CN108721251B - 靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向β‑环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统及其制备方法和应用。本发明将β‑环糊精接枝在壳聚糖大分子上，再联合透明质酸HA制得β‑CD‑CS/HA，再通过离子交联法制得纳米粒，然后包裹厄洛替尼Erlotinib制得Erlotinib@β‑CD‑CS/HA纳米复合物。本发明所制备的Erlotinib@β‑CD‑CS/HA离子交联纳米载药系统，靶向治疗非小细胞肺癌，不仅可以为肿瘤治疗提供了一个新方法，也为靶向载药系统研究指明了一种新思路。

Description

靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒载药系统及其制备方法和应用。

背景技术

壳聚糖(chitosan，聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖)是甲壳素(chitin，聚-2-乙酰-氨基-β(1，4)-D-葡萄糖)的脱乙酰基产物壳。甲壳素广泛存在蟹、虾等低等动物以及藻类、真菌等低等植物中，含量极其丰富，自然界每年产量约在1010t～1011t，是仅次于纤维素的第二大多糖。作为甲壳素的衍生物，壳聚糖是唯一天然存在及阳离子的多糖。通常情况下，壳聚糖呈一种白色、无味的半透明固体，平均分子质量一般从几万至数百万不等。不溶于水和一般有机试剂，只有在醋酸溶液中，壳聚糖中的氨基葡萄糖单元上的游离氨基被质子化以后才能被溶解。壳聚糖具有生物相容性好，且能被生物降解，降解产物无毒性，其衍生物具有许多独特的等一系列特殊化学和生物特性，适合作为药物的控缓释载体，被广泛用于制剂研究。壳聚糖容易进行如酰基化、羧基化、醚化、N-烷基化、酯化、水解等改性。由于壳聚糖具有带阳离子的氨基，因此，壳聚糖在药物控制释放载体、色谱分离填料和水处理剂等。方面有着巨大的应用前景。

天然环糊精（cyclodextrin，CD），作为第二代超分子主体化合物，是一类环状寡聚糖，在淀粉酶的作用下分离得到。目前，已经被广泛应用的环糊精主要有三种，分别是具有6、7、8个葡萄糖单位的α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）和γ-环糊精（γ-CD）其中应用最广的主要是β-环糊精。其中，葡萄糖基通过α-1,4糖苷键连接组成于类似漏斗状的结构，漏斗的狭窄开口处和宽口处分别为初级面和次级面，均连接着羟基，漏斗空腔内部排列着来自C-3和C-5碳原子的CH基及糖苷键中的氧原子。当环糊精中葡萄糖单元数目增加时，组成环糊精的葡萄糖均为D型葡萄糖，故环糊精分子本身具有手性，且所有葡萄糖单元都保持椅式构像，基本上没有变形，其内腔半径变大，其空腔内部呈非极性，外部呈极性，因而环糊精具有内腔疏水，外腔亲水的特性，能够与多种小分子物质形成典型的主客体化合物。正是由于环糊精的分子构型比较特殊，其外形象一个内空去顶的锥形体，含有一个亲水性外表面和一个疏水性内孔洞，这种环状结构允许环糊精包埋客体分子并形成内含复合物，这就是环糊精在食品和制药行业有很大应用潜力的原因。再者，相邻葡萄糖单元中烃基氢可以形成分子内氢键，空腔内部有较大的电子云密度，因此，环糊精分子具有碱性，其化学法改性是利用β-环糊精分子外表面醇羟基进行酯化，醚化，氧化，交联等化学反应，引进新的功能团，生成具有新性质或新功能的β-环糊精衍生物。使得β-环糊精分子易于修饰；以下为 β -环糊精的结构式：

。

透明质酸（ hyaluronic acid ）的基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。与其它粘多糖不同，它不含硫，是一种在生物体内广泛存在的天然线性糖胺多糖，其化学结构式如下所示：

