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CN103571815B - 一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用 - Google Patents

一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用 Download PDF

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CN103571815B CN201310524588.6A CN201310524588A CN103571815B CN 103571815 B CN103571815 B CN 103571815B CN 201310524588 A CN201310524588 A CN 201310524588A CN 103571815 B CN103571815 B CN 103571815B
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Abstract

本发明公开了一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及其应用，属于生物工程技术领域。利用食品级乳酸乳球菌表达系统成功实现了酸性脲酶的高效表达制备方法及应用，酸性脲酶酶活达到10200U/L，纯化后酸性脲酶比酶活为325.6U/mg。纯化后的酶对氨基甲酸乙酯底物的比酶活达到243.4U/mg，在黄酒中加入本发明制备的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯（3天降解率72%）。本发明制备的重组酸性脲酶可以用于发酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解决发酵食品中氨基甲酸乙酯的残留问题，本发明为实现食品级酸性脲酶的工业化生产奠定了基础。

Description

一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用
技术领域
本发明涉及在乳酸菌中高效表达酸性脲酶的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
脲酶（Urease，EC3.5.1.5）又称氨基水解酶，广泛存在与生物界的动物、植物、细菌、真菌等中，其能专一性的催化尿素水解产生两分子氨和一分子碳酸。自从1926年Summer首次从刀豆中提取出结晶态的脲酶，各国对脲酶进行了广泛的研究。根据脲酶作用的最适pH值，可将脲酶分为酸性脲酶、中性脲酶和碱性脲酶。
进入80年代后，研究证实在酒精类(如我国的黄酒类)的发酵生产中，酵母细胞由于氮源利用的先后次序导致精氨酸代谢产生的尿素被分泌的细胞外，同时，原材料中的尿素也残留在酒类中。而生成的乙醇和尿素会自发发生反应生成一种具有致癌的物质——氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，简称EC）。长期饮用含有较高浓度氨基甲酸乙酯的酒类容易诱发多种癌症，如肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。因此国外如加拿大、日本以及欧洲纷纷制定了酒中EC的限量标准，而我国迟迟不能制定相应的标准。因此，如何尽快解决氨基甲酸乙酯的问题已经提上了议事日程。国内外已有多种相关报道，其中，通过人为添加制备的酸性脲酶是一个非常实际、可行的方法，2005年OIV（国际葡萄·葡萄酒组织）通过了允许添加酸性脲酶降低酒中尿素的决议。
我国拥有十分悠久的酿酒历史，尤其是黄酒，其与葡萄酒和啤酒并称为世界三大古酒。我国黄酒因其品质优良，口感醇厚，营养丰富，具有深厚的文化底蕴而远销日本，韩国，东南亚和欧美等国家，但近年来，由于EC残留问题遭到了严重的技术贸易壁垒威胁。我国黄酒pH值为3.5-5.5，且有一定的乙醇浓度，中性脲酶和碱性脲酶在此条件下酶活力几乎或者完全丧失，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，绍兴黄酒集团至今仍需从日本进口昂贵的酒用酸性脲酶，因此获得具有耐酸和耐乙醇的酸性脲酶是问题解决的关键。
目前，许多课题组已从自然界中筛选获得了多种产酸性脲酶的菌株，研究表明，菌株多为肠杆菌属、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯氏菌，由于这些菌多为致病菌或者条件致病菌，从而限制了其进一步的应用。而日本商业化的酸性脲酶生产依然是利用野生菌进行发酵生产的，产酶水平较低，这也是现在酒用酸性脲酶价格居高不下的原因。
鉴于此，构建具有自主知识产权的新型食品级重组工程菌高效生产酒用酸性脲酶的方法更有利于酸性脲酶今后的工业化生产，也更有利于我国酿酒业的发展和国际市场拓展。
本发明从一株食品安全级的乳杆菌中克隆获得酒用酸性脲酶的全长基因，并实现利用重组乳酸乳球菌，异源高效表达酒用酸性脲酶及其纯化制备的方法。本发明的实现为食品级酒用酸性脲酶的工业化制备生产奠定了基础。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种高效制备食品级酸性脲酶的方法，技术方案为：从罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）基因组上克隆获得酸性脲酶基因，将重组质粒导入乳酸乳球菌、植物乳杆菌或嗜热链球菌中任一一种，构建高效表达酸性脲酶的重组菌，利用重组菌发酵生产脲酶。
所述酸性脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控，据此制备食品级酸性脲酶的方法步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒酶切、连接构建重组质粒；
3）将步骤2）构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控；
4）利用重组乳酸乳球菌发酵生产脲酶。
依据上述制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ8148或pNZ8149酶切、连接构建重组质粒；
3）将步骤2）构建的重组质粒导入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900构建产脲酶重组乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148-ureLR)或NZ3900(pNZ8149-ureLR)，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控；
4）利用重组乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148-ureLR)或NZ3900(pNZ8149-ureLR)发酵生产脲酶。
酸性脲酶基因簇表达在乳酸乳球菌、植物乳杆菌或嗜热链球菌中受p32或p59启动子调控。其中，重组菌株酸性脲酶基因簇表达受p32启动子调控，据此制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）根据NCBI公布的P32（GenBank:M24764.1）启动子序列，设计引物扩增P32启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32；
3）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR；
4）将步骤3）构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32启动子调控；
5）利用重组菌发酵生产脲酶。
重组菌株酸性脲酶基因簇表达受p59启动子调控的制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）根据NCBI公布的P59（GenBank:M24806.1）启动子序列，设计引物扩增P59启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ59；
3）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ59-ureLR；
4）将步骤3）构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P59启动子调控；
5）利用重组菌发酵生产脲酶。
以乳酸乳球菌为表达宿主，且重组菌株酸性脲酶基因簇的表达受P32或P59启动子调控，制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）根据NCBI公布的P32或P59（GenBank:M24764.1，GenBank:M24806.1）启动子序列，设计引物扩增P32或P59启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32或pNZ59；
3）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32或pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR或pNZ59-ureLR；
4）将步骤3）构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控；
5）利用重组菌发酵生产脲酶。
以嗜热链球菌或植物乳杆菌为表达宿主制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下：
1）根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2）根据NCBI公布的P32或P59（GenBank:M24764.1，GenBank:M24806.1）启动子序列，设计引物扩增P32或P59启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32或pNZ59；
3）将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32或pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR或pNZ59-ureLR；
4）将步骤3）构建的重组质粒导入植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控；
5）利用重组菌发酵生产脲酶。
同时，本发明对发酵制得的酸性脲酶产物，采用60%乙醇沉淀，DEAE离子交换，疏水层析进行纯化，并测定重组酸性脲酶的酶活及酶学性质。
