有1至3个氢被取代基取代的亚烷基基团。
“被取代的”是指其中一个或多个氢原子独立地被相同或不同的取代基取代的基团。目的取代基包括但不限于亚烷二氧基(例如，亚甲二氧基)、M、R60、O、＝O、OR60、SR60、S、＝S、NR60R61、＝NR60、CF3、CN、OCN、SCN、NO、NO2、＝N2、N3、S(O)2O、S(O)2OH、S(O)2R60、OS(O)2O、OS(O)2R60、P(O)(O)2、P(O)(OR60)(O)、OP(O)(OR60)(OR61)、C(O)R60、C(S)R60、C(O)OR60、C(O)NR60R61、C(O)O、C(S)OR60、NR62C(O)NR60R61、NR62C(S)NR60R61、NR62C(NR63)NR60R61和C(NR62)NR60R61，其中M是卤素；R60、R61、R62和R63独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环杂烷基、被取代的环杂烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，或者任选地，R60和R61与其所结合的氮原子共同形成环杂烷基或被取代的环杂烷基环；且R64和R65独立地为氢、烷基、被取代的烷基、芳基、环烷基、被取代的环烷基、环杂烷基、被取代的环杂烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，或者任选地，R64和R65与其所结合的氮原子共同形成环杂烷基或被取代的环杂烷基环。在某些实施例中，取代基包括M、R60、＝O、OR60、SR60、S、＝S、NR60R61、＝NR60、CF3、CN、OCN、SCN、NO、NO2、＝N2、N3、S(O)2R60、OS(O)2O、OS(O)2R60、P(O)(O)2、P(O)(OR60)(O)、OP(O)(OR60)(OR61)、C(O)R60、C(S)R60、C(O)OR60、C(O)NR60R61、C(O)O和NR62C(O)NR60R61。在某些实施例中，取代基包括M、R60、＝O、OR60、SR60、NR60R61、CF3、CN、NO2、S(O)2R60、P(O)(OR60)(O)、OP(O)(OR60)(OR61)、C(O)R60、C(O)OR60、C(O)NR60R61和C(O)O。在某些实施例中，取代基包括M、R60、＝O、OR60、SR60、NR60R61、CF3、CN、NO2、S(O)2R60、OP(O)(OR60)(OR61)、C(O)R60、C(O)OR60和C(O)O，其中R60、R61和R62如上文所定义。例如，被取代的基团可以具有亚甲二氧基取代基或选自卤素原子、(1-4C)烷基基团和(1-4C)烷氧基基团的一个、两个或三个取代基。当被取代的基团是芳基或杂芳基基团时，所述取代基(例如，如本文所述)可以称之为“芳基取代基”。
“磺酰氨基”是指基团–NR21SO2R22，其中R21和R22独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环，其中R21和R22任选地与其所结合的原子连接，共同形成杂环或被取代的杂环基团，而且其中烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环和被取代的杂环如本文所定义。
应当理解，在上文所定义的所有被取代的基团中，通过本身具有进一步取代基的取代基(例如，具有一个被取代的芳基基团作为取代基的被取代的芳基，其本身已被一个被取代的芳基基团所取代，所述被取代的芳基基团进一步被一个被取代的芳基基团所取代等)得到的聚合物不适于纳入本文中。在这种情况下，所述取代的最大数值为三。例如，本文具体考虑的被取代的芳基基团的连续取代结果仅限于被取代的芳基-(被取代的芳基)-被取代的芳基。
除非另有说明，否则本文中未明确定义的取代基按如下方式命名：即官能团末端部分的名称加上朝向附着点的相邻官能团的名称。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
对于本发明所揭示的含有一个或多个取代基的任何基团，当然，应当理解，所述基团不含有在空间上不切实际和/或在合成上不可行的任何取代或取代模式。此外，标的化合物包括由所述化合物的取代产生的所有立体化学异构体。
其他术语定义可能在说明书其他地方出现。
具体实施方式
如上所述，本发明提供含多个侧基发色基团的水溶性捕光多发色团。所述捕光多发色团具有包括非共轭重复单元的聚合物骨架以及多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团。侧基发色基团可以是被一个或多个水溶性基团取代的BODIPY基团。本发明也提供基于标的多发色团的聚合物串联染料，其进一步包括与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的受体荧光团，所述受体荧光团被配置成在能量接收时接近所述捕光多发色团的至少一个侧基供体发色基团。本发明还提供包括标的聚合物串联染料的已标记的特异性结合成员。此外，本发明也提供评估样品中靶标分析物存在情况的方法以及标记靶分子的方法，其中可在所述靶分子中使用标的聚合物串联染料。本发明还提供用于实施标的方法的体系和试剂盒。
在更加详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
本文中提出的某些范围在数值前带有术语“大约”。本文中使用术语“大约”的目的是为其后的精确数字以及与该术语之后数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定某一数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字在其出现的上下文中可以是基本上等同于所具体列举数字的数字。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了具有代表性的示例性方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用方式并入本文中，犹如每一单独出版物或专利被具体地和单独地表明通过引用方式并入，且通过引用并入本文的目的是公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
需要注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。
在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本专利所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何陈述的方法。
尽管为了语法的流畅性已经或将要描述该设备和方法，并进行功能上的说明，但应明确理解，除非《美国法典》第35章第112节有明确规定，否则任何情况下都不得将权利要求解释为必须受“方式”或“步骤”的限制，而应按照等效物的司法原则与权利要求中所述定义的含义和等效物的完整范围相符，当明确按照《美国法典》第35章第112节的规定编写权利要求时，权利要求应与《美国法典》第35章第112节中的法定等效物完全相符。
在进一步描述本发明时，首先更加详细地描述捕光多发色团和包括受体荧光团的相关聚合物串联染料。接下来描述包括标的聚合物串联染料的已标记特异性结合成员。然后，综述了在其中使用标的聚合物串联染料的目的方法。此外，还描述了可用于实施本发明所述的方法的体系和试剂盒。
捕光多发色团
如上所述，本发明包括具有模块化支架(其上附着有侧基吸光发色基团)的捕光多发色团。术语“侧基”是指与模块化支架的骨架连接但不属于骨架任一部分的侧链基团。与共轭聚合物染料的吸光共聚单体相反，标的多发色团的侧基吸光发色基团不会彼此发生π共轭，也不会形成离域π电子体系。标的多发色团的模块化支架更多地是在足以实现发色团(请参见，例如，图6A)之间以及发色团与受体荧光团(如有，请参见，例如，图6B)之间的有效能量转移的紧凑区域内提供具有多个吸光发色基团的构型。侧基吸光发色基团的这种构型一同形成了具有吸收波长(例如，如本文所述)的捕光多发色团，在所述波长处，光学活性发色基团吸收光以变为激发态。因此，吸光发色基团被配置成在能量接收时彼此接近，且在存在受体荧光团时，能够将能量提供给受体荧光团。
术语“捕光多发色团”和“聚合染料”可互换使用，是指本发明所述的聚合物，其具有多个侧基发色基团，所述侧基发色基团能够捕获具有特定最大吸收波长的光并将其转换为具有更长的最大发射波长的发射光。所述聚合物可以具有饱和或部分不饱和的骨架。
此外，还可以使侧基(例如，受体荧光团、次要供体发色团、能够实现生物分子结合的连接子和化学选择性标签)和水增溶性基团附着在模块化支架上。在某些情况下，受体荧光团可与两种供体发色团(主要和次要供体发色团)一同置入，以提供来自受体荧光团的所需荧光发射。可以针对侧基供体发色团的所述构型控制受体荧光团的数目和位置。
侧基的特定构型可以通过排列侧基所附着的基础模块化支架的重复单元来加以确定和控制。标的多发色团可以包括在任何合适的位置附着在支架和/或侧基上的多个水增溶性基团，以提供水溶性捕光多发色团。模块化支架可由重复单元组成，所述重复单元形成具有侧链基团的聚合物骨架，其中侧基可附着在所述聚合物骨架上。重复单元可以按照各种构型排列，以提供具有所需光谱性质的水溶性捕光多发色团。可以控制侧基供体发色团和受体荧光团(如有)的共价连接位点之间的距离和排列，以完成所需的能量转移过程。这可以实现合乎需求的高捕光并获得信号放大特性。
如图6A所示，所述构型的侧基供体发色基团在入射光的激发下，相对于未猝灭的分离供体发色基团可能表现出荧光自猝灭现象。自猝灭是指相对于未猝灭的分离供体发色基团，10％或以上的荧光淬灭，例如，20％或以上、25％或以上、30％或以上、40％或以上或50％或以上的荧光淬灭。
模块化支架可由含非共轭重复单元的聚合物骨架组成，所述重复单元具有任何合适的构型，例如，直链状、分枝状或树枝状构型。聚合物骨架可以是直链状聚合物。聚合物骨架可以呈分支状。在一些情况下，捕光多发色团包括多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团。所述构型的侧基可以在聚合物骨架合成期间或之后置入。依据所采用的特定合成方法，侧基可以无规构型、嵌段构型的形式或在逐步合成过程中按照特定序列引入。
术语“单元”是指聚合物的结构亚单元。术语“单元”旨在包括单体、共聚单体、共嵌段、重复单元等。“重复单元”是指聚合物的亚单元，其由被视为是单体的单元所需的最小数量的不同结构特征所定义，因此当所述单元重复n次时，由此得到的结构描述所述聚合物或其嵌段。在一些情况下，所述聚合物可以包括两个或以上的不同重复单元，例如，当所述聚合物为多嵌段聚合物、无规则排列单元或限定序列单元时，每个嵌段均可定义不同的重复单元。应当理解，重复单元或嵌段可能出现各种各样的排列形式，而且在本文所述的标的多发色团的所示式中，各种长度的任何合适的线性排列都可以包括在整个聚合物的结构中。应当理解，就每个单元的mol％值而言，所述聚合物也可以用式表示，而且所述式可以表示重复单元的各种排列形式，例如，无规或多嵌段聚合物或限定序列的残基。在一些情况下，所述聚合物的重复单元包括单个单体基团。在某些情况下，所述聚合物的重复单元包括两个或以上的单体基团，即共聚单体基团，例如，两个、三个、四个或以上的共聚单体基团。术语“共聚单体”或“共聚单体基团”是指聚合物的结构单元，其本身可以是聚合物重复单元的一部分。
捕光多发色团包括具有含非共轭重复单元的直链状聚合物骨架的模块化支架。模块化支架可以具有包括无规构型的非共轭重复单元的聚合物骨架。模块化支架可以具有包括嵌段或共嵌段构型的非共轭重复单元的聚合物骨架。此外，模块化支架可以具有包括特定限定序列的非共轭重复单元(例如，多肽序列的氨基酸残基)的聚合物骨架。这些构型的特征在于重复单元的聚合物链段(例如，如本文所述)，其中所述链段本身可以在整个模块化支架中重复。
“非共轭的”是指重复单元中至少有一部分包括饱和的骨架基团(例如，具有两个或以上的连续单个共价键的基团)，其防止了沿聚合物骨架分布、从一个重复单元到下一个重复单元之间出现的π共轭结构或扩展的离域电子结构。应当理解，即使一个重复单元可能未与相邻重复单元共轭，所述重复单元也可以包括一个或多个分离不饱和基团，所述分离不饱和基团包括一个不饱和键(例如，亚烯基基团或亚炔基基团)和/或芳基或杂芳基基团，所述基团可以是骨架的一部分。在一些情况下，聚合物骨架的每个重复单元包括一个侧链，所述侧链包括已连接的侧基或用于与侧基连接的化学选择性标签。在一些情况下，所述多发色团包括如式(I)所示的链段：
其中：
每个M1和M2均独立地为不饱和共聚单体；
每个S1和S2均独立地为非共轭间隔基单元；
每个D1均独立地为与M1连接的侧基吸光发色团(例如，如本文所述)；
每个Z1均独立地为与M2连接的化学选择性标签；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下，其中*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。
在式(I)的一些情况下，M1和S1形成聚合物骨架的第一重复单元(M1-S1)，而M2和S2则形成聚合物骨架的第二重复单元(M2-S2)。第一和第二重复单元可以按照无规构型或共嵌段构型来排列。在第一重复单元中，D1可通过将第一化学选择性标签共轭至D1前体而与M1连接。在第二重复单元中，Z1基团可进一步通过第二化学选择性标签(Z2)与目的分子共轭，以置入侧基，例如，第二吸光发色团、受体荧光团或已连接的生物分子(例如，如本文所述)。在式(I)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基包括两种或以上(例如，两种或三种)不同类型的侧基捕光发色团，所述侧基捕光发色团共同构成捕光多发色团体系。在式(I)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基全部相同。
在式(I)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(I)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
任何合适的不饱和共聚单体都可以用作标的多发色团(例如，式(I)所示的多发色团)中的M1和M2基团。不饱和共聚单体是指在聚合物骨架中具有至少一个不饱和共价键的共聚单体。目的不饱和共聚单体包括但不限于芳基或杂芳基共聚单体、炔基共聚单体(例如，亚乙炔基)或链段和烯基共聚单体(例如，亚乙烯基)或链段。用于多发色团(例如，式(I)所示的多发色团)中的目的芳基或杂芳基共聚单体包括但不限于苯基共聚单体、联苯共聚单体、苯并恶唑共聚单体、苯并噻唑共聚单体、聚亚苯基共聚单体和稠合三环共聚单体，例如，芴共聚单体、咔唑共聚单体、噻咯共聚单体和桥联联苯共聚单体。芳基或杂芳基共聚单体可以任选地进一步被取代，例如，如本文所述。在式(I)的一些情况下，每个M1和M2独立地包括一个或多个选自芴、咔唑、噻咯、亚联苯基和亚苯基的基团。
式(I)所示的捕光多发色团包括含非共轭重复单元的聚合物骨架，其中每个S1和S2独立地为饱和间隔基单元，其不包括相邻M1和/或M2共聚单体之间的π共轭结构。在一些情况下，S1和S2独立地选自二价聚乙二醇(PEG)和二价修饰的PEG基团。二价是指连接两个相邻共聚单体的PEG或经修饰的PEG连接子。在某些情况下，PEG或经修饰的PEG包括3至100个聚乙二醇单元，例如，6至100个单元(例如，PEG6至PEG100)。
在一些情况下，所述多发色团包括如式(II)所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1、SM2和SM3共聚单体，所述共聚单体各自独立地为非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基吸光发色团；
每个Z1均独立地为与SM2连接的化学选择性标签；
每个Z2均是与SM3连接的任选侧链基团；
x为50mol％或以上；且
y+z为50mol％或以下，其中*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。
Z2可以不存在，也可以是任何合适的侧链基团，例如，吸光发色团、化学选择性标签、连接子、已连接的生物分子、受体荧光团、WSG等。在式(II)的某些情况下，SM3是间隔基共聚单体，其中Z2不存在。在式(II)的某些情况下，SM3是包括Z2基团(即，第二侧基吸光发色团)的共聚单体，其中每个D1和每个Z2共同构成捕光多发色团体系。在一些情况下，SM3是包括第二化学选择性标签(Z2)的共聚单体，例如，受保护的官能团或与Z1正交的标签，其可选择性地置入目的部分。
在式(II)的某些情况下，x为60mol％或以上，例如，65mol％或以上、70mol％或以上、75mol％或以上、80mol％或以上、85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上，甚至更高。在式(II)的某些情况下，y+z为40mol％或以下，例如，30mol％或以下、25mol％或以下、20mol％或以下、15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下，甚至更低。在式(II)的某些情况下，y至少为1mol％且不超过25mol％，例如，20mol％或以下、15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下，甚至更低。在式(II)的某些情况下，z至少为1mol％且不超过10mol％，例如，5mol％或以下，甚至更低。
在式(II)的某些情况下，SM3不存在，即z为0mol％。因此，所述多发色团可以包括如式(III)所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，所述共聚单体各自独立地为非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基吸光发色团；
每个Z1均独立地为与SM2连接的化学选择性标签；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下，其中*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。
在式(III)的某些实施例中，SM1和SM2各自独立地为饱和非共轭共聚单体，例如，仅提供单个共价C-C键的共聚单体。在式(III)的一些实施例中，SM1和SM2各自独立地为部分饱和非共轭共聚单体，例如，在含饱和共价键的骨架中提供分离的双C＝C共价键的共聚单体。式(III)所示的第一和第二重复单元(SM1和SM2)可以按照无规构型、嵌段构型或共嵌段构型来排列，或者按特定序列排列。在第一重复单元中，D1可通过将第一化学选择性标签共轭至D1前体而与SM1连接。在第二重复单元(SM2)中，Z1基团可进一步通过第二化学选择性标签(Z2)与目的分子共轭，以置入侧基，例如，第二捕光发色团、受体荧光团或已连接的生物分子(例如，如本文所述)。在式(III)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基包括两种或以上(例如，两种或三种)不同类型的侧基吸光发色团，所述侧基吸光发色团共同构成捕光多发色团体系。在式(III)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基全部相同。
在式(III)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(III)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
任何合适的共聚单体均可用作式(II)或式(III)所示的多发色团中的聚合物骨架。可用于制备完全饱和或部分饱和的聚合物骨架的目的共聚单体包括但不限于衍生自丙烯酸酯的共聚单体、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、聚苯乙烯、ROMP(开环易位聚合)单体、ADMET(非环二烯易位)单体、环状碳酸酯、衍生自聚乙二醇的单体和衍生自聚乙烯亚胺的单体。共聚单体可以任选地被诸如化学选择性标签等取代。共聚单体可以通过任何合适的化学作用聚合或连接，所述化学作用包括但不限于烯烃聚合、开环聚合、自由基聚合和点击化学反应或相容化学选择性官能团或标签之间的共轭。目的ADMET单体包括但不限于以下出版物中所述的单体：Mutlu等人，非环二烯易位：用于构建确定聚合物结构的多功能工具，化学学会评论，2011年，40，第1404-1445页。在一些情况下，SM1、SM2和/或SM3的结构式如下所示：
其中：
R21是–L1-D1或–L2-Z1，其中D1是侧基供体发色团，Z1是化学选择性标签，而L1和L2是任选连接子；
n和m独立地为介于1至6(例如，1或2)之间的整数；且
*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。
目的ROMP单体包括但不限于以下出版物中所述的单体：Song等人，1-被取代的环丁烯的开环易位聚合(ROMP)反应的范围，美国化学学会会志，2010年，132(30)，第10513–10520页。在一些情况下，SM1、SM2和/或SM3的结构式如以下任一项所示：
其中：
R21是–L1-D1或–L2-Z1，其中D1是侧基供体发色团，Z1是化学选择性标签，而L1和L2是任选连接子；
X是CH2或O；且
*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。
在一些情况下，SM1、SM2和/或SM3包括以下任一结构式：
其中：
R21是–L1-D1或–L2-Z1；
D1是侧基供体发色基团；
Z1是化学选择性标签；
L1和L2是任选连接子；
X是O或NR"；
R'是H或低级烷基(例如，甲基)；
R"是H、低级烷基、被取代的低级烷基和WSG；且
*是连接所述多发色团的聚合物骨架的连接点。在一些情况下，聚合物骨架包括由聚苯乙烯和丙烯酸酯或丙烯酰胺衍生的共聚单体构成的混合物(例如，如本文所述)。
所述多发色团可以具有采用任何合适的聚合法制备的烃骨架。在一些情况下，烃骨架衍生自丙烯酸酯、丙烯酰胺或苯乙烯共聚单体或其衍生物。在一些情况下，所述多发色团的结构式如式(X)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色团；
每个Z1均是化学选择性标签(例如，如本文所述)；
每个L1、L2和L3均独立地为连接子；
a、b和c均是各共聚单体的mol％值；
d表示所述聚合物的总聚合或平均长度(例如，d是2-1000，例如2-500、2-200、2-100或2-50)；
WSG是水增溶性基团(例如，如本文所述)；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在式(X)的一些情况下，c＝0。在式(X)的一些情况下，a>0且b>0。在式(X)的一些情况下，a为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(X)的一些情况下，b为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。在式(X)的一些情况下，a为65-95mol％，b为5-35mol％，c为0-30mol％，其中a+b+c＝100％。在式(X)的某些情况下，L1-L3包括连接选自以下各项的聚合物骨架的键：-COO-、-CONR"-、-Ph-、-O-，其中R"是H、低级烷基、被取代的低级烷基或WSG。所述键可用于将D1、Z1和WSG连接至聚合物骨架上。
在式(X)的某些情况下，L1-D1的结构式如以下任一项所示：
其中R4是H、低级烷基、被取代的低级烷基或WSG。在式(X)的某些情况下，所述WSG是任一实施例中所述的水增溶性基团，所述基团的结构如本文所述。
