Procédé pour la préparation de l'acide 5,6,7, 8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-glutamique. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de l'acide 5,6,7,8-tétra- hydro-10-fox-myl-ptéroyl-glutaniique qui est un composé nouveau destiné à être utilisé en mé decine.
En 1918, Sauberlich et Baumann (Journal of Biological Chemistry, 176, p.165, 1948) reconnurent l'existence d'une substance stimu lant la croissance du Leuconostoc citrovorum. On trouva que cette substance inconnue était présente dans les extraits de foie industriels et également dans le foie et dans une grande variété de matières naturelles. Des travaux ultérieurs ont montré que le facteur de crois sance n'est pas l'acide ptéroylglutamique, ni la vitamine 1312, ni aucune des vitamines déjà reconnues que l'on rencontre dans le foie et d'autres produits naturels.
On a également trouvé par la suite que la substance inconnue petit satisfaire aux besoins d'acide folique des micro-organismes et des poussins. On a de plus trouvé que ce facteur de puissance in verse l'action des antagonistes de l'acide pté- roy1glutamique et, chose surprenante, inverse les effets toxiques de l'aminoptérine, c'est- à-dire de l'acide N-[4-1[ (\?,4-d iamino-6-pyrimido- [ 4, 5-b ] - pyr azyl)
méthyl ] -amino } benzoS#1 ] - glutamique, sur les souris et les bactéries, dans des condi tions dans lesquelles l'acide ptéroylglutamique est inefficace.
lie facteur citrovorunî, existe dans les pro duits naturels en quantité extrêmement faible, de sorte que sa récupération de ces produits naturels est excessivement difficile et prati quement impossible du point de vue indus triel. On a cependant découvert qu'il est pos sible de préparer un composé ayant une acti vité biologique identique ou voisine par un procédé rendant possible industriellement. la fabrication de quantités convenables de cet agent actif, de sorte qu'on peut utiliser celui-ci en médecine.
Comme on n'a pas encore aujour d'hui élucidé la structure chimique du facteur de croissance du Leuconostoc cit-rovorum dé crit par Sauberlich et d'autres, il n'est pas possible de dire actuellement si le produit obtenu par le procédé décrit ci-après est le même ou pas, bien qu'il ait la même activité biologique. Pour autant qu'on le sache, cepen dant, le produit obtenu par le procédé selon la présente invention est nouveau.
Selon la présente invention, on prépare l'acide 5,6,7,8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl- glutamique par hydrogénation de l'acide 10 formyl-ptéroyl-glutamiqne avec environ 2 moles d'hydrogène par mole d'acide.
L'acide 10-formyl-ptéroyl-gltttamique uti lisé comme produit de départ petit être pré paré par divers procédés y compris celui dé crit par Gordon et d'autres dans Journal of the American Chemical Society, 70, p. 878, 1918. Selon ce procédé, on prépare l'acide formyl- ptéroylglutamique en chauffant de l'acide for mique à 981/o et de l'anhydride acétique avec de l'acide folique (acide ptéroylglutamique ) pendant une heure à 100 C. On élimine sous vide les réactifs volatils et un produit jaune clair précipite d'une solution alcaline par addition d'acide acétique.
Le composé obtenu par le procédé suivant la présente invention répond à. la formule sui vante
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dans laquelle R représente le radical de l'acide glutamique.
On peut réaliser la réduction de l'acide 10-formy 1-ptéroyl-glutamique avec ou sans l'aide de catalyseurs. Quand on utilise une réduction catalytique, on peut utiliser une ;nnde variété de solvants comprenant l'eau, l'acide formique, l'alcool, le glycol, l'acide acé tique, le diméthylformamide et d'autres, selon naturellement la nature de l'agent catalytique. La température de la réduction peut être située dans un grand intervalle allant de 0 C à 150 C. Le pH peut varier dans un intervalle (en milieu aqueux) de 3 à 12.
On peut utiliser de nombreux catalyseurs de réduction différents, comme on le verra clans les exemples qui suivent.
D'une faon générale, la réaction se pro duit très rapidement et on peut obtenir des rendements appréciables du produit désiré en un temps aussi court que 10 minutes à la tem pérature ambiante en utilisant par exemple, comme catalyseur, du platine dans l'acide for mique. Ordinairement, on réalise la réduction dans une période de 30 minutes à 2 heures.
La réaction est réalisée de préférence de la manière suivante: La matière de départ. est obtenue à partir de l'acide ptéroylgluta- mique, par formylation en le chauffant dans 20 parties d'acide formique à 90-100 % pen- dant 30 minutes à 1 heure à 80-95 C; elle est isolée, si on désire effectuer la réduction dans un solvant différent..
Il est cependant généralement plus commode de continuer la réaction en refroidissant la solution et en ajou tant le catalyseur à la solution, après quoi on peut faire passer de l'hydrogène dans le mé lange réactionnel en secouant ou en agitant. Dans certains cas, il peut être avantageux d'activer le catalyseur par l'hydrogène avant de le mélanger à l'acide ptéroylglutamique formylé bien que ce processus ne soit pas né cessaire. La pression d'hydrogène dans le réci pient de réaction peut être de 1 à 100 atm. on davantage, mais ordinairement une pression de 1 à. 3 atm. est. suffisante pour obtenir un bon rendement.
Après la réduction, on peut opérer de la faeon suivante: On élimine le catalyseur par filtration, on tamponne la solu tion par du bicarbonate de sodium aqueux, la substance désirée se trouvant dans la solu tion résultante. Quand il est désirable d'élimi ner l'excès d'acidë formique de la solution de réduction après élimination du catalyseur, on peut verser la solution dans l'éther et isoler le produit désiré, insoluble, par filtration du mélange.
Quand on utilise, pour la, réduction par l'hydrogène, des métaux ou des combinaisons métalliques telles que l'amalgame de sodium, le zinc, l'amalgame d'aluminium, le bor- hydrure de sodium, l'amalgame de magnésium. le magnésium, etc., le solvant est ordinaire ment l'eau ou de nature essentiellement aqueuse dans lequel de l'alcool, du benzène ou d'autres solvants organiques peuvent être présents.
Le pH de la solution peut être situé dans l'intervalle de 3 à 12, les conditions pré- férées variant avec les agents réducteurs par ticuliers utilisés. La température peut varier de 0 à 150 C, et le temps nécessaire peut varier depuis approximativement 10 minutes jusqu'à. 1 heures ou davantage.
On comprendra mieux l'invention en se référant aux exemples suivants. Exemple <I>1:</I> On ajoute, à une solution d'acide 10-formyl- ptéroyl-glutamique obtenue en chauffant 15 minutes au bain-marie 20 g d'acide ptéroyl- glutamique (90%) avec 200 cm3 d'acide for- mique à 90%,
1 g d'acide ascorbique et 0,5 Z d'oxyde de platine, et on hydrogène le mé- lan;ze dans un appareil à secousses sous 15,9 atni. de pression d'hydrogène jusqu'à ce chie '1 moles d'hydrogène par mole d'acide l0-forniyl-ptéroyl-glutainique soient, approxi mativement consommés. