CN102010826B - 微生物菌体的保存方法及微生物菌体的混悬液 - Google Patents

Abstract

本发明提供代替现有技术的廉价且简便的微生物菌体保存用混悬液及保存方法。本发明涉及微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体以干燥菌体质量为4~20质量％的浓度保存在分散介质中。

Description

微生物菌体的保存方法及微生物菌体的混悬液

技术领域

本发明涉及通过将具有腈水合酶活性的微生物菌体以规定浓度在菌体混悬液中保存来稳定地保存该微生物菌体的方法。此外，本发明还涉及以规定浓度含有具有腈水合酶活性的微生物菌体的菌体混悬液。

背景技术

微生物产生的酶在很多情况下作为化学转化反应的酶而使用。尤其是通过利用具有腈基的水合或水解作用的腈水合酶、腈水解酶等，可以廉价地生产在化学工业上重要的酰胺、羧酸、α-羟基羧酸等。此外，通过利用具有光学特异性的水合能力或光学特异性的水解能力的上述酶，也可以生产作为医药、农药的生产原料的重要的光学活性羧酸、氨基酸、α-羟基羧酸等。

在将微生物酶作为催化剂的化学转化反应中，有必要将培养及收集的微生物菌体稳定保存至使用之时。即，在保存时不能出现由于混入杂菌、腐败或是溶菌而使微生物酶的催化能力失去或降低。因此，一般情况下，通过使用稳定剂、代谢阻碍剂和高浓度盐类来抑制微生物菌体保存时微生物酶的失活、腐败和溶菌，从而应用于化学转化反应中。在不添加上述稳定剂的情况下，已知可以通过冻结、冷藏或持续搅拌来维持酶的活性，同时进行保存。

例如，对于具有腈水合酶活性的微生物，已知有在含有高浓度的无机盐类的水溶液中保存的方法(专利文献1)、通过冻结进行保存的方法(专利文献2)等。

参考文献

专利文献

[专利文献1]日本专利第3163224号

[专利文献2]日本特开第2003-219870号公报

发明内容

发明所要解决的课题

在这些保存方法中，使用含有高浓度的无机盐类的水溶液的方法因为在后续的工序中需要进行洗涤等，故有对产品的品质造成影响之虞，且生产方法也繁杂。此外，通过冻结来保存的方法中，存在冻结、融解操作很繁杂等操作性上的问题，且伴随着此操作，有酶活性失去或下降之虞。

解决课题的手段

本发明者们对廉价且稳定地保存培养、收集得到的微生物菌体的混悬液的条件进行了深入的研究，结果发现通过将菌体浓缩为4～20质量％的范围的浓度，可在目前通常情况下还基本未考虑的在室温下，且无需搅拌也不引起溶菌和酶失活地稳定保存，从而完成本发明。

即，本发明涉及微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体，以干燥菌体质量为4～20质量％的浓度在分散介质中保存。此外，本发明还涉及以干燥菌体质量为4～20质量％的菌体浓度含有具有腈水合酶活性的微生物菌体的微生物菌体的混悬液。

发明效果

依据本发明，通过将菌体混悬液中含有的微生物菌体的浓度控制在一定范围内，可以在室温下、即使不搅拌也不出现腐败或酶的劣化而维持腈水合酶等的酶活性的情况下，长时间保存大量菌体。此外，依据本发明，能够提供在使用微生物菌体时无需洗涤、可大幅削减现有的保存方法所必需的劳动力和成本、在工业上令人满意的微生物菌体的保存方法。

发明的实施方式

以下，对本发明进行详细的说明。以下的实施方式，是用于说明本发明的示例，但本发明并不仅限于此实施方式。只要不脱离其原理，可以以各式各样的形态来实施。

需要说明的是，本说明书中引用的全部文献和公开公报、专利公报以及其它的专利文献，均作为参考包含于本说明书中。此外，本说明书包含2009年7月24日提交的作为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请(日本特愿2009-173162号)的说明书中记载的内容。

本发明中的具有腈水合酶活性的微生物菌体，具有生产作为目的的酶催化物并在菌体内积蓄或分泌至菌体外的性质。此微生物中含有从自然界中分离出的微生物以及基因重组微生物。作为这样的微生物的代表例，可举例例如具有腈水合酶活性的属于红球菌属(Rhodococcus)、戈登菌属(Gordona)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)的微生物菌体。此外，还可举例引入了这些微生物的腈水合酶基因的重组微生物菌体。其中，在工业上优选红球菌属、戈登菌属及引入了这些微生物的腈水合酶基因的重组大肠杆菌及重组红球菌属细菌。例如，作为红球菌属微生物的具体实例，可举例日本特公平6-55148号公报记载的紫红红球菌J-1株(RhodococcusrhodochrousJ-1)。该株以委托编号“FERMBP-1478”于1987年9月18日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6(本说明书中下同))中。

