CN109153966A - 生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及已于BCCM‑LMG菌种保藏中心登记、登记号为LMG P‑29520、名为Palladio 22的嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌株。本发明还涉及采用上述菌株的生物质经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法。

Description

生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株

技术领域

本发明涉及属于嗜联苯红球菌种(Rhodococcus biphenylivorans)的菌株，该菌株能够产生腈水合酶。

本发明还涉及该菌株的培养方法，该菌株的生物质用于经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的用途，以及相应的丙烯酰胺生产方法。

现有技术

丙烯酰胺是丙烯酸酯合成中的中间体化合物，通常用作生产各种聚合物的单体，还在供水或排水处理中用作混凝剂或絮凝剂。分子生物学中，在色谱和电泳技术中，丙烯酰胺以凝胶的形式用于蛋白质解析和分离。

聚合在水溶液中进行，聚合物具有高水溶性和不溶于普通有机溶剂的特征。

至今，某些工场中，仍然在以还原铜作为催化剂存在下用硫酸化学水合丙烯腈来生产丙烯酰胺。

然而，化学水合反应存在诸多问题，包括金属催化剂制备复杂、形成的丙烯酰胺难以收获和纯化、有次级产物形成、转化率低和反应条件严苛。

此外，目前生产丙烯酰胺的工业化工艺包含许多不同的加工步骤，提高了原料最终成本。

因此强烈认为该化合物应当有替代来源从而克服上述缺陷同时维持生产成本低廉。

采用生物催化剂例如微生物的化学反应酶催化在文献中多有记载。

在上世纪70年代，文献记载了某些微生物具有将腈转化为相应酰胺的能力。

这一转化由作为生物催化剂的腈水合酶催化，由分属不同分类群的多种微生物合成这种酶，这些分类上不同的群例如：芽孢杆菌(Bacillus)、无芽孢杆菌(Bacteridium)、微球菌(Micrococcus)、短杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、黄杆菌(Xanthobacter)、链霉菌(Streptomyces)、根瘤菌(Rhizobium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、气单胞菌(Aeromonas)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、无色菌(Achromobacter)、农杆菌(Agrobacterium)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、红球菌(Rhodococcus)和丛毛单胞菌(Comomonas)。

专利EP 2749637A1(US 20140187818)是已知的，其中描述了嗜乙醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)菌株VKM Ac-2610D，该菌株生产丙烯腈转化为丙烯酰胺所必需的腈水合酶。

嗜乙醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)菌株VKM Ac-2610D的缺点之一在于所述腈水合酶的丙烯酰胺生产能力不超过49％。

专利US 5827699记载了一种新的红球菌属红球菌(Rhodococcus rhodochrous)菌株M33VKM Ac-1515D，该菌株具有高腈水合酶能力，能将脂肪族和芳香族化合物水合成相应的酰胺。

该菌株不需要培养基中存在任何酶诱导剂，培养基中仅有盐，碳源(葡萄糖、丙酮酸或乙酸盐)和氮源(铵、尿素或硝酸盐)。

不利的是，尽管该菌株具有组成性腈水合酶活性且能在无诱导剂的培养基中生长，但其在溶液中生产的丙烯酰胺最多不超过46％(重量/体积)。

迄今已知用于生产丙烯酰胺的菌株中大多数所能生产的丙烯酰胺的最高浓度一般不超过40％(重量/体积)，因此用途有限。

此外，不利的是，这些微生物生长所需的培养基组分例如维生素、酵母提取物和蛋白胨十分昂贵。

虽然已有关于腈类和酰胺类酶催化工艺的重要研究获得重大成功，对新的腈水合酶生产株的需求仍日益迫切。

这部分缘于生物技术生产酰胺的生态安全性和有效性，部分缘于专利菌株成本高昂。所以，近年来分离到了生产该酶的新微生物。

最后，对于生产无污染性残余的纯丙烯酰胺且能确保效果复现的生产方法的需求引导研究者寻找新的菌株并开发前文所述现有技术的替代策略。

发明内容

本发明目的在于提供具有以下所述技术特征的红球菌属菌株，所述技术特征相比现有技术菌株提高腈水合酶在腈基团转化为酰胺基团从而生产丙烯酰胺的水合反应中的产率。

本发明目的还在于开发出改良的、有效地、快速的培养方案来获得大量的红球菌菌株生物质，此处的生物质指培养液中红球菌细胞的总质量。开发出的方法能够获得每升培养液超过100g/L生物质，这些微生物105℃的干渣量约为25g/L。