所述多发色团可以具有衍生自共聚单体的骨架，所述共聚单体通过衍生自点击化学共轭反应(例如，如本文所述)的键或基团连接。任何合适的二价共聚单体基团都可以用末端化学选择性标签衍化，且可通过相容化学选择性标签的共轭实现聚合。图7A和7B阐明了通过点击化学反应使具有炔烃和叠氮化物化学选择性标签的共聚单体聚合的示例性示意图。在一些情况下，共聚单体包括构成聚合物骨架的一部分的一个或多个环氧乙烷或亚乙基氨基基团。所述基团可以为所得聚合染料提供所需的水溶性。所述共聚单体可以进一步包括用于连接至侧链基团(例如，供体或受体染料或WSG)的三价单元。在一些情况下，所述共聚单体包括骨架中的环氧丙烷或亚丙基氨基基团，其在2-位进一步被侧链基团或取代基所取代。所述基团可以包括已连接的化学选择性标签、已连接的供体或受体染料或已连接的WSG。
在式(II)的一些情况下，所述多发色团的结构式如式(XXI)所示：
其中：
非共轭重复单元的聚合物骨架包含SM1、SM2和SM3共聚单体，它们各自通过基团T进行连接，所述基团T是点击化学反应或化学选择性基团共轭反应(例如，叠氮化物-炔烃点击化学反应)的产物；
SM3任选地包括已连接的WSG；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基吸光发色团；
每个Z1均独立地为与SM2连接的化学选择性标签；
每个Z2均是与SM3连接的任选侧链基团；
x为50mol％或以上；且
y+z为50mol％或以下，其中*是连接所述多发色团或端基(例如，如本文所述)的聚合物骨架的连接点。在式(XXI)的某些情况下，SM1、SM2和SM3包含选自环氧乙烷、亚乙基氨基、2-被取代的环氧丙烷和2-被取代的亚丙基氨基的重复单元。在式(II)的一些情况下，每个T均是1,4-被取代的1,2,3-三唑，即叠氮化物-炔烃点击化学共轭反应的产物。
在式(XXII)的一些情况下，SM1、SM2和SM3的结构如下：
其中：
每个X均独立地为O或NR31，其中R31是H、烷基、被取代的烷基、烷酰基或被取代的烷酰基；
每个r和s均独立地为1-6(例如，1、2或3)；
每个d和e均独立地为1-12(例如，1-6，例如1、2、3、4、5或6)；
t是0或1；
D1是侧基供体发色基团；
Z1是化学选择性标签(例如，如本文所述)；
WSG是水增溶性基团(例如，如本文所述)；
每个L1、L2和L3均独立地为连接子；且
*是连接1,4-被取代的1,2,3-三唑(T)的连接点。
应当理解，对于衍生上述SM1-SM3结构的任何共聚单体，可以在所述共聚单体末端使用叠氮化物或炔烃基团，以在聚合过程中进行连接。因此，1,4-被取代的1,2,3-三唑(T)可能以以下两种可能的方向中的任一种存在：
聚合物骨架末端可以包括任何合适的端基，例如，叠氮化物或炔烃基团、连接子或已连接的特异性结合部分。
示例性多发色团结构及其前体详见实验部分实施例3，其结构如下：
其中：
G1是端基(例如，如本文所述)；
L1和L2独立地为连接子；
D1是侧基发色团(例如，如本文所述)；
每个d、e和f独立地为1-6；
n是1-1000(例如，2-1000、2-500、2-100或2-50)；
每个R41均选自烷基、被取代的烷基和WSG；且
“连接子”是包括任选化学选择性官能团(例如，用于与共聚单体或生物分子共轭的官能团)的连接子。在式(XXI)的一些情况下，L1–L3包含连接选自-NHCO-烷基的聚合物骨架的键。
适用于制备标的多发色团(请参见，例如，本文所述的式(IX))的聚合物骨架的目的环状碳酸酯和受保护的碳酸酯单体包括但不限于以下出版物中所述的单体：Barnes等人，WO2013036532；Cooley等人，美国化学学会会志，131，45，1640-3，2009年；以及Rothbard等人，第7,169,814号美国专利。在采用引发剂和合适的环状碳酸酯单体进料比的情况下，在聚合反应中加入所述单体，以提供聚合物骨架。此外，可以在逐步合成过程中组装受保护的碳酸酯单体，以提供限定序列。在式(II)-(III)的一些情况下，聚合物骨架具有聚碳酸酯骨架。因此，所述多发色团的结构式如式(IX)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自由以下各项组成的组：端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在某些实施例中，式(II)-(III)所示的重复单元(SM1、SM2和/或SM3)以限定的线性序列排列。可以以限定的逐步完成方式聚合的任何合适的共聚单体可用于构建式(II)-(III)所示的多发色团。共聚单体可以衍生自氨基酸、类肽单体或受保护的或环状碳酸酯单体。
在式(II)-(III)的一些情况下，聚合物骨架是具有限定的α-氨基酸残基和/或β-氨基酸残基序列的多肽。以下两种β-氨基酸和多肽可用于标的多发色团的聚合物骨架中：侧链基团接近胺的类型被称为β3-肽/残基；而侧链基团接近羰基基团的类型被称为β2-肽/残基。在某些实施例中，所述多发色团的结构式如式(IV)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基吸光发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、吸光(例如，供体)发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在式(IV)的一些实施例中，p1和p2各自为0，而q1和q2各自为1(例如，β3-氨基酸残基)。在式(IV)的一些实施例中，p1和p2各自为1，而q1和q2各自为0(例如，β2-氨基酸残基)。在一些情况下，p1、p2、q1和q2各自为0，且所述多发色团的结构式如式(V)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
L1和L2各自独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、吸光(例如，供体)发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。应当理解，式(V)所示的多发色团包括以限定的线性序列排列的任何合适的共聚单体，其具有总计达限定mol％比率的x和y。在一些情况下，含有Z1的共聚单体在整个聚合物骨架序列中是间隔开的，因此总是在两侧侧接一个或多个含有D1的共聚单体。
在式(V)的某些情况下，所述多发色团包括如式(VI)所示的链段：
其中：
每个D1均独立地为侧基吸光发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
n和p各自独立地为介于1至20之间的整数，其中n+p≥2；且
m是1或2。
在式(VI)的一些情况下，n和p各自独立地为1至10，例如，2至20、3至10或3至6。在式(VI)的一些情况下，n+p是介于2至20之间的整数，例如，3至20、4至20、5至20、5至15或5至12。在式(VI)的某些实施例中，m是1。
标的多发色团可以包括式(VI)所示的多个链段，其中每个链段包括一个分离的含有Z1的共聚单体，所述共聚单体侧接含有D1的共聚单体的嵌段。在一些情况下，所述多发色团包括两个或以上彼此相邻定向的式(VI)所示的链段，以提供两个分离的含有Z1的共聚单体，所述共聚单体被含有2-20个D1的共聚单体的嵌段(例如，含有3至20、4至20、5至20、5至15或5至12个D1的共聚单体的嵌段)分隔开来。因此，在某些实施例中，所述多发色团包括嵌段共聚物的q链段，且其结构式如式(VII)所示：
其中：每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于各q链段，(n)q+(p)q≥3；且q是介于1至100之间的整数。
应当理解，式(V)-(VII)所示的α-氨基酸残基可以被β2-氨基酸残基或β3-氨基酸残基取代，以得到相应的多肽产物。在式(V)-(VII)中，D1可通过将第一化学选择性标签共轭至D1前体而与氨基酸侧链连接子L1连接。在式(V)-(VII)中，Z1基团可进一步通过第二化学选择性标签(Z2)与目的分子共轭，以置入侧基，例如，第二捕光发色团、受体荧光团或已连接的生物分子(例如，如本文所述)。
任何合适的氨基酸都可用于形成侧基可与之共价连接的聚合物骨架。所述氨基酸可以是天然存在的，也可以是非天然存在的。例如，氨基酸(例如，赖氨酸、鸟氨酸)具有适合与氨基反应性基团(例如，活化的羧酸)共轭的侧链氨基基团。半胱氨酸包括适合与硫醇反应性基团(例如，马来酰亚胺或卤代乙酰基)共轭的侧链硫醇基团。天门冬氨酸和谷氨酸具有可与亲核基团(例如，氨基基团)共轭的侧链羧酸基团。本发明描述了制备标的多发色团的方法，包括肽合成方法。
在一些情况下，所述多发色团的聚合物骨架具有以下一个或多个多肽序列链段：
其中：
每个X均是具有侧链连接的第一化学选择性标签或侧链连接的侧基供体发色团的第一氨基酸残基；
每个Y均是具有侧链连接的第二化学选择性标签或侧链连接的侧基受体荧光团的第二氨基酸残基；且
n是介于2至20之间的整数，例如，2至10、3至10、4至10或5至10，例如，n是2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在某些实施例中，除本文所述的一个或多个多肽链段外，第三种氨基酸残基(Z)可并入聚合物骨架中，例如，引入两个链段之间。在某些情况下，单个分离的第三氨基酸残基被引入本文所述的任何两个链段之间，例如，(链段1)-Z-(链段2)。所述第三氨基酸残基可以是间隔基残基，也可以是具有适于选择性置入其他目的部分的化学选择性官能团的残基，例如，第二侧基吸光发色团、化学选择性标签(例如，生物正交点击化学标签)、连接子、已连接的生物分子、受体荧光团、WSG等。在某些情况下，在制备之前，将所述其他目的部分引入第三氨基酸残基中。
在某些情况下，第一氨基酸残基(X)包括侧链氨基基团，例如，赖氨酸或鸟氨酸或其受保护形式。在聚合物骨架SPPS期间，所述侧链氨基基团可保持受保护状态(例如，用Cbz或Boc保护基团加以保护)，而后进行正交脱保护，使第一残基与侧基供体发色基团共轭。在某些情况下，第二氨基酸残基包括侧链硫醇基团，例如，半胱氨酸或其受保护形式。类似地，在聚合物骨架SPPS期间，所述侧链硫醇基团可保持受保护状态，而后进行正交脱保护，使第二残基与目的侧基(例如，受体荧光团)共轭。
在一些实施例中，所述多发色团的聚合物骨架具有或衍生自以下一个或多个多肽序列链段：
其中：每个K均是赖氨酸残基、受保护的赖氨酸残基或通过侧链氨基基团与侧基供体发色基团共价连接的赖氨酸残基；n是介于2至20之间的整数(例如，2至10、3至10、4至10或5至10，例如，n是2、3、4、5、6、7、8、9或10)；且C是半胱氨酸残基或受保护的半胱氨酸残基。
在一些实施例中，所述多发色团的聚合物骨架具有或衍生自以下一个或多个多肽序列链段：
其中：
O是鸟氨酸残基、受保护的鸟氨酸残基或通过侧链氨基基团与侧基供体发色基团共价连接的鸟氨酸残基；n是介于2至20之间的整数(例如，2至10、3至10、4至10或5至10，例如，n是2、3、4、5、6、7、8、9或10)；且C是半胱氨酸残基或受保护的半胱氨酸残基。
在式(II)-(III)的一些情况下，聚合物骨架是类肽骨架。因此，所述多发色团的结构式如式(VIII)所示：
其中
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、吸光(例如，供体)发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。应当理解，式(VIII)所示的多发色团可以包括以限定的线性序列排列的任何合适的共聚单体，其具有总计达限定mol％比率的x和y。在一些情况下，含有Z1的共聚单体在整个聚合物骨架序列中是间隔开的，因此总是在两侧侧接一个或多个含有D1的共聚单体。
在式(IV)、(V)、(XIII)和(IX)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(IV)、(V)、(XIII)和(IX)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
侧基发色基团
任何合适的吸光发色基团均可用于标的多发色团中。术语“吸光发色基团”和“供体发色基团”可互换使用，是指多发色团的侧基，其能够在特定最大吸收波长处吸收光，并将能量转移至邻近发色团或受体发色团或将其转换为具有更长的最大发射波长的发射光。
BODIPY发色基团
侧基发色基团可以是BODIPY基团。在式(I)-(IX)的一些情况下，D1独立地为BODIPY基团。在一些情况下，BODIPY基团是侧基供体发色基团。术语“BODIPY基团”是指多发色团的侧基，其包括具有以下硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)核心结构的发色团：
其中Q是C或N；每个R均是任何合适的硼取代基。在一些情况下，Q是C。在一些情况下，每个R均独立地选自F、OH、H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、炔基和被取代的炔基。
BODIPY核心结构可以通过任选侧链连接子在所述核心结构的任何合适位置与多发色团的重复单元连接。BODIPY核心结构可以进一步任选地被取代。在某些实施例中，BODIPY基团定义属于重复单元一部分的共聚单体的侧链基团。任何合适的含有BODIPY的结构都可以作为BODIPY基团用于标的多发色团中。目的含有BODIPY的结构包括但不限于以下出版物中所述的BODIPY染料及其衍生物：Loudet和Burgess，BODIPY染料及其衍生物：合成和光谱性质，化学评论，2007年，107(11)：第4891–4932页；Suzuki等人，第8,193,350号美国专利；Ulrich等人，第8,476,461号美国专利；Ulrich等人，第7,897,786号美国专利，所述出版物中的内容以引用方式全文并入本文中。
BODIPY侧基发色基团的结构式可以如式(XI)所示：
其中：
Q是C或N；
R1-R7各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1，或
任选地，选自R6和R7、R2和R3、R5和R6、R3和R4、R4和R1以及R5和R1的任何一对或多对取代基共同形成二价基且与其所结合的碳原子连接成环状结构，共同形成5或6元稠合杂环、碳环、芳基环或杂芳基环(例如，包含碳原子以及选自O、S和N的0-3个杂原子的5或6元环)，其中所述环可能未被取代，也可能进一步被独立地选自以下基团的取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1；
L1是连接子；
Z1是聚合物骨架的非共轭重复单元；且
Y1和Y2独立地选自F、OH、H、氰基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基和WSG；
其中Y1、Y2和R1-R7中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。在式(XI)中，应当理解，取代基Y1、Y2和R1-R7可以选自不会抑制BODIPY基团发射荧光的基团。在式(XI)的某些情况下，Q是C。应当理解，对于本文所述的任何BODPIY基团式，可以包括相应式，其中式(XI)中用Q表示的原子是氮原子。在式(XI)的某些实施例中，Y1、Y2和R1-R7中的一项或多项包括WSG。在式(XI)的某些情况下，Y1和Y2各自包括WSG。在式(XI)的某些情况下，–L1-Z1的连接子包括WSG。
在式(XI)中，取代基对R6和R7和/或R2和R3可以连接成环状结构，形成5或6元稠合环，所述环未被取代或已被取代。在式(XI)的一些情况下，所述5或6元稠合环是选自呋喃、噻吩、吡咯、恶唑、异恶唑、噻唑、异噻唑、咪唑和吡唑的芳基或杂芳基环。在式(XI)的一些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XIIa)或式(XIIb)所示：
其中：
Z11和Z12独立地为稠合5或6元稠合杂环、碳环、芳基或杂芳基环；
每个“i”均独立地为0-3；且
每个R20均独立地为针对式(X)中的R2-R7所定义的取代基。
在式(XIIa)-(XIIb)的某些实施例中，Z11和Z12独立地为5或6元稠合芳基或杂芳基环。在某些情况下，Z11和Z12独立地选自呋喃、噻吩、吡咯、恶唑、异恶唑、噻唑、异噻唑、咪唑和吡唑。在式(XIIa)-(XIIb)的一些情况下，Z11和/或Z12是呋喃或噻吩。在式(XIIa)的某些情况下，R1-R5都不是环状连接基团。在式(XIa)-(XIIb)的一些情况下，Z11和Z12独立地选自以下环：
其中：
X是O或S；
Y是O、S或NR，其中R是H、烷基、被取代的烷基或针对式(XIIa)-(XIIb)中的R20所定义的取代基；且
R21-R23独立地选自H和针对式(XIIa)-(XIIb)中的R20所定义的取代基。在式(XIIa)-(XIIb)的某些情况下，Z11和Z12独立地选自以下环：
如上所述。
在式(XIIb)的某些情况下，Z11和/或Z12是相同的环。在某些情况下，Z11和Z12包括不同的环。
在式(XIIa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构式如式(XIIIa)或式(XIIIb)所示：
其中：
X是O或S；且
R16和R17是针对式(I)中的R6和R7所定义的取代基。
在式(XIIIa)或(XIIIb)的某些情况下，R1-R5都不是环状连接基团。
在式(XI)或(XIIb)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构式如式(XIVa)或式(XIVb)所示：
其中：
每个X均是O或S；且
R12、R13、R16和R17是针对式(I)中的R2、R3、R6和R7所定义的取代基。
在式(XI)-(XIVb)的某些实施例中，BOBIPY基团包括已连接的化学选择性官能团或目的分子，例如，捕光多发色团(例如，–L1-Z1)。在一些情况下，R1-R7中的一个包括–L1-Z1。在某些情况下，Y1或Y2包括–L1-Z1。在式(XI)-(XIVb)的某些实施例中，R1是–L1-Z1，其中L1是连接子，Z1是化学选择性官能团或捕光多发色团。在式(XI)-(XIVb)的某些实施例中，R4或R5是–L1-Z1。在式(XI)、(XIIa)和(XIIIa)-(XIIIb)的某些实施例中，R2或R7是–L1-Z1。在式(XI)、(XIIa)和(XIIIa)-(XIIIb)的某些实施例中，R3或R6是–L1-Z1。在式(XIIa)-(XIIb)的某些实施例中，R20取代基是–L1-Z1。在式(XIIIa)-(XIIIb)的某些实施例中，R16或R17是–L1-Z1。在式(XIVa)-(XIVb)的某些实施例中，R12、R13、R16或R17是–L1-Z1。
在一些情况下，R1是-L1-Z1，其中L1是连接子(例如，如本文所述)，所述连接子具有长度为20或以下个原子的骨架。在R1的一些情况下，L1选自烷基或被取代的烷基连接子、烷氧基或被取代的烷氧基连接子、PEG连接子、磺酰胺基-烷基或被取代的磺酰胺基-烷基连接子、胺基-烷基或被取代的胺基-烷基连接子以及烷基-胺基-烷基或被取代的烷基-胺基-烷基连接子。所述连接子可以被WSG(例如，PEG基团)取代。在R1的某些情况下，L1选自C1-C12烷基或被取代的烷基连接子、C1-C12烷氧基或被取代的烷氧基连接子、C1-C12胺基-烷基或被取代的胺基-烷基连接子以及C1-C12烷基-胺基-烷基或被取代的烷基-胺基-烷基连接子。在R1的某些情况下，Z1通过羧酸或其活化酯与BODIPY基团共轭。
在式(XI)-(XIVb)的某些情况下，R1包括与所述捕光多发色团的重复单元或化学选择性官能团连接的任选被取代的碳环或杂环基团。在某些情况下，R1是与所述捕光多发色团的重复单元连接(例如，通过化学选择性官能团连接)的任选被取代的芳基或杂芳基。目的二价碳环或杂环基团包括但不限于1,4-环己基、1,3-环己基、哌啶基(例如，1,4-哌啶基)、哌嗪基(例如，1,4-哌嗪基)等。目的二价芳基或杂芳基基团包括但不限于1,4-苯基、1,3-苯基、2,5-吡啶基、2,6-吡啶基、3,5-吡啶基等。R1的二价碳环或杂环基团或二价芳基或杂芳基基团可与–L2-Z1连接，其中L2是连接基团，例如，本文任一实施例中所述的连接基团。
在式(XI)的一些实施例中，Q是C；R1-R7各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基和被取代的炔基。在式(XI)的某些情况下，Y1和Y2均包括一个或多个水增溶性基团(WSG)。在一些情况下，Y1和Y2均是被WSG取代的炔基。在一些情况下，Y1和Y2均是被分支状WSG取代的炔基。在式(XI)的一些情况下，Y1和Y2均是–CC-CH2)n-O(CH2CH2O)m-R，其中n是1至6，m是2至50(例如，2至30、2至20、6至20、8至20或10至20)；R是H、烷基或被取代的烷基(例如，甲基)。
在式(XI)的一些实施例中，所述BODIPY侧基供体发色基团的结构式可以如式(XIa)所示：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y1和Y2均是被一个或多个WSG取代的炔基。在一些情况下，Y1和Y2均是被分支状WSG取代的炔基。在式(XIa)的一些情况下，每个R10均是–CC-CH2)n-O(CH2CH2O)m-R，其中n是1至6，m是2至50(例如，2至30、2至20、6至20、8至20或10至20)；R是H、烷基或被取代的烷基(例如，甲基)。
在式(XI)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XV)所示：
其中：
L3是共价键、氧代(-O-)、亚烷基(例如，C1-C6-亚烷基)、-O-亚烷基或其被取代形式；
R11是针对R1所定义的基团；
每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。在式(XV)的某些情况下，L3是共价键。在式(XV)的一些情况下，L3是氧代。在式(XV)的某些情况下，L3是共价键。
在式(XV)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XVa)所示：
其中：R11是针对R1所定义的基团；每个R9是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。在式(XV)-(XVa)的一些情况下，R11是L1-Z1(例如，如本文所述)。在式(XV)-(XVa)的一些情况下，R11包括磺酰胺基-烷基或被取代的磺酰胺基-烷基连接子、胺基-烷基或被取代的胺基-烷基连接子或烷基-胺基-烷基或被取代的烷基-胺基-烷基连接子。在式(XV)-(XVa)的某些情况下，R2、R4、R5和R7各自独立地为H、烷基或被取代的烷基。在式(XV)-(XVa)的某些情况下，R3和R6各自独立地为H、烷基或被取代的烷基。在一些情况下，R3和R6均是H。在式(XV)-(XVa)的某些情况下，R2、R4、R5和R7各自独立地为C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基。
在式(XV)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XVIa)或式(XVIb)所示：
其中：
*是键合所述捕光多发色团的重复单元或化学选择性官能团的键合点；且
Y1和Y2独立地选自由以下各项组成的组：F、OH、H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、炔基、被取代的炔基和WSG。
在式(XI)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XVIIa)或式(XVIIb)所示：
其中：n是0-12，Z1是化学选择性官能团(例如，如本文所述)或目的连接分子。在式(XVIIa)-(XVIIb)的某些情况下，n是1-12或1-6，例如，1、2、3、4、5或6。在式(XVIIa)-(XVIIb)的某些情况下，R2-R4和R5-R7各自独立地选自H、C1-C6烷基和被取代的C1-C6烷基。在式(XVIIa)-(XVIIb)的某些情况下，R2和R4和/或R5和R7各自独立地选自C1-C6烷基和被取代的C1-C6烷基。在式(XVIIa)-(XVIIb)的某些情况下，R3和/或R6是H。在式(XVIIa)-(XVIIb)的某些情况下，R3和/或R6是烷基或被取代的烷基。
在式(XIIIa)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XVIII)所示：
