KR100589121B1 - 효소반응을 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소적 방법에 의해 L-오르니틴을 제조하는 방법에 있어서, 바실러스 유래의 아르기나제 활성을 보유하는 고정화 균체에 아르기닌을 기질로 반응시켜 제조됨을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 반응결과물인 L-오르니틴을 함유하는 용액을 양이온교환수지탑에 통액시켜 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 수지에 흡착시키고, 요소는 통과시켜 제거하는 단계; 수지로부터 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 용리시키고, 미반응 아르기닌은 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

Description

효소반응을 이용한 Ｌ-오르니틴의 제조방법{Preparation Method of L-ornithine Using Enzymatic Reaction}

도 1은 본 발명의 실시예 3에 따른 것으로서, 아르기닌의 농도가 전환율에 미치는 영향을 관찰한 결과 그래프

도 2는 본 발명의 실시예 4에 따른 것으로서, 1차 반응액으로부터 요소를 제거한 후 재반응시킨 경우의 전환율을 관찰한 결과 그래프

도 3은 본 발명의 실시예 6에 따른 것으로서, 고정화 균체 효소의 운전 안정성을 관찰한 결과 그래프

본 발명은 효소적 방법에 의해 L-오르니틴을 제조하는 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 바실러스 유래의 아르기나제 활성을 보유하는 고정화 균체를 이용하여 L-오르니틴을 고농도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

오르니틴은 생체내의 요소회로상에 존재하는 아미노산 중의 하나이다. 혈중 의 암모니아 농도가 높으면 간 손상을 일으키는데 오르니틴과 시트룰린은 혈중의 암모니아와 결합하여 각각 시트룰린과 아르기닌이 되어 혈중의 암모니아 농도를 감소시켜준다.

지금까지 오르니틴을 산업적으로 제조하기 위해서는 L-아르기닌 영양변이주를 이용한 발효법을 이용하거나 아르기닌을 화학적 또는 효소적으로 전환시키는 방법을 이용하였다. 발효법의 경우 원료를 포도당을 사용하므로 원료가격은 비교적 낮으나 발효설비가 고가이고 설비생산성이 낮으며 정제부담이 크다. 한편 화학적으로 전환시키는 방법은 이성화반응에 의해서 이성질체가 생성되거나 시트룰린과 같은 부반응물질이 생성되었다. 일반적으로 효소를 이용한 경우는 L-오르니틴을 선택적으로 얻을 수 있으며 생산성이 발효법에 비해서 높으며 정제 부담이 작다. 이러한 효소법의 장점에도 불구하고 지금까지 아르기나제를 이용하여 L-오르니틴을 제조하는 방법이 산업화 되기 어려웠던 이유는 다음과 같다.

오르니틴은 아르기닌으로부터 아르기나제의 작용에 의하여 요소와 함께 생성된다. (식 1)

여기서 전환율은 투입된 아르기닌의 몰에 대한 생성된 오르니틴의 몰의 백분율로 정의한다. 아르기나제는 유산균, 효모, 바실러스와 같은 미생물, 소, 쥐와 같은 동물세포에서 발견되고 있으며, 작용온도, pH, 보효소의 요구성 등이 다르다. 소의 간에서 발견되는 아르기나제의 작용온도는 25∼37℃이고 최적 pH는 9.5∼10으 로 보고 되었다. 한편 바실러스 유래의 아르기나제는 최적온도가 50∼80℃와 같이 고온이며 최적 pH 9로 보고되었다. Mn²⁺는 아르기나제의 전형적인 보효소 (Cofactor)이며 그 외에 활성을 촉진시키거나 저해시키는 인자가 많이 알려져 있다. 아스코르빈산은 효소를 안정화 시키는 화합물의 한 예이다. 하지만, 반응생성물인 오르니틴과 요소는 생성물저해를 보이는 것으로 밝혀져 있어서 전환율이 증가할수록 반응속도는 급격히 떨어진다. 생성물저해를 완화시키기 위한 종래에 고안된 방법은 부생하는 요소를 제거하기 위하여 우레아제를 사용하는 것이었다. 우레아제는 식(2)와 같이 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해한다.