并且，本发明涉及生产高浓度丙烯酰胺的方法，进一步的目的在于相对于已知生产方法显著降低菌株培养的非必要成本。

以上目标是采用权利要求1所述菌株实现的，具体为12/04/2016按照布达佩斯条约的规定于比利时协作微生物保藏中心-LMG(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms-LMG)登记、登记号为LMG P-29520、名为“Palladio 22”的嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌株。

该菌株生产腈水合酶。该菌株优选为干燥、冷冻干燥或糊膏状生物质的形式，105℃的干渣量18-30％，优选20-27％。

本发明涉及所述菌株用于生产化合物—优选酰胺类化合物—的用途。本发明涉及所述菌株用于生产丙烯酰胺的用途。

本发明的目的还在于一种采用上述菌株的生物质经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，水合过程在按反应溶液总重计低于0.8％的丙烯腈浓度下进行。

较好的是，将丙烯腈加入含有所述菌株生物质的含水溶液以使溶液中游离丙烯腈的浓度在水合过程中从不超过反应溶液总重的0.8％。

较好的是，所述方法的丙烯酰胺生产得率为50％至57.5％，优选50-54％(重量/重量)。较好的是，丙烯腈生产在14℃至23℃的温度、5.0-8.5的pH、搅拌条件下进行。

本发明还涉及采用所述菌株的生物质经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，所述生物质固定在固体基质上。

本发明还涉及采用提取自所述菌株生物质的腈水合酶经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，所述酶固定在固体基质上。

本发明还涉及上述菌株的培养方法，其中，所述菌株的生长包括将菌株接种在含有以下物质的营养培养基中：含钠和钾的磷酸盐缓冲液，碳源，氮源，镁盐，锌盐，钙盐，铁盐(II)，钴盐和，可选地，酵母提取物。较好的是，所述生长在10-35℃、优选20-35℃的温度和8.3-6.3、优选7.4-6.5的生长pH下进行2-4天。