其中：L1是连接子，Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元(例如，如本文所述)。在式(XVIII)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XVIIIa)所示：
其中：L2是连接子(例如，L1的连接基团组分)；每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。
在式(XIVa)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XIX)所示：
其中：R12和R13是针对式(XI)中的R2和R3所定义的取代基；L1是连接子，Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元(例如，如本文所述)。在式(XIX)的某些情况下，所述BODIPY基团的结构式如式(XIXa)所示：
其中：L2是连接子(例如，L1的连接基团组分)；每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。
在本文所述的式(XI)-(XIXa)的任一实施例中，所述BODIPY基团可以包括以下任一实施例中所述的特定–L1-Z1基团。
L1可以是连接子(例如，如本文所述)，所述连接子具有长度为20或以下个原子的骨架。在一些情况下，L1选自烷基或被取代的烷基连接子、烷氧基或被取代的烷氧基连接子、PEG连接子、磺酰胺基-烷基或被取代的磺酰胺基-烷基连接子、胺基-烷基或被取代的胺基-烷基连接子以及烷基-胺基-烷基或被取代的烷基-胺基-烷基连接子。所述连接子可以被WSG(例如，PEG基团)取代。在某些情况下，L1选自C1-C12烷基或被取代的烷基连接子、C1-C12烷氧基或被取代的烷氧基连接子、C1-C12胺基-烷基或被取代的胺基-烷基连接子以及C1-C12烷基-胺基-烷基或被取代的烷基-胺基-烷基连接子。连接子L可以包括若干个已连接的组分，例如，一个或多个独立地选自以下各项的连接基团：低级亚烷基、被取代的低级亚烷基、亚烯基(-CH＝CH-)、被取代的亚烯基、亚炔基(-CC-)、被取代或未被取代的胺基(例如，-NRCO-或–CONR-，其中R是H、烷基或被取代的烷基)、被取代或未被取代的磺酰胺基(例如，-NRSO2-或-SO2NR-，其中R是H、烷基或被取代的烷基)、氧代(-O-)、硫代(-S-)、乙二醇(-OCH2CH2O-)、聚乙二醇(例如，-(CH2CH2O)n-，其中n是2-20，例如，2-10或2-6，或2、3、4、5或6)、亚芳基、被取代的亚芳基、杂亚芳基、被取代的杂亚芳基、α-氨基酸残基、β-氨基酸残基等。
所述聚合物骨架(Z1)的已连接的非共轭重复单元可以通过任何合适的化学选择性官能团(例如，适于与具有相容官能团的目的分子共轭的官能团)与BODIPY基团共轭。可用于将标的BODIPY基团与聚合物骨架连接的目的化学选择性官能团包括但不限于胺基(例如，-NH2)、羧酸(-CO2H)、活化酯(例如，NHS或磺基-NHS酯)、硫醇、马来酰亚胺、碘乙酰胺、羟基、酰肼基、肼基、醛类、酮类、叠氮基、炔烃、四嗪、烯烃、磷化氢和环氧化物。应当理解，在一些情况下，用于连接BODIPY基团的化学选择性官能团是所述目的官能团的合成前体或受保护形式，其可以被转化为能够与聚合物骨架共轭的反应性官能团。例如，羧酸是可与目的分子上的胺基偶联的化学选择性官能团。羧酸可以在原位或在偶联之前被转化为与胺基偶联的活化酯。
在式(XI)-(XIXa)的一些实施例中，L1包括与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的任选被取代的碳环或杂环基团。在某些情况下，L1是任选被取代的芳基或杂芳基。目的二价碳环或杂环基团包括但不限于1,4-环己基、1,3-环己基、哌啶基(例如，1,4-哌啶基)、哌嗪基(例如，1,4-哌嗪基)等。目的二价芳基或杂芳基基团包括但不限于1,4-苯基、1,3-苯基、2,5-吡啶基、2,6-吡啶基、3,5-吡啶基等。L1的二价碳环或杂环基团或二价芳基或杂芳基基团可与–L2-Z1连接，其中L2是连接基团，例如，本文任一实施例中所述的连接基团。在式(I)-(IXa)的一些情况下，-L1-Z1的结构如以下任一项所示：
其中：
R11是L2-Z1；
L2是连接子，Z1是所述聚合物骨架的非共轭重复单元；
t是0-4；且每个R9独立地选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、羟基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、卤素、磺酸和水增溶性基团(WSG)。在某些实施例中，-L1-Z1的结构如以下任一项所示：
其中：
L2是连接子，Z1是所述聚合物骨架的非共轭重复单元；
t是0-4；且每个R9独立地选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、羟基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、卤素、磺酸和水增溶性基团(WSG)。在某些实施例中，-L1-Z1的结构如以下任一项所示：
其中：
L2是连接子，Z1是所述聚合物骨架的非共轭重复单元；
R32是H、烷基、被取代的烷基和水增溶性基团(WSG)；
L3是选自亚烷基(例如，C1-C6-亚烷基)、-O-亚烷基和其被取代形式的连接子；
t是0-4；且每个R9独立地选自烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、羟基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、卤素、磺酸和水增溶性基团(WSG)。
在本文所述的式(XI)-(XIXa)的任一实施例中，所述BODIPY基团可以包括以下任一实施例中所述的特定Y1和Y2基团。在式(XI)-(XIXa)的一些情况下，Y1包括水增溶性基团(WSG)。在某些情况下，Y1是被WSG取代的炔基。Y2可以与Y1相同或不同。在式(XI)-(XIXa)的一些情况下，Y2选自F、OH、H、氰基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基和被取代的炔基。在一些情况下，Y2选自F、CN、苯基和被取代的苯基。
在式(XI)-(XIXa)的一些情况下，Y1和Y2均包含水增溶性基团(WSG)。在某些情况下，Y1和/或Y2是被WSG取代的炔基(例如，如本文所述)。在某些情况下，Y1和/或Y2是被聚乙二醇(PEG)或经修饰的(PEG)取代的炔基。在式(I)-(IXa)的任一实施例所述的某些情况下，Y1和/或Y2的结构式如下：
其中：
s是1至12；
q是0至50；且
R21是H、烷基或被取代的烷基。在某些情况下，s是1至6，例如，1、2或3。在一些情况下，q是1至50、1至30、2至30、4至30、6至30、8至30、10至30、10至20或11至16。在某些情况下，q是10至50，例如，10至30、10至20或11至16。
在式(XI)和(XVIIa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
其中Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元；n是0-6；每个R、R2、R4、R5和R7均独立地为H、C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基；且每个q是6-20(例如，10-20)。在式(XI)和(XVIIa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如以下任一项所示：
在式(XV)和(XVa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：
其中Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元；n是0-6；R、R2、R4、R5和R7独立地为H、C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基；且每个q是6-20(例如，10-20)。在式(XV)、(XVa)和(XVIa)或(XVIb)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如以下任一项所示：
在式(XVIII)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
其中Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元；n是0-6；每个R、R2和R4均独立地为H、C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基；且每个q是6-20(例如，10-20)。在式(XVIII)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如以下任一项所示：
在式(XIX)-(XIXa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
其中Z1是所述聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元；n是0-6；每个R和R13均独立地为H、C1-C6烷基或被取代的C1-C6烷基；且每个q是6-20(例如，10-20)。在式(XIX)-(XIXa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
在式(XIIIa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
在式(XIVa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如下：
在式(XIXa)的某些实施例中，所述BODIPY基团的结构如以下任一项所示：
芳基或杂芳基发色基团
所述吸光发色基团可以是芳基或杂芳基发色基团。用于标的多发色团(例如，式(I)-(IX)所示的多发色团)中的目的芳基或杂芳基发色基团包括但不限于苯基、联苯、苯并恶唑、苯并噻唑、聚亚苯基和稠合三环基团，例如，芴、咔唑、噻咯、联苯和桥联联苯。所述芳基或杂芳基发色基团可以任选地进一步被诸如水增溶性基团和/或赋予芳基或杂芳基基团所需的吸光特性的芳基或杂芳基取代基取代。在式(I)-(IX)的一些情况下，每个D1独立地包括稠合三环芳基或杂芳基。在式(I)-(IX)的一些情况下，每个D1独立地包括一个或多个选自芴、咔唑、噻咯、联苯和桥联联苯的基团。
稠合三环发色基团是包括三环芳族基(在构型中具有三个稠合环)的基团，其中两个芳基或杂芳基6元环与中心5或6元碳环或杂环稠合。在一些情况下，所述稠合三环基团包括两个与中心5或6元碳环或杂环稠合的苯并或吡啶并环。所述稠合三环基团可以通过所述稠合环上任何合适的环原子与所述聚合物骨架中的共聚单体的侧链连接。所述中心5或6元环可以是芳族或部分饱和的碳环或杂环，且可以进一步包括侧链取代基，例如，WSG和/或连接化学选择性标签或共聚单体侧链的连接子。桥联联苯共聚单体是具有联苯基团的稠合三环基团，其中两个苯环通过中心6元碳环或杂环彼此进一步连接。
在多发色团的某些情况下(例如，在式(I)-(IX)中)，侧基供体发色基团是结构式如以下任一项所示的稠合三环芳基或杂芳基：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y是C(R13)2、-C(R13)2C(R13)2-、-C(R13)2Si(R13)2-、NR13,Si(R13)2或Se；
每个Z独立地为CH、CR或N；
每个R13均独立地选自H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、酰基、被取代的酰基、烷氧基、被取代的烷氧基、胺基、被取代的胺基、芳烷基、被取代的芳烷基、PEG部分、-L11-Z1，其中L11是连接子，Z1是非共轭重复单元和WSG，或者其中任何两个合适的R3基团任选地连接成环状结构；和
每个R均独立地为H或一个或多个取代基(例如，WSG)，而且其中任何两个合适的R基团任选地连接成环状结构。在一些情况下，R和R13中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
在某些情况下，所述稠合三环基团的结构如以下任一项所示：
其中Y和每个R如上所定义；所述稠合三环基团可以通过Y或R与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
在某些情况下，所述稠合三环基团是芴，其中Y是C(R3)2。在一些情况下，所述稠合三环基团是咔唑，其中Y是NR3。在一些情况下，所述稠合三环基团是噻咯，其中Y是Si(R3)2。在一些情况下，所述稠合三环基团是桥联联苯，其中Y是-C(R3)2C(R3)2-或-C(R3)2Si(R3)2-。在一些情况下，所述稠合三环是桥联联苯，其中Y是-CHR3CHR3-。在本文所述的任一稠合三环基团的某些情况下，每个R独立地选自H、卤素、烷氧基、被取代的烷氧基、烷基和被取代的烷基。在某些情况下，每个R独立地选自H、氟代、氯代、甲氧基、被取代的烷氧基、烷基和被取代的烷基。
在所述稠合三环基团的某些实施例中，所述基团包括两个R取代基，其连接成环状结构，以提供任选地被进一步取代的碳环或杂环A：
其中Y是C(R3)2、-C(R3)2C(R3)2-、-C(R3)2Si(R3)2-、NR3、Si(R3)2或Se；且每个R3均独立地选自H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、酰基、被取代的酰基、烷氧基、被取代的烷氧基、胺基、被取代的胺基、芳烷基、被取代的芳烷基、PEG部分、-L11-Z1，其中L11是连接子，Z1是化学选择性标签(例如，包括化学选择性官能团的标签)和WSG；每个R如上所定义；且所述稠合三环基团可以通过R3或R与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。在某些情况下，所述稠合三环基团的结构如下所示：
其中R8-R9各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、酰基、被取代的酰基、烷氧基、被取代的烷氧基、胺基、被取代的胺基、芳烷基、被取代的芳烷基、PEG部分、-L11-Z1，其中L11是连接子，Z1是化学选择性标签(例如，包括化学选择性官能团的标签)和WSG；Y和每个R如上所定义；且所述稠合三环基团可以通过Y、R8-R8或R与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。在所述共聚单体的一些情况下，Y是C(R3)2。
水增溶性基团
本发明包括具有侧基发色基团的水溶性捕光多发色团以及包括受体荧光团的聚合物串联染料。所述多发色团可以被多个水增溶性基团(WSG)取代。在一些情况下，WSG是直接与模块化支架连接的侧基，例如，作为聚合物骨架的侧链。在某些情况下，WSG是附着在侧基供体发色团或侧基受体荧光团上的取代基。在一些情况下，每个侧基供体发色基团均被一个或多个WSG取代。
本文中使用的术语“水增溶性基团”、“水溶性基团”和WSG可互换使用，是指在水相环境中(例如，在生理条件下)有效溶剂化且能使其所附着的分子的水溶性提高的基团或取代基。与无WSG的对照多发色团相比，WSG可提高多发色团在主要水溶液中的溶解度。水溶性基团可以是在水相环境中有效溶剂化的任何合适的亲水基团。
本发明所述的水溶性多发色团可在水相环境中溶解，这使其特别适用于各种生物测定。标的水溶性多发色团和聚合物串联染料及其共轭物可以抵抗不合需求的聚合，这可以在各种生物测定中产生有利的荧光和光谱特性。染料聚合是不合需求的，因为这可能导致荧光信号减少，例如，聚合引起的染料荧光猝灭。标的水溶性多发色团和聚合物串联染料可用作各种生物传感器的荧光报告分子，并提供异常亮度信号以及适用于各种应用(例如，流式细胞术和成像)的一系列激发和发射波长选项。
各种水溶性聚合物基团可用于标的多发色团的WSG中。任何合适的水增溶性基团(WSG)均可包括在本文所述的多发色团中，以提高水溶性。虽然溶解度的增加量可能有所不同，但是在一些情况下，所述增加量(与无WSG的化合物相比)可以达到2倍或以上，例如，5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或以上。在一些情况下，亲水水增溶性基团带电，例如，带正电或带负电。在某些情况下，亲水水增溶性基团是中性亲水基团。在一些实施例中，WSG是分支状的(例如，如本文所述)。在某些情况下，WSG是直链状的。在一些实施例中，WSG是亲水聚合物，例如，聚乙二醇、经修饰的PEG、肽序列、类肽、碳水化合物、恶唑啉、多元醇、树突、树状聚甘油、纤维素、壳聚糖或其衍生物。目的水增溶性基团包括但不限于羧酸根、膦酸根、磷酸根、磺酸根、硫酸根、亚磺酸根、锍、酯类、聚乙二醇(PEG)和经修饰的PEG、羟基、胺、氨基酸、铵基、胍基、吡啶盐、聚胺和锍、多元醇、直链状或环状糖类、伯胺、仲胺、叔胺或季胺和聚胺、膦酸酯基、次膦酸酯基、抗坏血酸酯基、乙二醇，包括聚醚、-COOM′、-SO3M′、-PO3M′、-NR3 +、Y′、(CH2CH2O)pR及其混合物，其中Y′可以是任何卤素、硫酸根、磺酸根或含氧阴离子；p可以是1至500；每个R可以独立地为H或烷基(例如，甲基)；且M′可以是阳离子抗衡离子或氢、--(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy、--(CH2CH2O)yyCH2CH2X--、--X(CH2CH2O)yyCH2CH2--、乙二醇和聚乙二醇，其中yy选自1至1000；X选自O、S和NRZZ；且RZZ和RYY独立地选自H和C1-3烷基。在一些情况下，WSG是(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3，其中每个x均独立地为介于0至20之间的整数，每个y均独立地为介于0至50之间的整数。在一些情况下，水增溶性基团包括在末端被离子基团(例如，磺酸根)取代的非离子聚合物(例如，PEG聚合物)。
在所述式的一些实施例中，目的侧基包括选自(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(其中每个x均独立地为介于0至20之间的整数，每个y均独立地为介于0至50之间的整数)的取代基以及任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基或(OCH2CH2)zOCH3(其中每个z均独立地为介于0至50之间的整数)取代的苄基。在一些情况下，所述取代基是(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3。在一些实施例中，一个或多个取代基是被至少一个WSG基团(例如，一个或两个WSG基团)取代的苄基，所述WSG基团选自(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3，其中每个x均独立地为介于0至20之间的整数，每个y均独立地为介于0至50之间的整数。
多个WSG可以通过分支型连接子包括在标的多发色团的单个位置中。在某些实施例中，分支型连接子是芳烷基取代基，其进一步被水增溶性基团二取代。因此，在一些情况下，分支型连接子基团是使多发色团与两个或更多个水增溶性基团连接的多发色团的取代基。在某些实施例中，分支型连接子是氨基酸，例如，赖氨酸氨基酸，其通过氨基和羧酸基团与三个基团连接。在一些情况下，多个WSG通过分支型连接子引入后，可使多发色团达到所需溶解度。在一些情况下，所述WSG是能使水中溶解度超过50mg/mL的非离子侧链基团。在一些情况下，所述WSG是能使水中溶解度超过100mg/mL的非离子侧链基团。在一些实施例中，所述多发色团包括选自由烷基、芳烷基和杂环基团组成的组的取代基，每个基团还进一步被包括水增溶性基团的亲水聚合物基团取代，例如，聚乙二醇(PEG)(例如，含2至20个单位的PEG基团)。
可用于WSG中的目的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)基团或经修饰的PEG基团。目的水溶性聚合物包括但不限于基于聚亚烷基氧化物的聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)(请参见，例如，聚(乙二醇)化学物质：生物技术和生物医学应用，J.M.Harris，编辑，PlenumPress，纽约州纽约市(1992年)；聚(乙二醇)化学和生物学应用，J.M.Harris和S.Zalipsky，编辑，ACS(1997年)；国际专利申请：WO 90/13540、WO 92/00748、WO 92/16555、WO 94/04193,WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28937、WO 95/11924、WO 96/00080、WO 96/23794、WO 98/07713、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/30727、WO 99/32134、WO 99/33483、WO 99/53951、WO 01/26692、WO 95/13312、WO 96/21469、WO 97/03106、WO 99/45964；且编号如下的美国专利：4,179,337；5,075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455,027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614,549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127,355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966)。
目的水溶性聚合物的示例包括但不限于含有聚亚烷基氧化物、聚酰胺亚烷基氧化物或其衍生物的水溶性聚合物，包括包含式(CH2-CH2-O)-所示的环氧乙烷重复单元的聚亚烷基氧化物和聚酰胺亚烷基氧化物。目的聚合物的进一步示例包括式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-所示的分子量大于1,000道尔顿的聚酰胺，其中X和Y是二价基，两者可以相同，也可以不同，且可以是分支状或直链状的，n是介于2至100之间的离散整数，例如，2至50；而且X和Y中的一个或两者都包含具有生物相容性、基本上非抗原性的水溶性重复单元，所述重复单元可以是分支状或直链状的。水溶性重复单元的进一步示例包括式-(CH2-CH2-O)-或-(O-CH2-CH2)-所示的环氧乙烷。所述水溶性重复单元的数量可能有较大差异，其中所述单元的数量范围为2至500、2至400、2至300、2至200、2至100、6至100，例如，2至50或6至50。一个实施例的示例是其中X和Y中的一个或两者都选自以下各项：-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n-1-)，其中n1是1至6、1至5、1至4或1至3；n2是2至50、2至25、2至15、2至10、2至8或2至5。一个实施例的进一步示例是其中X是-(CH2-CH2)-；Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。
术语“经修饰的聚合物”(例如，经修饰的PEG)，是指在任一末端或两个末端进行了修饰或衍生化的水溶性聚合物，例如，包括末端取代基(例如，末端烷基、被取代的烷基、烷氧基或被取代的烷氧基等)和/或末端连接的官能团(例如，适于通过酰胺键形成而附着的氨基或羧酸基团)，其适于使聚合物附着在多发色团上(例如，通过分支型基团)。所述标的水溶性聚合物适于包括任何合适的连接基团。应当理解，在一些情况下，基于聚合物起始物料的制备和/或纯化方法，所述水溶性聚合物相对于聚合物长度可以具有一定的分散性。在一些情况下，所述水溶性聚合物是单分散的。
