CH670708A5

CH670708A5 -

Info

Publication number: CH670708A5
Application number: CH1929/86A
Authority: CH
Inventors: Stephen Roderick Postle; Peter John Elton; David Preston Gregory; Janice Butcher
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1985-05-24
Filing date: 1986-05-13
Publication date: 1989-06-30
Also published as: IT8648014A0; DE3616338A1; DK223286D0; GB2176132A; NL8601226A; GB8611166D0; US4668359A; BE904753A; GB2176132B; IT1191896B; DK223286A; DE3616338C2; GB8513152D0; JPS61272647A; SE8602222D0; SE8602222L

Description

BESCHREIBUNG Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mit Agarose beschichteten Diagnosestreifen sowie die Verwendung der so hergestellten Diagnosestreifen bei der Elektrophorese und isoelektrischen Fokussierung.

Agarose, ein Polysaccharid aus Agar-Agar, der seinerseits aus Seetang gewonnen wird, wurde schon als Milieu zur Durchführung solcher elektrophoretischer Trennungen verwendet. Wie Agar-Agar bildet Agarose ein steifes Gelee, wenn in Wasser gelöst und getrocknet. Ausrüstungen zur

Herstellung von Agaroseplatten sind seit einigen Jahren erhältlich; solche Ausrüstungen enthalten Agarosepulver und Schalen zur Bildung des Agrarosegelees. Auf Glasplatten gegossene Agarose mit einer Schichtdicke von etwa 0,5 mm s ist ebenfalls erhältlich. Die Präparation von Agarose in Schalen mittels einer Ausrüstung ist jedoch sowohl zeitraubend als auch teuer. Ferner sind vergleichsweise dicke,

vorher auf Glasplatten gegossene Agaroseschichten noch kostspieliger. Die Anwendung von Agarose war deshalb sehr io beschränkt. Es wurden nun aber neue, mit einer dünnen, Agarose enthaltenden Schicht beschichtete Diagnosestreifen gefunden, die leicht in grossen Mengen herstellbar sind und dann zur leichteren Handhabung getrocknet werden können, aber beim Einweichen in Wasser oder einer Pufferlösung ls wieder aufquellen können und so ein Milieu zur Verwendung bei der Elektrophorese und ähnlichen Methoden liefern.

Gewisse Patentschriften des Standes der Technik beschreiben Elektrophoreseelemente, die eine geringe 20 Menge Agarose in der Beschichtung enthalten. Dazu gehören U.S. Patent 3 578 604 und die europäischen Patentanmeldungen 126 638 und 126 639, aber in allen diesen bekannten Vorschlägen besteht das Hauptmilieu zur Elektrophorese aus vernetztem Polyacrylamid. Agarose oder ein anderes wasser-25 lösliches Polymer ist dabei in einer gewissen Menge vorhanden, um die Eigenschaften des vernetzten Polyacrylamids in den in diesen Patentschriften beschriebenen Aufbauten einzustellen. Vernetzte Polyacrylamidschichten werden jedoch durch Vermischen von geradkettigem Polyacrylamid 30 mit einem Vernetzungsmittel wie Methylen-bis-acrylamid und Giessen des Gemischs auf einen Träger in Abwesenheit von Sauerstoff gebildet. Dabei entsteht dann ein verhältnismässig dickes vernetztes Polyacrylamidgel. Wird dieses Gel völlig getrocknet, so sind dann einige Stunden Quellung 35 erforderlich, um das Gel wieder aufzuquellen, damit es zur Elektrophorese verwendbar ist. Bei der Herstellung vernetztet Polyacrylamidschichten, die nicht zu spröde zur Handhabung sind und gut am Träger, auf den sie gegossen sind, anhaften, sind bei diesem Verfahren grosse Schwierig-40 keiten aufgetreten.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mit Agarose beschichteten Diagnosestreifen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Rolle Bahnmaterial, auf welchem eine wässrige Gelatine-Sil-45 berhalogenidemulsion an einer Seite davon anhaften kann, das aber keine Gelatine- oder sonstige proteinhaltige Schicht auf dieser Seite aufweist, nach einer kontinuierlichen Bahngiessmethode auf dieser Seite der Bahn bei einer Temperatur von mindestens 40 °C eine Schicht einer wässrigen Lösung so vergiesst, die 0,5 bis 2 Gew.-% Agarose und 0,5 bis 3,0 Gew.-% unvernetztes Polyacrylamid bzw. Polyvinylalkohol oder ein Gemisch dieser Polymeren enthält, die gegossene Agarose-und Polymerschicht auf eine Trockenschichtdicke von 0,1 bis 100 fim und 10 bis 50 Gew.-% Feststoffgehalt trocknet und 55 die beschichtete Bahn in Streifen der erforderlichen Grösse schneidet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Diagnosestreifen in einer Elektrophoresemethode und einer isoelektri-60 sehen Fokussiermethode.

