CN110180023B - 一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海藻酸钠、壳聚糖基高强度生物质组工程支架材料的制备方法，该支架材料由海藻酸钠交联形成的第一网络及羧甲基壳聚糖交联的第二网络构建的双网络凝胶经冷冻干燥后得到，该支架具有优异的强度，回弹性，大孔隙率、良好的生物相容性及一定的表面疏水性特征，可以用于人体组织工程领域。

Description

一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法

技术领域

本发明属生物质组织工程支架材料的制备方法，特别是涉及一种具有高强度的，良好生物相容性的生物质基支架的制备方法。

背景技术

组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料。为了使种子细胞增殖和分化，需要提供一个由生物材料所构成的细胞支架，支架材料相当于人工细胞外基质。组织工程支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等的组织支架材料。

目前的组织工程材料的制备和原料来源多样，主要包括天然可降解高分子材料和合成可降解高分子材料，但各有优缺点。如天然可降解高分子材料。天然生物可降解高分子材料是指由动植物组织中提取的高分子可降解材料。如胶原，其本身就是天然骨的组织成分。壳聚糖，是甲壳素的衍生物。还有明胶、琼脂、葡聚糖、透明质酸。这类材料的特点是降解产物易被机体吸收，但强度和加工性能较差，降解速度无法调节。合成可降解高分子材料。常用的可降解合成高分子材料有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚醚，聚碳酸酯等。这类材料的降解产物可在体内代谢排除，对机体无害，可塑性较好。其中聚乳酸和聚乙醇酸在组织工程中应用最广泛。但高分子材料同样存在弊端，如缺乏骨结合能力，不便于临床显影，降解速率不可控，细胞粘附性难等。

支架材料的制备可通过凝胶材料冷冻干燥制备得到。凝胶是指三维网络结构的高分子化合物与溶剂组成的体系，其中的高分子以范德华力，化学键力，物理缠绕力，氢键力等连接。由于它是一种三维网络立体结构，它不溶解于溶剂，但可溶胀。凝胶的制备和构成主要为合成的聚合物材料以及生物质材料，其中生物质材料包括纤维素、壳聚糖、甲壳素、海藻酸钠、明胶、透明质酸等。生物质凝胶具有合成凝胶所没有的优势，如具有良好的生物相容性，低细胞毒性、可降解性等。生物质凝胶材料制备支架材料的主要需要克服的困难是提高强度，控制降解时间等以真正实现优异支架材料的制备。

在本发明中，将以海藻酸钠和壳聚糖为基础材料以制备水凝胶材料进而制备组织工程支架材料。

所涉及壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。壳聚糖具有良好的抗菌性、可加工性。也因为其良好的成型性可用于组织工程支架材料的制备。如壳聚糖与磷酸钙的复合物可作为骨的替代物，用于骨的修补及牙的填料，壳聚糖衍生物与聚酯的复合材料可用作人造血管。所涉及的海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic，G）按（1→4）键连接而成，是一种天然多糖。传统上，海藻酸钠用作片剂的粘合剂或速释片的崩解剂。近年来，海藻酸纳在不同的生物医药领域的应用不断扩展，利用海藻酸纳在 pH小于3时产生凝胶或在氯化钙的存在下发生离子交换从而产生凝胶的特性，海藻酸钠凝胶已经被越来越广泛的应用，如作为三维支架、模拟皮肤组织等。但无论是海藻酸钠凝胶还是壳聚糖凝胶制备的支架材料其强度均无法达到实际应用的要求。在本发明中，采用了多种技术来解决此问题。一是构建了多网络结构，并在网络中引入多支化基团如接枝共聚物等，另一个则是采用了一种新型的纳米POSS电解质，作为传统海藻酸钠交联剂氯化钙的替代品。多面体低聚倍半硅氧烷( Polyhedral oligomeric silsesquioxane, POSS) 是一种新型的有机无机纳米颗粒,于1946 年首次合成。POSS 的分子通式为( RSiO1.5)₈, 式中的R 是有机取代基, 可以为H、烷基、芳基等惰性基团和乙烯基、氨基等活性基团, 同时分子具有无机骨架且分子尺寸在1~3nm之间。惰而近年来，POSS已被广泛应用于生物领域，并发现具有非常好的生物相容性。同时，POSS也被运用于水凝胶中被用于提高凝胶的力学性能、解溶涨速率或将功能性引入水凝胶中。