所谓腈水合酶是指具有水解腈化合物、生成对应的酰胺化合物的能力的酶。作为编码腈水合酶的核酸及其序列的实例，可举例前述专利文献2记载的例子。这类核酸通过通常的分子生物学方法即可导入微生物细胞内(有关这些分子学的方法，参考如下：Sambrook，FritschandManiatis，“MolecularCloning：ALaboratoryManual”2ndEdition(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。

以干燥菌体计，保存时的菌体混悬液的浓度为4质量％以上，优选5质量％以上。现已知在不足4质量％的低浓度的情况时，在室温下的活性降低。考虑其原因，认为若在菌浓度高达一定程度的液体中的密集状态下，在菌体表面具有抑制其它菌的生长发育的机能，或是具有某种抑制其它菌体生长发育的物质。在不足4质量％的低浓度的情况下，不能出现这种效果，混悬液中杂菌易发生增殖，认为由于杂菌生成的氮氧化物等而使菌体遭受损伤。且在不足4质量％的低浓度的情况下，认为由于粘度较低，因此菌体可以自由地做布朗运动，菌体之间的冲突频发，菌体自身损伤，酶活力下降。

因此，通过使菌浓度在4质量％以上，室温下的保存稳定性变得良好，但若超过20质量％，菌体混悬液的流动性降低，因此作为液体的处理变困难，不适于保存·搬运。故，以干燥菌体计，保存时的菌体混悬液的浓度为4～20质量％、优选5～15质量％、更优选5～10质量％。

所谓“干燥菌体”是指在实质上不含有水的微生物菌体的干燥物，但某些场合下含有菌体以外的残存混悬液成分。干燥菌体例如通过使菌体混悬液在120℃的干燥器中干燥3小时而获得。

所谓“干燥菌体浓度(干燥菌体质量(％))”是用菌体混悬液中含有的菌体干燥质量的比率来表示的，具体而言，从菌体混悬液在120℃的干燥机中干燥3小时的干燥前后的质量比(百分率：(菌体干燥残渣比例“％”))中减去将菌体混悬液分离为微生物菌体层和实质上不含有菌体的液层时的该液层同样地干燥时的干燥前后的质量比(百分率：上清盐浓度“％”)而求得的。

本发明中的“保存”是指在储罐和容器中保管菌体混悬液。此时，为了不使储罐和容器内的浓度不均匀，可进行搅拌和通气。在不易形成浓度分布的菌体混悬液的情况下，不进行搅拌和通气，静置即可。在本发明中，因为不需要搅拌和通气，故优选静置。

本发明中的“静置”是指不进行搅拌和通气，将菌体混悬液保存在储罐和容器中。保存可在室温下进行。但为了抑制菌体及酶的腐败·分解，优选在分解介质不冻结的范围内的较低温。具体而言，指冰点～35℃，优选冰点～30℃，更优选冰点～20℃，进一步优选冰点～10℃。此处，所谓“冰点”是指菌体混悬液的固体状态和液体状态的平衡温度，是依照混悬液的组成(分散介质的种类、浓度、菌体的浓度等)和保存容器内的压力不同而变化的温度。因此，菌体混悬液在冰点以上的温度下保存时，维持不冻结的状态。

保存时间可以为1日以上，但本发明的效果在保存3日以上的情况下比较显著，故可优选3日以上、更优选5日以上的长期保存。

依照本发明的方法保存微生物菌体时，前述微生物菌体的腈水合酶的活性在保存前后并无实质上的变化。所谓微生物菌体的腈水合酶的活性“在保存前后并无实质性的变化”是指相对于保存前的腈水合酶的活性，保存后的腈水合酶的活性维持在70％以上，优选维持在75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、100％以上。

腈水合酶的活性可以使用本技术领域内公知的任一方法进行测定，例如，可以通过比较保存开始前和保存后对基质(例如，丙烯腈)的丙烯酰胺生成反应速度等来测定。

在本发明中，所谓混悬液的分散介质是指在作为保存对象的微生物菌体的混悬中所使用的溶液。该分散介质优选有机酸的水溶液。该有机酸水溶液的有机酸浓度是任意的，但过低时会导致酶活性的降低，另一方面，过高时会导致后续过程中将其除去时的工序繁杂，故优选10～100mM。

