CN102884199A - 使用了微生物催化剂的丙烯酰胺的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过作为微生物源酶的腈水合酶的作用由丙烯腈更有效地制造丙烯酰胺的方法。更具体而言，本发明提供使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括按照丙烯腈的温度低于30℃的方式冷却和保管丙烯腈的工序。另外，本发明还提供一种使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺的制造装置。

Description

使用了微生物催化剂的丙烯酰胺的制造方法

技术领域

本发明涉及通过作为微生物源酶的腈水合酶的作用由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法。更详细而言，本发明涉及通过腈水合酶的作用由保管在低于30℃的温度下的丙烯腈制造丙烯酰胺的方法以及装置。

背景技术

丙烯酰胺作为产业上的重要物质而应用于广大领域中。例如，丙烯酰胺的聚合物广泛应用于废水处理用絮凝剂、纸力增强剂、石油回收剂等。丙烯酰胺以往在工业上以还原状态的铜为催化剂对相应丙烯腈进行水合而制造，近年来，开发了使用生物催化剂(微生物催化剂)来代替铜催化剂的方法，其一部分已经实用化。生物催化剂法因兼具反应条件温和、几乎没有副产物、工艺极简单，作为工业制法是最有希望的，至今为止，发现了多种含有作为酶的腈水合酶的微生物，所述腈水合酶具有将丙烯腈水合而转换成丙烯酰胺的催化能力。

作为使用了微生物催化剂的丙烯酰胺的制造方法，可列举出专利文献1~3中记载的方法，作为反应方法，可列举出专利文献4中记载的方法等。

关于有效的反应方法，也进行了大量研究(专利文献5~9)。

另外，为了更有效地制造高性能的丙烯酰胺，还针对对丙烯腈进行处理或者使用杂质少的丙烯腈进行了各种研究(专利文献10~15)。

然而，关于保存或贮藏丙烯腈时的温度，记载了按照通常的MSDS(材料安全数据表，Material Safety Date Sheet)等在冷暗处保管(例如，非专利文献1)，但关于丙烯腈保存温度对丙烯酰胺水合反应的影响，至今为止没有研讨过。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平11-123098号

专利文献2：日本特开平7-265091号

专利文献3：日本特公昭56-38118号

专利文献4：日本特开平11-89575号

专利文献5：日本特表2004-524047号

专利文献6：中国专利申请公开1482250号

专利文献7：国际公开第2007/097292号

专利文献8：国际公开第2007/132601号

专利文献9：国际公开第03/000914号

专利文献10：日本特开平9-227478号

专利文献11：日本特开2000-016978号

专利文献12：日本特开平11-123098号

专利文献13：日本特开2001-288156号

专利文献14：国际公开第2007/043466号

专利文献15：国际公开第2004/090148号

非专利文献

非专利文献1：制品安全数据表丙烯腈DIA-NITRIX CO.,LTD.制作

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供制造高浓度的丙烯酰胺的方法和装置。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，关于丙烯腈的保存温度与使用该丙烯腈作为原料的丙烯酰胺的生成反应的效率之间的关系，如果使用在低于30℃的温度下保管的丙烯腈，则能够以更少的催化剂量制造浓度更高的丙烯酰胺，从而完成了本发明。

即，本发明如下所示。

(1)一种使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括：

按照丙烯腈的温度低于30℃的方式冷却和保管丙烯腈的工序。

(2)一种丙烯酰胺制造装置，所述制造装置使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺，具备用于将丙烯腈的温度维持在低于30℃的温度调节机构。

发明的效果

如果使用在低于30℃的温度下保存的丙烯腈，则能够以更少的催化剂量制造浓度更高的高品质丙烯酰胺。即，与以往的制造方法相比，在本发明的制造方法中，每单位催化剂量的化合物的产量(即催化剂的生产效率(以下，也简称为“生产率”))显著增加。