较好的是，所述培养方法还包括：在其他固体培养基中培养所述菌株的步骤，在液体培养基中培养所述菌株的步骤，发酵步骤，对所述菌株的生物质进行絮凝和分离的步骤。

较好的是，菌株培养至细胞光学密度达90-220OD，所述光学密度为10mm厚池中于540nm波长所测。

较好的是，所得菌株的腈水合酶活性至少为150微摩尔酰胺/分钟/毫克细胞干重。

并且，本发明还涉及经本发明菌株繁殖或扩增可得的嗜联苯红球菌(Rhodococcusbiphenylivorans)菌株。

尤其，本发明的菌株能够将丙烯腈底物水合成丙烯酰胺，使得终产物的产量高于现有技术菌株。

如此高的丙烯酰胺生产能力得益于菌株对丙烯酰胺毒性的优良耐受性。

事实上，申请人出人意料地发现本发明菌株能够在转化反应期间耐受并达到超过50％(重量/重量)的丙烯酰胺浓度。

该丙烯酰胺生产株分离自意大利土壤，取样的土壤中有分解中的草/叶类物质。

菌株的分离和培养采用培养基和能够选出能够生产腈水合酶的微生物的培养基和催化方法，腈水合酶即能够将腈基团水合成相应的酰胺的酶。

对本发明的菌株进行了核糖体RNA 16S(16S rRNA)编码基因的1365核苷酸区域测序。

所得序列显示与嗜联苯红球菌(TG9^T)株具有99.93％的相似度，与对比序列全长相比仅相差一个核苷酸。

本发明菌株具有以下形态特征和生物化学特征：

-琼脂培养：有光泽的粉-橙色菌落，具有圆形凸起的形态；

-移动性：无；

-孢子形成：无；

-革兰氏菌：阳性；

-培养条件：20-35℃，好氧。

本发明菌株好氧，过氧化氢酶阳性，并且，根据生长的相期，在显微镜下呈棒状或椰子状。

嗜联苯红球菌Palladio 22株具有优异的生长性能并能够催化脂肪族和芳香族腈类水解成相应的酰胺。

这样的水合反应由腈水合酶专性催化，优选向培养基中添加酶诱导剂(如尿素及其衍生物)来进行诱导。

对本发明菌株进行了功能性鉴定；经PCR扩增和桑格(Sanger)测序发现该菌株具有钴依赖性腈水合酶的α和β亚基。

该菌株的另一优点是酰胺酶活性很低，确保了所产丙烯酰胺品质优异。酰胺酶活性实际上包括对所产丙烯酰胺的降解。

嗜联苯红球菌Palladio 22株的优点在于能够在简单培养基中生长，培养基中不含昂贵的营养成分如维生素和其他生长因子。

换言之，申请人发现在标准培养条件下、在配方适当的培养基中，本发明菌株的水合酶活性优于现有技术中的菌株。

采用专用培养基使得培养基的配方可以通过组合各单独组分来调配，这不仅比采用市售即用培养基节省了开支，而且允许根据特定需要对每一组分的浓度进行调控。

不像目前已有的，本发明菌株能够耐受培养基中产生和释放的很高浓度的丙烯酰胺，这使它有利地适合高浓度的丙烯酰胺工业化生产。

尤其，嗜联苯红球菌Palladio 22株对显著超过50％(重量/重量)的丙烯酰胺浓度具有出人意料的耐受性。

所述菌株的这些特征以及所述生产方法的特征使得本发明具有经济上的优势并能够成功的实现产业应用。

本发明还涉及为大规模生产丙烯酰胺而开发的合成方法，所述大规模生产是基于菌株生物质的应用及后续丙烯酰胺与生物质的分离。

嗜联苯红球菌Palladio 22株的生长首先(例如生长于培养皿和琼脂斜面管中)是固体营养培养基中(通常为琼脂培养基)的接种，但此后的繁殖步骤(例如烧瓶或发酵罐)则在液体营养培养基中(培养液)进行。

所述固体营养培养基由牛提取物、蛋白胨、NaCl、酵母提取物和琼脂构成。液体营养培养基含有碳源、氮源和无机盐。

一般说来，在液体培养基中，可吸收碳源由单种糖或多种糖的混合物构成。较好的，碳源选自葡萄糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、核糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇、水杨苷、菊粉、柠檬酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐及其组合。

通常，根据欲获得的生物质量和具体的培养步骤，液体培养基中糖的浓度为20-80g/L。

通常，液体培养基中，氮源为3-25g/L。优选所用氮源是尿素。

优选实施方式之一中，液体培养基中采用浓度为0.01-0.08g/L的钴离子作为诱导剂来诱导活性腈水合酶的合成。

并且，液体培养基的配方中还可采用选自微生物培养所用普通营养培养基中所含的各种盐。

这些盐的非限定性例子是磷酸盐、硫酸盐、氯化物、钾、铵、钴、钙和镁。

较好的是，液体营养培养基含碳源、氮源、无机盐和酵母提取物。

优选实施方式之一中，菌株的第一生长步骤在固体营养培养基中进行，优选装有由以下所述制得的培养基的培养皿：牛提取物、蛋白胨、NaCl、酵母提取物和琼脂(优选1.5％含量以便胶凝)。培养基通常在高压釜中121℃消毒灭菌15-20分钟。