所述水溶性聚合物可以包括一个或多个间隔基或连接子。间隔基或连接子的示例包括直链状或分支状部分(其包含在水溶性聚合物中使用的一个或多个重复单元、二氨基和/或二酸单元、天然或非天然氨基酸或其衍生物)以及脂肪族部分(其包括烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷氧基等，其可以包含，例如，至多18个碳原子或甚至其他聚合物链)。
所述水溶性聚合物部分或所述聚合物部分的一个或多个间隔基或连接子(如有)可以包括具有生物稳定性或可生物降解的聚合物链或单元。例如，基于键的不稳定性，具有重复键的聚合物在生理条件下具有不同程度的稳定性。具有所述键的聚合物可以基于低分子量类似物的已知水解速率，按照其在生理条件下的相对水解速率进行分类，例如，从较不稳定至较为稳定，例如，聚氨酯(-NH-C(O)-O)>聚原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)>聚酰胺(-C(O)-NH)。类似地，使水溶性聚合物附着在靶分子上的键合体系可以是生物稳定的或可生物降解的，例如，从较不稳定至较为稳定：碳酸盐(-O-C(O)-O)>酯(-C(O)-O)>尿烷(-NH-C(O)-O-)>原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)>酰胺(-C(O)-NH-)。通常情况下，基于硫酸根基团的不稳定性，可能需要避免使用硫酸化多糖。此外，可能不太需要使用聚碳酸酯和聚酯。所述键是作为示例提供的，其无意限制可用于本发明所揭示的WSG中的水溶性聚合物的聚合物链或键合体系中的键的类型。
在一些情况下，WSG是分支状非离子水溶性基团(WSG)，其包含已连接的分支型基团且可进一步与两个、三个或更多个非离子水溶性聚合物键合。在一些情况下，所述分支状非离子WSG的结构式如以下任一项所示：
其中：
每个B1和B2均独立地为分支型连接子；
每个W1均独立地为非离子水溶性聚合物，例如，包含6个或更多个单体单元；
T3是连接所述多发色团的侧基或重复单元的任选连接子；且
每个p和q均独立地为0或1，其中，每个T1和每个T2(如有)均独立地为连接子。在某些情况下，每个W1均独立地为PEG或经修饰的PEG聚合物。在某些情况下，每个W1均独立地选自被取代烷基、PEG或经修饰的PEG基团和WSG。在某些情况下，每个W1均独立地为含6-30个单体单元的PEG或经修饰的PEG聚合物，例如，6-24或10-30、10-24或10-20、12-24、12-20、12-16或16-20个单体单元。
在一些情况下，所述分支状非离子WSG的结构式如下所示：
其中：
每个B1均是分支型基团；
每个W1均独立地为非离子水溶性聚合物，例如，包含6个或更多个单体单元；
T3是连接稠合6-5-6三环共聚单体的任选连接子；且
每个p均独立地为0或1，其中，每个T1(如有)均独立地为连接子。在某些情况下，每个W1均独立地为PEG或经修饰的PEG聚合物。在某些情况下，每个W1均独立地选自被取代烷基、PEG或经修饰的PEG基团和WSG。在某些情况下，每个W1均独立地为含6-30个单体单元的PEG或经修饰的PEG聚合物，例如，6-24或10-30、10-24或10-20、12-24、12-20、12-16或16-20个单体单元。在所述分支状非离子WSG的一些实施例中，B1是四取代芳基基团(例如，1,3,4,5-苯基)。
在所述分支状非离子WSG的一些实施例中(例如，如上式所示)，B1选自CH、N、C(＝O)N、SO2N、三取代芳基基团(例如，1,3,5-苯基)、四取代芳基基团和三取代杂芳基基团。在所述分支状非离子WSG的一些实施例中，每个p均为0。在所述分支状非离子WSG的一些实施例中，p是1；每个T1选自–(CH2)n-O–、–O-(CH2)n–、–(CH2)n–和–O–，其中n是1至12，例如，1至6。在所述分支状非离子WSG的一些实施例中，每个T2和/或T3均独立地为C1-C12-烷基连接子，例如，C1-C6-烷基连接子，其中一个或多个骨架原子任选地被杂原子取代。
在标的多发色团的一些实施例中，所述侧基供体发色基团被一个或多个独立地选自下式的水增溶性基团(WSG)取代：
其中：
T5是任选连接子；
每个T6均是连接子；
R11和R独立地为H、烷基或被取代的烷基；且
每个s均是介于1至100之间的整数(例如，6至100或6至50)。
在某些情况下，每个s均独立地为6至30，例如，6至24、6至20、11至20、12至20、12至18或12至16。在某些情况下，每个s均独立地为6至30，例如，6至24、8至24、10至24、12至24、13至24、14至24、15至22或16至20。在一些情况下，每个s均独立地为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在一些实施例中，每个s均独立地为7或更大，例如，8、9或更大、10或更大、11或更大、12或更大、13或更大、14或更大、15或更大，甚至更大，而且在一些情况下，至多具有50个单体单元，例如，至多40个、至多30个或至多24个单体单元。在一些情况下，每个s均独立地为6-30个单体单元，例如，6-24或10-30、10-24或10-20、12-24、12-20、12-16或16-20个单体单元。在一些情况下，每个s均相同。在所述WSG的一些实施例中，T5和/或T6是C1-C12-烷基连接子，例如，C1-C6-烷基连接子，其中一个或多个骨架原子任选地被杂原子取代(例如，–O-)。在所述WSG的一些实施例中，每个R11均是H。在所述WSG的一些实施例中，每个R11均是甲基。
应当理解，在上述任一WSG基团中，可以使用羟基末端PEG链而非甲氧基末端PEG链。在本文所述的任一式的某些情况下，一个或多个重复单元或侧基被WSG取代，所述WSG是选自以下任一结构的树突：
其中R＝H，CH3
在本文所述的任一式的某些情况下，一个或多个重复单元或侧基被WSG取代，所述WSG是选自以下任一结构的多元醇：
在本文所述的任一式的某些情况下，一个或多个重复单元或侧基被WSG取代，所述WSG是以下结构所示的恶唑啉：
在本文所述的任一式的某些情况下，一个或多个重复单元或侧基被WSG取代，所述WSG是选自以下任一结构的类肽：
所述水溶性基团(WSG)可使多发色团或聚合物串联染料的水中溶解度超过10mg/mL，例如，超过20mg/mL、超过30mg/mL、超过40mg/mL、超过50mg/mL、超过60mg/mL、超过70mg/mL、超过80mg/mL、超过90mg/mL或超过100mg/mL。在某些情况下，所述分支状非离子水溶性基团(WSG)可使多发色团或聚合物串联染料的水中溶解度(例如，在水性缓冲液中的溶解度)达到20mg/mL或以上，例如，30mg/mL或以上、40mg/mL或以上、50mg/mL或以上、60mg/mL或以上、70mg/mL或以上、80mg/mL或以上、90mg/mL或以上、100mg/mL或以上，甚至更高。应当理解，在某些条件下，水溶剂化多发色团可以在水性体系中形成离散的水溶性纳米粒子。在某些情况下，所述水溶剂化纳米粒子具有抗聚合性，可用于各种生物测定中。
所述多发色团的聚合物骨架可以具有任何合适的长度。在一些情况下，所述多发色团的单体重复单元的具体数目范围可以是2至500,000，例如2至100,000、2至30,000、2至10,000、2至3,000或2至1,000个单元或链段，或者例如5至100,000、10至100,000、100至100,000、200至100,000或500至50,000个单元或链段。在一些情况下，所述多发色团的聚合物骨架的单体重复单元或链段的具体数目范围可以是2至1,000，例如，2至500、2至500、3至500、4至500、5至500、6至500、7至500、8至500、9至500、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100或20至100个单元或链段。
所述多发色团可以具有任何合适的分子量(MW)。在一些情况下，所述多发色团的MW可以表示为平均分子量。在一些情况下，所述聚合染料的平均分子量范围是500至500,000，例如，1,000至100,000、2,000至100,000(例如，2,000至10,000或10,000至100,000)，甚至平均分子量范围达到50,000至100,000。在一些情况下，制备具有特定离散单体序列的多发色团的聚合物骨架，使得所述多发色团的MW可以表示为精确分子量。在一些情况下，所述聚合染料的精确分子量范围是500至500,000，例如，1,000至100,000、1,000至50,000、2,000至50,000(例如，2,000至10,000或10,000至50,000)，甚至平均分子量范围达到50,000至100,000。
聚合物串联染料
如上所述，标的捕光多发色团可包括含非共轭重复单元的聚合物骨架，且包括多个侧基供体发色基团，每个基团可与一个重复单元连接。如上所述，标的水溶性捕光多发色团能够在侧基供体发色团之间进行同质能量转移，这可使相同发色团之间出现连续可逆能量转移，而非使单个发色团发射。因此，虽然多发色团体系本身可以发射荧光，但是通过图6A所示的自猝灭过程，所述多发色团体系的量子产率可能显著低于在单个分离发色团中所观察到的量子产率。
所述水溶性捕光多发色团能够将能量转移至已连接的受体荧光团。详情请参见，例如，图6B。因此，标的聚合物串联染料进一步包括在能量接收时接近所述供体水溶剂化捕光多发色团体系(即，在能量接收时接近至少一个侧基供体发色基团)的共价连接的受体信号传导荧光团。术语“受体荧光团”和“受体发色团”在本文中可互换使用。
所述受体信号传导荧光团可以作为侧基与聚合物骨架的非共轭重复单元连接。所述多发色团供体的激发可使能量转移至共价连接的受体信号传导荧光团或使所述荧光团发射能量。具有已连接的受体信号传导荧光基团的供体水溶剂化捕光多发色团的重复单元数目可能有所不同，其中，在一些情况下，所述数目的范围为重复单元的1mol％至50mol％，例如，1mol％至25mol％、2mol％至25mol％、3mol％至25mol％、4mol％至25mol％、5mol％至25mol％或10mol％至25mol％。
在所述多发色团的捕光发色团之间的能量转移机制以及由所述供体发色团转移至已连接的受体信号传导荧光团的能量转移机制包括，例如，共振能量转移(例如，(或荧光)共振能量转移，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。所述能量转移机制的转移距离可能相对较短；也就是说，所述捕光多发色团体系的发色团彼此和/或与受体荧光团极为贴近方可实现有效的能量转移。
在有效的能量转移条件下，可能出现放大受体荧光团发射的情况，其中，相较于由泵浦光直接激发发光受体荧光团，在入射光(“泵浦光”)波长为所述捕光多发色团的发色团吸收并转移的波长时，所述发光受体荧光团的发射强度更高。
“有效的”能量转移是指由供体发色团捕获并转移给受体的能量的10％或以上，例如，20％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上。“放大”是指，与用等效强度的入射光直接激发受体荧光团的情况相比，通过来自供体捕光多发色团体系的能量转移激发的受体荧光团发射的信号高出1.5倍或以上。所述信号可以采用任何合适的方法来测定。在一些情况下，所述1.5倍或以上的信号是指发射光的强度。在某些情况下，所述1.5倍或以上的信号是指增加的信噪比。在所述聚合物串联染料的某些实施例中，与用入射光直接激发受体荧光团的情况相比，通过多发色团激发的受体荧光团发射高出1.5倍或以上，例如，2倍或以上、3倍或以上、4倍或以上、5倍或以上、6倍或以上、8倍或以上、10倍或以上、20倍或以上、50倍或以上、100倍或以上，甚至更高(与用入射光直接激发受体荧光团的情况相比)。
任何合适的荧光染料都可以作为受体荧光团用于聚合物串联染料中。术语“荧光染料”和“荧光团”在本文中可互换使用。所述受体荧光团(例如，每个A1)可以是小分子荧光团。所述受体荧光团(例如，每个A1)可以是选自以下各项的染料分子：罗丹明、香豆素、氧杂蒽、花青、聚次甲基、芘、噻嗪、吖啶、二吡咯亚甲基二氟化硼、萘酰亚胺、藻胆蛋白、多甲藻-叶绿素-蛋白、其共轭物及其组合。在某些实施例中，所述受体荧光团(A1)是花青染料、氧杂蒽染料、香豆素染料、噻嗪染料或吖啶染料。在一些情况下，所述受体荧光团(A1)选自DY431、DY 485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY 800、DY 831、Biotium CF 555、Cy3.5和二乙氨基香豆素。目的荧光染料包括但不限于荧光素、6-FAM、罗丹明、Texas Red、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酸、羧基罗丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-Chrome、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor700、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY FL、BODIPY FL-Br.sub.2、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、其共轭物及其组合。目的镧系元素螯合物包括但不限于铕螯合物、铽螯合物和钐螯合物。在一些实施例中，所述聚合物串联染料包括与选自以下各项的受体荧光团连接的多发色团：Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa488、Alexa 647和Alexa 700。在某些实施例中，所述聚合物串联染料包括与选自以下各项的受体荧光团连接的多发色团：Dyomics染料(例如，DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 530、DY 610、DY 633、DY 640、DY 651、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 754、DY 778、DY 782、DY 800或DY 831)、Biotium CF 555、Cy3.5和二乙氨基香豆素。
在一些情况下，所述受体荧光团是BODIPY基团，例如，式(XI)-(XIXa)中任一项或本文所述的任一实施例中所示的BODIPY基团。应当理解，本文所述的具有合适吸收和发射谱的任何合适的BODIPY基团可以被配置成在能量接收时接近供体水溶剂化捕光多发色团体系(即，在能量接收时接近至少一个相容侧基供体发色基团)的受体荧光团。
在一些实施例中，所选择的受体荧光团的最大发射波长范围为300至900nm，例如，350至850nm、350至600nm、360至500nm、370至500nm、380至500nm、390至500nm或400至500nm，其中目的信号传导发色团的发射极大值的具体示例包括但不限于：395nm±5nm、420nm±5nm、430nm±5nm、440nm±5nm、450nm±5nm、460nm±5nm、470nm±5nm、480nm±5nm、490nm±5nm、500nm±5nm、510nm±5nm、520nm±5nm、530nm±5nm、540nm±5nm、550nm±5nm、560nm±5nm、570nm±5nm、580nm±5nm、590nm±5nm、605nm±5nm、650nm±5nm、680nm±5nm、700nm±5nm和805nm±5nm。
所述聚合物串联染料的已连接发光受体荧光团发射的量子产率为0.03或以上，例如，量子产率为0.04或以上、0.05或以上、0.06或以上、0.07或以上、0.08或以上、0.09或以上、0.1或以上、0.15或以上、0.2或以上、0.3或以上，甚至更高。在一些情况下，所述聚合物串联染料的消光系数为5×105cm-1M-1或以上，例如，6×105cm-1M-1或以上、7×105cm-1M-1或以上、8×105cm-1M-1或以上、9×105cm-1M-1或以上，例如1×106cm-1M-1或以上、1.5×106cm-1M-1或以上、2×106cm-1M-1或以上、2.5×106cm-1M-1或以上、3×106cm-1M-1或以上、4×106cm-1M-1或以上、5×106cm-1M-1或以上、6×106cm-1M-1或以上、7×106cm-1M-1或以上或8×106cm-1M-1或以上。在一些实施例中，所述聚合物串联染料的摩尔消光系数为5×105M-1cm-1或以上。在某些实施例中，所述聚合物串联染料的摩尔消光系数为1×106M-1cm-1或以上。
标的聚合物串联染料可以提供来自发光信号传导发色团染料的荧光发射，所述荧光发射的亮度相较于可能来自分离的所述发光染料的发射更高。所述聚合物串联染料的已连接发光信号传导发色团发射的亮度可以为50mM-1cm-1或以上，例如，60mM-1cm-1或以上、70mM-1cm-1或以上、80mM-1cm-1或以上、90mM-1cm-1或以上、100mM-1cm-1或以上、150mM-1cm-1或以上、200mM-1cm-1或以上、250mM-1cm-1或以上、300mM-1cm-1或以上，甚至更高。在某些情况下，相较于直接激发的发光染料的亮度，所述聚合物串联染料的已连接信号传导发色团发射的亮度高出至少5倍，例如，高出至少10倍、高出至少20倍、高出至少30倍、高出至少50倍、高出至少100倍、高出至少300倍，甚至更高(相较于直接激发的发光染料的亮度)。
目的聚合物串联染料可以提供斯托克斯位移为100nm或以上的荧光发射，例如，110nm或以上、120nm或以上、130nm或以上、140nm或以上或150nm或以上。在一些情况下，斯托克斯位移为300nm或以下，例如，200nm或以下。
在一些实施例中，聚合物串联染料包括式(I)-(IX)中任一项所示的水溶性捕光多发色团，其中Z1化学选择性标签被受体荧光团(A1)取代。应当理解，对于本发明所述的聚合物串联染料，也可以实施式(I)-(IX)所示的标的多发色团的任一实施例。在式(I)-(IX)的某些实例中，一个或多个Z1基团可与受体荧光团前体共轭，以得到受体荧光基团(A1)。因此，所述聚合物串联染料可以包括如式(Ia)所示的链段：
其中：
每个M1和M2均独立地为不饱和共聚单体(例如，芳基或杂芳基共聚单体)；
每个S1和S2均独立地为非共轭间隔基单元；
每个D1均独立地为与M1连接的侧基供体发色团(例如，如本文所述)；
每个A1均独立地为与M2连接的受体荧光团；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
第一(M1-S1)和第二重复单元(M2-S2)可以按照无规构型或共嵌段构型来排列。在式(Ia)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基包括两种或以上(例如，两种或三种)不同类型的侧基吸光发色团，所述侧基吸光发色团共同构成捕光多发色团体系。在式(Ia)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基全部相同。
在式(Ia)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(Ia)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
在一些情况下，所述聚合物串联染料包括如式(IIa)所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1、SM2和SM3共聚单体，所述共聚单体各自独立地为非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基供体发色团；
每个A1均独立地为与SM2连接的受体荧光团；
每个Z2均是与SM3连接的任选侧链基团；
x为50mol％或以上；且
y+z为50mol％或以下。
Z2可以不存在，也可以是任何合适的侧链基团，例如，吸光发色团、化学选择性标签、连接子、已连接的生物分子、受体荧光团、WSG等。在式(IIa)的某些情况下，SM3是间隔基共聚单体，其中Z2不存在。在式(IIa)的某些情况下，SM3是包括Z2基团(即，第二侧基吸光发色团)的共聚单体，其中每个D1和每个Z2共同构成捕光多发色团体系。在一些情况下，SM3是包括第二化学选择性标签(Z2)的共聚单体，例如，受保护的官能团或与Z1正交的标签，其可选择性地置入目的部分。
在式(IIa)的某些情况下，x为60mol％或以上，例如，65mol％或以上、70mol％或以上、75mol％或以上、80mol％或以上、85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上，甚至更高。在式(IIa)的某些情况下，y+z为40mol％或以下，例如，30mol％或以下、25mol％或以下、20mol％或以下、15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下，甚至更低。在式(IIa)的某些情况下，y至少为1mol％且不超过25mol％，例如，20mol％或以下、15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下，甚至更低。在式(IIa)的某些情况下，z至少为1mol％且不超过10mol％，例如，5mol％或以下，甚至更低。
在一些情况下，所述聚合物串联染料包括如式(IIIa)所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，所述共聚单体各自独立地为非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基供体发色团；
每个A1均独立地为与SM2连接的受体荧光团；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
在式(IIIa)的某些实施例中，SM1和SM2各自独立地为饱和非共轭共聚单体，例如，仅提供单个共价C-C键的共聚单体。在式(IIIa)的一些实施例中，SM1和SM2各自独立地为部分饱和非共轭共聚单体，例如，在含饱和共价键的骨架中提供分离的双C＝C共价键的共聚单体。式(IIIa)所示的第一和第二重复单元(SM1和SM2)可以按照无规构型、嵌段构型或共嵌段构型来排列，或者按特定序列排列。在式(IIIa)的某些情况下，SM1的D1侧基包括两种或以上(例如，两种或三种)不同类型的侧基吸光发色团，所述侧基吸光发色团共同构成捕光多发色团体系。在式(IIIa)的某些情况下，第一重复单元的D1侧基全部相同。
在式(IIIa)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(IIIa)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
在某些情况下，所述聚合物串联染料的结构式如式(IVa)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、吸光(例如，供体)发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在式(IVa)的一些实施例中，p1和p2各自为0，而q1和q2各自为1(例如，β3-氨基酸残基)。在式(IVa)的一些实施例中，p1和p2各自为1，而q1和q2各自为0(例如，β2-氨基酸残基)。在一些情况下，p1、p2、q1和q2各自为0，且所述聚合物串联染料的结构式如式(Va)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
L1和L2各自独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、吸光(例如，供体)发色基团、连接子和已连接的特异性结合成员。应当理解，式(Va)所示的多发色团包括以限定的线性序列排列的任何合适的共聚单体，其具有总计达限定mol％比率的x和y。在一些情况下，含有A1的共聚单体在整个聚合物骨架序列中是间隔开的，因此总是在两侧侧接一个或多个含有D1的共聚单体。
在式(Va)的某些情况下，所述聚合物串联染料包括如式(VIa)所示的链段：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体发色团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