Vorzugsweise beträgt die Dicke der getrockneten Schicht des Diagnosestreif ens 5,0 bis 15 (xm.

Der Feststoffprozentgehalt in der getrockneten Schicht beträgt vorzugsweise 15 bis 30 und besonders bevorzugt 65 ungefähr 20 Gew.-%.

Bei einem Feststoffprozentgehalt der Giesslösung über 50% ist die Schicht klebrig und lässt sich ohne Beschädigung nicht richtig trocknen. Liegt der Feststoffprozentgehalt unter

10%, so baut sich die getrocknete Schicht beim Einweichen in Wasser und danach in einem Puffer, was die bevorzugte Methode zur Wiederherrichtung der Schicht vor der Verwendung darstellt, nicht richtig wieder auf, und das Material ist dann für keine der weiter unten angeführten Methoden brauchbar.

Das erfindungsgemäss verwendete Polyacrylamid besteht vorzugsweise aus geradkettigem Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht unter 100 000 zusammen mit einem geringen Anteil eines geradkettigen Polyacrylamids mit einem Molekulargewicht über 400 000. Besonders bevorzugt besteht es aus einem geradkettigen Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht von 30 000 bis 100 000 zusammen mit einem geringen Anteil eines Molekulargewichts von 400 000 bis 600 000.

Als Bahnmaterial kommt eine Bahn aus zur Verzögerung der Wasseraufnahme durch den Träger geleimter Papiermaterial in Betracht, wobei die verwendete Leimung nicht pro-teinhaltig, aber genügend hydrophiler Art ist, um eine Beschichtung der Bahn mit einer wässrigen Gelatine-Silber-halogenidemulsion zuzulassen. Das Bahnmaterial kann mit Polyäthylen kaschiertes Papier sein, dessen eine Seite mit einer Koronaentladung behandelt wurde, um diese Seite für eine wässrige Gelatine-Silberhalogenidemulsionsschicht empfänglich zu machen.

Vorzugsweise stellt das Bahnmaterial jedoch ein Filmmaterial der als Filmträger für photographische Filme verwendeten Art dar, aber ohne Gelatine-Substrierschicht. Solches Filmmaterial kann aus Cellulosetriacetat oder Celluloseace-tobutyrat bestehen, das vorbehandelt wurde, um es für eine wässrige Gelatine-Silberhalogenidemulsionsschicht empfänglich zu machen.

Besonders bevorzugtes Bahnmaterial besteht aus Polyesterfilmmaterial, das nach einem Verfahren hergestellt wurde, bei dem man nichtorientierten Polyester in Bahnform in einer Richtung auf einem Spannrahmen orientiert, dann mindestens eine Fläche des Polyesters mit einem Latex-copo-lymeren beschichtet und die Orientierung des Polyesters in der anderen Richtung gleichzeitig mit einer Thermofixier-stufe zu Ende führt. In manchen Fällen wird danach eine Koronaentladungsbehandlung der polymerbeschichteten Fläche durchgeführt. Anschliessend giesst man die Agarose-und Polymerlösung auf die Copolymerfläche des biaxial orientierten Polyesterfilms.