而且，可以降低由生物催化剂或用于将其悬浊的液体带入的、或者提取出的各种有机系杂质(糖类、蛋白质)和/或无机系杂质(矿物质类)，可以得到浓度更高的丙烯酰胺。

附图说明

图1是本发明的丙烯酰胺制造装置中使用的具备丙烯腈冷却机构的贮存装置的说明立体图。

图2是表示具备丙烯腈贮存装置的丙烯酰胺制造装置的概略的说明图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明。以下的实施方式仅作为用于说明本发明的例示，本发明不受该实施方式的限制。本发明在不脱离其宗旨的范围内，可以通过各种方式实施。

本说明书包含作为本申请优先权基础的日本特愿2010-106562号说明书(申请日：2010年5月6日)的内容。关于本说明书中引用的所有出版物、例如、技术文献和公开公报、专利公报以及其它专利文献，将其整体作为本说明书的参考而援引于此。

使用了生物催化剂的丙烯酰胺的制造方法可以是利用连续反应而进行的方法(使丙烯酰胺连续生成的方法)，也可以是利用间歇式反应而进行的方法(使丙烯酰胺非连续地生成的方法)，对此没有限定，优选利用连续反应而进行的方法。

此处，利用连续反应而进行的方法是指一边连续或间歇地供给反应原料(包括生物催化剂和丙烯腈)和连续或间歇地取出反应混合物(包括生成的丙烯酰胺)，一边连续地制造丙烯酰胺而不将反应器内的反应混合物全部抽出的方法。

反应中的丙烯腈浓度根据所使用的生物催化剂的种类、形态而异，优选为0.5~15.0重量%左右。

利用连续反应进行本发明的制造方法时，按照可以连续地制造而不将反应器内的反应混合物全部抽出的方式，并考虑丙烯腈和生物催化剂的导入速度而决定从反应器中取出反应混合物时的流体速度。

本发明所使用的生物催化剂中包含含有催化目标反应的酶(即，腈水合酶)的动物细胞、植物细胞、细胞器、菌体(活菌体或死灭体)或其处理物。作为处理物，包含从细胞中提取的粗制酶或纯化酶，进而包含用包埋法、交联法、载体结合法等将动物细胞、植物细胞、细胞器、菌体(活菌体或死灭体)或酶自身固定化而成的产物。优选的是，具有腈水合酶的生物催化剂是指用包埋法、交联法、载体结合法等将包含具有腈水合酶活性的酶的菌体或其处理物或菌体或酶自身固定化而成的产物。此处，作为包埋法，可列举出将菌体或酶包入高分子凝胶的微细格子中或用半透膜性的高分子皮膜包覆的方法，作为交联法，可列举出将酶用具有两个或两个以上官能团的试剂(多官能性交联剂)进行交联的方法，作为载体结合法，可列举出使酶与水不溶性的载体结合的方法。作为固定化载体，有玻璃微珠、硅胶、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜胶(carrageenan)、海藻酸、琼脂以及明胶等。

在将菌体固定化的方法之中，由于包埋固定化法可以得到菌体浓度高的固定化菌体，因此在工业上较常用。例如，日本特公昭58-35078、日本特开平7-203964中示出了将丙烯酰胺和/或丙烯酰胺的衍生物用作包埋固定化用单体的例子。

作为本发明所指的具有腈水合酶活性的微生物，可优选列举出属于芽孢杆菌(Bacillus)属、无芽孢杆菌(Bacteridium)属、微球菌(Micrococcus)属、短杆菌(Brevibacterium)属〔日本特公昭62-21519号〕、棒状杆菌(Corynebacterium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属〔日本特公昭56-17918号〕、假单胞菌(Pseudomonas)属〔日本特公昭59-37951号〕、微杆菌(Microbacterium)属〔日本特公平4-4873号〕、红球菌(Rhodococcus)属〔日本特公平4-4873号、日本特公平6-55148号、日本特公平7-40948号〕、无色杆菌(Achromobacter)属〔日本特开平6-225780〕、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属〔日本特开平9-275978号〕的微生物，但不限定于这些。更优选红球菌(Rhodococcus)属细菌。作为更优选的菌体，可列举出紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株(FERM BP-1478)。

具有腈水合酶活性的紫红红球菌Rodococcus rhodochrous

J1株以保藏号：FERM BP-1478于1987年9月18日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际保藏。