通过以上的策略得到了一种具有优异力学性能、生物相容性和缓慢降解性的生物质组织工程支架材料。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种组织工程支架材料的制备方法，尤其是提供一种具有高强度的、大孔隙率的、良好生物相容性的组织工程支架材料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

（1）20^oC下，在0.1mol/L浓度醋酸溶液中加入一定量壳聚糖及O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸，经4-8小时搅拌得到水溶液A，水溶液A中壳聚糖的质量浓度介于2-3%之间，水溶液A中壳聚糖与O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的质量比介于2：1-3：1之间；

（2）在水溶液A中加入质量浓度为2-3.5%的海藻酸钠水溶液B，搅拌均匀以形成水溶液C，水溶液A和海藻酸钠水溶液B的体积比介于2：1-3：1之间；

（3）在水溶液C中持续滴入1g/mL的β-甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀后形成预聚液D，预聚液D中β-甘油磷酸钠与壳聚糖的质量比介于4：1-6：1之间；

（4）将预聚液D升温至38^oC并放置30分钟，形成凝胶A；

（5）将凝胶A以清水反复冲洗后，于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到气凝胶B；

（6）20^oC下将一定量八氨盐基笼状倍半硅氧烷加入去离子水中，超声振荡并搅拌至均匀分散，得到水溶液B，在水溶液B中加入缓冲液调解水溶液pH值至8-8.5之间，水溶液B中八氨盐基笼状倍半硅氧烷的质量浓度为1.5-2%；

（7）将气凝胶B在20^oC下完全浸入水溶液B中浸置48小时，后取出浸入大量pH=3的醋酸水溶液中浸泡12小时，得到凝胶C，将凝胶C于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到最终产品。

进一步，所述壳聚糖的粘均分子量介于250000-500000之间，脱乙酰度大于95%，其黏度为：20℃，10g/L浓度下为150-200 mPa.s。

进一步，所述海藻酸钠在20^oC下质量分数为1%水溶液黏度介于500-600 mPa.s之间。

进一步，所述O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的按聚乳酸与O-羟乙基壳聚糖质量比计算的接枝率介于120-210%之间。

进一步，所述O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的典型制备过程可为下述过程：

称取一定质量壳聚糖，加入5%质量浓度氢氧化钠水溶液调节pH值至13，后在60^oC下回流并反应60h，加入至60^oC后，每20分钟加入部分体积分数为15%的环氧乙烷水溶液，壳聚糖和总共加入环氧乙烷水溶液的比例为每g壳聚糖/2-3ml环氧乙烷水溶液，固体全部溶解后终止反应，向体系中加入5%质量浓度HCl水溶液调节体系pH值至5，至溶液澄清透明。将溶液过滤并浓缩后采用无水乙醇沉淀，离心得到固体，以蒸馏水溶解固体并重复以上的过滤、浓缩、沉淀过程，直至无不溶固体。将最终所得固体以水溶解后，通过透析袋以大量水透析，透析后液体冷冻干燥，所得固体即为水溶性O--羟乙基壳聚糖。在烧瓶中按一定比例加入D, L-丙交酯和水溶性O--羟乙基壳聚糖，加入丙交酯摩尔比为0.1%的催化剂辛酸亚锡，真空脱气密封后于油浴锅内140^oC下搅拌反应24小时得到粗产品，经加入丙酮搅拌、抽屉、纯化后得到固体产物，干燥后使用。根据加入不同D, L-丙交酯和水溶性O--羟乙基壳聚糖的用量比可以调控聚乳酸的接枝率。在本发明中D, L-丙交酯和水溶性O--羟乙基壳聚糖的投料比介于20：1-40：1之间。

