CN104857560A - 羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羧基化的普鲁兰多糖水凝胶及其制备方法，本发明将羧基化普鲁兰多糖溶于去离子水中，再加入交联剂溶液搅拌反应；将反应液水浴加热制得水凝胶，浸洗后用制粒机制成可注射的颗粒。本发明涉及的水凝胶采用化学交联法由羧基化的普鲁兰多糖与交联剂制成，具有优异的可注射性，也可以塑成不同形状的支架模型，具有良好的稳定性、机械强度、生物学效能和生物可降解性。

Description

羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种水凝胶，具体涉及一种羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶及其制备方法。

背景技术

无毒、转染效率高、良好的生物相容性和抗降解性能等特性是皮肤缺损修复构建的关键因素。近来，有细菌发酵生产的多糖混合制备的聚合物有利的物理化学特性和简单的生物降解性，结构单元是规则有序的直链或支链组成的，因此逐渐受到人们的关注。普鲁兰多糖是由短梗霉菌发酵生产的，结构单元是由α(1→4)糖苷键连接麦芽三糖，麦芽三糖之间由α(1→6)糖苷键连接。目前普鲁兰多糖主要应用于食品、医药以及一些工业领域。羧基化的普鲁兰多糖是通过发酵的方式对普鲁兰多糖改性，同样结构单元是由α(1→4)糖苷键连接麦芽三糖，麦芽三糖之间由α(1→6)糖苷键连接，在麦芽三糖的C6位连接一个羧甲基，这种结构具有柔韧性、增加了溶解度和粘附性。有人研究报道：透明质酸与1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联制备的水凝胶很受人们的关注，但是该水凝胶的膨胀程度比较大、水凝胶的孔径大、细胞粘附困难等。

发明内容

本发明的目的是提供一种羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶及其制备方法, 采用化学交联方法制备更具可降解性、生物相容性、安全性更高的皮肤填充材料和植入支架材料。

发明人选用羧基化的普鲁兰多糖代替透明质酸，羧基化的普鲁兰多糖是通过发酵生产的，价格比透明质酸廉价很多，制备出的水凝胶膨胀度不大、孔径比较均匀、降解时间和粘附特性等都表达良好。很多交联剂也有报道，比如，二甲基辛二亚酰胺化物、乙二醛、京尼平和碳化二亚胺盐酸化物等，但是1，4-丁二醇二缩水甘油醚一直备受人们的青睐，也是由FDA/EMEA规章认证的。因此，本发明选用普鲁兰多糖改性的羧基化普鲁兰多糖与交联剂BDDE交联制备可注射的水凝胶，分析新型的水凝胶的物理化学、生物学和细胞学方面的评价。

本发明的实现过程如下：

一种羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）将羧基化普鲁兰多糖溶于去离子水中，得到质量体积分数为100～500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液，温度控制为20～27℃；

（2）加入质量分数为5～15%的交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚搅拌均匀，控制温度为25～30℃，其中羧基化普鲁兰多糖与交联剂的质量比为100～1000：1～20；

（3）将反应液在45～55℃反应3～6h制得水凝胶；

（4）制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2～6天，用制粒机制成可注射的颗粒。

上述羧基化普鲁兰多糖为出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

上述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

上述羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，具体制备过程为：

（1）将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为100～500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为20～27℃，在搅拌条件下反应0.5～1h；

（2）加入0.05～0.3mL、质量分数为5～15%的交联剂溶液，反应温度控制为25～30℃，在搅拌条件下反应0.1～0.6h；

（3）将反应液放于50℃恒温水浴锅中3h～6h，制得水凝胶；

（4）制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2～6天，用制粒机制成可注射的颗粒。

本发明具有以下优点：

本发明所涉及的一种羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶，是将羧基化的普鲁兰多糖和1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）结合起来制成的皮肤填充材料。羧基化的普鲁兰多糖为由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）分泌的水溶性胞外中性多糖，采用化学交联方法制成，羧基化的普鲁兰多糖中两个相邻的羟基与BDDE的两端的环氧基对接，形成一个对接聚合物。聚合物在50℃下反应形成类似于果冻状的水凝胶，可通过制粒机制成不同粒径的毫米级的颗粒，用于可注射性水凝胶使用，具有稳定性高、生物学性能良好、可避免外科手术的创伤的优点。

附图说明

图1为羧基化普鲁兰多糖水凝胶（PCB）的红外光谱图；

图2为羧基化普鲁兰多糖水凝胶的样品图；

图3为羧基化普鲁兰多糖水凝胶的扫描电镜图，图中，1号为水凝胶的扫描电镜图（放大100倍），2号为水凝胶的扫描电镜图（放大250倍）；

图4为羧基化普鲁兰多糖水凝胶中BDDE的残留量；

图5为羧基化普鲁兰多糖水凝胶的抗压实验；

图6为羧基化普鲁兰多糖注射于小鼠皮下后，组织与材料的炎症反应，用透射电镜观察，图中，空白对照为注射生理盐水；PCB为羧基化普鲁兰多糖注射于小鼠皮下1周和24周的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明所涉及的一种羧基化的普鲁兰多糖水凝胶，以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）分泌的水溶性胞外中性普鲁兰多糖为原料，采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）交联剂进行化学交联，将反应液放入50℃下静态放置3～6h，制备得到水凝胶。制备出的粗产品经过纯化处理，即采用无热原水和磷酸盐缓冲溶液置换水凝胶中残留的BDDE以及杂质。