；

其可广泛分布在哺乳动物的骨髓细胞外基质和疏松结缔组织中，而作为透明质酸受体CD44 是一种跨膜糖蛋白，在细胞的迁移、增殖、分化、黏附和基因表达等有着重要关系。CD44 基因位于人类第11号染色体的短臂上，视其外显子的转录片段是否参与选择性拼接分为正常型CD44(CD44s) 和变异型CD44(CD44v)。CD44作为HA 受体之一，在多种恶性肿瘤如乳腺癌、皮肤癌、卵巢癌等细胞表面都高度表达，HA可以通过与CD44受体的特异性结合，通过受体-配体机制实现靶向药物递送的目的。综合HA和纳米给药系统的优点，对开发靶向纳米给药系统（NDDS）的药物载体具有较高的实用价值。

厄洛替尼(Erlotinib)，化学结构式为，通用商品名称为特罗凯（Tarceva），是其冰乙酸盐。化学名为N-(3-乙炔苯基)-6,7-双(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺冰乙酸盐，是一种对表皮生长因子受体EGFR（EpithErloialGrowthFactorReceptor）具有高选择性的小分子喹唑啉类衍生物。Erlotinib用于两个或两个以上的化疗失败后的局部晚期或转移的非小细胞肺癌（NSCLC）的三线治疗方案,于2004年正式获得美国FDA批准上市的抗肿瘤靶向治疗药物，同时得到了我国国家食品药品监督管理总局（CFDA）的认证，并已于2007年批准进入我国市场。，也常与抗癌药吉西他滨联合用于治疗局部晚期或转移性的胰腺癌。厄洛替尼主要在肝脏清除，经体外细胞色素酶P450分析表明厄洛替尼主要通过CYP3A4代谢，少量通过CYP1A2和肝外同工酶CYP1A1代谢。口服Erlotinib最常见的不良反应是皮疹（75%）和腹泻（54%），皆为不明原因的不良反应且较为轻微，无需中断用药即可处理。大量研究表明Erlotinib针对EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）的抗肿瘤作用是体现在其能够抑制与表皮生长因子受体（EGFR）相关的细胞内酪氨酸激酶（TK）的磷酸化，进而阻断表皮生长因子（HER1）的信号传导，其中，TK是肿瘤细胞生长的重要物质，Erlotinib可通过抑制TK的活性来抑制肿瘤生长。

正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，纳米粒不易透过，但是肿瘤微环境较复杂，肿瘤血管丰富，血管壁间隙较宽，结构完整性差，淋巴回流缺失，可以让尺寸几百纳米的纳米给药体系通过，因此将药物制备成纳米给药体系已经成为肿瘤治疗领域的新趋势，具有广阔的应用前景。本发明以人肺腺癌细胞（A549）为代表的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞验证基于β-环糊精接枝壳聚糖纳米载厄洛替尼纳米复合物和肿瘤细胞CD44受体靶向的透明质酸（HA）构建具有靶向功能一个具有靶向离子交联纳米给药系统Erlotinib@β-CD-CS/HA NPs。

发明内容

本发明的目的是基于β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米载药系统和肿瘤细胞CD44受体靶向的透明质酸（HA），采用离子交联法构建一个具有靶向纳米给药系统Erlotinib@β-CD-CS/HA NPs，靶向输送抗癌药物至肿瘤部位，发挥抗肿瘤作用。

本发明所述的Erlotinib@β-CD-CS/HA NPs制备步骤如下：

A.准确称取纯化后的壳聚糖加至烧杯中，逐滴滴入体积浓度1％的乙酸溶液搅拌溶胀溶解壳聚糖，搅拌24小时，得到粘稠透明的壳聚糖溶液；

B.准确称取49.73 mmol C₂H₃ClO₂，将其溶于10mL二次水中；称取3.55 mmol的β-环糊精，溶于 4mL质量分数为25%的NaOH溶液，逐滴滴入配制好的C₂H₃ClO₂溶液中，室温下反应，使用冰乙酸调节pH至7，然后加入合适量的甲醇，直到不再有沉淀生成，放置12h后，再过滤，之后继续加水溶解，再加合适量的甲醇，直到不再有沉淀生成，过滤，所得产物用足量乙醇水溶液( V_乙醇 :V_水= 8：2 )反复洗涤，至无氯为止，干燥，得白色产物，即为羧甲基-β-环糊精。