Besonders bevorzugt enthält das verwendete Copolymer bis zu 10 Gew.-% Itaconsäure.

Zur Verwendung bei diesem Verfahren geeignete Copoly-mere sind in den britischen Patentschriften 1 540 067, 1 583 343 und 1 589 926 beschrieben. Die in den dortigen Methoden angeführte Koronaentladungsbehandlung biaxial orientierten Polyesters ist erforderlich, um optimale Haftung nach dem Aufbringen einer Schicht wässriger Giesslösung zu erzielen.

Ein weiteres geeignetes Copolymer ist in der britischen Patentschrift 1 571 583 beschrieben, wobei aber keine Koronaentladungsbehandlung der Copolymerschicht nötig ist, um die Oberfläche für eine wässrige Giesslösungsschicht empfänglich zu machen.

Besonders bevorzugt ist das Copolymer ein solches auf Sty-rolgrundlage.

Beschichtungen mit einer Trockendicke über 100 ,um lassen sich ebenfalls nach diesem Verfahren herstellen, doch wird bei solchen Beschichtungen Agarose unnötig verschwendet, da es sich gezeigt hat, dass nur 5 bis 15 jim dicke Beschichtungen als Diagnosestreifen schon sehr gute Leistungen erbringen und eine kürzere Wiederauf quellzeit benötigen.

670 708

Verschiedene Zusatzstoffe können der Agarose- und Polymerlösung vor dem Giessen zugegeben werden. Dazu gehören Netzmittel als Giesshilfen, Befeuchtungsmittel z. B. Glycerin, welche zur Weichmachung der gegossenen Schicht beitragen, und Bakterizide z. B. Phenol zur Verbesserung der Lagerfähigkeit der beschichteten Streifen. Ebenfalls kann man Zusatzstoffe, z. B. Sorbit und Galaktomannan, verwenden, die zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Agarose beitragen.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Streifen werden vor der Verwendung mit einer Flüssigkeit behandelt, um die Agarose- und Polymerschicht zu quellen. Diese Flüssigkeit ist üblicherweise Wasser oder ein ausgewählter wässriger Puffer. Zur Förderung der Quellung der Agarose- und Polymerschicht kann man der Agarose-und Polymergiesslösung Zusatzstoffe zugeben, z. B. Harnstoff, gegebenenfalls zusammen mit weiter unten erwähnten Ampholyten.

Agarose ist ein gereinigtes, festes, lineares Galaktanhydro-kolloid, das aus Agar-Agar isoliert oder direkt aus agarhal-tigen Marinenalgen gewonnen wird. Verschiedene Agarosepräparate unterscheiden sich erheblich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften.

In Form einer Ausrüstung angewandte oder in dicken Schichten auf Platten gegossene Agarose allein ist erfolgreich für elektrophoretische Trennungen verwendbar, da im ersten Fall das Agarosepulver mit dem üblicherweise erforderlichen Puffer vermischt wird und im zweiten Fall der Puffer in der teilweise ausgetrockneten, dicken Schicht vorliegt. Werden aber Schichten aus Agarose allein auf eine Rolle Bahnmaterial gegossen und die Schicht getrocknet, so nimmt die getrocknete Agarose eine zur Erzielung elektrophoretischer Trennungen ungenügende Menge Puffer oder Wasser auf. Die Trocknung der dünnen Agaroseschicht führt offenbar zu einer Art Zerfall der Struktur der Agarose. Liegt jedoch in dem erfindungsgemässen Diagnosestreifen ein Polymer der weiter oben beschriebenen Art zusätzlich in der Schicht vor, so wird die erwünschte Struktur der Agaroseschicht wiederhergestellt, wenn man die getrocknete Beschichtung in Wasser oder vorzugsweise einer ausgewählten Pufferlösung rehydratisiert. Diese wiederhergestellte Schicht ist bei der Elektrophorese oder ähnlichen Methoden verwendbar. Die Quellungszeit zur Wiederherstellung der Schicht vor der Verwendung beträgt manchmal nur 0,5 Stunden gegenüber Materialien des Standes der Technik, bei denen häufig einige Stunden Quellzeit erforderlich sind.

Der wichtigste Teil der rehydratisierten Beschichtung ist somit die Agarose mit ihrer Gelfestigkeit, Porosität und elek-troendoosmotischen Eigenschaften. Insbesondere die Porosität wird durch Trocknen der gegossenen Schicht beeinträchtigt, ausser wenn das oben bezeichnete Polymer ebenfalls in der gegossenen Schicht vorliegt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Agarose werden durch die Seetangquelle, einschliesslich des Standorts und der Stufe im Wachstumszyklus, der Gewinnungsmethode und dem zur Isolierung der Agarose angewandten Verfahren beeinflusst.

Eigenschaften der Agarose, wie die Geliertemperatur, Gelfestigkeit, Porosität und Elektroendoosmose lassen sich durch Vermischen zweier oder mehrerer Chargen einstellen. Die Gelier- und Schmelztemperaturen stehen in Beziehung mit dem Methoxylgehalt der Agarose, und Eigenschaften von Agarose lassen sich durch Einbau von Hydroxyäthylgruppen beeinflussen, wie z. B. in Miles Seaplaque-Agarose. Agarosegele sind wegen Mikrokristallinitätsgebieten nicht vollkommen klar. Kleine Konzentrationen an Harnstoff und Polyäthylenglykol verringern die Trübung, aber die Gelfestigkeit wird dabei erniedrigt. Das Agarose- und Polymerge3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670708

rüst ist zwar vorwiegend neutral, enthält aber einige anionische Reste, z. B. Sulfat und Pyruvat, mit zugeordneten hydratisierten Gegenionen. Beim Anlegen eines elektrischen Stroms wandern die Gegenionen zur Kathode unter Mitnahme von Hydratwasser und jeglichen neutralen Molekülen in der Probe, was als Elektroendoosmose bekannt ist. Dies ist ein Vorteil bei Gegenelektrophorese-Diagnoseme-thoden, aber nicht bei der isoelektrischen Fokussierung. Die isoelektrische Fokussierung bedient sich der Tatsache, dass für jedes Protein der pH, bei dem es elektrisch neutral ist, verschieden ist: der isoelektrische Punkt (pl). Proteine werden nach ihrem pl durch Elektrophorese auf einem Gel getrennt, in welchem ein stabiles pH-Gefälle durch Einbau von Ampholyten erzeugt wurde. Die Ampholyte können Gemische aus Amid- und Carbonsäuregruppen sein, die sich bei angelegtem elektrischen Feld in Reihenfolge ihres pl anordnen und auf Grund hoher Pufferkapazität jeweils einen ihrem pl entsprechenden lokalen pH aufrechterhalten. Die Ampholyte lassen sich während der Formulierung oder Quellung der getrockneten Agarose- und Polymerschicht mit nur geringer Einwirkung auf den erzielten Trennungsgrad einbauen.

Zahlreiche weitere Methoden zur Elektrophorese und Immunologie, Zellkultur und Klonierung können mit Aga-rose- und Polymerschichten verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften durchgeführt werden, z. B. Serumproteinelektrophorese, Nukleinsäureelektrophorese, Trennung nach Molekulargewicht, zweidimensionale Elektrophorese, Zellen-und Viruselektrophorese, Ouchterlony-Geldiffusion, radiale Immundiffusion, Immunelektrophorese, Laurell-Rockets und Überkreuzimmunelektrophorese, Gegenelektrophorese sowie Antigen-Antikörperüberlage-rungen.