其中，委托保藏者的信息如下所示。

名称：山田秀明

地址：京都府京都市左京区松崎木之本町19番地1

另外，也可以使用：取得前述微生物源的腈水合酶基因，直接或人为地进行改良，将该基因导入任意宿主而成的转化体。

作为前述转化体，可例示出：用无色杆菌(Achromobacter)属的腈水合酶进行转化的大肠杆菌MT 10770(FERMP-14756)(日本特开平8-266277号)、用假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属的腈水合酶进行转化的大肠杆菌MT10822(FERM BP-5785)(日本特开平9-275978号)或者用紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)种的腈水合酶(日本特开平4-211379号)进行转化的微生物。进而，还可以按照上述文献中记载的方法或其他公知方法(分子克隆，实验室手册第二版(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))；分子生物学的现有草案(Current Protocols in Molecular Biology),(JohnWiley&Sons(1987-1997))，制作所期望的转化体。在本发明的方法中，只要可表达腈水合酶基因，则可以使用任意的转化体来作为生物催化剂。

生物催化剂的用量根据所使用的生物催化剂的种类和/或形态而异，优选以在反应温度10℃下每mg干燥菌体达到50~200U左右的方式调整向反应器中导入的生物催化剂的活性。其中，前述单位U(unit)是指1分钟内由丙烯腈生成1微摩尔的丙烯酰胺，是使用制造中使用的丙烯腈测定而得到的值。与使用了在30℃以上保管的丙烯腈的丙烯酰胺的制造方法中使用的生物催化剂的量相比，本发明的制造方法能够以更少的量进行反应，或者以等量的生物催化剂的量制造更多的丙烯酰胺。

在本发明中，保管原料丙烯腈是指，例如在丙烯酰胺制造设备附带的丙烯酰胺保管贮存设备中，将丙烯腈保管一定时间以上(例如，1天以上，优选为3天以上，更优选为7天以上)。作为保管贮存设备，有保管包含丙烯腈的桶的设备和贮存丙烯腈的罐等，工业上制造丙烯酰胺时，通常优选丙烯腈贮存罐。

丙烯腈的贮存设备优选具有遮光性、氧隔绝性、防火性、抗静电性、防振性等，进而，理想的是具备可以使贮存环境处于密闭且可以根据情况排气/换气的机构。贮存形态只要能够确保丙烯腈的稳定性则没有特别限定，为了提高丙烯腈的稳定性，可以任选添加稳定剂。

按照丙烯腈的温度低于30℃的方式冷却和保管是指，在夏季、高温地域贮存丙烯腈时，以内部的丙烯腈温度不会达到30℃以上的方式进行冷却和保管。

本发明还提供设置有用于冷却和保管丙烯腈的冷却装置的丙烯酰胺制造装置(设备)。作为用于防止内部温度上升的冷却装置，只要是可使用冷却用流体冷却丙烯腈的装置则没有特别限定。对冷却用流体没有特别限定，较之气体，通过使用热容量大的液体可以更有效地冷却丙烯腈。

特别是，冷却用液体之中优选使用成本低且容易处理的水。

上述那样的具备罐的冷却设备可以用各种方法冷却丙烯腈。作为丙烯腈的贮存罐的冷却机构，例如可列举出向罐的表面喷洒水或冷却水的机构、设置于罐壁的冷却用夹套机构或者在罐壁或罐内部设置蛇管并使冷却水、乙二醇水溶液等冷却用溶液(冷媒)在蛇管内部流通的机构等。冷却水或冷媒可以循环反复使用，在喷洒廉价且不影响环境的水时，也可以不重复使用而直接排水。

以下，针对具备喷水设备的丙烯腈的贮存装置，使用图1进行更详细的说明。需要说明的是，图1所示那样的丙烯腈的贮存装置仅为一个例子，丙烯腈的冷却方法不限定于以下的说明。

如图1所示那样，丙烯腈的贮存装置2具备能够组装到丙烯酰胺的制造装置30(参照图2)的构成，用于贮存丙烯腈的贮存罐4具备用于将容纳于该罐4的丙烯腈冷却至例如低于30℃的冷却机构10。