较好的是，用无菌接种环将嗜联苯红球菌Palladio 22株接种在固体培养基的全表面。

较好的是，所述生长在20-35℃、优选28-32℃的温度和7.4至6.5的生长pH下进行2-5天，优选3-4天。

宏观上讲，可以通过可见菌落的外观来确认生长进程，所述可见菌落呈圆形、凸起，具有典型的粉-橙色。

下一步包括菌株接种，优选接种在斜面琼脂管中，斜面琼脂管的特点之一是培养基适当固化形成倾斜表面。

管中含有与培养皿相同的培养基，同样如上所述经消毒灭菌。

斜面管接种如下进行：从培养皿取菌落，将细胞接种到斜面上，最好用无菌接种环进行。

菌株在斜面管中的生长在培养箱中进行：20-35℃、优选28-32℃，进行1-4天、优选2-3天。

在菌落生长的终点，将斜面上长出的生物质重悬在中性pH6.5-7.5、10-35℃的无菌盐水中，优选pH 7.0±0.2、15-25℃，优选采用涡流搅拌。

然后，将由此制得的菌株悬液接种到玻璃烧瓶中，玻璃烧瓶中装有含有糖、尿素、磷酸盐、硫酸盐、氯化物、钾、铵、钴、钙、镁、铁和酵母提取物的合成培养基或通用液体培养基(优选加有10-20g/L酵母提取物)。

较好的是，菌株悬液接种到含有添加了10-20g/L酵母提取物的通用液体培养基或以下组成(g/L)合成培养基的烧瓶中：

本发明的菌株是好氧菌，在液体培养基中时，在定轨摇床形成的搅拌条件下生长，速率为200-350rpm、优选约300rpm。通过加强培养基供氧，搅拌能实现更高的菌生长量，继而实现更高的腈水合酶产量。

烧瓶中菌生长条件如下：20-35℃、优选28-32℃，pH 6.3-8.3、优选≥6.5且≤7.4，直至细胞悬液光密度达30-40OD，所述光密度为10mm厚小管中于540nm波长测得。

较好的是在35-38OD务必终止烧瓶中的菌生长，这样的光密度提示细胞含量已高，即将进入缓滞生长期。

在烧瓶中在菌株生长期获得高OD值能够获得仍处于活跃生长状态的细胞，这将有利地缩短下一步在发酵罐中放大培养所需的时间。

接着，将所得菌悬液接种到第一发酵罐中。

该发酵罐中，优选的接种量为发酵液最终体积的1/50。例如，如果发酵罐的工作容积为20L，则接种400mL细胞悬液。

优选实施方式之一中，在工作容积20L的发酵罐中，菌生长条件如下：

-通气：向发酵罐中通入无菌空气，例如用装在发酵罐底部的鼓泡器；起始通气条件为5L/min至10L/min；

-压力：发酵罐内必须略带正压以利培养液中更好的氧吸收。相对内压为0.1-0.3巴，优选0.15-0.25巴；

-搅拌：最初，反应器内的搅拌为低速，且可根据搅拌器的尺寸与形状以及发酵罐的尺寸调整。通常，小反应器中的初始搅拌值为150-500rpm。初始生长条件中，搅拌速率为200-250rpm；调整搅拌从而在任意时刻保持最佳氧浓度(≥55％)；

-温度：发酵全程保持稳定在20-35℃，优选28-32℃。

-pH：6.0至8.0之间，优选6.5至7.4之间，可通过添加NaOH或H₃PO₄来调整将其维持在最佳值；

-pO₂：参数pO₂对于发酵成功非常重要，取值可以是≥55％直至100％。由于本发明的菌株是好氧的，菌浓度与培养液中的需氧量成正比。

上述培养条件中，好氧微生物生长产生大量泡沫，这种现象随着菌体生长速度和浓度的提升而恶化。事实上，如果不用适当的液位探针和消泡剂对泡沫水平进行监控，泡沫会上涨以至堵塞发酵罐出口过滤器，甚至造成发酵罐渗漏。