C.将羧甲基-β-环糊精溶于去离子水中，加入后测量溶液的pH值，用少量稀冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4左右，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐( EDC )和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基（摩尔比为1:1），在室温下、搅拌的条件下反应4个小时，活化羧甲基-β-环糊精上的羧基；

D.将透明质酸溶于去离子水中，加入后测量溶液的pH值，用少量稀冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4左右，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐(EDC )和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基（摩尔比为1:1），在室温下、搅拌的条件下反应4个小时，活化透明质酸上的羧基；

E.将B步骤制备的活化好的羧甲基-β-环糊精加入到壳聚糖溶液中，调节pH，控制体系pH在3~4之间，4h后，以同样的方法 把步骤（4）中加入活化好羧基的透明质酸加入到壳聚糖和制备的活化好的羧甲基-β-环糊精反应体系中，加入透明质酸，在室温条件下持续搅拌，反应48小时，将产物使用透析袋透析，高速低温离心，于- 80℃预冻，真空冻干至恒重，获得的产物即为β-CD-CS/HA；

F.将E步骤制备的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸溶于1wt％的冰乙酸溶液，形成1wt％的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸溶液，超声处理20-30分钟，用微孔过滤器过滤，得到羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸滤液，在超声条件下逐滴滴入三聚磷酸钠（TPP）溶液（m_TPP: m_β-CD-CS/HA=2：1），通过离子交联法制得纳米粒，反应0.5~1小时，过滤，滤液于零下70摄氏度冷冻干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒（β-CD-CS/HA NPs）。

G.室温下，将100 µL Erlotinib的良溶剂溶液逐滴加入到700 µL不良溶剂中，然后加入100 µL的β-CD-CS/HA NPs 振荡1分钟后，超声30分钟以上，制得Erlo@β-CD-CS/HA离子交联纳米复合物，其中上述的良溶剂和不良溶剂分别为1% 冰乙酸和甲醇。

其中壳聚糖、β-环糊精的摩尔比为1~8:1~4。

步骤（3）和步骤（4）中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐 EDC和N-羟基琥珀酰亚胺 NHS活化羧基的摩尔比为1:1。

步骤（3）中羧甲基-β-环糊精、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为2:2:1。

步骤（4）中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐 EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS摩尔比为2:2:1。

所述活化好的羧甲基-β-环糊精与透明质酸摩尔比为1:1。

步骤（6）三聚磷酸钠TPP与β-CD-CS/HA质量比为2：1。

本发明的优点在于：

1.本发明所制备的Erlotinib@β-CD-CS/HA通过离子交联法制得，操作简便易行。

2.与合成的高分子相比，本发明所制备的Erlotinib@β-CD-CS/HA具有壳聚糖作为一种天然的高分子阳离子聚合物，生物相容度高、毒性低和生物降解性好等特点，又具有环糊精的包络识别，运输和控制释放的性能，适用于药物、蛋白等控制释放载体，联合透明质酸本身具有的识别肿瘤细胞表面过度表达特定受体的能力，可以将抗癌药物靶向传递到肿瘤细胞内，另一方面有提高药物载体靶向性，使药物富集于肿瘤组织，从而更好地杀死肿瘤细胞。

3.本发明所构建的大分子纳米载药系统，材料简单易得，具有普遍推广性。

4.本发明所构建的β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米载药系统可以包载厄洛替尼这种抗肿瘤药物到达肿瘤部位；

5.本发明所构建的Erlotinib@β-CD-CS/HA离子交联纳米载药系统可以包载厄洛替尼这种抗肿瘤药物并能够靶向CD44 高表达肿瘤细胞，可特异性地输送更多治疗药物至肿瘤部位发挥药效，有明显的治疗优势。