本发明还提供了一种用于消除黄酒等发酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯的方法。将重组制备的酸性脲酶加入黄酒或含有尿素和氨基甲酸乙酯的食品中，用以降低食品中尿素和氨基甲酸乙酯的含量。本发明成功从乳杆菌中克隆获得酸性脲酶全长基因，并实现利用重组乳酸乳球菌，异源高效表达酸性脲酶及其纯化制备方法和应用。本发明为实现食品安全级酸性脲酶的工业化制备生产奠定了基础。
本发明具有如下有益效果：
本发明利用食品级乳酸乳球菌表达系统成功实现了酸性脲酶的高效表达，酸性脲酶酶活达到10200U/L，纯化后酸性脲酶比酶活为325.6U/mg。纯化后的酶对氨基甲酸乙酯底物的比酶活达到243.4U/mg，在黄酒中加入本发明制备的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯（3天降解率72%）。本发明制备的重组酸性脲酶可以用于发酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解决发酵食品中氨基甲酸乙酯的残留问题，本发明为实现食品级酸性脲酶的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1所示为酸性脲酶基因克隆的电泳结果；
（M，marker；1，酸性脲酶基因）。
图2所示为构建的不同酸性脲酶工程菌发酵结果。
图3所示为L.lactisNZ3900（pNZ8149-UreLR）上罐发酵结果。
图4所示为重组酸性脲酶的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果；
（M，蛋白marker；1，L.lactisNZ3900（pNZ8149-UreLR）全细胞液；2，重组菌株L.lactisNZ3900（pNZ8149-UreLR）酒精沉淀；3，DEAE纯化后活性部位；4，疏水层析纯化后活性部位）。
图5所示为重组表达的酸性脲酶分别以尿素和EC为底物时的比酶活。
图6重组酸性脲酶酶学性质测定结果；
（A，温度对酶活的影响；B，pH对酶活的影响；C，酒精浓度对酶活的影响；D，温度对脲酶稳定性的影响；E，pH对脲酶稳定性的影响；F，酒精浓度对脲酶稳定性的影响）。
图7所示为酸性脲酶在黄酒中降解尿素和EC的结果。
具体实施方式
材料与方法
1.GM17培养基：M17培养基（青岛海博生物技术有限公司），0.5%葡萄糖，pH7.0-7.2，固体培养基添加15%琼脂。
2.LM17培养基：M17培养基（青岛海博生物技术有限公司），0.5%乳糖，pH7.0-7.2，固体培养基添加15%琼脂。
3.MRS培养基（青岛海博生物技术有限公司）。
4.酸性脲酶酶活测定方法：用移液管准确吸取由pH4.550mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至适当浓度的纯化后酶液各0.2mL于2支25mL的比色管中，其中一支作为对照，加塞，沸水浴处理5min，使酶失活，冷却后将2支比色管于37℃水浴中保温平衡10min，分别加入0.8mL3%EC底物溶液(pH4.5，0.05mol·L-1的柠檬酸缓冲液配制)，摇匀，于37℃下恒温反应20min，立即用移液管加1mL终止剂（10%三氯乙酸）于比色管中，振荡混匀，再向比色管中依次加入1mL显色剂（15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL）和1mL显色剂II（13.125gNaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL），每加入一种显色剂均需强烈振荡，使之充分混匀，37℃下恒温反应20min，然后用超纯水定容至25mL，在625nm下比色测定OD值，计算酶活（采用氯化铵绘制标准曲线）。
5.酸性脲酶酶活力单位定义：在常压，pH4.5（50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）和37℃下，每分钟降解尿素产生1μmolNH3 +所需的酶量为一个酶活力单位。
表1
实施例1：酸性脲酶基因的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒（OMEGA）使用说明提取罗伊氏乳杆菌（LactobacillusreuteriCICC6124）基因组DNA，-20℃保藏备用。根据NCBI公布的酸性脲酶基因序列（GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098），设计引物P1-P2，以罗伊氏乳杆菌DNA为模板进行酸性脲酶基因的扩增，扩增条件为：95℃，5min，1个循环；95℃，30s，55℃，30s，72℃，5min30s，30个循环；72℃，5min，1个循环；12℃，5min，1个循环。扩增体系：按照PrimeSTARHSDNAPolymerase（TAKARA）试剂盒说明书配制50μL体系。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收方法按照胶回收试剂盒（Thermo）说明书进行。PCR扩增获得的目的基因连接pMD19T-simple（TAKARA）克隆载体并测序验证。
实施例2：重组乳酸菌的构建及酸性脲酶的高效表达