소의 간세포 중의 아르기나제는 우레아제를 함께 사용하지 않을 경우 얻을 수 있는 전환율이 40％에 불과한데 비해서 우레아제를 함께 사용할 경우에 97％의 전환율을 얻을 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 이 방법은 얻어진 오르니틴의 농도는 45 g/L 로 비교적 낮고 동물 유래의 복합효소를 사용하기 때문에 효소비용이 높다는 단점이 있다.

따라서, 효소를 이용한 오르니틴 제조 공정이 산업적으로 가능하기 위해서는 첫째, 아르기나제 활성이 높은 미생물균체 (이하 균체효소)를 사용하여야 하고, 둘째, 고농도의 아르기닌 수용액에 균체효소를 적용시켜 전환율을 100％ 가깝게 얻을 수 있어야 하며, 셋째, 효소비용을 낮추기 위해서는 균체효소를 고정화할 것이 요구된다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,

제 1의 목적은 아르기닌을 기질로 하여 L-오르니틴을 제조하는 과정에서 아르기나제의 활성이 높고, 반응온도가 높아 기질수용액 중의 아르기닌의 농도를 높일 수 있으며, 병원성 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있는 고정화 균체를 사용하여 고농도의 L-아르기닌을 생산할 수 있고, 효소에 소요되는 비용이 매우 경제적인 L-오르니틴의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제 2의 목적은 상기 제 1목적에 따라 얻어지는 1차 반응액으로부터 요소를 제거하고, 요소가 제거된 반응액을 다시 효소반응시켜 1차 반응액내의 미반응 아르기닌을 L-오르니틴으로 전환시킴으로써 L-오르니틴의 전환율을 더욱 높인 L-오르니틴의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제 3의 목적은 상기 제 2목적에 따른 미반응 아르기닌의 L-오르니틴으로의 전환공정에서 제 1목적에 따른 고정화 균체를 재사용하는 보다 경제적인 L-오르니틴의 제조방법을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 제1측면에 따른 본 발명은 효소적 방법에 의해 L-오르니틴을 제조하는 방법에 있어서, 바실러스 유래의 아르기나제 활성을 보유하는 고정화 균체에 아르기닌을 기질로 반응시켜 제조됨을 특징으로 하는 L-오르 니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 반응결과물인 L-오르니틴을 함유하는 용액을 양이온교환수지탑에 통액시켜 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 수지에 흡착시키고, 요소는 통과시켜 제거하는 단계; 수지로부터 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 용리시키고, 미반응 아르기닌은 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 요소제거시점에서의 L-오르니틴으로의 전환율은 50∼90％ 임을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 요소제거 이후과정에서의 효소반응은 청구항 1 기재의 고정화 균체를 재사용하여 수행되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 고정화 균체에 의한 효소반응은 45∼65℃, pH 7.5∼12.5에서 수행되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 기질은 아르기닌의 농도가 50∼300g/ℓ인 액상으로 제공되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 고정화 균체의 담체는 PVA가 사용되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 PVA는 건조물 기준으로 함량이 2∼20 중량％인 것을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