较好的是，发酵罐中采用以下组成(g/L)的培养基：

优选的是，为了获得高菌体浓度，可采用补料分批发酵，每次注入少量的一种或多种营养物质。

当光密度达到90-220OD、优选140-180OD时终止发酵罐内有控制的菌体生长，以上光密度在540nm波长于10mm厚池内用已知方法测得。

本发明的新菌株，按照以上所述生长过程，据分光光度法测定，能够产生具有特异性活性的腈水合酶，优选该活性等于至少150微摩尔酰胺/分钟/毫克细胞干重。活性的测定反应在最大容积5-10mL的试管中进行。将试管置于温控水浴中，带搅拌。试管装有生物催化剂已知浓度的含水悬浮液，所述生物催化剂与已知量的反应底物(丙烯腈)接触并反应一定时间。用酸终断反应；用已知方法例如分光光度计、气象色谱或HPLC测定产出丙烯酰胺浓度。待测定了所产丙烯酰胺浓度之后，再计算活性。

在放大步骤后，生长过程保持相同的生长特征，区别仅在于采用的发酵罐更大，400/1000L至20000/50000L。

发酵终点，将所得生物质与培养基分离—优选离心或压滤—直至得干渣，干渣量优选105℃、20-25％(重量/重量)。如有必要，将菌体生物质在发酵罐中于10-15℃、无通气、无搅拌条件下多停留24小时。

可将菌体生物质冷冻保存于-20℃，或冻干后不超过30℃室温保存。

尤其，发酵过程后，为了进行生物质的分离，必需令发酵液温度达到至少10-30℃、优选15-20℃，为的是启动絮凝步骤。

生物体呈胶体悬浮液状态，即微生物细小地分散在液体介质中的状态；此处的液体介质是耗废了的营养发酵液，这样的废营养发酵液长期来说会降低微生物的品质。生物质分离先加阳离子溶液(优选10％)后加阴离子溶液(优选0.1％)。阳离子溶液的加量为待絮凝物质量的2-8％，阴离子溶液加量为1-2.5％。较好的是，阳离子溶液为4-7％，阴离子为1-2％。较好的是，悬浮液保持在持续搅拌条件下。

低分子量阳离子絮凝剂起凝聚剂的作用，数分钟后形成微小絮凝物。

然后加入阴离子溶液。

以上新形成的微小絮凝物成为高分子量阴离子絮凝剂进一步团聚的底物。

添加阴离子溶液后，一般10分钟后絮凝物充分形成，可通过离心或压滤分离絮凝物。

通常，采用孔径≤0.45μm的滤器进行分离。可适当将经过滤的生物质重悬于最初悬浮液量1/5的软水中，然后过滤分离，如此，生物质进一步与发酵液残留分离净化。

如果以糊膏状态保存，生物质一般与防腐剂混合，防腐剂优选硫酸盐或铵盐。

产业规模的制备过程可采用双叶板组(double-sheet panels)或自动排放离心机。

以上所述方法获得的生物质由嗜联苯红球菌Palladio 22株细胞构成，所述细胞表现出高腈水合酶活性，该活性能够经脂肪族或芳香族腈类水合获得相应的酰胺，尤其如丙烯酰胺。

就丙烯酰胺生产反应而言，1g/3L经本文所述培养方法所得嗜联苯红球菌Palladio 22株细胞干生物质重悬于反应器中约一升的软水中，反应器维持在初始反应温度即10-17℃、优选13-15℃。可向初始含水溶液中添加添加剂溶液。

在反应器内，丙烯酰胺生产条件如下：温度为10-27℃、优选14-23℃，pH5.0-8.5、优选6.8-7.2。

将丙烯腈加入含嗜联苯红球菌Palladio 22株生物质的水溶液，丙烯酰胺合成由此启动。

丙烯腈可以连续添加也可以分多步添加从而使得溶液中其游离浓度在向丙烯酰胺转化的转化反应期间从不超过反应溶液总重量的0.8％、优选不超过0.6％、优选不超过0.5％、甚至不超过0.4％或0.3％。