（1）将实施例1克隆获得的pMD19T-ureLR质粒用NcoI和SacI两种限制性内切酶（Thermo）进行双酶切，酶切后按实施例1方法进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。将回收得到的目的片段连接于采用相同限制性内切酶（NcoI和SacI）酶切回收后的乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148，转化E.coilMC1061感受态细胞，涂布于含有10μg/mL氯霉素的LB平板上，待有菌落长出后，随机挑取几个菌落，以P3-P4为引物，PCR鉴定阳性克隆，将菌落PCR验证正确的菌落接种LB液体，培养后提取质粒测序验证，连接成功的酸性脲酶质粒命名为pNZ8148-ureLR，并电转化至表达宿主菌乳酸乳球菌NZ9000中，菌落PCR验证阳性克隆子，成功获得酸性脲酶重组菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148-ureLR)。
（2）将实施例1克隆获得的pMD19T-ureLR质粒用NcoI和SacI两种限制性内切酶（Thermo）进行双酶切，酶切后按实施例1方法进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。将回收得到的目的片段连接于采用相同限制性内切酶（NcoI和SacI）酶切回收后的乳酸乳球菌表达质粒pNZ8149，按照核酸共沉淀试剂盒（TAKARA）使用说明书对连接液进行共沉淀，共沉淀复溶后将连接液电转化表达宿主菌乳酸乳球菌NZ9000中，菌落PCR验证阳性克隆子，成功获得酸性脲酶重组菌株乳酸乳球菌NZ3900(pNZ8149-ureLR)。
（3）根据NCBI公布的P32（GenBank:M24764.1）启动子序列，设计引物P5-P6，以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板进行P32启动子的PCR扩增，扩增条件为：95℃，5min，1个循环；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min，1个循环；12℃，5min，1个循环。扩增体系：按照PrimeSTARHSDNAPolymerase（TAKARA）试剂盒说明书配制50μL体系。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收方法按照胶回收试剂盒（Thermo）说明书进行。回收产物用BglII和NcoI两种限制性内切酶（Thermo）进行双酶切，酶切后按实施例1方法进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。将回收得到的目的片段连接于采用相同限制性内切酶（BglII和NcoI）酶切回收后的乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148，转化E.coilMC1061感受态细胞，涂布于含有10μg/mL氯霉素的LB平板上，待有菌落长出后，随机挑取几个菌落，以P5-P6为引物，PCR鉴定阳性克隆，将菌落PCR验证正确的菌落接种LB液体，培养后提取质粒测序验证，连接成功的酸性脲酶质粒命名为pNZ32，按（1）的方法构建酸性脲酶表达载体，命名为pNZ32-ureLR，并分别电转化至表达宿主菌乳酸乳球菌NZ9000，植物乳杆菌JN1207和嗜热链球菌JN1201中，菌落PCR验证阳性克隆子，成功获得酸性脲酶重组菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ32-ureLR)，植物乳杆菌CICC6002（pNZ32-ureLR）和嗜热链球菌CICC6216（pNZ32-ureLR）。
（4）根据NCBI公布的P59（GenBank:M24806.1）启动子序列，设计引物P7-P8，按(3)的方法构建组成型P59启动子的表达载体（pNZ59）和酸性脲酶表达载体（pNZ59-ureLR），并构建酸性脲酶重组菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ59-ureLR)，植物乳杆菌CICC6002（pNZ59-ureLR）和嗜热链球菌CICC6216（pNZ59-ureLR）。
（5）对成功构建的重组乳酸乳球菌菌株NZ9000（pNZ8148-UreLR）进行摇瓶发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至GM17（终浓度添加5μg/mL氯霉素）培养基中，50mL摇瓶中装液5mL，温度30℃，静置培养16h。摇瓶发酵：按2%的接种量将培养好的种子接入GM17(终浓度添加5μg/mL氯霉素，1.0mM的NiCl2)培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度30℃，静置培养至菌体OD600为0.4，加诱导剂Nisin（终浓度10ng/mL）,诱导表达8h。结果如图2所示，酶活为1500U/L。
（6）对成功构建的重组乳酸乳球菌菌株NZ3900（pNZ8149-UreLR）进行摇瓶发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至LM17培养基中，50mL摇瓶中装液5mL，温度30℃，静置培养16h。摇瓶发酵：按2%的接种量将培养好的种子接入GM17(终浓度添加5μg/mL氯霉素，1.0mM的NiCl2)培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度30℃，静置培养至菌体OD600为0.4，加诱导剂Nisin（终浓度10ng/mL）,诱导表达8h。结果如图2所示，酶活为1450U/L。