贮存罐4由金属等导热度高的材料形成，罐表面实施了耐腐蚀加工以使其不被水等腐蚀。

作为贮存罐4的冷却机构，可以使用内部蛇管式或夹套式，从运转成本等低等方面出发，冷却机构优选使用喷水方式。喷水方式的冷却机构10具备温度检测部12、冷却水阀16等。在可以根据经验通过外界气温、天气等气候条件推测丙烯腈的温度的情况下，也可以不使用温度检测部12。

在使用具有温度检测部12的冷却机构10时，基于由温度检测部12输入的温度信息反馈控制丙烯腈的温度，温度调节部14基于温度信息控制冷却水阀16的开关，调节丙烯腈的温度。从冷却水源供给的冷却水使用例如温度调节至5℃~20℃的经冷却的水或乙二醇水溶液，或者在可廉价地获取工业用水等的情况下，直接使用工业用水。使用工业用水时，可以进行排水而不回收所喷洒的水。

贮存罐4的上部设置有用于喷洒冷却水的、例如形成为环状的喷水环4a，从冷却水源经由冷却水供给管20向喷水环4a供给冷却水。喷水环在外圆周上穿通有小喷水孔18，以便使水均匀地润湿贮存罐4的表面。由喷水环4a介由喷水孔18喷洒的冷却水在流过例如贮存罐4表面的同时冷却罐表面，由此来冷却贮存罐4内的丙烯腈。只要能够冷却贮存罐4，则对喷水环4a的大小、喷水孔18的尺寸没有特别限定，例如，可以将喷水环4a的直径设为40mm，在该喷水环4a上以75mm的间隔设置直径3.5mm的喷水孔18。

作为冷却水阀16的驱动形式，例如可列举出以下形式等：在温度检测部12检测的丙烯腈的温度超过阈值(例如，25℃)时打开冷却水阀16，向贮存罐4侧供给冷却水，而在所检测的丙烯腈的温度处于阈值以下时关闭冷却水阀16。

通过这样打开冷却水阀16向贮存罐4侧供给冷却水，可以将贮存罐4内贮存的丙烯腈维持在低于30℃。

接着，使用图2说明具有丙烯腈的贮槽装置的丙烯酰胺的制造装置。需要说明的是，关于丙烯腈的贮存装置，与图1所例示的贮存装置相同的部分赋予相同的符号，仅作简单说明而省略其详细说明。

如图2所示那样，丙烯酰胺的制造装置30具备丙烯腈的贮存装置2、反应器36、分离器39、丙烯酰胺贮留罐43、冷却水供给部45等。

冷却水供给部45可以经由冷却水路向反应器36供给冷却水，反应器36能够通过所供给的冷却水进行冷却。从反应器36排出的冷却水经由冷却水路返回至冷却水供给部45。

制造装置30中，从丙烯腈的贮存罐2经由供给线47向反应器36供给丙烯腈，供给于反应器36的丙烯腈例如通过搅拌桨36a与生物催化剂混合，利用腈水合酶反应生成丙烯酰胺。从反应器36中排出混合了丙烯酰胺的反应混合液，所排出的反应混合液供给于以例如离心分离机等为代表的分离器39。

从供给于分离器39的反应混合液中分离丙烯酰胺，所分离的丙烯酰胺被贮留在丙烯酰胺的贮留罐43中，所分离的生物催化剂以废催化剂的形式被废弃。

罐4内的丙烯腈的温度被控制在例如25℃以下，将这样调节过温度的丙烯腈供给于反应器36中，从而可以高效地生产丙烯酰胺，另外，可以提供高品质的丙烯酰胺。

需要说明的是，针对上述冷却时的阈值，作为一例例示出了25℃，但阈值不限于此，可以按照腈水合酶反应所使用的生物催化剂的性质、反应时的温度进行适当变更。特别是有时微生物的腈水合酶活性水平会因各种条件而变动，在这种情况下，理想的是，基于其条件确定反应温度，灵活地变更丙烯腈冷却时的阈值的设定。