进一步，所述八氨盐基笼状倍半硅氧烷(OaPOSS)为POSS的改性产物。此POSS单体因为有大量氨盐基的存在，使得单体具有良好的水溶性。其结构式如下：

其中，OaPOSS角落的八个氨盐基在一定酸碱度环境下更容易解离，形成正离子，在和海藻酸钠混合后起到类似钙离子的作用，通过离子交换形成交联效果，从而形成凝胶，这种交联方式除了有离子交换作用外，也存在一定的物理交联效果。

进一步，所述水溶液D和醋酸水溶液的质量均超过气凝胶B的30倍，水溶液D的质量为保证有足够的POSS离子进入气凝胶B中实现海藻酸钠的离子交换交联；醋酸水溶液的质量是用于保证足够的酸度以完善海藻酸钠的交联以实现内部结构均匀。

进一步，本发明的技术特点的实现和优势如下：

（1）构建了壳聚糖网络和海藻酸钠网络的双网络结构，双网络中壳聚糖网络起到柔性链作用，交联海藻酸钠网络为刚性网络相互配合以协同更佳的力学性能；

（2）其中壳聚糖网络为主网络在其中引入了O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的接枝结构，更加有效的三维连接了壳聚糖网络，从而有效提高了强度并提升了孔隙率；

（3）OaPOSS作为交联剂交联海藻酸钠较传统钙离子交联具有更加明显的性能优势，可更加有效的提供强度和回弹性，也可提供生物附着点。

本发明所述组织工程支架材料各性能，包括力学性能，孔隙率、流变特性等均可通过调节单体浓度，交联剂用量、OaPOSS用量与双网络含量的比例来进行调节。

本发明所述一种具有优异生物相容性的双网络海藻酸钠基多响应性水凝胶有如下性能特点：

本发明范围内，凝胶的性能如下：

压缩负载（70%）：4.2-5.8N

孔隙率：85.7%-93.4%

弹性模量： 10.5-22.7MPa

最大拉伸应变：44%-56%

孔径：50-100微米

降解周期（50%降解）：5-10周

具体实施方式

下面结合具体实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步详细阐述，但不应理解为下述各实施例是对本发明上述主题所涉及范围的限制，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。

实施例1

本发明之一种具有优异生物相容性的双网络海藻酸钠、壳聚糖基多响应性高强度生物质组织工程支架材料制备如下：

（1）20^oC下，在100ml浓度为0.1mol/L醋酸溶液中加入2.3g壳聚糖及1.02g的O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸，经5小时搅拌得到水溶液A；

（2）在水溶液A中加入40ml质量浓度为2.5%的海藻酸钠水溶液B，搅拌均匀以形成水溶液C；

（3）在水溶液C中持续滴入11.5ml浓度为1g/mL的β-甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀后形成预聚液D；

（4）将预聚液D升温至38^oC并放置30分钟，形成凝胶A；

（5）将凝胶A以清水反复冲洗后，于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到9.6g气凝胶B；

（6）20^oC下将5.76g八氨盐基笼状倍半硅氧烷加入320g去离子水中，超声振荡并搅拌至均匀分散，得到水溶液B，在水溶液B中加入缓冲液调解水溶液pH值至8.2；

（7）将气凝胶B在20^oC下完全浸入水溶液B中浸置48小时，后取出浸入400g pH=3的醋酸水溶液中浸泡12小时，得到凝胶C，将凝胶C于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到最终产品。

所述壳聚糖的粘均分子量为426000，脱乙酰度为95.5%，其黏度为：20℃，10g/L浓度下为175mPa.s。

所述海藻酸钠在20^oC下，质量分数为1%水溶液黏度为550 mPa.s。

所述O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的按聚乳酸与O-羟乙基壳聚糖质量比计算的接枝率为155%。