反应期间，对悬浮液持续搅拌，搅拌速度为50-200rpm、优选100-150rpm。该范围可根据所用反应器尺寸和搅拌器类型调整。

持续监测反应液中丙烯腈和丙烯酰胺的浓度，监测方法包括分光光度法、折光计法和气相色谱，直至反应所需全部丙烯腈添加完毕，或直至丙烯酰胺达到要求的浓度。

当利用腈水合酶进行的该生物转化反应几乎为零时务必终止所述过程。这可能出现在丙烯酰胺已达高浓度之时。

水合反应因停止添加丙烯腈而终止和/或在达到预定的丙烯酰胺浓度后终止。

含水溶液中的丙烯酰胺和悬浮生物质形成的最终产物中丙烯酰胺的浓度为30-57.5％、优选45-57％、48-56％、50％-54％。丙烯酰胺浓度用合适的仪器来测定，例如气相色谱、HPLC、折光计和分光光度计。

尤其，可以获得含水溶液中浓度高达57.5％(w/w)的丙烯酰胺产率。

在采用气相色谱的反应的终点，检验无丙烯腈污染物残留，并对丙烯酰胺与生物质的悬浮液进行适当的纯化处理，例如过滤或离心，从而将生物催化剂与含水溶液中的丙烯酰胺分离。

较好的是，丙烯酰胺分离过程通过自动离心进行。

所得丙烯酰胺一般按照特殊安全规定储存于不锈钢罐或瓶等容器中，保持连续空气循环，温度为20℃。

丙烯酰胺长期保存可能发生聚合反应现象，为此，持续监测聚合物浓度，聚合物浓度必须控制在≤15FTU(福尔马肼(Formazine)浊度形成单位)。

为了抑制聚合，可以在转运储存前向含丙烯酰胺的溶液中吹入空气。

最终的溶液透明且悬浮液中无生物催化剂残留。

本领域技术人员可以看出，采用大容积的工业用发酵罐和反应器可将本文所述方法改进为大规模生产。

根据本发明的变换实施方式之一，丙烯酰胺合成通过将丙烯腈添加到固定于固体基质的Palladio 22株生物质来进行，固体基质本身是已知的，例如活性炭、硅酸盐、沸石、交联丙烯酰胺、聚合物基质等等。

并且，根据已知技术，这样做是可能的即将提取自本发明菌株的腈水合酶固定在固体基质上(例如以上所述基质)并向所述固定在基质上的酶添加丙烯腈来合成丙烯酰胺。

优势在于，这样的方法既能够“连续”产出丙烯酰胺从而提高反应得率，又能利于生物催化剂从丙烯酰胺中去除，由此减少运行时间。

本申请还请求保护可通过本发明嗜联苯红球菌Palladio 22株繁殖或扩增获得的嗜联苯红球菌菌株。这些菌株可用于生产酰胺，尤其丙烯酰胺，如前文所述。并且，可采用具有就本发明菌株所述技术特征的方法来获得上述菌株的生长。这些菌株在培养中具有优异的生长特性，并能够催化脂肪族和芳香族腈类水解形成相应的酰胺。

根据不同的本发明变换实施方式，本申请包括这样的菌株：它们具有自发的基因突变，由于细菌特征性的高度遗传可变性，这些突变在培养生长过程中天然存在，这使得它们能够适应不同的生长环境。

另有可能，这些基因突变可通过培养过程中采用外部的化学、物理或生物手段或物质诱导产生，例如抗生素、UV光或病毒，条件是具有这样突变的Palladio 22扩增/繁殖所得菌株适合用于本文所述的用途或方法，并具有与本发明菌株相同的技术特征。

本发明及其优点将通过以下说明性实施例变得更清楚。

以下实施例描述了实施本发明的不同步骤，仅为说明，非为限定。

实施例1

培养皿制备与接种

将嗜联苯红球菌Palladio 22株的细胞培养在含有以下组成通用生长培养基的培养皿上：1.0g/L牛提取物，2.0g/L酵母提取物，5.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，向其中添加最终浓度为1.5％的琼脂。根据需要用NaOH或H₃PO₄调整溶液的pH为7.0±0.1。