또한, 제 2측면에 따른 본 발명은 아르기닌을 기질로 여기에 아르기나제를 작용시켜 L-오르니틴을 제조하는 단계; 반응 후의 L-오르니틴을 함유하는 용액을 양이온교환수지탑에 통액시켜 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 수지에 흡착시키고, 요소는 통과시켜 제거하는 단계; 및 수지로부터 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 용리시키고, 미반응 아르기닌은 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 아르기나제는 바실러스 속 미생물로부터 유래하는 효소를 말하며, 바람직하게는 반응온도가 45∼65℃, 보다 바람직하게는 최적 반응온도가 60℃ 이상인 효소로부터 선택된다. 상기한 반응온도는 사용되는 구체적인 효소에 따라 상이하지만, 반응온도가 45℃ 이하에서는 효소활성이 낮아질 우려가 있고, 65℃ 이상에서는 고정화 균체의 기계적 물성이 약해져서 장기운전에 불리하게 작용할 수 있다. 또한, 반응을 위한 pH 조건은 사용되는 구체적인 효소에 따라 상이하여 특별한 한정을 요하지는 않지만, 바람직하게는 7.5∼12.5 정도로 하는 것이 효소활성을 위하여 권장된다. 이와 같이 미생물 유래의 아르기나제는 동물 유래의 것에 비해서 비교적 저렴하게 구입할 수 있는 장점을 제공한다. 한편, 효소의 반응온도가 높으면 기질용액 중의 아르기닌의 농도를 높일 수 있고 병원성 미생물에 의한 오염을 막을 수 있으며, 유전자 조작으로 숙주세포(대장균 등)에 클로닝하는 경우 숙주가 가지는 다른 효소의 작용을 막을 수 있다는 장점을 제공한다.

또한, 효소는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 바람직하게는 최적조건에 서 적어도 500 IU/g-습윤체 보다 높은 활성을 가지는 것으로 하는 것이 좋다.

본 발명에서 「고정화 균체」란 미생물에 의해 생합성된 효소에 의한 반응을 공업적으로 이용할 경우 미생물 세포를 어느 일정한 공간에 가둔 상태의 것을 말하며, 불용성 담체에 화학적으로 결합시키는 담체결합법, 시약으로 균체끼리 다리걸침시키는 다리걸침법, 그리고 균체를 적당한 소재로 둘러싸는 포괄법 등에 의해 고정화된 균체 모두가 여기에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에서 「고정화 균체효소」란 위 고정화 균체에서 분비되는 또는 내부에 함유되어 아르기닌을 기질로 하여 오르니틴으로 전환하는 상기 바실러스 속에 속하는 아르기나제를 말한다.

상기에서 균체는 바람직하게는 바실러스 속 미생물로부터 유래하는 효소를 코딩하는 유전자를 소정 미생물에 형질전환시켜 발현율을 높인 재조합 미생물의 형태를 포함한다. 미생물에게 특정 형질을 부여하기 위하여 재조합 기술을 이용하여 형질전환시키는 방법은 이미 광범위하게 연구되어져 있으며 이러한 기술은 본 발명의 요지를 구성하지는 않는다. 이하의 실시예에서는 상기 재조합 미생물로서 바실러스 켈도벨록스의 아르기나제가 발현되도록 재조합된 대장균(E.coli) 균체를 폴리비닐 알코올(PVA)를 주 담체로 하여 고정화한 예를 제시할 것이다. PVA를 담체로 사용하고자 하는 경우에는 건조물 기준으로 그 함량을 2∼20 중량％로 하여 두는 것이 좋다. 이러한 고정화균체 효소는 칼럼에 충진하여 운전한 결과에서 장시간 안정되게 효소활성을 유지하고 있는 것으로 확인되었다.

고정화균체 효소를 사용하는 경우 종래의 발효법이나 자유효소(free enzyme)을 기질용액에 현탁시켜 반응시키는 방법에 비하여 생산성을 크게 올릴 수 있고, 효소비용을 줄일 수 있으며 반응 후 균체를 분리하는 공정을 생략할 수 있는 장점을 제공한다. 다만, 상기 예시한 고정화 방법은 그 특성상 대장균 균주에 한하지 아니하며 아르기나제 활성을 보유한 다른 미생물 균체를 이용하는 경우에도 모두 적용될 수 있음은 본 발명의 기재를 통해 자명하다.

상기에서 기질로 제공되는 아르기닌은 바람직하게는 수용액상에서 고농도로서 제공되어지는 것이 좋다. 특별히 한정하는 것은 아니나, 아르기닌의 농도는 5∼30중량％, 바람직하게는 10∼15중량％로 하는 것이 고함량의 L-오르니틴을 얻을 수 있다는 점에서 권장된다.