6.本发明所制备的Erlotinib@β-CD-CS/HA离子交联纳米载药系统，靶向治疗非小细胞肺癌，不仅可以为肿瘤治疗提供了一个新方法，也为靶向载药系统研究指明了一种新思路。

附图说明

图1. 本发明给药系统 Erlotinib@β-CD-CS/HA纳米复合物在β-CD-CS/HA NPs与厄洛替尼的质量比为8:1时纳米的粒径大小；

图2. 本发明 Erlotinib@β-CD-CS/HA纳米复合物在β-CD-CS/HA NPs与厄洛替尼的质量比为8:1时纳米的电势大小；

图3本发明给药系统Erlotinib@β-CD-CS/HA纳米复合物在β-CD-CS/HA NPs与厄洛替尼的质量比为8:1时纳米的稳定性检测；

图4 厄洛替尼的标准曲线；

图5 本发明纳米给药系统 Erlotinib@β-CD-CS/HA NPs在不同pH条件下的释放曲线。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

一、Erlotinib@β-CD-CS/HA的制备，包括以下步骤：

（1）室温条件下，准确称取纯化后的7.10g壳聚糖加至烧杯中，逐滴滴入体积分数为1％的冰乙酸溶液搅拌溶胀溶解壳聚糖，搅拌24小时，使得壳聚糖充分溶解，得到粘稠透明的壳聚糖溶液。

（2）准确称取11.64g（99.46 mmol）C₂H₃ClO₂，将其溶于10ml 超纯水H₂O中。称取8.10g （7.10 mmol）的β-环糊精，溶于50ml质量分数为25%的NaOH溶液，逐滴滴入配制好的氯乙酸溶液中，室温下反应，冰乙酸调节pH至9，然后加入合适量的甲醇（50~60滴/min），直到不再有沉淀生成，放置12小时，再过滤，之后继续加水溶解，再逐滴滴入（50~60滴/min）合适量的甲醇，直到不再有沉淀生成，过滤，所得产物用足量乙醇水溶液( V_乙醇:V_水=8：2 )反复洗涤，至无氯为止，干燥，得白色产物，即为羧甲基-β-环糊精。

（3）活化羧甲基-β-环糊精的羧基：将2 g 羧甲基-β-环糊精溶于20 ml去离子水中，加入后测量溶液的pH值，用少量1%冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4，再加入1.91 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐( EDC )和 1.15 g N-羟基琥珀酰亚胺( NHS )活化羧基，在室温下、搅拌的条件下反应4个小时左右，活化羧甲基-β-环糊精上的羧基；

（4）将1.0 g透明质酸溶于去离子水中，加入后测量溶液的pH值，用少量冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4，再加入0.9 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐( EDC )和 0.5g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基，在室温下、搅拌的条件下反应4个小时，活化透明质酸上的羧基；

（5）将活化好的羧甲基-β-环糊精加入到壳聚糖溶液中混合，在室温下搅拌，搅拌速度为180 r/min条件下，用冰乙酸调节pH，控制体系pH在3~4之间，4h后，以以同样的方法把步骤（4）中加入活化好羧基的透明质酸加入到壳聚糖和制备的活化好的羧甲基-β-环糊精反应体系中，透明质酸，在室温条件下持续搅拌4000 r/min，反应48小时，将产物使用分子量为10000透析袋透析，高速低温离心，于- 80℃预冻，真空冻干至恒重，获得的产物即为β-CD-CS/HA；

（6）将制备好的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸β-CD-CS/HA溶于重量浓度为1％的冰乙酸溶液，形成浓度为1.464g/ml的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸溶液，100 W超声处理20-30分钟，得到羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸滤液，在超声条件下逐滴滴入三聚磷酸钠（TPP）溶液（m_TPP: m_β-CD-CS/HA=2：1），通过离子交联法制得纳米粒，反应0.5~1小时，过滤，滤液于-80℃预冻后，冷冻干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒，即称之为β-CD-CS/HA NPs。

