CN101041075A

CN101041075A - 生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法

Info

Publication number: CN101041075A
Application number: CN 200710057173
Authority: CN
Inventors: 张其清; 史艳萍; 李学敏
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2007-09-26
Anticipated expiration: 2027-04-20
Also published as: CN100571781C

Abstract

本发明涉及一种生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法。生物素化普鲁兰多糖纳米微粒是将生物素化普鲁兰多糖衍生物在有机溶剂溶解，再加入水中生成悬液，然后悬液进行透析，超滤浓缩，冷冻干燥即可，平均粒径为100－300纳米。制备过程中只需加入少量甚至不加任何表面活性剂。条件温和、安全。制备的纳米微粒表面光滑、规整。本发明制备的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒具有特异结合肿瘤细胞的能力，是一种更好的具有肿瘤靶向载体材料。

Description

生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法。

技术背景

普鲁兰多糖(Pullulan)中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普鲁兰糖。它是出芽孢梗霉产生的胞外多糖，以α-1，6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。α-1，4-糖苷键同α-1，6-糖苷键的比例为2∶1，聚合度(D.P)为100-5000。商品普鲁兰糖平均分子量2×10⁵，大约由480个麦芽三糖组成。该物质无毒，无致突变作用，无色无味，可以食用，具有良好的生物相容性，能够被体内淀粉酶降解，是一种良好的药物载体材料。其水溶液黏度明显低于其它多糖溶液，使其更有利于实际应用。研究也表明，普鲁兰多糖能够与肝细胞表面的半乳糖受体结合，可为药物肝脏靶向提供新材料。但是，由于普鲁兰多糖的水溶性极强，所以要想在水溶液中制备出能够载药的微粒，必须在制备过程中加入交联剂，如戊二醛等，这些有毒的交联剂在后处理过程很难彻底清除，就会导致最终的产品具有一定的毒性。近年来，合成的疏水改性普鲁兰多糖衍生物作为药物载体已广泛用于多种化学药物、蛋白药物和基因药物的递送系统。

生物素(biotin)，又称维生素H，分子式C₁₀H₁₆N₂O₃S，化学结构式：

生物素是一种人体必需的水溶性维生素，但人体不能自身合成，必须通过外界补充。进一步的研究表明，人体几乎所有的细胞表面都有生物素受体的表达，尤其肿瘤细胞。肿瘤细胞快速的增长需要大量的营养因子，例如生物素，所以细胞表面会过度表达结合生物素的受体，这样在肿瘤细胞周围会形成一个较正常组织相对较高的结合生物素的区域。利用这个特点可以将生物素受体作为一种特异识别的靶点，通过结合生物素使材料具有肿瘤细胞靶向。

近年来研究表明，疏水改性的普鲁兰多糖衍生物能够在水溶液中通过疏水作用自组装成纳米微粒，并广泛用于了各种化学药物，蛋白药物和基因药物的研究。纳米微粒用作药物载体能增加药物在病灶部位停留时间，达到缓释及可控释放的目的；同时通过化学键合的方法把一些具有靶向作用或控制药物释放的功能性基团结合到纳米粒子表面，可以实现靶向及控缓释给药的目的。可用于制备纳米微粒的材料必须具有良好生物相容性，可生物降解性，且制备方法简便。

发明内容

本发明旨在提供一种生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法。它是对普鲁兰多糖载体材料的改性，结合普鲁兰多糖和生物素的特点，本发明制备的生物素化普鲁兰多糖衍生物，不仅易于在水溶性中形成纳米微粒，粒径分布范围窄，表面光滑，规整，而且具有特异结合肿瘤细胞的能力，是一种更好的具有肿瘤靶向载体材料。

本发明制备方法的优点在于纳米微粒可直接在水溶液中形成，引入的有机试剂可通过旋转蒸发或透析的方法除尽，制备过程中只需加入少量甚至不加任何表面活性剂，条件温和、安全。

本发明提供的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒是将生物素化普鲁兰多糖衍生物在有机溶剂溶解，再加入水溶液中生成悬液，然后悬液进行透析，超滤浓缩，冷冻干燥即可。平均粒径为100-300纳米，分散系数0.002-0.250。

本发明所述生物素化普鲁兰多糖纳米微粒制备方法的步骤如下：

1)首先是在有机溶剂中，生物素，二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶和普鲁兰多糖反应，经过透析制备得到的生物素化普鲁兰多糖衍生物，生物素取代度为20-85％。

2)生物素化普鲁兰多糖衍生物完全溶解于有机溶剂中(有机相)，搅拌下再加到水溶液中(水相)，形成纳米悬液；水相可为水或者水与乙醇、水与丙酮混合溶液。水∶乙醇(体积比)＝1∶0.5～4，水∶丙酮(体积比)＝1∶0.5～4；有机溶剂中生物素化普鲁兰多糖衍生物质量浓度为0.5-10％；

3)将2)中纳米悬液在1-10L水中透析3-12小时；

4)纳米悬液超滤浓缩，加1-5％冻干保护剂冷冻干燥。超滤管截留分子量30,000，转数1000-1800rpm，时间10-20分钟。

本发明所述的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)；水溶液中可含有表面活性剂聚乙烯醇(PVA分子量30,000-70,000)，PVA浓度：0.1-4％；冻干保护剂为：甘露糖，山梨醇，葡萄糖，乳糖或蔗糖。有机相∶水相＝1∶1～20(体积比)。