Sollen die beschichteten Agarose- und Polymerstreifen zur isoelektrischen Fokussierung verwendet werden, so kann man der Agarose- und Polymerlösung Ampholyten z. B. Gemische von Verbindungen mit Amid- und Carbonsäuregruppen, zusetzen. Vorzugsweise werden die Ampholyten jedoch der Quellflüssigkeit zugesetzt.

Zum Giessen der Agarose- und Polymerlösung auf die Bahn verwendbare, kontinuierliche Bahnbeschichtungsma-schinen schliessen alle solche ein, die zur Beschichtung von Papierbahnen mit Leimlösungen verwendet werden, sowie alle zum Giessen von Gelatinelösungen auf photographische Trägermaterialien verwendeten Geräte. Dazu gehören Schlitz- und Troggiessgeräte mit oder ohne Luftrakel oder Rakelklinge als Vorrichtungen zur Regulierung der Schichtdicke. Kaskaden- und Vorhanggiessgeräte sowie Tiefdruck-und Umkehrtiefdruckbeschichtungsmaschinen sind ebenfalls verwendbar.

Die wässrige Agarose- und Polymerlösung lässt sich dadurch herstellen, dass man die erforderliche Menge Agarosepulver in Wasser gibt und das Gemisch eine Stunde stehen lässt. Dann erhitzt man rasch unter kräftigem Rühren auf über 50 °C und hält die erhöhte Temperatur 30 Minuten lang oder bis zur völligen Auflösung des Pulvers. Dies ist an einer erheblichen Abnahme der Trübung in der Lösung erkennbar. Dann erniedrigt man die Temperatur unter ständigem Rühren auf 5 °C über der gewünschten Giesstempe-ratur und gibt das Polymer danach zu der Agaroselösung. Die Lösung wird dann bis zum Giessen in einem thermostatisch kontrollierten Vorratsgefäss aufbewahrt. Die jeweilige Giess-temperatur über 40 °C hängt von der Art der eingesetzten Agarose und dem Verwendungszweck der Diagnosestreifen ab.

Die getrockneten Agarose- und Polymerschichten sind durch Einweichen in einem geeigneten Lösungsmittel leicht quellbar. Der Quellungsgrad hängt von der Art und Menge der gegossenen Agarose, der Menge und Art des verwendeten Polymeren, der Quelltemperatur sowie der Art und dem pH der verwendeten Lösungsmittel ab. Agarose- und Polymerbe-schichtungen für elektrophoretische Methoden werden in 5 einer verdünnten Form des zur Proteintrennung zu verwendenden Puffers eingeweicht.

Ein wichtiges Merkmal der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Streifen besteht darin, dass sich zwischen dem Polyesterträger und der Agarose- und Polymer-lo schicht keine Gelatine-Substrierschicht befindet.

Da Gelatine auf Protein basiert, verursacht sie erhebliche Störungen in Proteintrennungsmethoden. Bei der bevorzugten erfindungsgemässen Methode liefert das zwischen den Streckstufen aufgebrachte, getrocknete Latex-Copo-i5 lymer auf Styrolgrundlage eine hydrophile Schicht, auf der die Agarose- und Polymerlösungen aufgebracht werden und anhaften können. Vorzugsweise wird der Filmträger nach vollständiger Orientierung und Thermofixierung mit einer Koronaentladung behandelt. Dies fördert die Haftung der 20 Agarose- und Polymerlösung am Träger, ist aber nicht immer notwendig.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung:

25 Beispiel 1:

Man verwendet einen Polyäthylenterephthalatpolyester-filmträger, hergestellt wie in Beispiel 11 der britischen Patentschrift Nr. 1 540 067 beschrieben, aber ohne auf die mit einer Koronaentladung behandelte Filmoberfläche 30 gegossene Silberhalogenidemulsion.