在本发明中的分散介质的组成，只要是不阻碍酶活性的有机酸水溶液即可，并无特别的规定。作为有机酸，可列举例如，丙烯酸、甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸等羧酸类，其中，从维持丙烯酰胺的品质这一点考虑，优选丙烯酸。

在本发明的混悬液的配制中，具有腈水合酶活性的微生物菌体可以使用该技术领域内公知的任一浓缩方法进行浓缩，但优选膜分离或离心分离来进行浓缩。使用膜分离进行浓缩的情况下，优选使用具有0.02～0.45μm孔径的膜。此类膜可以为市售的，可列举例如中空纤维膜组件(Kuraray会社，细孔径0.05μm，表面积39000m²)等。此外，使用离心分离进行浓缩的情况下，优选使用分离板型连续离心分离机。

以下，使用实例对本发明的实施方法进行更加详细的说明，但这些实施例的目的是本发明的示例，而本发明并不仅限于此。在以下的实施例及比较例中的％表示的是质量％。

实施例

实施例1(室温保存)

培养

在500ml的三角烧瓶中配制含有葡萄糖2％、尿素1％、蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、氯化钴0.05％的培养基(PH7.0)100ml，通过高压釜于121℃下灭菌20分钟。在此培养基中接种具有腈水合酶活性的紫红红球菌J-1株(RhodococcusrhodochrousJ-1：FERMBP-1478)，在30℃、230rpm下培养66小时。

菌体混悬液的干燥菌体质量测定

将培养后的菌体混悬液约1g采集至铝盘中并称量。并在12000rpm下将菌体缓冲液离心分离20分钟，用滤膜(Advantec社，细孔径0.45μm)过滤上清10g，置于铝盘中并称量。分别通过干燥器(Yamato科学会社生产，DN63)于120℃下干燥3小时后，对它们进行称量。对于菌体混悬液和上清，将干燥后的质量用相对于干燥前的质量的百分率表示，求出干燥菌体质量。

保存用菌体混悬液的配制

通过离心分离(1200rmp，20分钟)将培养后的微生物菌体沉淀后，使用0.1％的丙烯酸钠水溶液(pH7.0)再混悬·再离心分离，反复操作3次后，再次使用0.1％的丙烯酸钠水溶液(pH7.0)将沉淀菌体混悬，得到以干燥菌体质量为8.0％的菌体混悬液(实施例1)。将此菌体混悬液的一部分用0.1％的丙烯酸钠水溶液稀释，得到干燥菌体质量为3.4％的菌体混悬液(比较例1)。

腈水合酶活性的测定、

腈水合酶的活性如下得到：使用通过上述方法刚刚配制的菌体混悬液(第0日)和同样地配制的菌体混悬液在室温(15～20℃)下静置、保存5日而得到的混悬液(5日后)，通过这些混悬液内含有的菌体引起的丙烯酰胺生成反应速度来计算。将作为基质的丙烯腈的水溶液添加至菌体混悬液中即可启动反应，10℃下震荡10分钟后，通过菌体的过滤分离和磷酸的添加而终止反应，用气相色谱仪(GC-14B，岛津制作所)进行分析。分析条件为使用填充了PorapackPS(Waters会社)的1m玻璃柱，柱温为210℃，检测器用230℃的FID。

本发明中的腈水合酶的酶活性用1分钟内1mg菌体产生的丙烯酰胺的量(μmol)来测定，以下以0日的反应速度为100％的相对反应速度比在表1中显示。

[表1]

	干燥菌体质量(％)	第0日(％)	5日后(％)
				实施例1	8.0	100	100
比较例1	3.4	100	84

实施例2及3(30℃保存)

培养

除了使用3L的发酵罐(高衫制作所生产)来代替500ml的三角烧瓶以外，和实施例1一样地进行培养。

菌体混悬液的干燥菌体质量测定

用和实施例1同样的方法来测定菌体混悬液的干燥菌体质量。保存用菌体混悬液的配制

将培养后的微生物菌体使用中空纤维膜组件(Kuraray会社，细孔径0.05μm，表面积39000m²)进行浓缩后，用0.1％丙烯酸钠水溶液(pH7.0)进行洗涤，再度浓缩至干燥菌体质量为10.0％，配制出10.0％干燥菌体质量的菌体混悬液(实施例2)。将此菌体混悬液的一部分使用0.1％的丙烯酸水溶液进行稀释，配制出干燥菌体质量为5.0％(实施例3)、2.5％(比较例2)、0.2％(比较例3)的菌体混悬液。腈水合酶活性的测定