（7）在室温下，将0.732g羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒溶于1 ml1％的冰乙酸溶液，取0.183g Erlotinib的固体溶于1 ml甲醇中，然后取250 μl Erlotinib和250 μl超纯水混合，加入到200 μl 3.66g/ml的TPP溶液与1 mL β-CD-CS/HA NPs，振荡1分钟后，超声30分钟以上，即可制得Erlotinib@β-CD-CS/HA离子交联纳米复合物。

二、Erlotinib@β-CD-CS/HA离子交联纳米复合物的粒径和电位分析检测

使用马尔文粒径仪测量制备的纳米复合物的粒径分布及Zeta电位大小，每个样品重复三次，根据粒径和电位分析检测结果进行筛选，筛选出最佳电荷比，并以此比例进行后续实验。

表1使用马尔文粒径仪测量制备的纳米复合物的粒径分布及Zeta电位。

采用“离子交联法”制备 Erlotinib@β-CD-CS/HA，厄洛替尼、β-CD-CS/HA和三聚磷酸钠的质量比是影响 Erlotinib@β-CD-CS/HA纳米复合物粒径的重要因素，PDI值则能反应纳米粒径的分布，Erlotinib@β-CD-CS/HA在β-CD-CS/HA NPs与厄洛替尼的最佳质量比为8:1，在质量比为8:1时，Erlotinib@β-CD-CS/HA 纳米复合物的最低粒径为227.5 nm，PDI为 0.288，电势为2.75 mV。

三、纳米复合物的稳定性实验

利用马尔文激光粒度仪检测纳米的粒径分布，结果如图1所示，Erlotinib@β-CD-CS/HA 纳米复合物的粒径分布在连续的一周里没有发生显著的变化，表明Erlotinib@β-CD-CS/HA 纳米复合物稳定性较好。

四、载药量与包封率的

（1）绘制厄洛替尼标准曲线

精密称取厄洛替尼标准品3.9344 mg，加入1 mL甲醇中制备浓度为10 mM的厄洛替尼标准溶液，然后使用甲醇将厄洛替尼标准溶液进行梯度稀释，制备浓度分别为 10、20、30、40、50、60 、70、80、90 µM 的样品溶液。然后使用紫外分光光度计分别测定每个样品的吸光度，用吸光度为纵坐标、厄洛替尼浓度作为横坐标，进行线性回归方程分析，即可得到厄洛替尼的标准曲线，如图4所示。其中线性回归方程为y=0.2719x+0.02083, R²=0.9915。

（2）载药量和包封率的测定

①使用超滤管离心获得未负载的游离厄洛替尼和纳米复合物，冻干称量纳米总质量，用紫外分光光度计测定游离厄洛替尼紫外吸光度，根据厄洛替尼标准曲线即可计算出其对应浓度，进而计算出纳米复合物的载药量和包封率。

计算公式：

载药量＝(厄洛替尼总质量－游离厄洛替尼质量)/纳米总质量*100%

包封率＝(厄洛替尼总质量－游离厄洛替尼质量)/厄洛替尼总质量*100%

②根据厄洛替尼的标准曲线计算，当质量比为8:1 时，Erlotinib@β-CD-CS/HA 的载药量和包封率分别为 31.93%、49.56%；

五、厄洛替尼在不同 pH 条件下的释放

将Erlotinib@β-CD-CS/HA 纳米复合物溶液移至分子量为1000的透析袋内，然后然后放入到装有49 mL PBS(pH 7.4/ pH 5.5)的透析介质中，在 37 ℃下恒温磁力搅拌，进行厄洛替尼在不同 pH 值下的释放实验。在预先设定的时间点(0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h)取样，每次取 2mL 的透析液，然后再补加 2 mL 新鲜透析介质，然后利用紫外分光光度计测定每个时间点样品的吸光度，根据厄洛替尼的标准曲线，计算出每个时间点的的累积释放量，绘制出厄洛替尼在不同 pH 值下随时间变化的释放曲线，图5。