n和p各自独立地为介于1至20之间的整数，其中n+p≥2；且
m是1或2。
在式(VIa)的一些情况下，n和p各自独立地为1至10，例如，2至20、3至10或3至6。在式(VIa)的一些情况下，n+p是介于2至20之间的整数，例如，3至20、4至20、5至20、5至15或5至12。在式(VIa)的某些实施例中，m是1。
标的聚合物串联染料可以包括式(VIa)所示的多个链段，其中每个链段包括一个分离的含有A1的共聚单体，所述共聚单体侧接含有D1的共聚单体的嵌段。在一些情况下，所述多发色团包括两个或以上彼此相邻定向的式(VIa)所示的链段，以提供两个分离的含有A1的共聚单体，所述共聚单体被含有2-20个D1的共聚单体的嵌段(例如，含有3至20、4至20、5至20、5至15或5至12个D1的共聚单体的嵌段)分隔开来。因此，在某些实施例中，所述聚合物串联染料包括嵌段共聚物的q链段，且其结构式如式(VIIa)所示：
其中：每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于各q链段，(n)q+(p)q≥3；且q是介于1至100之间的整数。
在某些实施例中，所述聚合物串联染料的结构式如式(VIIIa)所示：
其中
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体发色团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在某些实施例中，所述聚合物串联染料的结构式如式(IXa)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基BODIPY供体发色团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自由以下各项组成的组：端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在式(IVa)、(Va)、(XIIIa)和(IXa)的一些情况下，x为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(IV)、(V)、(XIII)和(IX)的一些情况下，y为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。
在某些实施例中，所述聚合物串联染料的结构式如式(Xa)所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1、L2和L3均独立地为连接子；
a、b和c均是各共聚单体的mol％值；
d表示所述聚合物的总聚合或平均长度(例如，d是2-1000，例如2-500、2-200、2-100或2-50)；
WSG是水增溶性基团(例如，如本文所述)；且
G1和G2各自独立地选自由以下各项组成的组：端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
在式(Xa)的一些情况下，c＝0。在式(Xa)的一些情况下，a>0且b>0。在式(Xa)的一些情况下，a为80mol％或以上，例如，85mol％或以上、90mol％或以上、95mol％或以上、96mol％或以上、97mol％或以上、98mol％或以上或99mol％或以上。在式(Xa)的一些情况下，b为20mol％或以下，例如，15mol％或以下、10mol％或以下、5mol％或以下、4mol％或以下、3mol％或以下、2mol％或以下、1mol％或以下。在式(Xa)的一些情况下，a为65-95mol％，b为5-35mol％，c为0-30mol％，其中a+b+c＝100％。
在式(Xa)的某些情况下，每个D1均是已连接的BODIPY基团(例如，如本文所述)。在一些情况下，各受体染料A1均选自DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY800、DY 831、iFluor染料(350、405、488、514、532、594、660、680、700、710、790)、Tide Fluor染料(5WS、7WS、8ws)、ICG、基于BODIPY的染料、Biotium CF 555、Cy 3.5和二乙氨基香豆素。在式(Xa)的某些情况下，L1-D1选自以下各项：
其中R4是H、低级烷基、被取代的低级烷基和WSG。
此外，在式(Xa)的某些情况下，供体和受体染料对D1和A1可以选自以下各项：Dyomics染料(DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY 682、DY 700、DY701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY 800、DY 831)、iFluor染料(350、405、488、514、532、594、660、680、700、710、790)、Tide Fluor染料(5WS、7WS、8ws)、ICG、基于BODIPY的染料、Biotium CF 555、Cy 3.5和二乙氨基香豆素。在式(Xa)的某些情况下，所述WSG是任一实施例中所述的水增溶性基团，所述基团的结构如本文所述。
在某些情况下，所述聚合物串联染料衍生自式(XXI)所示的多发色团，其中SM2的化学选择性标签Z1与受体荧光团共轭。因此，示例性聚合物串联染料结构详见实验部分实施例3，其结构如下：
其中：
G1是端基(例如，如本文所述)；
L1和L2独立地为连接子；
D1是侧基发色团(例如，如本文所述)；
A1是受体荧光团；
每个d、e、f、g和h均独立地为1-6；
每个n和m均独立地为1-1000(例如，2-1000、2-500、2-100或2-50)；
每个R41均选自烷基、被取代的烷基和WSG；且
“连接子”是包括任选化学选择性官能团(例如，用于与共聚单体或生物分子共轭的官能团)的连接子。在某些情况下，每个D1均是BODIPY发色基团(例如，如本文所述)。在一些情况下，由式(XXI)衍生的聚合物串联染料的结构如以下通用结构所示：
其中，每个n和m均独立地为1-1000(例如，2-1000、2-500、2-100或2-50)。在一些情况下，所述供体发色团是BODIPY发色团(例如，如本文所述)，而受体染料选自DY 431、DY485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY 800、DY 831、iFluor染料(350、405、488、514、532、594、660、680、700、710、790)、Tide Fluor染料(5WS、7WS、8ws)、ICG、基于BODIPY的染料、Biotium CF 555、Cy 3.5和二乙氨基香豆素。
已标记的特异性结合成员
本发明所述的方面包括已标记的特异性结合成员。已标记的特异性结合成员是标的聚合染料(例如，如本文所述)与特异性结合成员组成的共轭物。本文所述的任一聚合染料或聚合物串联染料均可与特异性结合成员共轭。所述特异性结合成员与所述聚合染料可通过任选连接子在所述两个分子的任何合适位置彼此共轭(例如，共价连接)。在一些实施例中，所述已标记的特异性结合成员具有抗聚合性。本文中使用的“抗聚合”是指目的水性缓冲液中浓度为1mg/ml或以上的已标记的特异性结合成员，其能够形成同质水性组合物，且无聚合沉淀物，例如，2mg/ml或以上、3mg/ml或以上、4mg/ml或以上、5mg/ml或以上、6mg/ml或以上、7mg/ml或以上、8mg/ml或以上、9mg/ml或以上、10mg/ml或以上，甚至更高浓度的已标记的特异性结合成员。
在某些实施例中，所述已标记的特异性结合成员包含：具有深紫外光激发光谱且包含π共轭共聚单体的链段以及共轭修饰重复单元的水溶剂化聚合染料；且与所述多发色团共价连接的特异性结合成员。
本文中使用的术语“特异性结合成员”是指对于彼此具有结合特异性的一对分子的一个成员。这对分子中的一个成员可以在其表面上或腔中具有与这对分子的另一个成员的表面上或腔中的相应区域特异性结合的区域。因此，这对分子的成员具有与彼此特异性结合以产生结合复合物的特性。在一些实施例中，结合复合物中特异性结合成员之间的亲和力的特征在于Kd(解离常数)为10-6M或以下，例如10-7M或以下，包括10-8M或以下，例如，10-9M或以下、10-10M或以下、10-11M或以下、10-12M或以下、10-13M或以下、10-14M或以下，包括10- 15M或以下。在一些实施例中，所述特异性结合成员以高亲和力特异性结合。高亲合力是指结合成员以表观亲和力特异性结合，所述表观亲和力的特征在于表观Kd为10×10-9M或以下，例如1×10-9M或以下、3×10-10M或以下、1×10-10M或以下、3×10-11M或以下、1×10-11M或以下、3×10-12M或以下或1×10-12M或以下。
所述特异性结合成员可以是蛋白质部分。本文中使用的术语“蛋白质的”是指由氨基酸残基组成的部分。蛋白质部分可以是多肽。在某些情况下，所述蛋白质特异性结合成员是抗体。在某些实施例中，所述蛋白质特异性结合成员是抗体片段，例如，与聚合染料特异性结合的抗体的结合片段。本文中使用的术语“抗体”和“抗体分子”可互换使用，是指由一种或多种多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由全部或部分公认的免疫球蛋白基因编码。所述公认的免疫球蛋白基因(例如，人体内的相应基因)包括κ(k)、λ(I)和重链遗传基因座，其共同构成无数可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型的恒定区基因μ(u)、δ(d)、γ(g)、σ(e)和α(a)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)间断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围已被精确定义(详情请参见，“具有免疫学意义的蛋白质序列”，E.Kabat等人，美国卫生和公众服务部，(1991年))。本文所探讨的所有抗体氨基酸序列的编号均符合Kabat系统要求。不同轻链或重链构架区的序列在同一物种内是相对保守的。抗体的框架区(即，组成性轻链和重链的组合框架区)用于定位和调整CDR。CDR主要负责与抗原表位结合。术语“抗体”旨在包括全长抗体，且可以指用于实验、治疗或下文进一步定义的其他目的的来自任何生物体的天然抗体、工程化抗体或重组产生的抗体。
目的抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或抗体的其他抗原结合子序列，其通过修饰全抗体或使用重组DNA技术从头合成产生。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且可以具有针对细胞的其他比活性(例如，拮抗剂、激动剂、中和抗体、抑制性抗体或刺激性抗体)。应当理解，抗体可以发生对抗原结合或其他抗体功能基本上无影响的其他保守氨基酸取代。
在某些实施例中，所述特异性结合成员是Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体或三链抗体。在某些实施例中，特异性结合成员是抗体。在一些情况下，所述特异性结合成员是鼠抗体或其结合片段。在某些情况下，所述特异性结合成员是重组抗体或其结合片段。
在一些实施例中，所述已标记的特异性结合成员包括：水溶剂化捕光多发色团(例如，如本文所述)；与在能量接收时接近的多发色团共价连接的信号传导发色团(例如，如本文所述)；且与多发色团共价连接的特异性结合成员。在所述已标记的特异性结合成员的一些情况下，本文所述的任一式所示的多发色团，其中：G1和G2各自独立地选自由端基(例如，末端基)、连接子和已连接的特异性结合成员组成的组，其中G1和G2中至少有一项是已连接的特异性结合成员。
在本文所述的式的某些实施例中，G1和/或G2是连接子，例如，包括适于与特异性结合部分共轭的官能团的连接子。应当理解，可以选择位于多发色团G1和/或G2位置的连接子，以使其与包括化学选择性标签(例如，如本文所述)的任何其他连接子(可能存在于多发色团侧链上，例如，在Z2处)正交。在某些实施例中，在G1和/或G2处引入氨基官能团或其衍生物，并在Z2处引入羧酸官能团或其衍生物。在某些实施例中，在G1和/或G2处引入羧酸官能团或其衍生物，并在Z2处引入氨基官能团或其衍生物。
在本文所述的式的一些实施例中，G1和G2中至少有一项是-L3-Z4，其中L3是连接子(例如，如本文所述)，Z4是特异性结合成员(例如，如本文所述)。在本文所述的式的一些实施例中，G1和G2中至少有一项是-L3-Z3，其中L3是连接子(例如，如本文所述)，Z3是化学选择性标签(例如，如本文所述)。任何合适的化学选择性标签和共轭化学均可用于标的多发色团中。目的化学选择性标签包括但不限于胺、活化酯、马来酰亚胺、硫醇、六价硫氟交换化学(SuFEX)、氟化磺酰，Diers Alder环加成点击试剂和点击化学、四嗪、反式环辛烯、醛类、烷氧基胺、炔烃、环辛炔、叠氮化物等。在某些情况下，Z3选自由以下各项组成的组：羧酸、活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)或磺基-NHS)、氨基、马来酰亚胺、碘乙酰基和硫醇。
目的生物分子包括但不限于多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其结构类似物及其组合。在某些情况下，Z4是抗体。在一些情况下，Z4是抗体片段或其结合衍生物。在一些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由以下各项组成的组：Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体和三链抗体。
使用方法
如上所述，本发明所述的方面包括评估样品中靶标分析物存在情况的方法。所述方法的方面包括使样品与特异性结合靶标分析物的聚合染料共轭物接触，以产生标记组合物接触样品。本文中使用的术语“聚合染料共轭物”和“已标记的特异性结合成员”可互换使用。因此，所述聚合染料共轭物可以包括：(i)水溶剂化聚合染料(例如，如本文所述)；且(ii)特异性结合成员(例如，如本文所述)。在一些情况下，所述聚合染料共轭物进一步包含与在能量接收时接近的所述聚合染料的多发色团共价连接的信号传导发色团。
可以采用任何合适的方法使样品与特异性结合靶标分析物的聚合染料共轭物接触，以产生标记组合物接触样品。在一些情况下，在特异性结合成员与靶标分析物(如有)特异性结合的条件下，使样品与聚合染料共轭物接触。为了使共轭物的特异性结合成员与靶标分析物特异性结合，可以使用适当的溶液来维持样品组分和特异性结合成员的生物活性。所述溶液可以是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清、人血小板裂解物或其他因子以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。合适的缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。各种培养基可在市场上购得，且可根据靶标分析物的性质加以使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove培养基等，而且在一些情况下，需要补充胎牛血清或人血小板裂解物。所述溶液的最终组分可以根据所包括的样品组分加以选择。
所述共轭物的特异性结合成员与靶标分析物特异性结合的温度可能会有所不同，而且在一些情况下，所述温度范围可以是5℃至50℃，例如10℃至40℃、15℃至40℃、20℃至40℃，例如，20℃、25℃、30℃、35℃或37℃(例如，如上所述)。在一些情况下，选择进行特异性结合的温度，以与特异性结合成员和/或靶标分析物的生物活性相匹配。在某些情况下，所述温度是25℃、30℃、35℃或37℃。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体或其片段，且进行特异性结合的温度是室温(例如，25℃)、30℃、35℃或37℃。可以选择适用于特异性结合的任何合适的温育时间，以便得到所需量的结合复合物，而且在一些情况下，所述时间可以是1分钟(min)或以上，例如，2分钟或以上、10分钟或以上、30分钟或以上、1小时或以上、2小时或以上，甚至是6小时或以上。
任何合适的特异性结合成员均可在共轭物中使用。目的特异性结合成员包括但不限于与各种细胞类型的细胞表面蛋白特异性结合的试剂，所述细胞类型包括但不限于干细胞(例如，多能干细胞、造血干细胞)、T细胞、调节性T细胞、树突细胞、B细胞(例如，记忆B细胞、抗原特异性B细胞)、粒细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、病毒细胞(例如，HIV细胞)、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和红系细胞。目的靶细胞包括具有合适的细胞表面标记物或抗原的细胞，其可以被合适的特异性结合成员共轭物捕获。在一些实施例中，所述靶细胞选自含有HIV的细胞、Treg细胞、抗原特异性T细胞群体、肿瘤细胞或来自全血、骨髓或脐带血的造血祖细胞(CD34+)。在标的方法中，可以靶向任何合适的细胞表面蛋白或细胞标记物，以特异性结合聚合染料共轭物。在一些实施例中，所述靶细胞包括选自细胞受体和细胞表面抗原的细胞表面标记物。在一些情况下，所述靶细胞可以包括细胞表面抗原，例如CD11b、CD123、CD14、CD15、CD16、CD19、CD193、CD2、CD25、CD27、CD3、CD335、CD36、CD4、CD43、CD45RO、CD56、CD61、CD7、CD8、CD34、CD1c、CD23、CD304、CD235a、T细胞受体α/β、T细胞受体γ/δ、CD253、CD95、CD20、CD105、CD117、CD120b、Notch4、Lgr5(N-末端)、SSEA-3、TRA-1-60抗原、双唾液酸神经节苷脂GD2和CD71。
可以采用标的方法选择任何合适的靶标进行评估。目的靶标包括但不限于核酸，例如，RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子；蛋白质，例如，融合蛋白、改性蛋白(例如，磷酸化蛋白、糖基化蛋白、泛素化蛋白、SUMO化蛋白或乙酰化蛋白)；或抗体、肽、聚合生物分子、细胞、小分子、维生素和药物分子。本文中使用的术语“靶蛋白”是指靶标家族中的所有成员及其片段。所述靶蛋白可以是任何目的蛋白，例如，治疗或诊断靶标，包括但不限于：激素、生长因子、受体、酶、细胞因子、成骨诱导因子、集落刺激因子和免疫球蛋白。术语“靶蛋白”旨在包括重组和合成分子，其可以采用任何合适的重组表达方法或任何合适的合成方法制备或商购。在一些实施例中，所述聚合染料共轭物包括抗体或抗体片段。在标的方法中，可以靶向与目的抗体或抗体片段特异性结合的任何合适的靶标分析物。
在一些实施例中，所述靶标分析物与细胞缔合。在某些情况下，所述靶标分析物是细胞的细胞表面标记物。在某些情况下，所述细胞表面标记物选自由细胞受体和细胞表面抗原组成的组。在一些情况下，所述靶标分析物是细胞内靶标，且所述方法进一步包括裂解细胞。
在一些实施例中，所述样品可以包括从中分离靶细胞的异质细胞群体。在一些情况下，所述样品包括外周全血、在细胞分离之前红细胞已裂解的外周全血、脐带血、骨髓、密度梯度纯化的外周血单核细胞或匀浆组织。在一些情况下，所述样品包括全血、骨髓或脐带血中的造血祖细胞(例如，CD34+细胞)。在某些实施例中，所述样品包括外周血中的肿瘤细胞。在某些情况下，所述样品是包括(或疑似包括)病毒细胞(例如，HIV)的样品。
所述已标记的特异性结合成员可用于标的方法中，例如，用聚合染料或聚合物串联染料标记靶细胞、颗粒、靶标或分析物。例如，已标记的特异性结合成员可用于标记待在流式细胞仪中处理(例如，检测、分析和/或分选)的细胞。所述已标记的特异性结合成员可以包括与诸如各种细胞类型(例如，如本文所述)的细胞表面蛋白特异性结合的抗体。所述已标记的特异性结合成员可用于研究各种生物(例如，细胞)特性或过程，例如，细胞周期、细胞增殖、细胞分化、DNA修复、T细胞信号传导、细胞凋亡、细胞表面蛋白表达和/或呈递等。已标记的特异性结合成员可用于包括(或可能包括)对细胞、颗粒或分析物进行的抗体介导的标记的任何应用中。
在所述方法的某些情况下，所述已标记的特异性结合成员包括本文所述的多发色团(例如，根据式(I)-(IX)中的任一项所述的多发色团)。在某些情况下，G1和G2各自独立地选自由端基、聚合物链段、连接子、化学选择性标签和已连接的特异性结合成员组成的组，其中G1和G2中至少有一项是已连接的特异性结合成员。
所述方法的方面包括测定标记组合物接触样品中是否存在聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，以评估样品中是否存在靶标分析物。一旦所述样品与聚合染料共轭物接触，便可以采用任何合适的方法来测定产生的标记组合物接触样品中是否存在聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物。所述聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物是所述共轭物的特异性结合成员与所述靶标分析物(如有)特异性结合时产生的结合复合物。测定标记组合物接触样品可以包括检测来自结合复合物的荧光信号(如有)。在一些情况下，所述测定包括分离步骤，在所述步骤中使靶标分析物(如有)与样品分离。可以利用各种方法来使靶标分析物与样品分离，例如，通过固定在支持物上。目的测定方法包括但不限于任何合适的方法和测定形式，其中涉及到特异性结合成员对，例如，可使用亲和素-生物素或半抗原-抗半抗原抗体。适于与标的组合物结合使用的目的方法和测定形式包括但不限于流式细胞术方法、原位杂交方法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。
在某些实施例中，所述方法进一步包括使样品与特异性结合靶标分析物的第二特异性结合成员接触。在某些情况下，第二特异性结合成员已结合支持物。可以采用任何合适的支持物来固定标的方法所述的组分(例如，第二特异性结合成员)。在某些情况下，所述支持物是颗粒，例如，磁粉。在一些情况下，所述第二特异性结合成员和聚合染料共轭物产生夹层复合物，所述复合物可以采用任何合适的方法进行分离和检测(如有)。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过流式细胞术分析聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，即荧光标记的靶标分析物。聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物存在情况测定可以提供相应测定结果(例如，定性或定量测定数据)，其可以用于评估样品中是否存在靶标分析物。
任何合适的支持物均可用于标的方法中，以固定所述方法中所示的任何合适的组分，例如，已标记的特异性结合成员、靶标、第二特异性结合成员等。目的支持物包括但不限于：固体基质，其中所述基质可以具有多种构型，例如，片状、微球状或其他结构，例如带孔的板；微球、聚合物、颗粒、纤维网格、水凝胶、多孔基体、针、微阵列表面、色谱分析支持物等。在一些情况下，所述支持物选自由以下各项组成的组：颗粒、平面固体基质、纤维网格、水凝胶、多孔基体、针、微阵列表面和色谱分析支持物。可以将所述支持物引入系统中，所述系统可在任何合适方法的辅助下进行细胞分离，例如，手动操作的注射器、离心机或自动化液体处理系统。在一些情况下，所述支持物可用于自动化液体处理系统(例如，流式细胞仪)中，以实现细胞的高通量分离。
在所述方法的一些实施例中，所述分离步骤包括施加外部磁场以固定磁粉。任何合适的磁体都可以用作外部磁场源(例如，磁场梯度)。在一些情况下，所述外部磁场由磁源产生，例如，通过永磁体或电磁体产生。在一些情况下，固定磁粉是指使磁粉在最靠近磁场梯度源(即磁体)的表面附近积聚。
所述分离可以进一步包括一个或多个任选洗涤步骤，以从支持物中除去样品的未结合物质。可以采用任何合适的洗涤方法，例如，用生物相容性缓冲液洗涤固定的支持物，所述缓冲液可以保留聚合染料与特异性结合成员之间的特异性结合相互作用。从支持物中分离并任选地洗涤样品的未结合物质，以提供富集的靶细胞群体，其中可除去不合需求的细胞和物质。
在某些实施例中，所述方法进一步包括检测已标记的靶标。检测已标记的靶标可以包括用一个或多个激光器激发多发色团，随后用一个或多个光学检测器检测来自聚合物串联染料的荧光发射。所述已标记的靶标可以采用任何合适的仪器和方法进行检测，包括但不限于流式细胞术、FACS系统、荧光显微镜检查；使用酶标仪进行的荧光、冷光、紫外光和/或可见光检测；高效液相色谱法(HPLC)；以及质谱分析法。在本发明所述的方法和组合物中使用荧光标记的组分时，通常认为可以使用不同类型的荧光检测系统来实践标的方法。在一些情况下，可以进行高通量筛选，例如，使用96孔或更多孔的微量滴定板的系统。可以采用各种方法对荧光物质进行测定，例如，以下出版物中所述的方法：Lakowicz,J.R.，荧光光谱的原理，纽约：Plenum Press(1983年)；Herman,B.，共振能量转移显微镜检查，载于：培养物中活细胞的荧光显微镜检查，第B部分，细胞生物学方法，第30卷，编辑，Taylor,D.L.和Wang,Y.-L.，圣地亚哥：Academic Press(1989年)，第219-243页；Turro,N.J.，现代分子光化学，门洛帕克：Benjamin/Cummings Publishing Col,Inc.(1978年)，第296-361页。
可以使用荧光计测定样品中的荧光。在一些情况下，来自具有第一波长的激发源的激发辐射穿过激发光学器件。所述激发光学器件促使激发辐射激发样品。作为响应，所述样品中荧光标记的靶标发出的辐射的波长不同于激发波长。然后，收集光学器件收集来自样品中的发射。相关设备可以包括温度控制器，以在扫描样品时使样品保持在特定温度下。在某些情况下，多轴平移台移动装有多个样品的微量滴定板，以便定位待暴露的不同孔。所述多轴平移台、温度控制器、自动聚焦功能以及与成像和数据采集相关的电子设备均可以通过适当编程的数字计算机进行管理。所述计算机也可以将在测定过程中采集的数据转换成另一种格式以进行显示。
在一些实施例中，评估样品中是否存在靶标分析物的方法进一步包括在流式细胞仪中检测荧光。在一些实施例中，评估样品中是否存在靶标分析物的方法进一步包括通过荧光显微镜检查对标签组合物接触样品进行成像。荧光显微镜成像可用于识别接触样品中的聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，以评估靶标分析物是否存在。在标的方法中使用的目的显微镜检查法包括激光扫描共聚焦显微镜检查。
本发明还提供了标记靶分子的方法。标的聚合染料可用于各种标记、分离、检测和/或分析方法中。在一些实施例中，所述方法包括：使靶分子与聚合染料(例如，如本文所述)接触，以产生标记的靶分子，其中所述聚合染料包括与靶分子共价连接的共轭标签。在一些情况下，所述聚合染料进一步包括与在能量接收时接近的所述聚合染料的多发色团共价连接的信号传导发色团。在所述方法的一些情况下，所述聚合染料成员包括根据式(I)-(IX)中任一项所述的多发色团(例如，如本文所述)，其中G1和G2中的一个是端基，而G1和G2中的另一项则是共轭标签。
本文中使用的术语“共轭标签”是指包括化学选择性官能团(例如，如本文所述)的基团，所述官能团在任选活化和/或脱保护后可以与靶分子的相容官能团共价连接。任何合适的共轭标签可用于标的聚合染料中，以使所述染料与目的靶分子共轭。在一些实施例中，所述共轭标签包括选自以下各项的末端官能团：氨基、羧酸或其衍生物、硫醇、羟基、肼、酰肼、叠氮化物、炔烃和蛋白质反应性基团(例如，氨基反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑基反应性基团或胍基反应性基团)。
任何合适的方法和试剂均适合用于标的标记方法中，以使共轭标签与靶分子共价连接。用于标记靶标的目的方法包括但不限于以下出版物中所述的方法和试剂：Hermanson，生物共轭技术，第三版，Academic Press，2013年。所述接触步骤可以在水溶液中进行。在一些情况下，所述共轭标签包括氨基官能团，而所述靶分子包括活化酯官能团，例如，NHS酯或磺基-NHS酯，反之亦然。在某些情况下，所述共轭标签包括马来酰亚胺官能团，而所述靶分子包括硫醇官能团，反之亦然。在某些情况下，所述共轭标签包括炔烃(例如，环辛炔基)官能团，而所述靶分子包括叠氮化物官能团，反之亦然，其可以通过点击化学反应进行共轭。
可以采用标的方法选择任何合适的靶分子进行标记。目的靶分子包括但不限于核酸，例如，RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子；蛋白质，例如，融合蛋白、改性蛋白(例如，磷酸化蛋白、糖基化蛋白、泛素化蛋白、SUMO化蛋白或乙酰化蛋白)；或抗体、肽、聚合生物分子、细胞、小分子、维生素和药物分子。本文中使用的术语“靶蛋白”是指靶标家族中的所有成员及其片段。所述靶蛋白可以是任何目的蛋白，例如，治疗或诊断靶标，包括但不限于：激素、生长因子、受体、酶、细胞因子、成骨诱导因子、集落刺激因子和免疫球蛋白。术语“靶蛋白”旨在包括重组和合成分子，其可以采用任何合适的重组表达方法或任何合适的合成方法制备或商购。在一些实施例中，所述靶分子是特异性结合成员(例如，如本文所述)。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体。在一些情况下，所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。在一些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由以下各项组成的组：Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体和三链抗体。
在一些情况下，所述方法包括分离步骤，在所述步骤中使已标记的靶分子与反应混合物分离，例如，多余试剂或未标记的靶标。可以采用各种方法来分离样品中的靶标，例如，通过固定在支持物上、沉淀、色谱分析法等。
在一些情况下，所述方法进一步包括检测和/或分析已标记的靶分子。在一些情况下，所述方法进一步包括荧光检测已标记的靶分子。可以利用任何合适的方法以及标的方法和组合物来检测和/或分析已标记的靶分子。分析标的方法中使用的目的靶标的方法包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜检查、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。目的检测方法包括但不限于荧光光谱法、荧光显微镜检查、核酸测序、荧光原位杂交(FISH)、蛋白质质谱分析、流式细胞术等。
可以通过聚合染料或聚合物串联染料直接进行检测，也可以通过二级检测系统间接进行检测。后者可基于几种不同原理中的任一种或其组合进行，包括但不限于抗体标记的抗物种抗体和其他形式的免疫或非免疫桥接和信号放大系统(例如，生物素-链霉亲和素技术、蛋白质-A和蛋白质-G介导的技术或核酸探针/抗核酸探针等)。合适的报告分子可以是免疫细胞化学、分子生物学、光、荧光和电子显微镜检查、细胞免疫表型分析、细胞分选、流式细胞术、细胞可视化、检测、枚举和/或信号输出定量领域中已知的报告分子。可以标记一种以上具有特异性和/或非特异性的抗体，且同时或相继使用所述抗体来增强靶标的检测、鉴定和/或分析。
制备方法
本发明所述的方面包括制备标的多发色团和聚合物串联染料的方法。标的多发色团的一个优点是基础支架的模块化。在一些情况下，模块化支架是具有限定序列的重复单元的直链状聚合物。所用的侧基发色团可以选自各种染料，其可以在聚合物合成前或合成后与聚合物骨架共价连接。
在一些实施例中，标的多发色团的聚合物骨架(请参见，例如，本文所述的式(IX))可以使用环状碳酸酯或受保护的碳酸酯单体来制备。目的方法和共聚单体包括但不限于以下出版物中所述的方法和单体：Barnes等人，WO2013036532；Cooley等人，美国化学学会会志，131，45，1640-3，2009年；以及Rothbard等人，第7,169,814号美国专利。在采用引发剂和合适的环状碳酸酯单体进料比的情况下，可以在聚合反应中加入所述单体，以提供聚合物骨架。此外，可以在逐步合成过程中组装受保护的碳酸酯单体，以提供限定序列。
目的共聚单体可以使用相容的化学选择性官能团和化学方法连接。在一些情况下，共聚单体通过点击化学反应连接，例如，铜催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、烯烃-叠氮化物[3+2]环加成、烯烃与四嗪的逆需求Diers-Alder、施陶丁格连接等(请参见，例如，Kolb等人，应用化学国际版，40：2004-2021，2001年)。因此，共聚单体的连接可以通过相容化学选择性官能团对的共轭来实现，例如，炔烃/叠氮化物、四嗪/烯烃、叠氮化物/烯烃、磷化氢/叠氮化物等。叠氮化物-炔烃环加成反应的非限制性示例包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)反应和钌催化的叠氮化物-炔烃环加成(RuAAC)反应。CuAAC适用于宽温度范围，它对水相环境不敏感，适用的pH值范围为4至12，且可以耐受各种官能团(请参见Himo等人，美国化学学会会志，127：210-216，2005年)。活性Cu(I)催化剂可以利用作为还原剂的抗坏血酸钠，通过诸如Cu(I)盐或Cu(II)盐等生成。所述反应可生成1,4-被取代的产物。RuAAC利用五甲基环戊二烯基氯化钌[Cp*RuCl]络合物，所述络合物能够催化叠氮化物与末端炔烃的环加成反应，区域选择性地生成1,5-二取代1,2,3-三唑(请参见Rasmussen等人，有机化学通讯，9：5337-5339，2007年)。此外，与CuAAC相反，RuAAC也可与内部炔烃结合使用，以提供完全取代的1,2,3-三唑。
在一些实施例中，标的多发色团的聚合物骨架是多肽。任何合适的肽合成方法均可用于制备标的多发色团的所述聚合物骨架。在一些情况下，固相肽合成(SPPS)方法用于通过限定的逐步合成方式制备标的多发色团的聚合物骨架。常规的保护基团策略按照限定序列对目的氨基酸残基进行脱保护和偶联，而对目的侧链官能团进行正交保护。在一些情况下，采用Fmoc/叔丁基方法。在一些情况下，采用Boc/苄基方法。所述保护基团策略也可以适用于在特定氨基酸残基的侧链上和/或在多肽末端上置入目的侧基。在某些情况下，可将一个或多个侧基置入受保护的氨基酸单体起始物料中。在一些情况下，在完成聚合物骨架的SPPS之后，将侧基置入多发色团中。使用正交保护基团，可以使不同的目的基团独立地附接在多肽骨架上，例如，附接在N-和C-末端和/或各不同类型的氨基酸残基上。所述多肽可以包括β2-氨基酸残基、β3-氨基酸残基、α-氨基酸残基或其混合物。
在一些实施例中，制备捕光多发色团的方法(例如，如本文所述)包括合成具有限定氨基酸序列的受保护的多肽，所述限定氨基酸序列由被单次出现的第二氨基酸残基分隔的第一氨基酸残基的嵌段组成。如本文所述，限定序列的氨基酸残基的制备可沿多肽提供所需的侧基供体发色团和受体荧光团构型。在多肽合成后置入侧基时，沿多肽骨架的氨基酸侧链的化学选择性官能团选择性地与侧基共轭。在某些情况下，所述捕光多发色团是具有限定序列的多肽，其中：第一氨基酸残基的每个嵌段包含至少两个残基；第一氨基酸残基各自包含受保护的第一化学选择性侧链基团；且第二氨基酸残基各自包含受保护的第二化学选择性侧链基团。
此外，所述侧基供体发色基团可以利用已包括发色基团作为侧链一部分的受保护的氨基酸构建嵌段来置入。应当理解，至少可以先将侧基发色基团附接在限定多肽序列的侧链上，以产生捕光多发色团。然后，可以通过与附于所述序列特定残基的化学选择性标签进行选择性共轭，从而依次置入包括受体荧光团在内的各种其他侧基。
在一些情况下，所述方法进一步包括使反应性受体荧光团部分与第二氨基酸残基的脱保护的第二化学选择性侧链基团偶联，以产生侧基受体荧光团。
在所述方法的某些情况下，所述限定氨基酸序列包含一个或多个选自以下各项的氨基酸序列链段：
其中，每个X均是具有第一化学选择性官能团或其受保护形式的第一氨基酸残基，而每个Y均是具有第二化学选择性官能团或其受保护形式的第二氨基酸残基。
在上述序列的某些实施例中，每个X均是赖氨酸或鸟氨酸残基或其受保护形式，其具有可选择性地与侧基供体发色基团共价N-连接的侧链氨基基团。每个Y均是半胱氨酸残基或其受保护形式，其具有可选择性地与侧基受体荧光团共价连接的侧链硫醇基团。
包含两个或更多个上述序列链段的多肽序列可以通过任选地被其他第三氨基酸残基(例如，(链段1)-Z-(链段2)，其中Z是第三残基)分隔而制备。所述第三氨基酸残基可以是间隔基残基(例如，无侧链或标签)，也可以是具有适于选择性置入其他目的部分的化学选择性官能团的残基，例如，第二侧基吸光发色团、化学选择性标签(例如，生物正交点击化学标签)、连接子、已连接的生物分子、受体荧光团、WSG等。在某些情况下，在多肽合成之前，将所述其他目的部分引入第三氨基酸残基中。
类似地，在肽合成期间或之后，可以在多肽的N-和/或C-末端置入各种部分。在某些情况下，所述方法进一步包括使受保护的多肽的N-末端脱保护，以及将G1基团(例如，如本文所述)与所述N-末端脱保护的多肽的N-末端偶联。G1可以是任何合适的末端基团(例如，封端基团(例如烷酰基)，例如，乙酰基)、供体发色基团、具有特定化学选择性标签的连接子或目的生物分子。
在一些情况下，所述方法进一步包括在多肽的C-末端处置入G2基团。这可以通过多种方式实现：例如，在SPPS期间，将C-末端基团G2置入固相支持物与所述序列的第一氨基酸残基之间；从固相支持物上裂解多肽；或在合成后，可以将目的部分(例如，特异性结合成员)或针对其定向的特定化学选择性标签与所述多肽的C-末端偶联。在一些情况下，可以采用天然化学连接方法来制备适合与目的多肽片段或部分偶联的C-末端多肽硫酯。
本文所述的任一多肽多发色团均可以根据标的方法制备，例如，本文所述的式(IV)-(VII)所示的多肽及其合成前体。
可用于合成标的多肽多发色团的各种方法中的一些方法概述请参阅以下出版物：Steward等人，固相肽合成，W.H.Freeman Co.，旧金山，1969年；Bodanszky等人，肽合成，John Wiley&Sons，第二版，1976年；Meienhofer，激素蛋白和肽，第2卷，第46页，AcademicPress(纽约)，1983年；Kent，生物化学年鉴，57，957，1988年，适用于固相肽合成；以及Schroder等人，载于：肽，第1卷，Academic Press(纽约)，1965年，适用于液相合成。可以使用任何合适的保护基团策略，例如，但不限于Fmoc固相肽合成和Boc固相肽合成策略。在Boc固相肽合成中，在氨基末端使用Boc-氨基保护基团，而且可以使用苄基或基于苄基的保护基团或其他合适的保护基团，以保护侧链官能团。在Fmoc固相肽合成中，在氨基末端使用Fmoc-氨基保护基团，而且可以使用叔丁基或基于苄基的保护基团或其他合适的保护基团，以保护侧链官能团。在所述合成方法中使用的合适的保护基团请参阅上述参考文献以及下述出版物：McOmic，有机化学中使用的保护基团，Plenum Press，纽约，1973年；以及Greene和Wuts，有机合成中使用的保护基团，John Wiley&Sons，第4版，2006年。
系统
本发明的方面进一步包括用于实施标的方法和组合物相关过程的系统。样品分析系统可以包括装载有样品和已标记的特异性结合成员的样品视场或流道。在一些实施例中，所述系统是流式细胞术系统，其包括：包括流路的流式细胞仪；流路中的组合物，其中所述组合物包括：样品；以及已标记的特异性结合成员(例如，如本文所述)。在一些实施例中，用于分析样品的系统是荧光显微镜系统，其包括：包括样品视场的荧光显微镜；在样品视场中加以处置的组合物，其中所述组合物包含样品；以及已标记的特异性结合成员(例如，如本文所述)。
在所述系统的一些情况下，所述已标记的特异性结合成员包括：水溶剂化捕光多发色团(例如，如本文所述)和特异性结合成员(其与共价连接至多发色团的靶标分析物特异性结合)。在一些情况下，所述已标记的特异性结合成员进一步包含与在能量接收时接近的所述聚合染料的多发色团共价连接的信号传导发色团。在所述系统的一些情况下，所述已标记的特异性结合成员和所述多发色团的结构式如式(I)-(IX)(例如，如本文所述)中的任一项所示，其中：G1和G2各自独立地选自由端基、聚合物共轭链段、连接子和已连接的特异性结合成员组成的组，其中G1和G2中至少有一项是已连接的特异性结合成员。
在所述系统的某些实施例中，所述组合物进一步包括第二特异性结合成员，其已结合支持物且与靶标分析物特异性结合。在一些情况下，所述支持物包括磁粉。因此，在某些情况下，所述系统还可以包括可控的外部顺磁场，其被配置成适用于流道的测定区域。
所述样品可以包括细胞。在一些情况下，所述样品是含有细胞的生物样品。在一些情况下，所述样品包括与靶细胞特异性结合的已标记的特异性结合成员。在某些情况下，与特异性结合成员特异性结合的靶标分析物是所述细胞的细胞表面标记物。在某些情况下，所述细胞表面标记物选自由细胞受体和细胞表面抗原组成的组。
在某些方面，所述系统还可以包括光源，其被配置成将光引导至流道的测定区域或样品视场。所述系统可以包括检测器，其被配置成接收来自流道的测定区域或样品视场的信号，其中所述信号由荧光组合物提供。任选地，所述样品分析系统可以进一步包括一个或多个附加检测器和/或光源，以检测一个或多个附加信号。
在某些方面，所述系统可以进一步包括被配置成检测荧光信号是否存在的基于计算机的系统。“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明所述的基于计算机的系统的最低硬件配置包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置和数据存储装置。技术人员可轻易理解的是，当前可用的任何一种基于计算机的系统都适用于标的系统。所述数据存储装置可以包括任何产品，包括对如上所述的本发明信息的记录，或可以访问所述产品的内存访问装置。
为了“记录”数据，计算机可读介质上的编程信息或其他信息是指使用本领域已知的任何所述方法存储信息的过程。基于用于访问存储信息的装置，可以选择任何合适的数据存储结构。各种数据处理器程序和格式可用于存储，例如，文字处理文本文件、数据库格式等。
“处理器”是指将执行其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文所述的任何处理器可以是可编程数字微处理器，例如，通过以下形式提供：电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(台式机或便携式计算机)。若处理器是可编程的，则适合的编程可以从远端位置传送至所述处理器，或预先保存在计算机程序产品(例如，便携式或固定式计算机可读存储介质，无论是基于磁性、光学还是固态设备)中。例如，磁性介质或光盘可以承载编程，而且可以由在其相应基站与各处理器连通的合适的读取器来读取。
除了传感器设备和信号处理模块(例如，如上所述)外，本发明所述的系统可以包括多个附加组件，例如，数据输出设备(例如，显示器和/或扬声器)、数据输入装置(例如，接口、键盘等)、流体处理组件、电源等。
在某些方面，所述系统包括流式细胞仪。用于分析样品的合适的流式细胞仪系统和方法包括但不限于以下出版物中所述的系统和方法：Ormerod(编)，流式细胞术：实用方法，牛津大学出版社(1997年)；Jaroszeski等人(编)，流式细胞术方案，Methods inMolecular Biology第91期，Humana Press(1997年)；实用流式细胞术，第三版，Wiley-Liss(1995年)；Virgo等人(2012年)，临床生物化学年鉴，1月；49(pt 1)：17-28；Linden等人，血栓形成和止血研讨会，2004年10月；30(5)：502-11；Alison等人，病理学期刊，2010年12月；222(4)：335-344；和Herbig等人(2007年)，治疗性药物载体系统评论，24(3)：203-255；这些出版物中的内容以引用方式并入本文。在某些情况下，目的流式细胞仪系统包括BDBiosciences FACSCantoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVantageTM、BD BiosciencesFACSortTM、BD Biosciences FACSCountTM、BD Biosciences FACScanTM和BD BiosciencesFACSCaliburTM系统、BD Biosciences AccuriTM系统、BD Biosciences FACSCantoTM系统、BDBiosciences FACSCelestaTM系统、BD Biosciences FACSLyricTM系统、BD BiosciencesFACSVerseTM系统、BD Biosciences FACSymphonyTM系统、BD Biosciences LSRFortessaTM系统、BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSJazzTM细胞分选仪和BDBiosciences FACSAriaTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSMelodyTM细胞分选仪等。
在某些实施例中，标的系统是流式细胞仪系统，其装有以下美国专利号文件中所述的一种或多种流式细胞仪组件：3,960,449；4,347,935；4,667,830；4,704,891；4,770,992；5,030,002；5,040,890；5,047,321；5,245,318；5,317,162；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,620,842；5,627,040；5,643,796；5,700,692；6,372,506；6,809,804；6,813,017；6,821,740；7,129,505；7,201,875；7,544,326；8,140,300；8,233,146；8,753,573；8,975,595；9,092,034；9,095,494和9,097,640；这些文件中的内容以引用方式并入本文。
其他系统可用于实施标的方法。在某些方面，所述系统可以是装载有样品(具有本文所探讨的任一实施例中所述的荧光组合物)的荧光计或显微镜。所述荧光计或显微镜可以包括光源，其被配置成将光引导至流道的测定区域或样品视场。所述荧光计或显微镜还可以包括检测器，其被配置成接收来自流道的测定区域或视场的信号，其中所述信号由荧光组合物提供。
试剂盒
本发明的方面进一步包括用于实施标的方法和组合物相关过程的试剂盒。本发明所述的组合物可以作为试剂被包括在试剂盒中，其可以作为起始物料或提供以用于诸如上述方法中。
试剂盒可以包括聚合染料(包括水溶剂化捕光多发色团(例如，如本文所述))和容器。可以使用任何合适的容器，例如，管、瓶、多孔条或板中的孔、盒、袋、隔热容器等。所述标的试剂盒可进一步包括一种或多种选自以下各项的组成部分：聚合物串联染料、荧光团、特异性结合成员、特异性结合成员共轭物、支持物结合的特异性结合成员、细胞、支持物、生物相容的水性洗脱缓冲液和使用说明。在所述试剂盒的一些实施例中，所述多发色团与特异性结合成员共价连接。在一些情况下，所述特异性结合成员是抗体。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。在某些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由以下各项组成的组：Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体和三链抗体。
在某些实施例中，所述试剂盒可用于评估样品中是否存在靶标分析物，例如，细胞内靶标。因此，在一些情况下，所述试剂盒包括一种或多种适于裂解细胞的组分。所述试剂盒的一种或多种附加组分可以装在单独的容器(例如，单独的管、瓶或者多孔条或板中的孔)中提供。
在某些方面，所述试剂盒进一步包括用于进行流式细胞术测定的试剂。目的试剂包括但不限于用于重构和稀释的缓冲液、用于使细胞样品与多发色团接触的缓冲液、洗涤缓冲液、对照细胞、对照微球、用于流式细胞仪校准的荧光微球及其组合。所述试剂盒试剂盒还可以包括一种或多种细胞固定试剂，例如，多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林或其任何组合或缓冲液。此外，所述试剂盒可以包括细胞透化试剂，例如，甲醇、丙酮或清洁剂(例如，曲通、NP-40、皂苷、吐温20、毛地黄皂苷、leucoperm)或其任何组合或缓冲液。技术人员熟悉的其他蛋白转运抑制剂、细胞固定试剂和细胞透化试剂均在标的试剂盒的范围内。
所述试剂盒的组合物可以液体组合物(例如，任何合适的缓冲液)的形式提供。此外，所述试剂盒的组合物可以干组合物(例如，可以冻干)的形式提供，而且所述试剂盒可以任选地包括一种或多种用于重构所述干组合物的缓冲液。在某些方面，所述试剂盒可以包括装在单独的容器(例如，单独的管、瓶或者多孔条或板中的孔)中提供的组合物的等分试样。
此外，可以将一种或多种组分混合装在单个容器中，例如，玻璃或塑料小瓶、管或瓶。在某些情况下，所述试剂盒可以进一步包括其中装有所有相应组分(及其单独的容器)的容器(例如，盒、袋、隔热容器、瓶、管等)。所述试剂盒可以进一步包括与所述试剂盒容器分开或附于其上且上面印有关于试剂盒、试剂盒的组成部分和/或试剂盒的使用说明的信息的包装。
除上述组成部分外，标的试剂盒可能进一步包括用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的试剂盒中，其中一种或多种可能存在于所述试剂盒中。这些说明书可能存在的一种形式是印在适合的介质或基底(例如，其上印有信息的一张纸或多张纸)、试剂盒包装、包装说明书等之上的印刷信息。其存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、CD、便携式闪存驱动器等。这些说明书还可能存在的一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。所述试剂盒中可能存在任何合适的装置。
效用
本文所述的聚合染料、组合物、方法和系统可用于各种应用中，包括诊断和研究应用，其中需要对目的靶标进行标记、检测和/或分析。所述应用包括各种方法，例如，细胞计数、显微镜检查、免疫测定(例如，竞争性或非竞争性)、游离分析物评估、受体结合配体的评估等。本文所述的组合物、系统和方法可用于分析多种样品中的任何一种，包括但不限于生物流体、细胞培养样品和组织样品。在某些方面，本文所述的组合物、系统和方法可用于使用荧光标记(例如，在荧光活化的细胞分选或分析、免疫测定、免疫染色等中)检测样品中的分析物(如有)的方法。在某些情况下，所述组合物和方法可用于涉及评估样品中是否存在靶标分析物的应用中。
在一些情况下，所述方法和组合物可用于涉及检测和/或分析样品中的靶标的任何测定形式，包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜检查、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。在某些情况下，所述方法和组合物可用于涉及靶分子的荧光标记的任何应用中。所述标的组合物适合用于任何可使用特异性结合成员对(例如，生物素-链霉亲和素和半抗原-抗半抗原抗体)的合适应用中。
实施例
实施例1
所述标的聚合染料的合成可以通过Suzuki偶联法实现。还可以采用其他方法(例如，C-H键芳基化或Stille偶联法)来构建和聚合包括芳基或杂芳基共聚单体以及饱和PEG共聚单体的重复单元。
基于多发色团A(MC)的串联染料的结构式如图1所示。制备了一系列具有以下核心结构和不同受体荧光团(“染料”)的串联染料：
评估了示例性聚合物串联染料的光谱特性，相应光谱如图2和图3所示。
表1：侧基多发色团和相应串联染料的光谱数据
发射体 λmax(em)(nm) D/A 量子产率(％) 放大系数
MC 523 不适用 9 不适用
MC-染料1 649 0.09 12 5.1
MC-染料2 661 0.06 23 2.1
MC-染料3 682 0.06 33 1.8
MC-染料4 717 0.08 27 2.2
MC-染料5 740 0.12 16 2.3
MC-染料6 786 0.16 14 2.1
实施例2
采用固相肽合成法来制备一系列赖氨酸和半胱氨酸氨基酸残基KCKK，相应残基如图4所示。羧酸取代的BODIPY基团通过酰胺键偶联与肽的赖氨酸残基的N-末端和侧链氨基共轭。马来酰亚胺取代的受体荧光团(染料7)通过马来酰亚胺-硫醇偶联化学反应与半胱氨酸残基共轭。所述肽采用适合与生物分子(例如，蛋白质)共轭的C-末端连接子制备。
描述了图4所示的基于BODIPY的串联染料的光谱特性。图5A显示了BODIPY供体侧基的吸收和发射光谱。图5B显示了受体染料(染料7)的吸收和发射光谱。图5C显示了图4所示的示例性聚合物串联染料的吸收和发射光谱。对于所述有支架的发色团的发射光谱，主要发色团被激发。对于所述系统，供体的发射几乎完全淬灭，大部分发射是受体荧光团的发射。所述聚合物串联染料的量子产率与受体荧光团(染料7)相当，这表明串联染料表现出有效的能量转移过程。所述示例性串联染料的荧光相较于单独的受体荧光团(染料7)的荧光放大约2倍。
提供的供体与受体之比为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和20:2的多肽通过上述方法制备和表征。
实施例3
水溶性荧光聚合染料可以在温和条件下通过点击聚合来制备。所述聚合染料可与生物识别单元(生物分子)共价键合，并用作靶标的荧光探针。引入第二染料作为受体时，形成聚合物串联染料。可以调节受体染料的颜色，制备激发波长相同(见图9A)但发射波长差别较大(见图9B)的聚合物串联染料。
选择具有所需窄吸收的聚乙二醇化BODIPY染料作为荧光团侧基染料。所述侧基荧光团与水溶性乙二醇醚单体(末端为二叠氮化物、二炔烃或叠氮化物/炔烃)化学键合。具有附接的BODIPY染料的PEG聚合物链可以基于合适的MW(例如，如本文所述)，利用针对炔烃与叠氮化物的Cu(I)催化的1,3-偶极环加成来制备。仅有一种荧光团染料作为侧基连接时，所得聚合物作为简易荧光聚合染料发出荧光(见图8)。连接第二个受体荧光团时，可获得具有两个荧光团侧基的聚合物链。处于较高能级的一个荧光团可以用作能量供体，而处于较低能级的第二个荧光团可以用作能量受体。混合合适比例的供体/受体对，可以得到具有所需发射波长的聚合物串联染料。
以下聚合染料可以通过点击聚合法，利用图7A和7B所示的合成示意图所述的共聚单体和方法制备，其中，应当理解，n和m一起可以表示所述聚合物的平均长度以及共聚单体的相对比率，而且n和m可以根据需要通过控制聚合反应参数(采用任何一种合适的方法实现)加以选择。应当理解，根据聚合方法，n和m重复单元可以无规构型或嵌段构型形式存在。此外，以下聚合物结构可以通过末端叠氮化物或炔基，利用点击化学反应进一步与任何合适的目的分子(例如，生物分子)共轭。在一些情况下，n和m各自独立地选自1至1000，例如，1至500、1至200、1至100、2至100或5至100。
图8显示了一种基础聚合染料的吸收和发射光谱，所述染料包括通用结构如上所述的侧基BODIPY染料。其他示例性聚合染料(其中R是已连接的供体染料(例如，如上所述的BODIPY染料)，且所述染料包括适于共轭(例如，通过酰胺键和连接子与受体染料共轭)的侧链–NH2基团)如下所示：
示例性聚合物串联染料结构如下所示，其中R是已连接的供体染料(例如，如上所述的BODIPY染料)，且所述染料包括目的已连接的受体染料(例如，适于共轭(例如，与受体染料共轭))，例如，DY-754或DY-704，其中DY是指Dyomics染料，例如，其最大发射波长分别为754nm或704nm。通过选择发射光谱至少部分与基础聚合物(见图8)重叠的目的受体染料，可以生产具有各种发射波长的聚合物串联染料。详情请参见，例如，图9A-9B。
其他实施例
虽然本文附有权利要求书，但本发明的内容范围还受以下条款限定：
条款1。一种水溶性捕光多发色团，其包含：
包含非共轭重复单元的聚合物骨架；和
多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团。
条款2。根据条款1所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团均被水溶性基团取代。
条款3。根据条款1所述的多发色团，其中所述聚合物骨架是直链状聚合物。
条款4。根据条款1所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团被配置成在能量转移时彼此接近。
条款5。根据条款4所述的多发色团，其中所述构型的侧基供体发色基团在入射光的激发下，相对于未猝灭的分离供体发色基团表现出荧光猝灭现象。
条款6。根据条款1-5中任一项所述的多发色团，其中侧基供体发色基团选自稠合三环芳基或杂芳基基团和BODIPY基团。
条款7。根据条款6所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团选自芴、咔唑和噻咯。条款8。根据条款6-7中任一项所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团是结构式如以下任一项所示的稠合三环芳基或杂芳基：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y是C(R13)2、-C(R13)2C(R13)2-、-C(R13)2Si(R13)2-、NR13,Si(R13)2或Se；
每个Z独立地为CH、CR或N；
每个R13均独立地选自H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、酰基、被取代的酰基、烷氧基、被取代的烷氧基、胺基、被取代的胺基、芳烷基、被取代的芳烷基、PEG部分、WSG和-L11-Z1，其中L11是连接子，Z1是非共轭重复单元，或者其中任何两个合适的R'基团任选地连接成环状结构；和
每个R均独立地为H或一个或多个取代基，而且其中任何两个合适的R基团任选地连接成环状结构；
其中，R和R13中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
条款9。根据条款1-6中任一项所述的多发色团，其中侧基供体发色基团是BODIPY基团。
条款10。根据条款9所述的多发色团，其中所述BODIPY基团的结构式如下：
其中：
R1-R7各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1，或
任选地，选自R6和R7、R2和R3、R5和R6、R3和R4、R4和R1以及R5和R1的任何一对或多对取代基共同形成二价基且与其所结合的碳原子连接成环状结构，共同形成5或6元稠合杂环、碳环、芳基环或杂芳基环(例如，包含碳原子以及选自O、S和N的0-3个杂原子的5或6元环)，其中所述环可能未被取代，也可能进一步被独立地选自以下基团的取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1；
L1是连接子；
Z1是聚合物骨架的非共轭重复单元；且
Y1和Y2独立地选自F、OH、H、氰基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基和WSG；
其中Y1、Y2和R1-R7中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
条款11。根据条款10所述的多发色团，其中R1是与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的任选被取代的芳基或杂芳基。
条款12。根据条款10-11中任一项所述的多发色团，其中Y1和Y2各自包含水增溶性基团(WSG)。
条款13。根据条款10-12中任一项所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团的结构式如下：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y1和Y2均是被WSG取代的炔基。
条款14。根据条款13所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团的结构式如下：
其中：
R11是L1-Z1(聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元)；
每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。条款15。根据条款1-14中任一项所述的多发色团，其中所述侧基供体发色基团被一个或多个独立地选自下式的水增溶性基团(WSG)取代：
其中：
T5是任选连接子；
每个T6均是连接子；
R11和R独立地为H、烷基或被取代的烷基；且
每个s均是介于1至50之间的整数。
条款16。根据条款1-15中任一项所述的多发色团，其包含如下式所示的链段：
其中：
每个M1和M2均独立地为芳基或杂芳基共聚单体；
每个S1和S2均独立地为非共轭间隔基单元；
每个D1均独立地为与M1连接的侧基供体发色团；
每个Z1均独立地为与M2连接的化学选择性标签；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
条款17。根据条款16所述的多发色团，其中所述聚合物骨架的M1-S1和M2-S2重复单元具有无规构型。
条款18。根据条款16-17中任一项所述的多发色团，其中：
每个M1和M2独立地包含一个或多个选自芴、咔唑、噻咯、亚联苯基和亚苯基的基团；且
每个S1和S2均独立地为选自二价聚乙二醇(PEG)和二价修饰的PEG基团的饱和间隔基单元。
条款19。根据条款1-15中任一项所述的多发色团，其包含如下式所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，所述共聚单体各自独立地为饱和非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基供体发色团；
每个Z1均独立地为与SM2连接的化学选择性标签；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
条款20。根据条款19所述的多发色团，其中所述聚合物骨架的SM1和SM2重复单元具有无规构型。
条款21。根据条款19-20中任一项所述的多发色团，其中SM1和SM2是衍生自以下各项的共聚单体：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、聚苯乙烯、ROMP单体、ADMET单体或环状碳酸酯。
条款22。根据条款21所述的多发色团，其中SM1和SM2选自下式：
其中：
R21是–L1-D1或–L2-Z1；
D1是与M1连接的侧基供体发色团；
Z1是与M2连接的化学选择性标签；
L1和L2是任选连接子；
X是O或NR"；
R22是H或低级烷基；
R"是H或低级烷基、被取代的低级烷基和WSG；且
*是连接所述聚合物骨架的连接点。
条款23。根据条款19所述的多发色团，其中所述多发色团的结构式如式(XXI)所示：
其中：
非共轭重复单元的聚合物骨架包含SM1、SM2和SM3共聚单体，它们各自通过基团T进行连接，所述基团T是点击化学反应或化学选择性基团共轭反应的产物；
SM3任选地包括已连接的WSG；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基吸光发色团；
每个Z1均独立地为与SM2连接的化学选择性标签；
x为50mol％或以上；且
y+z为50mol％或以下，其中*是连接所述多发色团或端基的聚合物骨架的连接点。
条款24。根据条款23所述的多发色团，其中SM1、SM2和SM3包含以下结构：
其中：
每个X均独立地为O或NR31，其中R31是H、烷基、被取代的烷基、烷酰基或被取代的烷酰基；
每个r和s均独立地为1-6(例如，1、2或3)；
每个d和e均独立地为1-12(例如，1-6，例如1、2、3、4、5或6)；
t是0或1；
D1是侧基供体发色基团；
Z1是化学选择性标签(例如，如本文所述)；
WSG是水增溶性基团(例如，如本文所述)；
每个L1、L2和L3均独立地为连接子；且
*是连接1,4-被取代的1,2,3-三唑(T)的连接点，其具有以下任一结构：
或端基G1或G2(例如，如本文所述)。
条款25。根据条款19所述的多发色团，其中所述聚合物骨架的重复单元具有限定的线性序列。
条款26。根据条款25所述的多发色团，其中SM1和SM2是衍生自以下各项的共聚单体：氨基酸、类肽单体、受保护的碳酸酯单体或环状碳酸酯单体。
条款27。根据条款19、25和26中任一项所述的多发色团，其中所述聚合物骨架是具有限定的-氨-氨基酸残基和/或-氨基酸残基序列的多肽。
条款28。根据条款19和25-27中任一项所述的多发色团，其中所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光基团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款29。根据条款28所述的多发色团，其中p1和p2均为0，q1和q2均为1。
条款30。根据条款28所述的多发色团，其中p1和p2均为1，q1和q2均为0。条款31。根据条款28所述的多发色团，其中p1、p2、q1和q2均为0，且所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
L1和L2各自独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光基团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款32。根据条款27、28和31中任一项所述的多发色团，其包含如下式所示的链段：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
n和p各自独立地为介于1至20之间的整数，其中n+p≥2；且
m是1或2。
条款33。根据条款32所述的多发色团，其中所述多发色团包含共聚物的q链段，且其结构式如下：
其中：
每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于各q链段，(n)q+(p)q≥3；且
q是介于1至100之间的整数。
条款34。根据条款19、25-28和31-33中任一项所述的多发色团，其中所述聚合物骨架包含一个或多个选自以下各项的氨基酸序列：
其中：
每个X均是赖氨酸或鸟氨酸残基，所述残基与侧基供体发色基团进行共价N连接；且
每个Y均是半胱氨酸残基或受保护的半胱氨酸残基。
条款35。根据条款19、25和26中任一项所述的多发色团，其中所述多发色团的结构式如下：
其中
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款36。根据条款19-21和26中任一项所述的多发色团，其中所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色团；
每个Z1均独立地为化学选择性标签；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自由以下各项组成的组：端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款37。根据条款16-36中任一项所述的多发色团，其中侧基供体发色基团是BODIPY基团。
条款38。一种聚合物串联染料，其包含：
捕光多发色团，其包含：
包含非共轭重复单元的聚合物骨架；和
多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团；且
与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的受体荧光团，所述受体荧光团被配置成在能量接收时接近所述捕光多发色团的至少一个侧基供体发色基团。
条款39。根据条款38所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团均被水溶性基团取代。
条款40。根据条款38所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架是直链状聚合物。条款41。根据条款38所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团被配置成在能量转移时彼此接近。
条款42。根据条款36所述的聚合物串联染料，其斯托克斯位移为100nm或以上。条款43。根据条款36-40中任一项所述的聚合物串联染料，其中侧基供体发色基团选自稠合三环芳基基团、稠合三环杂芳基基团和BODIPY基团。
条款44。根据条款43所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团选自任选被取代的芴、咔唑和噻咯基团。
条款45。根据条款43-44中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团是结构式如以下任一项所示的稠合三环芳基或杂芳基：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y是C(R13)2、-C(R13)2C(R13)2-、-C(R13)2Si(R13)2-、NR13,Si(R13)2或Se；
每个Z独立地为CH、CR或N；
每个R13均独立地选自H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、酰基、被取代的酰基、烷氧基、被取代的烷氧基、胺基、被取代的胺基、芳烷基、被取代的芳烷基、PEG部分、WSG和-L11-Z1，其中L11是连接子，Z1是非共轭重复单元，或者其中任何两个合适的R3基团任选地连接成环状结构；和
每个R均独立地为H或一个或多个取代基，而且其中任何两个合适的R基团任选地连接成环状结构；
其中，R和R13中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
条款46。根据条款43所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团是BODIPY基团。
条款47。根据条款46所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY基团的结构式如下：
其中：
R1-R7各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1，或
任选地，选自R6和R7、R2和R3、R5和R6、R3和R4、R4和R1以及R5和R1的任何一对或多对取代基共同形成二价基且与其所结合的碳原子连接成环状结构，共同形成5或6元稠合杂环、碳环、芳基环或杂芳基环(例如，包含碳原子以及选自O、S和N的0-3个杂原子的5或6元环)，其中所述环可能未被取代，也可能进一步被独立地选自以下基团的取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和–L1-Z1；
L1是连接子；
Z1是聚合物骨架的非共轭重复单元；且
Y1和Y2独立地选自F、OH、H、氰基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基和WSG；
其中Y1、Y2和R1-R7中的一个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
条款48。根据条款47所述的聚合物串联染料，其中R1是与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的任选被取代的芳基或杂芳基。
条款49。根据条款47-48中任一项所述的聚合物串联染料，其中Y1和Y2各自包含水增溶性基团(WSG)。
条款50。根据条款47-49中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团的结构式如下：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y1和Y2均是被WSG取代的炔基。
条款51。根据条款50所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团的结构式如下：
其中：