本实施例凝胶的性能如下：

压缩负载（70%）：4.75N

孔隙率：91.4%

弹性模量： 18.6MPa

最大拉伸应变：52.4%

孔径：50-100微米

降解周期（50%降解）：6.5周

实施例2

本发明之一种具有优异生物相容性的双网络海藻酸钠、壳聚糖基多响应性高强度生物质组织工程支架材料制备如下：

（1）20^oC下，在100ml浓度为0.1mol/L醋酸溶液中加入2.6g壳聚糖及1.14g的O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸，经6小时搅拌得到水溶液A；

（2）在水溶液A中加入45ml质量浓度为2.5%的海藻酸钠水溶液B，搅拌均匀以形成水溶液C；

（3）在水溶液C中持续滴入13.2ml浓度为1g/mL的β-甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀后形成预聚液D；

（4）将预聚液D升温至38^oC并放置30分钟，形成凝胶A；

（5）将凝胶A以清水反复冲洗后，于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到10.04g气凝胶B；

（6）20^oC下将5.5g八氨盐基笼状倍半硅氧烷加入350g去离子水中，超声振荡并搅拌至均匀分散，得到水溶液B，在水溶液B中加入缓冲液调解水溶液pH值至8.4；

（7）将气凝胶B在20^oC下完全浸入水溶液B中浸置48小时，后取出浸入350g pH=3的醋酸水溶液中浸泡12小时，得到凝胶C，将凝胶C于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到最终产品。

所述壳聚糖的粘均分子量为482000，脱乙酰度为95.5%，其黏度为：20℃，10g/L浓度下为190mPa.s。

所述海藻酸钠在20^oC下，质量分数为1%水溶液黏度为550mPa.s。

所述O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的按聚乳酸与O-羟乙基壳聚糖质量比计算的接枝率为172%。

本实施例凝胶的性能如下：

压缩负载（70%）：5.045N

孔隙率：92.2%

弹性模量： 19.2MPa

最大拉伸应变：48.2%

孔径：50-100微米

降解周期（50%降解）：7.2周。

Claims (5)

1.一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法，其特征为：

材料按以下的步骤制备：

（1）20^oC下，在0.1mol/L浓度醋酸溶液中加入一定量壳聚糖及O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸，经4-8小时搅拌得到水溶液A，水溶液A中壳聚糖的质量浓度介于2-3%之间，水溶液A中壳聚糖与O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的质量比介于2：1-3：1之间；

（2）在水溶液A中加入质量浓度为2-3.5%的海藻酸钠水溶液B，搅拌均匀以形成水溶液C，水溶液A和海藻酸钠水溶液B的体积比介于2：1-3：1之间；

（3）在水溶液C中持续滴入1g/mL的β-甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀后形成预聚液D，预聚液D中β-甘油磷酸钠与壳聚糖的质量比介于4：1-6：1之间；

（4）将预聚液D升温至38^oC并放置30分钟，形成凝胶A；

（5）将凝胶A以清水反复冲洗后，于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到气凝胶B；

（6）20^oC下将一定量八氨盐基笼状倍半硅氧烷加入去离子水中，超声振荡并搅拌至均匀分散，得到水溶液D，在水溶液D中加入缓冲液调解水溶液pH值至8-8.5之间，水溶液D中八氨盐基笼状倍半硅氧烷的质量浓度为1.5-2%；

（7）将气凝胶B在20^oC下完全浸入水溶液D中浸置48小时，后取出浸入大量pH=3的醋酸水溶液中浸泡12小时，得到凝胶C，将凝胶C于-40^oC中冷冻真空干燥24小时，得到最终产品。

2.根据权利要求1所述的一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖的粘均分子量介于250000-500000之间，脱乙酰度大于95%。

3.根据权利要求1所述的一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠在20^oC下质量分数为1%水溶液黏度介于500-600 mPa.s之间。

4.根据权利要求1所述的一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述O-羟乙基壳聚糖接枝聚乳酸的按聚乳酸与O-羟乙基壳聚糖质量比计算的接枝率介于120-210%之间。

5.根据权利要求1所述的一种高强度生物质组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述水溶液D和醋酸水溶液的质量均超过气凝胶B的30倍。