（7）对成功构建的重组乳酸乳球菌菌株NZ9000（pNZ32-UreLR）和乳酸乳球菌NZ9000（pNZ59-UreLR）进行摇瓶发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至GM17（终浓度添加5μg/mL氯霉素）培养基中，50mL摇瓶中装液5mL，温度30℃，静置培养16h。摇瓶发酵：按2%的接种量将培养好的种子接入GM17(终浓度添加5μg/mL氯霉素，1.0mM的NiCl2)培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度30℃，表达24h。结果如图2所示，乳酸乳球菌菌株NZ9000（pNZ32-UreLR）酶活为900U/L，乳酸乳球菌NZ9000（pNZ59-UreLR）酶活为1000U/L。
（8）对成功构建的重组植物乳杆菌CICC6002（pNZ32-UreLR）和植物乳杆菌CICC6002（pNZ59-UreLR）进行摇瓶发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至MRS（终浓度添加5μg/mL氯霉素）培养基中，50mL摇瓶中装液5mL，温度37℃，静置培养16h。摇瓶发酵：按2%的接种量将培养好的种子接入MRS(终浓度添加5μg/mL氯霉素，1.0mM的NiCl2)培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度37℃，表达24h。结果如图2所示，植物乳杆菌CICC6002（pNZ32-UreLR）酶活为640U/L，植物乳杆菌CICC6002（pNZ59-UreLR）酶活为850U/L。
（9）对成功构建的重组嗜热链球菌CICC6216（pNZ32-UreLR）和嗜热链球菌CICC6216（pNZ59-UreLR）进行摇瓶发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至GM17（终浓度添加5μg/mL氯霉素）培养基中，50mL摇瓶中装液5mL，温度37℃，静置培养16h。摇瓶发酵：按2%的接种量将培养好的种子接入GM17(终浓度添加5μg/mL氯霉素，1.0mM的NiCl2)培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度37℃，表达24h。结果如图2所示，嗜热链球菌CICC6216（pNZ32-UreLR）酶活为700U/L，嗜热链球菌CICC6216（pNZ59-UreLR）酶活为930U/L。
实施例3：食品级酸性脲酶的表达及纯化制备
对成功构建的重组乳酸乳球菌菌株NZ3900（pNZ8149-UreLR）进行上罐发酵实验，种子液制备：将实验菌株接种至LM17培养基中，50mL摇瓶中装液20mL，温度30℃，静置培养16h；3L发酵罐装1.5L培养基（5%乳糖，1.5%蛋白胨，1%酵母膏，1mMMgSO4，0.1mMMnSO4，2.0mM的NiCl2），温度30℃，静置培养至菌体OD600为1.0，加诱导剂Nisin（终浓度10ng/mL），诱导表达27h，酶活达到10200U/L（如图3所示）。离心收集菌体后，用300mL无菌蒸馏水洗涤菌体2次，用10mMTris-HCl（pH7.4），1mMEDTA溶液200mL重悬菌体，添加10mg溶菌酶，37℃水浴处理3h，300w，超声破碎20min，离心收集上清，比酶活为10.4U/mg添加酒精至终浓度60%，冰上放置30min,离心收集沉淀，用10mMTris-HCl（pH7.4）,1mMEDTA溶液200mL重悬沉淀，离心收集上清，比酶活为20.8U/mg；采用DEAE离子交换树脂吸附，用0-1MNaCl溶液进行梯度洗脱，收集活性部位，比酶活为67.3U/mg，将活性部位用疏水层析柱吸附，用1-0MNaCl溶液进行梯度洗脱，收集活性部位，纯化后比酶活为325.6U/mg。取各纯化阶段获得的酶液20μL,加5μL5×上样缓冲液，加热煮沸10min，取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳检测，SDS-PAGE使用5%的浓缩胶和15%的分离胶，采用用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色，电泳图如图4所示。
实施例4：酸性脲酶酶学性质分析测定
酸性脲酶对尿素底物的降解性质分析：分别对
（1）pH对脲酶活性的影响：用0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置不同pH的缓冲液，用不同pH的缓冲液分别配置3%的尿素溶液，以此为反应底物，37℃条件下测定酶活；
（2）温度对脲酶活性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液分别配置3%的尿素溶液，在不同温度条件下测定酶活；
（3）酒精浓度对脲酶活性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液，加入不同浓度酒精后分别配置3%的尿素溶液，37℃条件下测定酶活；