除了保存时的温度为30℃以外，用和实施例1一样地进行试验。以在0日的反应速度为100％的3日后的相对反应速度比在表2中显示。

[表2]

	干燥菌体质量(％)	第0日(％)	3日后(％)
				实施例2	10.0	100	100
实施例3	5.0	100	100
				比较例2	2.5	100	85
比较例3	0.2	100	66

实施例4及5

具有紫红红球菌M8株来源的腈水合酶的转化体的制备。

(1)由紫红红球菌M8株(以下简称M8株)制备染色体DNAM8株(SU1731814)可以从微生物生化学生理学研究所(InstituteofBiochemistryandPhysiologyofMicroorganisms：IBFM、Pushchino，142290，MoscowRegion，亚洲)(委托编号：VKPMS-926)购得。

将M8株培养于100ml的MYK(0.5％多聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物(バクトイ一ストエキス)、0.3％Bacto麦芽提取物(バクトモルトエキス)、0.2％K₂HPO₄、0.2％KH₂PO₄)培养基(pH7.0)中，在30℃下震荡培养72小时。离心分离培养液，将收集的菌体混悬于4ml的Saline-EDTA溶液(0.1MEDTA、0.15MNaCl(pH8.0))中。在混悬液中加入8mg的溶菌酶，于37℃下震荡1～2小时后，于-20℃下冻结。

随后，向该混悬液中将10ml的Tris-SDS液(1％SDS、0.1MNaCl、0.1MTris-HCl(pH9.0))一边温和地震荡一边加入。随后，在该混悬液中加入蛋白酶K(Merck会社)(终浓度0.1mg)并于37℃下震荡1小时。随后，加入等量的TE饱和苯酚并搅拌后(TE：10mMTris-HCl、1mMEDTA(pH8.0))离心。收集上层、加入2倍量的乙醇，用玻璃棒缠取DNA。随后，依次使用90％、80％、70％的乙醇对此进行离心分离以去除苯酚。

然后，用3ml的TE缓冲液溶解DNA，加入核糖核酸酶A溶液(已进行100℃、15分钟的加热处理)，使其终浓度为10μg/ml，于37℃下震荡30分钟。随后，加入蛋白酶K(Merck会社)，于37℃下震荡30分钟。加入和此等量的TE饱和苯酚进行离心分离后，分离上层和下层。

在上层中继续加入等量的TE饱和苯酚进行离心分离后，分离上层和下层。再次重复此操作。随后，在上层中加入等量的氯仿(4％异戊醇)进行离心分离，回收上层。而后，在上层中加入2倍量的乙醇，使用玻璃棒缠取DNA并回收，得到染色体DNA。

(2)使用PCR由M8株染色体DNA制备腈水合酶基因

在非专利文献(Veiko，V.P.等，Cloning，nucleotidesequenceofnitrilehydratasegenefromRhodococcusrhodochrousM8，Biotekhnologiia(Mosc.)5，3-5(1995))中记载有M8株来源的腈水合酶。M8来源的腈水合酶的β亚基、α亚基、激活蛋白的氨基酸序列分别用序列编号2、序列编号4、序列编号6来表示。此外，编码这些氨基酸序列的核苷酸序列分别用序列编号1、序列编号3、序列编号5来表示。以这些核苷酸序列信息为基础，合成下述的M8-1及M8-2引物，以(1)中提取的染色体DNA为模板进行PCR。

<PCR反应液的组成>

模板DNA(染色体DNA)200ng

PrimeSTARMaxPremix(宝酒造会社生产)25μl

引物M8-110pmol

引物M8-210pmol

<引物>

M8-1：5’-ggtctagaatggatggtatccacgacacaggc-3’(序列编号7)

M8-2：5’-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3’(序列编号8)

<反应条件>

(98℃10秒、55℃5秒、72℃下30秒)×30个循环

PCR结束后，取反应液5μl进行0.7％琼脂糖凝胶(使用同仁化学社产琼脂糖I；琼脂糖浓度为0.7重量％)电泳，检测1.6kb的扩增片段。使用WizardSVGelandPCRClean-UpSyste(Promega株式会社)对反应结束液进行精制。

使用LigationKit(宝酒造)将回收的PCR产物连接在载体上(pUC118/HincII部位)，使用反应液对大肠杆菌JM109的感受态细胞进行转化。从得到的转化体菌落中取出数个克隆，接种于1.5ml的LB-Amp培养基中，于37℃下震荡培养12小时。培养后，将此培养物离心分离来收集细菌。使用QIAprepSpinMiniprepKit(Amersham生物科学社)从收集的菌体中提取质粒DNA。对于得到的质粒DNA，使用序列试剂盒和自动序列分析仪CEQ8000(Beckmancoulter社)来确定腈水合酶的碱基序列。