효소반응의 속도를 빠르게 하고 오르니틴의 전환율을 높이기 위해서는 생성물 저해를 일으키는 오르니틴 또는 요소를 반응액으로부터 계속 제거해 주어야 하는데 오르니틴은 아르기닌과 성질이 유사하여 분리하는데 있어 어려움을 준다. 요소를 제거 또는 분리하기 위해서 종래에는 우레아제를 작용하여 요소를 이산화탄소와 암모니아로 분해시키는 방법이 시도되었다. 그러나, 이방법은 아르기나제와 우레아제의 반응조건이 다르고, 우레아제를 추가로 사용하므로서 효소비용이 많이 든다는 단점이 있다. 이하의 본 발명에서는 요소가 비이온성 화합물이므로 아르기닌이나 오르니틴으로부터 쉽게 분리될 수 있다는 점을 이용하여 상기한 문제를 해결하고자 한다.

이를 위해 보다 구체적으로는, 반응물을 양이온교환 수지탑에 통액시키면 아르기닌과 오르니틴은 수지탑에 흡착되는데 반해서, 요소는 흡착되지 않고 그대로 배출되어 제거되는 성질을 이용할 수 있다. 이때 바람직하게는 수지로부터 용리되 어진 미반응 아르기닌은 재차 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시킨다.

양이온교환수지탑에 흡착된 아르기닌과 오르니틴은 2∼7％ 염산 또는 2∼7％ 암모니아 수용액 등을 사용하여 쉽게 용리시킬 수 있다. 또한, 양이온교환수지는 젤형, 포러스형, 마크로포어가 많은 수지 등 특별한 제한은 없으며, 수지의 양이온은 수소이온 또는 나트륨 이온 등 일반적인 재생제로 재생이 가능한 것들이면 충분하며 특별한 제한을 두지는 않는다.

또한 요소를 분리시키는 시점에서의 전환율은 50％ 이상이 적당하며, 바람직하게는 70∼90％로 하는 것이 좋다. 전환율이 50％ 이하가 되면 요소를 제거하더라도 추가반응에 의해서 도달할 수 있는 최종전환율이 95％ 이하로 되어 나중에 결정화 공정을 거치더라도 제품 중에 아르기닌 또는 요소가 일부 혼입되어질 수 있다. 요소제거 시점에서의 전환율이 추가반응을 수행하므로써 얻어질 수 있는 전환율에 미치는 영향은 후술하는 실시예에서 다뤄질 것이다.

미반응 아르기닌의 오르니틴으로의 전환을 위한 추가반응시 사용될 수 있는 효소의 종류에는 아르기나아제 활성을 보유하는 한 특별한 제한은 없다. 이와 같은 효소의 예를 들면, 자유효소, 균체, 효소단백질을 고정화한 효소 또는 고정화균체 등이 사용되어질 수 있다. 바람직하게는 효소비용의 절감을 위해 요소가 제거된 반응액을 앞 단계에서 이미 사용한 고정화 균체효소에 재차 반응시키는 것이 좋다.

상기 본 발명에서는 미반응 아르기닌의 L-오르니틴으로의 후속 전환공정이 바실러스 유래의 아르기나제 활성을 보유하는 고정화 균체에 아르기닌을 기질로 반응시켜 제조되는 L-오르니틴의 제조방법에 따른 후속공정의 예로서 제시되었지만, 반드시 여기에 한정될 필요가 없음은 당업자에게 자명할 것이다. 즉, 이러한 후속 전환공정은 바실러스 유래의 아르기나제 이외에도 통상적으로 아르기나제 활성을 보유하는 어떠한 미생물 유래의 효소를 사용하는 L-오르니틴의 제조 공정에서도 그 후속공정으로서 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 아르기나제 효소활성을 가진 미생물의 제조