R11是L1-Z1(聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元)；
每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；且t是0-4。条款52。根据条款38-51中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述侧基供体发色基团被一个或多个独立地选自下式的水增溶性基团(WSG)取代：
其中：
T5是任选连接子；
每个T6均是连接子；
R11和R独立地为H、烷基或被取代的烷基；且
每个s均是介于1至50之间的整数。
条款53。根据条款38-52中任一项所述的聚合物串联染料，其包含如下式所示的链段：
其中：
每个M1和M2均独立地为芳基或杂芳基共聚单体；
每个S1和S2均独立地为非共轭间隔基单元；
每个D1均独立地为与M1连接的侧基供体发色团；
每个A1均独立地为与M2连接的受体荧光团；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
条款54。根据条款53所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架的M1-S1和M2-S2重复单元具有无规构型。
条款55。根据条款53-54中任一项所述的聚合物串联染料，其中：
每个M1和M2独立地包含一个或多个选自芴、咔唑、噻咯、亚联苯基和亚苯基的基团；且
每个S1和S2均独立地为选自二价聚乙二醇(PEG)和二价修饰的PEG基团的饱和间隔基单元。
条款56。根据条款38-52中任一项所述的聚合物串联染料，其包含如下式所示的链段：
其中：
含非共轭重复单元的所述聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，所述共聚单体各自独立地为非共轭共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基供体发色团；
每个A1均独立地为与SM2连接的受体荧光团；
x为75mol％或以上；且
y为25mol％或以下。
条款57。根据条款56所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架的重复单元具有无规构型。
条款58。根据条款56-57中任一项所述的聚合物串联染料，其中SM1和SM2是衍生自以下各项的共聚单体：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、聚苯乙烯、ROMP单体、ADMET单体或环状碳酸酯。
条款59。根据条款58所述的聚合物串联染料，其中SM1和SM2选自下式：
其中：
R21是–L1-D1或–L2-Z1；
D1是与M1连接的侧基供体发色团；
Z1是与M2连接的化学选择性标签；
L1和L2是任选连接子；
X是O或NR"；
R'是H或低级烷基；
R"是H或低级烷基、被取代的低级烷基和WSG；且
*是连接所述聚合物骨架的连接点。
条款60。根据条款56所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团的结构式如式(XXI)所示：
其中：
非共轭重复单元的聚合物骨架包含SM1、SM2和SM3共聚单体，它们各自通过基团T进行连接，所述基团T是点击化学反应或化学选择性基团共轭反应的产物；
SM3任选地包括已连接的WSG；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基吸光发色团；
每个A1均独立地为与SM2连接的受体荧光团；
x为50mol％或以上；且
y+z为50mol％或以下，其中*是连接所述多发色团或端基的聚合物骨架的连接点。
条款61。根据条款60所述的聚合物串联染料，其中SM1、SM2和SM3包含以下结构：
其中：
每个X均独立地为O或NR31，其中R31是H、烷基、被取代的烷基、烷酰基或被取代的烷酰基；
每个r和s均独立地为1-6(例如，1、2或3)；
每个d和e均独立地为1-12(例如，1-6，例如1、2、3、4、5或6)；
t是0或1；
每个L1、L2和L3均独立地为连接子；且
*是连接1,4-被取代的1,2,3-三唑(T)的连接点，其具有以下任一结构：
条款62。根据条款56所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架的重复单元具有限定的线性序列。
条款63。根据条款62所述的聚合物串联染料，其中SM1和SM2是衍生自以下各项的共聚单体：氨基酸、类肽单体、受保护的碳酸酯单体或环状碳酸酯单体。
条款64。根据条款56、62和63中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架是具有限定的-氨-氨基酸残基和/或-氨-氨基酸残基序列的多肽。
条款65。根据条款56和62-64中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款66。根据条款65所述的聚合物串联染料，其中p1和p2均为0，q1和q2均为1。
条款67。根据条款65所述的聚合物串联染料，其中p1和p2均为1，q1和q2均为0。
条款68。根据条款65所述的聚合物串联染料，其中p1、p2、q1和q2均为0，且所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
L1和L2各自独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款69。根据条款64、65和66中任一项所述的聚合物串联染料，其包含如下式所示的链段：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
n和p各自独立地为介于1至20之间的整数，其中n+p≥2；且
m是1或2。
条款70。根据条款69所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团包含共聚物的q链段，且其结构式如下：
其中：
每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于各q链段，(n)q+(p)q≥3；且
q是介于1至100之间的整数。
条款71。根据条款56、62-65和68-70中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物骨架包含一个或多个选自以下各项的氨基酸序列：
其中：
每个X均是赖氨酸或鸟氨酸残基，所述残基与侧基供体发色基团进行共价N连接；且
每个Y均是与侧基受体荧光基团共价连接的半胱氨酸残基。
条款72。根据条款56，62和63中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团的结构式如下：
其中
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体发色团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款73。根据条款56-58和63中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自由以下各项组成的组：端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款74。根据条款53-73中任一项所述的聚合物串联染料，其中侧基供体发色基团是BODIPY基团。
条款75。根据条款38-74中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述受体荧光团(例如，每个A1)是小分子荧光团。
条款76。根据条款38-75中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述受体荧光团(例如，每个A1)选自花青染料、罗丹明染料、氧杂蒽染料、香豆素染料、聚次甲基、芘、二吡咯亚甲基二氟化硼、萘甲酰亚胺、噻嗪染料和吖啶染料。
条款77。一个已标记的特异性结合成员，其包含：
聚合物串联染料，其包含：
捕光多发色团，其包含：
包含非共轭重复单元的聚合物骨架；和
多个与所述聚合物骨架的非共轭重复单元各自独立连接的侧基供体发色基团；且
与所述聚合物骨架的非共轭重复单元连接的受体荧光团，所述受体荧光团被配置成在能量接收时接近所述捕光多发色团的至少一个侧基供体发色基团；和
与聚合物串联染料连接的特异性结合成员。
条款78。根据条款77所述的已标记的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体。
条款79。根据条款77所述的已标记的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。
条款80。根据条款79所述的已标记的特异性结合成员，其中所述抗体片段或其结合衍生物选自由以下各项组成的组：Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体和三链抗体。
条款81。根据条款77-80中任一项所述的已标记的特异性结合成员，其中所述受体荧光团选自花青染料、罗丹明染料、氧杂蒽染料、香豆素染料、聚次甲基、芘、二吡咯亚甲基二氟化硼、萘甲酰亚胺、噻嗪染料和吖啶染料。
条款82。根据条款77-81中任一项所述的已标记的特异性结合成员，其中所述聚合物串联染料是根据条款39-76中任一项所述的染料。
条款83。根据条款77-81中任一项所述的已标记的特异性结合成员，其结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1是末端基团、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团或连接子；且
G2是已连接的特异性结合成员。
条款84。根据条款83所述的已标记的特异性结合成员，其中p1、p2、q1和q2均为0，且所述多发色团的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
L1和L2各自独立地为连接子；
x是75mol％或以上；y是25mol％或以下；
G1是末端基团、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团或连接子；且
G2是已连接的特异性结合成员。
条款85。一种评估样品中是否存在靶标分析物的方法，所述方法包含：
(a)使样品与特异性结合靶标分析物的已标记的特异性结合成员接触，以产生标记组合物接触样品，其中所述已标记的特异性结合成员包含：
(i)根据条款38-76中任一项所述的聚合物串联染料；以及
(ii)与聚合物串联染料连接的特异性结合成员；以及
(b)测定所述标记组合物接触样品中是否存在已标记的特异性结合成员-靶标分析物结合复合物，以评估样品中是否存在靶标分析物。
条款86。根据条款85所述的方法，其中所述聚合物串联染料的受体荧光团选自花青染料、罗丹明染料、氧杂蒽染料、香豆素染料、聚次甲基、芘、二吡咯亚甲基二氟化硼、萘甲酰亚胺、噻嗪染料和吖啶染料。
条款87。根据条款85-86中任一项所述的方法，其进一步包含使所述样品与第二特异性结合成员接触，所述第二特异性结合成员其已结合支持物且与靶标分析物特异性结合。
条款88。根据条款87所述的方法，其中所述支持物包含磁粉。
条款89。根据条款85-88中任一项所述的方法，其中所述靶标分析物与细胞缔合。条款90。根据条款89所述的方法，其中所述靶标分析物是细胞的细胞表面标记物。条款91。根据条款90所述的方法，其中所述细胞表面标记物选自由细胞受体和细胞表面抗原组成的组。
条款92。根据条款89所述的方法，其中所述靶标分析物是细胞内靶标，且所述方法进一步包含裂解细胞。
条款93。根据条款85-92中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过流式细胞术分析荧光标记的靶标分析物。
条款94。一种标记靶分子的方法，所述方法包含：
使靶分子与聚合物串联染料接触，以产生标记的靶分子，其中：
所述聚合物串联染料是根据条款38-76中任一项所述的染料，且包含与所述靶分子共价连接的共轭标签。
条款95。根据条款94所述的方法，其中所述聚合物串联染料的结构式如下：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1是末端基团、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团或连接子；且
G2是包含共轭标签的连接子。
条款96。一种制备捕光多发色团的方法，所述方法包含：
a)合成具有限定氨基酸序列的受保护的多肽，所述限定氨基酸序列由被单次出现的第二氨基酸残基分隔的第一氨基酸残基的嵌段组成，其中：
第一氨基酸残基的每个嵌段包含至少两个残基；
第一氨基酸残基各自包含受保护的第一化学选择性侧链基团；且
第二氨基酸残基各自包含受保护的第二化学选择性侧链基团；
b)使所述受保护的多肽脱保护，以产生脱保护的多肽，其中所述第一和第二化学选择性侧链基团均已脱保护；
c)使反应性供体发色团部分与第一氨基酸残基的脱保护的第一化学选择性侧链基团偶联，以产生侧基供体发色基团。
条款97。根据条款96所述的方法，其进一步包含，继续执行步骤c)，使反应性受体荧光团部分与第二氨基酸残基的脱保护的第二化学选择性侧链基团偶联，以产生侧基受体荧光团。
条款98。根据条款96所述的方法，其进一步包含，在步骤a)完成后，使受保护的多肽的N-末端脱保护，并使G1基团与所述N-末端脱保护的多肽的N-末端偶联，其中G1是端基(例如(封端基团)、供体发色基团或连接子。
条款99。根据条款96-98中任一项所述的方法，其进一步包含，在步骤c)完成后，使特异性结合成员与所述多肽的C-末端偶联。
条款100。根据条款96-99中任一项所述的方法，其中所述捕光多发色团的结构式如下：
其中：
D1是侧基供体发色基团；
Z1是第二化学选择性侧链基团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或以上；
y为25mol％或以下；且
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光团、连接子和已连接的特异性结合成员。
条款101。根据条款96-100中任一项所述的方法，其中所述捕光多发色团的结构式如下：
其中：
每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于各q链段，(n)q+(p)q≥3；且
q是介于1至100之间的整数。
条款102。根据条款96-101中任一项所述的方法，其中：
第一氨基酸残基独立地选自赖氨酸和鸟氨酸；且
第二氨基酸残基是半胱氨酸。
条款103。根据条款96-102中任一项所述的方法，其中所述限定氨基酸序列包含选自以下各项的氨基酸序列：
其中：
每个X均是赖氨酸或鸟氨酸残基，所述残基与侧基供体发色基团进行共价N连接；且
每个Y均是半胱氨酸残基或受保护的半胱氨酸残基。
尽管为了达到清晰理解的目的采用图示和示例的方式详细描述了前述发明，但是鉴于本发明的教学意义，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可对其进行特定的变更和修改。
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种结构，尽管这里没有明确表述或示出，但这些设计反应了本发明的原理，未超出本发明的精神和范围。此外，本文列举的所有示例和条件语言主要为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步拓展本领域所提供的构想，并且应解释为不受这些具体列举的示例和条件的限制。而且，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其在结构和功能上的等同物。此外，所述等同物拟包括目前已知的等同物和日后待开发的等同物，即，开发出的任何功能相同的原件且与结构无关。而且，无论在权利要求书中是否明确叙述了本发明的公开内容，都不会向公众披露其中的任何内容。
因此，本发明的范围并不限于本文中显示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求书体现。在权利要求书中，只有当权利要求书的限制内容开头明确使用短语“用于……的手段”或“用于……的步骤”时，《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)明确定义为被援引；如果权利要求书的限制内容中未使用所述短语，则《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)未被援引。

Claims (20)

1.一种水溶性聚合物串联染料，其包含：
多肽骨架；
多个与聚合物骨架的氨基酸残基各自独立连接的侧基供体荧光团；和
与所述多肽骨架的氨基酸残基连接的受体荧光团，所述受体荧光团在能量接收时接近至少一个侧基供体荧光团。
2.根据权利要求1所述的水溶性聚合物串联染料，其中：
每个侧基供体荧光团均被水溶性基团取代；
侧基供体荧光团被配置成在能量转移时彼此接近；和/或
侧基供体荧光团选自稠合三环芳基、稠合三环杂芳基基团和BODIPY基团。
3.根据权利要求1或2所述的水溶性聚合物串联染料，其中所述侧基供体荧光团是下式所示的BODIPY基团：
其中：
R1-R7各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和-L1-Z1，或
任选地，选自R6和R7、R2和R3、R5和R6、R3和R4、R4和R1以及R5和R1的任何一对或多对取代基共同形成二价基且与其所结合的碳原子连接成环状结构，共同形成5或6元稠合杂环、碳环、芳基环或杂芳基环(例如，包含碳原子以及选自O、S和N的0-3个杂原子的5或6元环)，其中所述环可以未被取代，也可以进一步被独立地选自以下基团的取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、水增溶性基团(WSG)和-L1-Z1；
L1是连接子；
Z1是聚合物骨架的非共轭重复单元；和
Y1和Y2独立地选自F、OH、H、氰基、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基和WSG；
其中Y1、Y2和R1-R7中的一个与聚合物骨架的非共轭重复单元连接。
4.根据权利要求3所述的水溶性聚合物串联染料，其中所述侧基供体荧光团的结构如下：
其中：
*是聚合物骨架的非共轭重复单元的键合点；
Y1和Y2均是被WSG取代的炔基。
5.根据权利要求4所述的水溶性聚合物串联染料，其中侧基荧光团的结构如下：
其中：
R11是L1-Z1(聚合物骨架的已连接的非共轭重复单元)；
每个R9均是选自卤素、羟基、氰基、硝基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基的任选取代基；和
t是0-4。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的水溶性聚合物串联染料，其中所述侧基供体荧光团被一个或多于一个独立地选自下式的水增溶性基团(WSG)取代：
其中：
T5是任选的连接子；
每个T6均是连接子；
R11和R独立地为H、烷基或被取代的烷基；和
每个s均是介于1至50之间的整数。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的水溶性聚合物串联染料，其包含如下式(IIa)所示的链段：
其中：
SM1、SM2和SM3均各自独立地为多肽骨架的氨基酸残基重复单元；
每个D1为多个侧基供体荧光团中的一个；
每个A1为受体荧光团；
每个Z2为任选的侧链基团。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料包含如下式所示的链段：
其中：
非共轭氨基酸残基重复单元的聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，所述共聚单体各自独立地为饱和非共轭氨基酸残基共聚单体；
每个D1均独立地为与SM1连接的侧基供体发色团；
每个A1均独立地为与SM2连接的受体荧光团；
x为75mol％或高于75mol％；和
y为25mol％或低于25mol％。
9.根据权利要求8所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料如下式所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
p1和q1独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
p2和q2独立地为0或1，其中p1+q1≤1；
x为75mol％或高于75mol％；
y为25mol％或低于25mol％；和
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光基团、连接子和已连接的特异性结合成员。
10.根据权利要求9所述的聚合物串联染料，其中p1、p2、q1和q2各自为0，且所述聚合物串联染料如下式所示：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
L1和L2各自独立地为连接子；
x为75mol％或高于75mol％；
y为25mol％或低于25mol％；和
G1和G2各自独立地选自端基、聚合物链段、供体发色基团、受体荧光基团、连接子和已连接的特异性结合成员。
11.根据权利要求10所述的聚合物串联染料，其包含如下式所示的链段：
其中：
每个D1均独立地为侧基供体发色基团；
每个A1均独立地为受体荧光团；
每个L1和L2均独立地为连接子；
n和p各自独立地为介于1至20之间的整数，其中n+p≥2；和
m是1或2。
12.根据权利要求11所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料包含共聚物的q个链段，且其结构式如下：
其中：
每个(n)q和每个(p)q均独立地为介于1至20之间的整数，其中，对于q个链段的每个，(n)q+(p)q≥3；和
q是介于1至100之间的整数。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的聚合物串联染料，其中多肽骨架包含一个或多个选自以下各项的氨基酸序列：
其中：
每个X均是赖氨酸残基或鸟氨酸残基，其与侧基供体发色基团进行共价N连接；和
每个Y均是半胱氨酸残基或经保护的半胱氨酸残基。
14.一个已标记的特异性结合成员，其包含：
根据权利要求1-13中任一项所述的聚合物串联染料；和
与所述聚合物串联染料连接的特异性结合成员。
15.根据权利要求14所述的已标记的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体或其结合片段。
16.一种评估样品中是否存在靶标分析物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与特异性结合靶标分析物的根据权利要求14-15中任一项所述的已标记的特异性结合成员接触，以产生标记组合物接触样品；和
(b)测定所述标记组合物接触样品中是否存在已标记的特异性结合成员-靶标分析物结合复合物，以评估样品中是否存在靶标分析物。
17.一种标记靶分子的方法，所述方法包括：
使靶分子与根据权利要求1-13中任一项所述的聚合物串联染料接触，以产生标记的靶分子，其中所述聚合物串联染料包含与所述靶分子共价连接的共轭标签。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶分子包含特异性结合成员。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述特异性结合成员包含抗体或其结合片段。
20.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-13中任一项所述的聚合物串联染料或根据权利要求14-15中任一项所述的已标记的特异性结合成员。
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