制备完成后，将发酵液煮沸以便令琼脂充分消毒灭菌。然后再在121℃消毒灭菌15分钟。消毒灭菌后，在无菌层流罩中将发酵液导入无菌培养皿，让发酵液在培养皿中胶凝。

用无菌接种环将菌株接种到培养皿中，在培养箱中于30℃有氧条件下放置3天。

经培养，培养基表面形成圆形凸起粉-橙色菌落。

实施例2

斜面制备与接种

将所得嗜联苯红球菌Palladio 22的菌落接种到含有培养皿中相同培养基的斜面上。

对斜面管进行121℃、15分钟消毒灭菌。

消毒灭菌后，将试管斜放在培养箱中，由此令培养基固化形成斜面。

然后用无菌接种环将先前生长步骤所得菌落接种到斜面上并于培养箱内30℃放置2天。

实施例3

烧瓶内液体培养基内的菌株接种

将斜面培养所得菌细胞生物质重悬于pH 7.2、30℃的无菌盐水中。

然后将该生物质悬液用于向烧瓶中接种，烧瓶中含有添加了15g/L酵母提取物的通用液体培养基或以下组成(g/L)合成培养基：

生物质在无菌条件下接种到烧瓶中，在30℃和pH7.2条件下生长。液相内的菌株生长在定轨摇床上进行，摇床对烧瓶进行300rpm搅拌。

在光密度达到35-38OD时终止烧瓶内生物质的生长，所述光密度在10mm厚池中于540nm波长测得。

将所得菌悬液用于后续发酵罐中放大培养接种。

实施例4

发酵罐内液体培养基中菌株的生长及后续放大

在20L发酵罐中制备以下组成(g/L)的培养基：

培养基121℃消毒灭菌15分钟，然后在接种菌体培养物前冷却至30℃。

接种体积是发酵罐中培养基最终体积的1/50。

20L发酵罐中的生长条件包括：5-10L/min通气，150-400rpm搅拌，可根据生物质浓度调整，pO₂≥55％，温度为30℃，pH 6.5-7.4(生长期间有改变)，生长至光密度达170-190OD。