随后，将得到的质粒DNA使用限制性内切酶XbaI和Sse8387I切断后，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳，回收腈水合酶基因片段(1.6kb)，导入质粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位点。

将得到的质粒命名为pSJ-N01A。

此外，pSJ042作为在红球菌中表达J1株腈水合酶的质粒，使用日本特开2008-154552号公报所示的方法制备。在pSJ042制备中使用的pSJ023作为转化体ATCC12674/pSJ023(FERMBP-6232)于平成9年3月4日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1路1号1中央第6)。

(3)感受态细胞的制备

将紫红红球菌ATCC12674株(以下简称ATCC12674株)培养于MYK培养基中直至数增殖前期，用离心分离机收集细菌，冰浴后用灭菌水洗涤3次，混悬于灭菌水中，制备成感受态细胞。

(4)具有M8株来源的腈水合酶的转化体的制备

将得到的质粒pSJ-N01A0.1μg和ATCC12674株的感受态细胞的菌体混悬液各20μl混合，分别冰浴。在试管中加入各混合液，用基因导入装置GenePulser(BIORAD)进行20KV/cm、200OHMS进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰浴下静置10分钟，于37℃下进行10分钟的热休克处理。随后，在试管中加入MYK培养基500μl，于30℃下静置5小时后，涂布于加入了50μg/ml的卡那霉素的MYK琼脂培养基上，于30℃下培养3日。

对得到的转化体菌落内含有的质粒DNA进行确认，此转化菌为具有M8株来源的腈水合酶的红球菌属重组菌(ATCC12674/pSJ-N01A)。

培养

和实施例1一样地培养，得到重组菌体混悬液(干燥菌体2重量％)。

保存用菌体混悬液的配制

在培养后的微生物培养液中加入终浓度为0.5重量％的氯化苄乙胺进行搅拌，于4℃下静置3日，通过沉淀分离菌体和上清。分离后的菌体使用50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)混悬，离心分离(12000rpm，20分钟)沉淀后使用0.1％的丙烯酸水溶液(使用NaOH调整为pH7.0)再次混悬，得到干燥菌体质量为5.4％的菌体混悬液(实施例4)。将此菌体混悬液的一部分使用0.1％的丙烯酸水溶液(使用NaOH调整为pH7.0)稀释，得到干燥菌体质量为4.0％的菌体混悬液(实施例5)和1.0％的菌体混悬液(比较例4)。

腈水合酶活性的测定

关于腈水合酶的活性，使用通过上述方法刚刚配制后的菌体混悬液(第0日)和同样地配制的菌体混悬液通过于30℃下静置保存5日(5日后)的混悬液，和实施例1一样地测定·计算。下面以0日的反应速度作为100％的相对反应速度比在表3中显示。

[表3]

从上述实施例1到4的结果可以知道，使用本发明的混悬液，即使在室温以上保存具有腈水合酶活性的微生物菌体时，也可以使微生物菌体的腈水合酶维持保存前的活性。

[委托编号]

紫红红球菌J-1株(RhodococcusrhodochrousJ-1)：委托编号为“FERMBP-1478”，于1987年9月18日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)中。

R.rhodochrousATCC12674/pSJ023：委托编号为“FERMBP-6232”，于1997年3月4日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1路1号地1中央第6)中。

[序列表自由文本]

序列编号7：合成DNA

序列编号8：合成DNA

Claims (5)

1.微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体以干燥菌体质量为4～10质量％的浓度保存在分散介质中，所述微生物菌体为属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物菌体，所述分散介质是丙烯酸水溶液。

2.权利要求1的方法，其中，前述保存方式是在35℃以下且不冻结的状态下静置保存。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，前述微生物菌体的腈水合酶活性在保存前后并无实质性变化。

4.权利要求1的方法，其中，具有腈水合酶活性的微生物为紫红红球菌J-1株(RhodococcusrhodochrousJ-1)，其委托编号为FERMBP-1478，或紫红红球菌M8株，其委托编号为VKPMS-926。

5.微生物菌体的混悬液，其以干燥菌体质量为4～10质量％的菌体浓度在分散介质中保存具有腈水合酶活性的微生物菌体，所述微生物菌体为属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物菌体，所述分散介质是丙烯酸水溶液。