호열성 균주 바실러스 켈도벨록스 (B.caldovelox)를 배양하여 게놈 DNA를 분리한 후, PCR 방법으로 바실러스 켈도벨록스의 내열성 아르기나제 유전자만을 증폭시킨 다음, 발현벡터에 삽입하여 대장균 BL21(DE3)에 클로닝하였다. 이어서, 아르기나제 유전자가 클로닝된 대장균 BL21(DE3)를 배양하여 단백질 발현유무를 확인 한 후, 발현율이 높게 나타나는 형질전환된 균주를 대량배양한 다음, 열처리 등을 이용하여 간단히 정제하였다. 상기 실시예 1에 제시된 형질전환 균주의 제조과정은 당업자에 의해 다양한 변경이 가능하며, 적절한 프라이머의 선정, 범용벡터의 선정 및 구체적인 실험조건(PCR 등) 등은 당업자에게 자명한 사실에 불과하나 이해의 편의를 위해 다음과 같은 참고문헌을 제시한다. [참고문헌: Maria C. Bewley, J. Shaun Lott, Edward N. Baker, Mark L. Patchett, FEBS Letters vol 386, pp215- 218 (1996)]

<실시예 2> 아르기나제 효소활성을 가진 미생물에 의한 발효

실시예 1에 따라 제조된 형질전환된 대장균들을 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 3 ㎖ LB 브로스에서 배양한 다음, 이를 다시 동일한 배지 10 ㎖에 1％ 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 600 nm에서의 흡광도가 0.8 정도가 되었을 때, 최종농도가 0.5 mM이 되도록 이소프로필 베타-디-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 클로닝된 아르기나제 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 6시간 더 배양시킨 다음, 6,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체의 아르기나제의 활성은 약 10,000 IU/g-습균체 였다. 아르기나제의 활성을 측정하기 위하여 0.1M 아르기닌 수용액에 MnCl₂를 0.1 mM 용해시키고 pH를 9.0으로 맞춘 액을 기질로 사용하였다. 기질용액 20 mL에 약 20 IU에 해당하는 균체를 넣고 60℃에서 5분간 반응시켰다. 5N 염산 2ml를 반응액에 넣어 반응을 종료시켰다. L-오르니틴이 1 분동안 1 마이크로몰이 생성되는 활성을 1 IU로 정의하였다.

<실시예 3> 효소반응에 사용된 기질의 농도와 전환율

아르기닌의 농도를 달리하여 실시예 2에서와 같이 기질용액을 제조한 다음 기질용액 20 ml에 함유된 아르기닌 1 그램당 150 IU에 해당하는 균체를 현탁시키고 60℃에서 3시간, 8 시간, 12시간, 24시간 반응시켰다. 기질용액의 아르기닌의 농도 에 따른 전환율을 도 1에 나타내었다.

<실시예 4> 요소가 제거된 반응액의 추가효소반응 (자유효소)

아르기닌의 농도를 15％로 하여 실시예 2와 같이 기질용액 1리터를 제조하여 22,500 IU에 해당하는 균체를 넣고 60℃에서 3, 8, 12, 24 시간 반응시켰다. 각각의 반응액을 MWCO 50,000인 한외여과막을 사용하여 균체를 제거한 후 2N염산으로 재생한 양이온교환수지(다이아이온 SK 1B) 500 mL에 SV 1(hr-1)의 속도로 통과 시켰다. 정수 1000 mL로 수세한 다음 2N 염산 1000 mL을 사용하여 SV 1(hr-1)의 속도로 용리시켰다. 500mL의 정수를 사용하여 압출하였으며 얻어진 용리액은 980 mL로 용리액 중의 요소농도는 0.1％ 이하였다. 용리액의 pH를 9.0으로 조정한 후 다시 5,000 IU에 해당하는 균체를 넣고 6시간 반응시켰다. 요소제거 전후의 전환율을 도 2에 비교하였다.