为了确定何时终止菌体生长，测定光密度和腈水合酶活性，光密度应为90-220OD，腈水合酶活性应至少150微摩尔酰胺/分钟/毫克细胞干重。

在后续的放大步骤，生长过程特征相同，区别在于依次采用400/1000L和20000/50000L的发酵罐。

由此所得最终的生物质经离心或压滤与培养基分离，冷冻保存于-20℃，或者冻干后不超过30℃室温保存。

如有必要，在分离前，菌体培养物可在发酵罐中于10-15℃、无空气、无搅拌条件下多停留24小时。

实施例5

生物质的絮凝与分离

如实施例4所述进行嗜联苯红球菌Palladio 22株的发酵放大步骤。

发酵终点，将菌悬液温度调至15℃，然后启动絮凝过程。

为了分离胶体悬液状态的生物质，向发酵液中添加絮凝液。

具体地说，假设为500g的量，则向菌悬液中边50rpm搅拌边添加25mL的10％阳离子溶液，数分钟后开始形成微小絮凝物。

然后，缓慢加入8mL的0.1％阴离子溶液，悬液保持搅拌直至充分形成片状物。

反应终点，用孔径≤0.45μm的过滤器最后将生物质与废发酵液分离。

然后，将所得生物质重悬于100g H₂O，然后再过滤。这样做大大减少发酵液残留。

所得糊膏样生物质于-20℃保存，或冻干后不超过30℃室温保存。

实施例6

丙烯酰胺生产反应

为丙烯酰胺生产反应，将1g(干重)嗜联苯红球菌Palladio 22的生物质于总容量3L的预冷反应器中重悬于含水溶液中。

丙烯酰胺生产的条件为：持续搅拌(150rpm)，温度为14-23℃，pH 7.0±0.2，溶液中丙烯腈游离浓度从不超过0.5％。

向1201.26的水和生物催化剂中连续或分步添加798.74g丙烯腈，直至丙烯腈完全转化为1070g丙烯酰胺(100％)。

当腈水合酶的速度急遽下降时终止反应。通常，该现象发生于丙烯酰胺浓度超过53％时。

通过自动离心将产出的丙烯酰胺与生物质分离，并保存在特殊的罐或容器中。

溶液中产生的丙烯酰胺的最终浓度为53.5％且没有丙烯腈残余。

实施例7

丙烯酰胺生产反应

为丙烯酰胺生产反应，将1g(干重)嗜联苯红球菌Palladio 22的生物质于总容量3L的预冷反应器中重悬于含水溶液中。

丙烯酰胺生产的条件为：持续搅拌(150-200rpm)，温度为14-23℃，pH7.0±0.2，溶液中丙烯腈游离浓度从不超过0.5-0.8％。

向1141.55的水和生物催化剂中连续或分步添加858.45g丙烯腈，直至丙烯腈完全转化为1150g丙烯酰胺(100％)。

当腈水合酶的速度急遽下降时终止反应。通常，该现象发生于丙烯酰胺浓度超过53％时。该浓度的反应批次约经4-8小时完成。

通过自动离心将产出的丙烯酰胺与生物质分离，并保存在特殊的罐或容器中。

溶液中产出的丙烯酰胺的最终浓度为57.5％且没有丙烯腈残余。

Claims (20)

1.名为Palladio 22的嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌株，该菌株已于BCCM-LMG菌种保藏中心登记、登记号为LMG P-29520。

2.如权利要求1所述的菌株，其生产腈水合酶。

3.如权利要求1或2所述的菌株，其为干燥、冻干或糊膏状生物质，具有18-30％、优选20-27％的干渣含量。

4.前述权利要求中任一项所述菌株用于生产酰胺的用途。

5.如权利要求4所述的用途，所述酰胺为丙烯酰胺。

6.采用权利要求1-3中任一项所述菌株的生物质经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，所述水合过程在小于反应溶液总重的0.8％的丙烯腈浓度下进行。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，丙烯腈加入含有所述菌株生物质的含水溶液以使溶液中游离丙烯腈的浓度在水合过程中从不超过反应溶液总重的0.8％。

8.如权利要求6或7所述的方法，具有50-57.5％(重量/重量)的丙烯酰胺产率。

9.如权利要求8所述的方法，具有50-54％的丙烯酰胺产率。

10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中，丙烯酰胺生产在14-23℃的温度和5.0-8.5的pH下进行。

11.采用权利要求1-3中任一项所述菌株的生物质经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，所述生物质固定在固体基质上。

12.采用提取自权利要求1-3中任一项所述菌株的生物质的腈水合酶经丙烯腈水合生产丙烯酰胺的方法，其中，所述腈水合酶固定在固体基质上。

13.权利要求1-3中任一项所述菌株的培养方法，其中，所述菌株的生长包括将菌株接种在含有以下物质的营养培养基中：含钠和钾的磷酸盐缓冲液，碳源，氮源，镁盐，锌盐，钙盐，铁盐(II)，钴盐和，可选地，酵母提取物。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述生长在10-35℃、优选20-35℃的温度和8.3-6.3、优选7.4-6.5的生长pH下进行2-4天。

15.如权利要求13或14所述的方法，所述方法还包括：在固体培养基中培养所述菌株的步骤，在液体培养基中培养所述菌株的步骤，发酵步骤，对所述菌株的生物质进行絮凝和分离的步骤。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，所述菌株培养至细胞光学密度达90-220OD，所述光学密度为10mm厚池中于540nm波长分光光度计所测。

17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，所得菌株的腈水合酶活性至少为150微摩尔酰胺/分钟/毫克细胞干重。

18.由权利要求1所述名为Palladio 22的嗜联苯红球菌菌株繁殖或扩增可得的嗜联苯红球菌菌株。

19.权利要求18所述菌株用于如权利要求6-12中任一项所述丙烯酰胺生产的用途。

20.权利要求18所述菌株的培养方法，所述方法采用权利要求13-17中任一项所述的方法。