Eine wässrige Agaroselösung wird wie folgt hergestellt:

3s Agarose (Miles Medium EEO) 18,75 g

Geradkettiges Polyacrylamid mit Durchschnittsmolekulargewicht 44000 von Allied Colloids (20%ige wässrige Lösung)

40 Polyacrylamid vom Durchschnittsmolekulargewicht 500000

(12,5°/oige wässrige Lösung 12 g (1,5g)

Netzmittel (Olin 10G10%ige wässrige Lösung) 7,5 g Wasser 1315,5 g

150 g (30 g)

45

Summe

1500 g

Die Agarose wird 60 Minuten lang unter Rühren in Gegen-50 wart des Netzmittels in Wasser eingeweicht. Dann erhitzt man rasch unter kräftigem Rühren bis zum Sieden bei 96 °C. Die Temperatur wird auf 92 °C abgesenkt und dort gehalten, bis ein opakes Aussehen auftritt. Man erniedrigt die Temperatur der Lösung auf 65 °C und gibt unter ständigem Rühren ss die Polyacrylamidlösungen dazu.

Die Agarose- und Polyacrylamidlösung wird dann in ein thermostatisch kontrolliertes Giessgefäss überführt. Danach wird die Lösung durch einen Schlitz auf den eben beschriebenen Polyesterfilmträger gegossen. Dabei wird der Film-60 träger mit einer Geschwindigkeit von 4,57 m pro Minute am Giessschlitz vorbeigeführt, und das pro Flächeneinheit auf den Filmträger gegossene Lösungsvolumen beträgt 2,1 cm3 • dm-2. Die Temperatur der Giesslösung beim Giessen beträgt 60 °C.

65 Der Guss wird dann zum Abbinden der Agarose und des Polyacrylamids abgekühlt und durch Aufblasen von Luft getrocknet. Die Dicke der gegossenen und getrockneten Agaroseschicht beträgt 10 p.m.

Der mit der getrockneten Agarose- und Polyacrylamid-schicht beschichtete Filmträger wird dann in 5 x 8 cm lange Streifen zerschnitten, was eine für Diagnosestreifen geeignete Grösse darstellt.

Sowohl nasse als auch trockene Haftprüfungen werden gemäss dem britischen Patent 1 540 067 durchgeführt, und die Agaroseschicht haftet bei beiden Prüfungen sehr gut am Filmträger.

Einer dieser Streifen wird dazu verwendet, in einem Elektrophoresetest aufzuzeigen, welche Proteine in einer Probe menschlichen Serums vorhanden sind. Dabei verwendet man eine Elektrophoresekammer Shandon 600.

Dann taucht man den Streifen 10 Minuten lang in 200 ml destilliertes Wasser und lässt ihn abtropfen.

Der Streifen wird dann 20 Minuten lang in ein wässriges Pufferbad (pH 8,6,0,1 m) (als Barbital-Bad bekannt) eingelegt, um die Agarose- und Polyacrylamidschicht zu quellen. Überschüssiger Puffer wird entfernt und der Streifen so in die Elektrophoresekammer eingelegt, dass beide Enden des Streifens in ein 0,05 m-Pufferbad eintauchen.

Mit Hilfe eines handelsüblichen Applikators wird ein kleines Volumen Serum auf ein Ende des Streifens aufgebracht. Kleine, bekannte Serumproteine enthaltende Proben werden in einer Reihe entlang des Streifens am selben Ende placiert.

Ein konstanter Strom von 4 mA, was 4 mA/5 cm Streifenbreite entspricht, wird 25 Minuten lang angelegt. Der Aga-rose- und Polyacrylamidstreifen wird dann aus der Kammer herausgenommen und zur Anfärbung der Proteine in eine konzentrierte Lösung von Coomassieblau in 5%iger Essigsäure eingelegt.

670708

Fremdfärbungen werden dann durch 10 Minuten langes Eintauchen in Essigsäure/Methanol/Wasser entfernt, wobei nur die abgetrennten Proteine angefärbt bleiben.

Danach wird der Streifen getrocknet.