（4）pH对脲酶稳定性的影响：用0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置不同pH的缓冲液，用不同pH的缓冲液配置酶液，37℃处理1h后，测定酶活；
（5）温度对脲酶稳定性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液配制酶液，在不同温度条件下处理1h后，37℃测定酶活；
（6）酒精浓度对脲酶稳定性的影响：0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液中加入不同浓度酒精后，37℃处理1h后，测定酶活。
通过研究发现，重组表达的酸性脲酶的最适pH为3.0（图6B），最适反应温度为70℃（图6A），pH稳定性试验表明，该酶在pH3.0～6.0之间酶活稳定（图6E）；温度稳定性表明，20～50℃处理对酶活无影响，70℃处理后仍残留30%以上的酶活（图6D）；酒精稳定性试验表明，5%～15%范围内对酶活无影响，25%酒精处理后仍残留60%以上的酶活（图6F）。
实施例5：酸性脲酶对氨基甲酸乙酯（EC）的降解分析
酸性脲酶对EC底物的降解性质分析：分别对
（1）pH对脲酶活性的影响：用0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置不同pH的缓冲液，用不同pH的缓冲液分别配置3%的EC溶液，以此为反应底物，37℃条件下测定酶活；
（2）温度对脲酶活性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液分别配置3%的EC溶液，在不同温度条件下测定酶活；
（3）酒精浓度对脲酶活性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液，加入不同浓度酒精后分别配置3%的EC溶液，37℃条件下测定酶活；
（4）pH对脲酶稳定性的影响：用0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置不同pH的缓冲液，用不同pH的缓冲液配置酶液，37℃处理1h后，测定酶活；
（5）温度对脲酶稳定性的影响：以0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液配制酶液，在不同温度条件下处理1h后，37℃测定酶活；
（6）酒精浓度对脲酶稳定性的影响：0.2mMNa2HPO4和0.1mM柠檬酸配置的pH4.5缓冲液中加入不同浓度酒精后，37℃处理1h后，测定酶活。
重组表达的酸性脲酶的最适pH为5.0（图6B），最适反应温度为60℃（图6A），pH稳定性试验表明，该酶在pH3.0～7.0之间酶活稳定（图6E）；温度稳定性表明，20～50℃处理酶活稳定，70℃处理后仍残留30%以上的酶活（图6D）；酒精稳定性试验表明，5%～15%范围内对酶活无影响，25%酒精处理后仍残留60%以上的酶活（图6F）。
实施例6：酸性脲酶的应用
黄酒中的尿素含量测定方法参照二乙酰一肟法，在波长527nm条件下，以超纯水作为空白，测定尿素标准溶液的OD527，绘制标准曲线。在相同条件下测定黄酒的OD527，计算黄酒中尿素的浓度。
黄酒中EC含量测定参照固相萃取结合GC-MS法，以氘代同位素为内标，采用硅藻土固相萃取柱萃取，乙醚洗脱，GC-MS选择离子法测定。
以酶活0.05U/mL的添加量，向市售黄酒（酒精浓度14%，pH3.7，尿素浓度35.8mg/L）中添加粗酶液，在20℃下放置，监测3天内的尿素和EC去除率，结果如图6，2天后尿素全部降解，尿素降解率达到了100%；3天后EC的含量从278μg/L降低至78μg/L，EC降解率达到了72.0%。

Claims (2)

1.一种高效制备食品级酸性脲酶的方法，其特征在于，从罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)基因组上克隆获得酸性脲酶基因，将重组质粒导入乳酸乳球菌中，构建高效表达酸性脲酶的重组菌，利用重组菌发酵生产脲酶；所述方法中酸性脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控，制备步骤如下：
1)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，GI:194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ8148或pNZ8149酶切、连接构建重组质粒；
3)将步骤2)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900构建产脲酶重组乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148-ureLR)或NZ3900(pNZ8149-ureLR)，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控；
4)利用重组乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148-ureLR)或NZ3900(pNZ8149-ureLR)发酵生产脲酶；
2.权利要求1所述方法用于消除发酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯。
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