Claims (10)

1.一种靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统，其特征在于：将β-环糊精接枝在壳聚糖大分子上，再联合透明质酸HA制得β-CD-CS/HA，再通过离子交联法制得纳米粒，最后包裹厄洛替尼Erlotinib制得Erlotinib@β-CD-CS/HA纳米载药系统。

2.一种制备如权利要求1所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的方法，其特征在于：具体制备步骤包括：

（1）称取纯化后的壳聚糖加至烧杯中，逐滴滴入体积浓度1％的乙酸溶液搅拌溶胀溶解壳聚糖，搅拌24小时，得到粘稠透明的壳聚糖溶液；

（2）称取C₂H₃ClO₂，将其溶于超纯水中；称取β-环糊精，使其溶于质量分数为25%的NaOH溶液，逐滴滴入配制好的C₂H₃ClO₂溶液中，室温下反应，使用冰乙酸调节pH至7，4℃放置16h，然后加入甲醇，直到不再有沉淀生成，放置12h后，再过滤，之后继续加水溶解，再加甲醇，直到不再有沉淀生成，过滤，所得产物用足量乙醇水溶液反复洗涤，至无氯为止，干燥，得白色产物，即为羧甲基-β-环糊精；

（3）将羧甲基-β-环糊精溶于去离子水中，测量溶液的pH值，用稀冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐 EDC 和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化羧基，在室温下、搅拌的条件下反应4个小时，活化羧甲基-β-环糊精上的羧基；

（4）将透明质酸溶于去离子水中，测量溶液的pH值，用稀冰乙酸调节pH，控制反应体系的pH值在3~4，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐EDC 和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化羧基，在室温下、搅拌的条件下反应4个小时，活化透明质酸上的羧基；

（5）将步骤（2）制备的活化好的羧甲基-β-环糊精加入到壳聚糖溶液中，调节pH，控制体系pH在3~4之间，4h后，把步骤（4）中活化好羧基的透明质酸加入到壳聚糖和制备的活化好的羧甲基-β-环糊精反应体系中，在室温条件下持续搅拌，反应48小时，将产物使用透析袋透析，高速低温离心，于- 80℃预冻，真空冻干至恒重，获得的产物即为β-CD-CS/HA；

（6）将步骤（5）制备的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸β-CD-CS/HA溶于1wt％的冰乙酸溶液，形成1wt％的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸溶液，超声处理20-30分钟，用微孔过滤器过滤，得到羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖/透明质酸滤液，在超声条件下逐滴滴入三聚磷酸钠TPP溶液，通过离子交联法制得纳米粒，反应0.5~1小时，过滤，滤液于零下70摄氏度冷冻干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒 β-CD-CS/HA NPs；

（7）室温下，将100 µL厄洛替尼的良溶剂溶液逐滴加入到700 µL不良溶剂中，然后加入100 µL β-CD-CS/HA NPs溶液，振荡1分钟后，超声30分钟以上，制得Erlotinib@β-CD-CS/HA离子交联纳米载药系统。

3.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：其中壳聚糖、β-环糊精的摩尔比为1~8:1~4。

4.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（4）中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化羧基的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：步骤（3）中羧甲基-β-环糊精、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为2:2:1。

6.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：步骤（4）中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺冰盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS摩尔比为2:2:1。

7.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：所述活化好的羧甲基-β-环糊精与透明质酸摩尔比为1:1。

8.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：步骤（6）三聚磷酸钠TPP与β-CD-CS/HA质量比为2：1。

9.根据权利要求2所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统的制备方法，其特征在于：步骤（7）中良溶剂为1vol % 冰乙酸，不良溶剂为1vol % 甲醇。

10.一种如权利要求1所述的靶向β-环糊精接枝壳聚糖离子交联纳米粒的载药系统在用于制备靶向治疗非小细胞肺癌药物的应用。

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