如上所述，本发明的丙烯酰胺制造装置可以将丙烯腈维持在低于30℃的温度下，而使其不受该装置所处的外部环境温度(周围温度)影响。例如，对于具备使用冷却水的冷却机构的制造装置而言，该装置的周围温度高于适合于丙烯酰胺的生产的温度时，可以更积极地使用冷却水。此时，优选预先监测丙烯腈的温度，但也可以不进行监测而根据气温和/或阳光的照射进行判断并使冷却机构运转。另外，还可以省略控制冷却水供给的阀或泵，而使低于30℃的一定温度的冷却水在丙烯腈的贮存罐内持续循环等，从而将丙烯腈维持于低于30℃。通过这样的结构也可以高效地生产丙烯酰胺。

实施例

以下列举实施例更具体地说明本发明，但本发明不受它们的限制。

[实施例1和2]：使用在20℃或28℃下进行保管的丙烯腈制造丙烯酰胺

(丙烯腈的保管)

将丙烯腈(DIA-NITRIX CO.,LTD.制造)放入500mL的玻璃瓶中，在调整至20℃和28℃的恒温槽中分别保管7天。

(生物催化剂的制备)

利用包含葡萄糖2%、尿素1%、胨0.5%、酵母提取物0.3%、氯化钴0.05%(均为重量%)的培养基(pH7.0)在30℃下对具有腈水合酶活性的紫红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）J1(FERMBP-1478)进行需氧培养。使用离心分离机对其进行分离，用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，得到菌体悬浊液(干燥菌体15重量%)。

(由丙烯腈至丙烯酰胺的反应)

向1L的附带夹套的可拆式烧瓶中加入664g去离子水，将水温控制在18℃。30分钟后，添加0.8g之前得到的菌体悬浊液，在180rpm搅拌下，连续地添加丙烯腈以使丙烯腈的浓度总是保持2%，开始制造丙烯酰胺。

其结果，在使用以20℃或28℃中的任一温度进行保管的丙烯腈的情况下，从开始添加丙烯腈起25小时内所生成的丙烯酰胺的浓度均达到45%，达到目标。

〔比较例1〕

除了使用以35℃进行保管的丙烯腈之外，与实施例1同样地实施，25小时时丙烯酰胺浓度仅达到42%。因此，将菌体的添加量设为0.9g时，25小时时达到45%。

以上示出，与使用在30℃以上的温度下进行保管的丙烯腈的情况相比，使用在低于30℃的温度下进行保管的丙烯腈能够以更少的生物催化剂量制造丙烯酰胺。

[实施例3]：具有紫红红球菌M8株源的腈水合酶的转化体的制作

(1)由紫红红球菌M8株(以下，称为M8株。)制备染色体DNA

M8株(SU 1731814)可以从俄罗斯菌株中心IBFM(VKPMS-926)获取。

在100ml的MYK(0.5%多聚蛋白胨、0.3%Bacto酵母提取物、0.3%Bacto麦芽提取物、0.2%K₂HPO₄、0.2%KH₂PO₄)培养基(pH7.0)中在30℃下对M8株进行72小时振荡培养。对培养液进行离心分离，将所收集的菌体悬浊在4ml Saline-EDTA溶液(0.1MEDTA、0.15M NaCl(pH8.0))中。向悬浊液中加入8mg溶菌酶，在37℃下振荡1~2小时后，在-20℃下冻结。

接着，边平稳地振荡边向该悬浊液中加入10ml的Tris-SD S液(1%SD S、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0))。进而，向该悬浊液中加入蛋白酶K(Merck&Co.)(终浓度0.1mg)，在37℃下振荡1小时。接着，加入等量的TE饱和苯酚，搅拌后(TE：10mMTris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))进行离心。采取上层，加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA。其后，将其依次用90%、80%、70%的乙醇离心分离，去除苯酚。

接着，将DNA溶于3ml的TE缓冲液，添加核糖核酸酶A溶液(100℃，进行了15分钟的加热处理)以使该核糖核酸酶A达到10μg/ml，在37℃下振荡30分钟。进而，加入蛋白酶K(Merck&Co.)，在37℃下振荡30分钟。向其加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成上层和下层。