本发明制备的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒具有特异结合肿瘤细胞的能力，是一种更好的具有肿瘤靶向载体材料。

本发明所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒及其制备方法的优点在于制备过程中只使用低速的机械搅拌，纳米微粒可直接在水溶液中形成，引入的有机试剂可通过旋转蒸发或透析的方法除尽，制备过程中只需加入少量甚至不加任何表面活性剂。条件温和、安全。制备的纳米微粒表面光滑、规整。平均粒径为100-300纳米，粒径分布范围窄。

附图说明：

图1，生物素化普鲁兰多糖纳米微粒透射电镜(TEM)照片。

图2，生物素化普鲁兰多糖纳米微粒粒径分布图。

具体实施方式

实施例1：

取生物素2.44g，二环己基碳二亚胺(DCC)2.06g和4-二甲胺基吡啶(DMAP)611mg加入50ml无水二甲基亚砜(DMSO)中完全溶解，并反应1小时。随后，将244mg普鲁兰多糖加入到上述反应液中反应6天，反应在磁力搅拌下进行。反应结束后将反应液用布氏漏斗抽滤三次，除掉反应液中的沉淀物DCU。将滤液每25ml放入一个透析袋，再将透析袋放入3L去离子水中透析6天，每30分钟换水一次。透析结束后将透析袋内的白色沉淀物取出，使用布氏漏斗抽滤3次，将漏斗上的白色固体收集，用200ml二氯甲烷洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，干燥后，得到白色固体物质，生物素取代度为81％。

取代度测定方法如下：精确称取产物50mg，加盐酸溶解并定容至20ml。将盐酸溶液通过电感耦合等离子体光谱仪(IPC)测定S元素含量，再根据公式：

取代度％＝S元素(摩尔数)/无水葡萄糖残基(摩尔数)×100

计算得到生物素取代度。

实施例2：

取实施例1制备的生物素化普鲁兰多糖10mg完全溶解于2mlDMSO中，在搅拌下将2mlDMSO溶液加入到4ml去离子水中，迅速形成具有淡蓝色乳光的纳米悬液。将纳米悬液倒入透析袋中(截留分子量8,000-14,000)，在3L去离子水中透析8小时。将透析后的纳米悬液使用截留分子量为30,000超滤管，在1200rpm下离心15分钟进行超滤浓缩。在超滤液中加入5％甘露醇进行冷冻干燥，得到白色粉末状生物素化普鲁兰多糖纳米微粒。取一定量白色粉末重新分散在一定体积去离子水中，取分散好的纳米悬液放入激光粒度分析仪样品池中进行粒径分析。测得平均粒径为123.6±0.7纳米，分散系数0.094。图1，生物素化普鲁兰多糖纳米微粒透射电镜(TEM)照片。图2，生物素化普鲁兰多糖纳米微粒粒径分布图。

实施例3：

取生物素化普鲁兰多糖10mg完全溶解于2mlDMSO中，在低速磁力搅拌下将2mlDMSO溶液滴加到5ml去离子水与5ml乙醇混和而成的水相中，迅速形成具有淡蓝色乳光的纳米悬液。将纳米悬液倒入透析袋中(截留分子量8,000-14,000)，在3L去离子水中透析8小时。将透析后的纳米悬液使用截留分子量为30,000超滤管，在1200rpm下离心15分钟进行超滤浓缩。在超滤液中加入5％甘露醇进行冷冻干燥，得到白色粉末状生物素化普鲁兰多糖纳米微粒。平均粒径为170.7±0.5纳米，分散系数0.065。

Claims

1、一种生物素化普鲁兰多糖纳米微粒，其特征在于它是将生物素化普鲁兰多糖衍生物在有机溶剂溶解，再加入水中生成悬液，然后悬液进行透析，超滤浓缩，冷冻干燥，平均粒径为100-300纳米，分散系数0.002-0.250。

2、权利要求1所述生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于它包括的步骤如下：

1)首先是在有机溶剂中，生物素，二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶和普鲁兰多糖反应，经过透析制备得到的生物素化普鲁兰多糖衍生物；

2)生物素化普鲁兰多糖衍生物完全溶解于有机溶剂中形成有机相，搅拌下再加到水溶液中，形成纳米悬液；

3)将2)中纳米悬液在1-10L水中透析3-12小时；

4)纳米悬液超滤浓缩，加1-5％冻干保护剂冷冻干燥；所述的超滤管截留分子量30,000，转数1000-1800rpm，时间10-20分钟。

3、根据权利要求2所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于所述的水溶液可为水或者水与乙醇、水与丙酮混合溶液。

4、根据权利要求3所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于：水∶乙醇或丙酮(体积比)＝1∶0.5～4。

5、根据权利要求3所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于：水溶液中含有表面活性剂聚乙烯醇(PVA分子量30,000-70,000)，PVA浓度：0.1-4％。

6、根据权利要求2所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于所述的有机溶剂中生物素化普鲁兰多糖衍生物质量浓度为0.5-10％。

7、根据权利要求2所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。

8、根据权利要求2所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于所述的冻干保护剂为：甘露糖，山梨醇，葡萄糖，乳糖或蔗糖。

9、根据权利要求2所述的生物素化普鲁兰多糖纳米微粒的其制备方法，其特征在于所述的有机相∶水相＝1∶1～20，体积比。