<실시예 5> 아르기나제 활성이 있는 미생물균체의 고정화

실시예 2의 방법으로 얻은 습균체 50 그램을 증류수 300 mL에 현탁시킨 현탁액을 미리 용해시킨 고정화담체수용액 (PVA 10％) 200 mL와 잘 혼합시켰다. 얻어진 혼합액은 팁의 직경이 1.5 mm인 팁을 통하여 계면활성제인 Tween 20 (0.2％)이 함유된 포화붕산 수용액에 방울방울 떨어 뜨려서 구형 입자를 형성시켰다. 이때 포화붕산수용액의 온도는 30℃였고 천천히 교반하였다. 이렇게 하여 얻어진 구형입자의 직경은 2∼3 mm 이었고 고정화균체 효소의 아르기나제 활성은 400 IU/g 이었다.

<실시예 6> 고정화균체효소를 사용한 반응기 운전 안정성

실시예 5에서 얻은 고정화균체효소 50 그램을 자켓이 달린 유리 칼럼 (직경 3.5 cm, 높이 30 cm)에 충진시켰다. 자켓에는 55℃의 물이 순환하도록 하였다. 아르기닌의 농도를 15％로 하여 실시예 2의 방법으로 제조한 기질용액을 시간당 60 mL의 속도로 통액하였다. 운전시간 경과에 따른 전환율의 변화를 도 3에 나타내었다.

<실시예 7> 요소가 제거된 반응액의 추가반응 (고정화균체효소)

실시예 6에서 22일째 경과된 액 (전환율 75％) 1 리터를 실시예 4의 방법으로 요소를 제거하고 용리액의 pH를 9로 조정한 후 12 그램의 고정화균체효소를 투입하여 6 시간 동안 반응시킨 결과 전환율은 98％로 증가하였다.

본 발명은 아르기닌을 기질로 하여 L-오르니틴을 제조하는 과정에서 아르기나제의 활성이 높고, 반응온도가 높아 기질수용액 중의 아르기닌의 농도를 높일 수 있으며, 병원성 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있는 고정화 균체를 사용하여 고농도의 L-오르니틴을 생산할 수 있다. 또한 아르기나제 효소활성을 보유하는 고정화 균체를 사용하므로 매우 경제적인 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 L-오르니틴 제조의 1차 반응물로부터 요소를 제거하 고, 요소가 제거된 반응액을 다시 효소반응시켜 1차 반응물내의 미반응 아르기닌을 L-오르니틴으로 전환시킴으로써 L-오르니틴의 전환율을 더욱 높일 수 있다.

또한, 1차 반응에서 사용된 고정화 균체를 후속공정인 미반응 아르기닌의 L-오르니틴 전환공정에 재사용할 수 있으므로 매우 경제적인 L-오르니틴의 제조방법을 제공한다.

Claims (9)

1. 효소적 방법에 의해 L-오르니틴을 제조하는 방법에 있어서, 바실러스 유래의 아르기나제 활성을 보유하는 고정화 균체에 아르기닌을 기질로 반응시키는 단계; 반응결과물인 L-오르니틴을 함유하는 용액을 양이온교환수지탑에 통액시켜 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 수지에 흡착시키고, 요소는 통과시켜 제거하는 단계; 및 수지로부터 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 용리시키고, 미반응 아르기닌은 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 요소제거시점에서의 L-오르니틴으로의 전환율은 50∼90％ 임을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 고정화 균체에 의한 효소반응은 45∼65℃, pH 7.5∼12.5에서 수행되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
6. 제 1항에 있어서, 기질은 아르기닌의 농도가 50∼300g/ℓ인 액상으로 제공되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
7. 제 1항에 있어서, 고정화 균체의 담체는 PVA가 사용되어짐을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
8. 제 1항에 있어서, PVA는 건조물 기준으로 함량이 2∼20 중량％인 것을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법
9. 아르기닌을 기질로 여기에 아르기나제를 작용시켜 L-오르니틴을 제조하는 단계; 반응 후의 L-오르니틴을 함유하는 용액을 양이온교환수지탑에 통액시켜 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 수지에 흡착시키고, 요소는 통과시켜 제거하는 단계; 및 수지로부터 L-오르니틴과 미반응 아르기닌을 용리시키고, 미반응 아르기닌은 효소반응시켜 L-오르니틴으로 전환시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조방법

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