进一步在上层中加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成上层和下层。再次重复该操作。其后，在上层中加入等量的氯仿(含4%异戊醇)，进行离心分离，回收上层。接着，在上层中加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA并进行回收，得到染色体DNA。

(2)使用PCR由M8株染色体DNA制备腈水合酶基因

M8株源的腈水合酶在Veiko,V.P.et al,Cloning,nucleotidesequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcusrhodochrous M8,Biotekhnologiia(Mosc.)5,3-5(1995)中有所记载，β亚基、α亚基、激活剂的序列示于表1。

[表1]

M8菌株	碱基序列	氨基酸序列
			β-亚基	序列号1	序列号2
α-亚基	序列号3	序列号4
			激活剂	序列号5	序列号6

基于上述序列信息，合成引物M8-1和M8-2，以(1)中制备的染色体DNA为模板进行PCR。

＜引物＞

M8-1：GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC(序列号7)

M8-2：CCCCTGCAGGTCAGTCGATGATGGCCATCGATTC(序列号8)

＜PCR反应溶液组成＞

模板DNA(染色体DNA)200ng

PrimeSTAR Max Premix(宝酒造公司制造)25μl

引物M8-110pmol

引物M8-210pmol

＜反应条件＞

(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下30秒)×30个循环

PCR结束后，将5μl反应液供于0.7%琼脂糖凝胶(使用同仁化学公司制造的Agarose I；琼脂糖浓度0.7重量%)电泳，进行1.6kb的扩增片段的检测。反应结束液体使用Wizard SV Gel and PCRClean-Up Syste(Promega KK.)进行了纯化。

使用连接试剂盒（Ligation Kit）(宝酒造公司)将所回收的PCR产物连结于载体(pUC 118/HincII位点)，利用反应液对大肠杆菌JM 109的感受态细胞进行转化。由所得转化体菌落向1.5mlLB-Amp培养基上接种数个克隆，在37℃下振荡培养12小时。培养后，通过离心分离收集该培养物的细菌。通过使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Amersham Biosciences K.K)，从所收集的菌体中提取质粒DNA。针对所得质粒DNA，使用测序试剂盒和自动测序仪CEQ 8000(Beckman Coulter,Inc.)确认腈水合酶的碱基序列。

接着，用限制性内切酶XbaI和Sse8387I将所得质粒DNA切断后，利用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，回收腈水合酶基因片段(1.6kb)，导入质粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位点。将所得质粒命名为pSJ-N01A。

另外，pSJ042为红球菌菌中表达J1株腈水合酶的质粒，用日本特开2008-154552号公报所示的方法进行制作，制作pSJ042所使用的pSJ023以转化体ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)于1997年3月4日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。

其中，保藏者的信息如下所示。

名称：Mitsubishi Rayon Co.,Ltd.

地址：东京都港区港南1丁目6番地41

(3)感受态细胞的制作

将紫红红球菌ATCC 12674株(以下，称为ATCC 12674株)用MYK培养基培养至对数增殖期前期，利用离心分离器收集细胞，用冰冷却过的灭菌水洗涤3次，并悬浊于灭菌水中，制作感受态细胞。

(4)具有M8株源的腈水合酶的转化体的制作

混合所得质粒pSJ-N01A0.1μg和ATCC12674株的感受态细胞的菌体悬浊液各20μl，分别在冰上冷却。向比色皿中加入各混合液，通过基因导入装置Gene Pulser(BIO RAD)以20KV/cm、200OHMS进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，在37℃下进行10分钟热休克。其后，向比色皿中加入500μlMYK培养基，在30℃下静置5小时后，涂布于添加了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，在30℃下培养3天。