Der getrocknete Streifen zeigt die verschiedenen in der Serumprobe vorhandenen Proteine getrennt entlang der Streifenlänge. Die Proteine werden durch Vergleich mit den bekannten, ebenfalls entlang der Streifenlänge getrennten Proteinen identifiziert.

Diese Prüfung zeigt, dass die erfindungsgemäss hergestellten Streifen trotz der sehr dünnen Agarose- und Polymergussschicht bei einer elektrophoretischen Proteintrennungsmethode verwendbar sind.

In diesem Beispiel dient die geringe Menge höhermolekularen Polyacrylamids dazu, die Viskosität der Giesslösung zu erhöhen, damit man ein geeignetes Agarose- und Polymer-giessgewicht erzielen kann.

Beispiel 2:

Es wird ein Streifen auf genau die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, ausser dass man statt des Zusatzes der Polyacrylamidlösungen zu der Agaroselösung 30 g Polyvinyl-alkohol (100% Hydrolyse) vom Molekulargewicht 14 000 verwendet. Der Streifen wird in Wasser und dann in Puffer wie in Beispiel 1 eingeweicht, und ein ähnlicher elektrophoreti-scher Test durchgeführt. Wie in Beispiel 1 trennen sich die verschiedenen in der Serumprobe vorhandenen Proteine entlang des Streifens. Dies zeigt, dass der Streifen bei einer elektrophoretischen Proteintrennmethode verwendbar ist.

B

Claims

670 708

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von mit Agarose beschichteten Diagnosestreifen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Rolle Bahnmaterial, auf welchem eine wässrige Gela-tine-Silberhalogenidemulsion an einer Seite davon anhaften kann, das aber keine Gelatine- oder sonstige proteinhaltige Schicht auf dieser Seite aufweist, nach einer kontinuierlichen Bahngiessmethode auf dieser Seite der Bahn bei einer Temperatur von mindestens 40 °C eine Schicht einer wässrigen Lösung vergiesst, die 0,5 bis 2,0 Gew.-% Agarose und 0,5 bis 3,0 Gew.-% unvernetztes Polyacrylamid bzw. Polyvinylal-kohol oder ein Gemisch dieser Polymere enthält, die gegossene Schicht auf eine Trockenschichtdicke von 0,1 bis 100 (im und 10 bis 50 Gew.-% Feststoffgehalt trocknet und die beschichtete Bahn in Streifen der erforderlichen Grösse schneidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Polyacrylamid aus geradkettigem Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht untèr 100 000 mit einem geringen Anteil eines geradkettigen Polyacrylamids mit einem Molekulargewicht über 400 000 zur Erhöhung der Viskosität der Giesslösung besteht.
3. Verfahrennach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Bahnmaterial eine Bahn aus mit Polyäthylen kaschiertem Papier vorliegt, deren zu beschichtende Seite mit einer Koronaentladung behandelt wurde.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Bahnmaterial biaxial orientierter Polyester vorliegt, der nach einem Verfahren hergestellt wurde, bei dem man eine Bahn aus nichtorientiertem Polyester in einer Richtung orientiert, einen Copolymerlatex auf eine Fläche des Polyesters aufbringt, die Orientierung zu Ende führt und den beschichteten Polyester thermofixiert.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Agarose- und Polymerlösung mittels eines Schlitz-, Trog-, Kaskaden- oder Vorhang-giessgeräts auf die Bahn gegossen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man der wässrigen Agarose- und Polymergiesslösung ein Netzmittel zusetzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man der wässrigen Agarose- und Polymerlösung ein Quellmittel zusetzt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man der wässrigen Agarose- und Polymerlösung einen Ampholyten zusetzt.
9. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten Diagnosestreifens in einer Elektrophoresemethode nach Rehydratisierung der Agarose- und Polymerschicht in einem wässrigen Bad.
10. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten Diagnosestreifens in einer isoelektrischen Fokussiermethode nach Rehydratisierung der Agarose- und Polymerschicht in einem wässrigen Bad.