原料中的羧基化的普鲁兰多糖采用的是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）分泌的水溶性胞外中性多糖，与透明质酸相比，其具有水溶性好、反应条件温和、稳定性良好等显著优点。另外，羧基化的普鲁兰多糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可应用于组织工程领域。

本发明涉及的羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，由以下步骤实现：

步骤一：将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为100～500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为20～27℃，在搅拌条件下反应0.5～1h；

步骤二：加入0.05～0.3mL、质量分数为5～15%的交联剂溶液，反应温度控制为25～30℃，在搅拌条件下反应0.1～0.6h；

步骤三：将反应液放于50℃恒温水浴锅中3h～6h，制得水凝胶；

步骤四：制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2～6天，用制粒机制成不同粒径的可注射的颗粒。

步骤一中，羧基化普鲁兰多糖指由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

步骤二中，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

步骤四中，磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

1,4-丁二醇二缩水甘油醚与羧基化普鲁兰多糖的分子链反应形成了对接聚合物，在50℃温度下形成类似于果冻状的水凝胶，经过无热原水和磷酸盐缓冲溶液洗水凝胶中残留的杂质和一些未反应的1,4-丁二醇二缩水甘油醚。清洗时间为2～6天。纯化后的水凝胶可用制粒机制成不同粒径的毫米级颗粒，然后可装入注射器中用于注射。

实施例1

步骤一：将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为100mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为27℃，在搅拌条件下反应0.5h；

步骤二：加入0.3mL、质量分数为5%的交联剂溶液，反应温度控制为30℃，在搅拌条件下反应0.1h；

步骤三：将反应液放于50℃恒温水浴锅中6h，制得水凝胶；

步骤四：制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2天，用制粒机制成不同粒径的可注射的颗粒。

步骤一中，羧基化普鲁兰多糖指由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

步骤二中，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

步骤四中，磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

实施例2

步骤一：将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为300mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为24℃，在搅拌条件下反应0.7h；

步骤二：加入0.18mL、质量分数为10%的交联剂溶液，反应温度控制为27℃，在搅拌条件下反应0.3h；

步骤三：将反应液放于50℃恒温水浴锅中4.5h，制得水凝胶；

步骤四：制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗4天，用制粒机制成不同粒径的可注射的颗粒。

步骤一中，羧基化普鲁兰多糖指由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

步骤二中，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

步骤四中，磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

实施例3

步骤一：将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为20℃，在搅拌条件下反应1h；

步骤二：加入0.05mL、质量分数为15%的交联剂溶液，反应温度控制为25℃，在搅拌条件下反应0.6h；

步骤三：将反应液放于50℃恒温水浴锅中3h，制得水凝胶；

步骤四：制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗6天，用制粒机制成不同粒径的可注射的颗粒。

步骤一中，羧基化普鲁兰多糖指由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

步骤二中，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

步骤四中，磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

对以上实施例的产物进行红外吸收、扫描电镜分析、样品观察、BDDE残留量和抗压强度分析，其分析结果如下：

1、水凝胶的特征官能团的红外吸收峰如图1所示，在1646 cm^-1，1373 cm^-1和1157cm^-1处有吸收峰。

2、水凝胶填充材料的样品如图2所示，水凝胶类似于果冻状的乳白色凝胶，呈乳白色。

3、水凝胶填充材料的扫描电镜分析如图3所示，水凝胶呈三维网络状的多孔结构，排布比较规整。

4、水凝胶的BDDE的残留量如图4所示，水凝胶在不同时间清洗后残留的BDDE含量较低，符合标准。

5、水凝胶的抗压强度如图5所示，压缩位移与压缩载荷之间的关系。压缩载荷达到0.1MPa。

6、水凝胶注射于小鼠皮下后，对皮肤组织进行透射电镜观察组织周围的炎症反应，如图6所示，第一周有可观察到有材料、巨噬细胞、成纤维细胞和空泡；第24周后组织周围有成纤维细胞、胶原纤维和一些扩散的内质网。与空白对照相比，24周后的空泡显著减少，炎症反应降低，组织相容性良好。

本发明制得的水凝胶填充材料用于成年雌性ICR小鼠的动物实验表明：用化学交联法制备出的水凝胶，具有较好的机械强度和生物相容性，适合用于组织填充。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将羧基化普鲁兰多糖溶于去离子水中得到质量体积分数为100～500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液，温度控制为20～27℃；

（2）加入质量分数为5～15%的交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚搅拌均匀，控制温度为25～30℃，其中羧基化普鲁兰多糖与交联剂的质量比为100～1000：1～20；

（3）将反应液在45～55℃反应制得水凝胶；

（4）制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2～6天，用制粒机制成可注射的颗粒。

2.根据权利要求1所述的羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：羧基化普鲁兰多糖为出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，其分子量为530000g/mol。

3.根据权利要求1所述的羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：

（1）将羧基化普鲁兰多糖粉末溶于去离子水中，得到质量体积分数为100～500mg/mL的羧基化普鲁兰多糖溶液5mL，反应温度控制为20～27℃，在搅拌条件下反应0.5～1h；

（2）加入0.05～0.3mL、质量分数为5～15%的交联剂溶液，反应温度控制为25～30℃，在搅拌条件下反应0.1～0.6h；

（3）将反应液放于50℃恒温水浴锅中3h～6h，制得水凝胶；

（4）制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2～6天，用制粒机制成可注射的颗粒。

5.权利要求1所述的制备方法制得的羧基化普鲁兰多糖可注射水凝胶。