确认所得转化体菌落中含有的质粒DNA，将该重组细菌作为具有M8株源的腈水合酶的红球菌属重组细菌(ATCC12674/pSJ-N01A)。

(5)红球菌属重组细菌的制备

与实施例1同样地进行培养，得到重组菌体悬浊液(干燥菌体6重量%)。

(6)基于重组细菌由丙烯腈至丙烯酰胺的反应

向1L的附带夹套的可拆式烧瓶中加入600g去离子水，将水温控制在25℃。30分钟后，添加5g之前得到的重组细菌(ATCC12674/pSJ-N01A)菌体悬浊液，在180rpm搅拌下，以84g/h的添加速度连续地添加预先在室温(25度以下)下进行保管的丙烯腈，开始制造丙烯酰胺。

4小时后，丙烯酰胺浓度达到40%，即达到目标。该反应的生产率约为900。

｛比较例2｝

除了使用在35℃下进行保管的丙烯腈之外，与实施例2同样地实施，4小时后丙烯酰胺浓度为38%，其后仅丙烯腈浓度上升，未达到40%，即未达到目标。

[实施例4]：具有Psedonocardia thermophila JCM3095株源的腈水合酶的转化体的制作

(1)使用PCR由pPT-DB1质粒DNA制备腈水合酶基因

pPT-DB1为日本特开平9-275978所得的包含嗜热假诺卡氏（Psedonocardia thermophila）JCM3095株(以下，称为JCM3095株。)源腈水合酶基因的质粒。

JCM3095株在日本特开平9-275978中有所记载，β亚基、α亚基、激活剂的序列示于表2。

[表2]

JCM3095菌株	碱基序列	氨基酸序列
			β-亚基	序列号9	序列号10
α-亚基	序列号11	序列号12
			激活剂	序列号13	序列号14

基于上述序列信息，合成引物PSN-1和PSN-2，以pPT-DB1质粒DNA为模板进行PCR。

＜引物＞

PSN-1：GGTCTAGAATGAACGGCGTGTACGACGTCGGC(序列号15)

PSN-2：ccCCTGCAGGTCAGGACCGCACGGCCGGGTGGAC(序列号16)

＜PCR反应溶液组成＞

模板DNA(pPT-DB 1)200ng

PrimeSTAR Max Premix(宝酒造公司制造)25μl

引物PSN-110pmol

引物PSN-210pmol

＜反应条件＞

(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下30秒)×30个循环

所得PCR产物用与实施例1(2)同样的方法制作质粒，并命名为pSJ-N02A。

(2)具有JCM3095株源的腈水合酶的转化体的制作

通过与实施例(4)同样的方法，制作具有JCM3095株源的腈水合酶的红球菌属重组细菌(ATCC12674/pSJ-N02A)。

(3)红球菌属重组细菌的制备

与实施例1同样地培养，得到重组菌体悬浊液(干燥菌体5重量%)。

(4)基于重组细菌由丙烯腈至丙烯酰胺的反应

向1L的附带夹套的可拆式烧瓶中加入700g去离子水，将水温控制在25℃。30分钟后，添加12g之前得到的菌体悬浊液，在180rpm搅拌下，以84g/h的添加速度连续地添加预先在室温(25度以下)下进行保管的丙烯腈，开始制造丙烯酰胺。

2小时后，丙烯酰胺浓度达到20%，达到目标。

｛比较例3｝

除了使用在35℃下进行保管的丙烯腈之外，与实施例5同样地实施，2小时后丙烯酰胺浓度为18%，其后仅丙烯腈浓度上升，未达到20%，未达到目标。

以上示出，即使使用转化体作为生物催化剂，与使用在30℃以上的温度下进行保管的丙烯腈的情况相比，使用在低于30℃的温度下进行保管的丙烯腈可以更高效地制造丙烯酰胺。

产业上的可利用性

根据本发明的方法，可以更有效地进行丙烯酰胺的制造。

序列表自由文本

序列号7：合成DNA

序列号8：合成DNA

序列号15：合成DNA

序列号16：合成DNA

Claims (2)

1.一种使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺的方法，所述方法包括：

按照丙烯腈的温度低于30℃的方式冷却和保管丙烯腈的工序。

2.一种丙烯酰胺制造装置，所述装置使用具有腈水合酶的生物催化剂由丙烯腈制造丙烯酰胺，具备用于将丙烯腈的温度维持在低于30℃的温度调节机构。

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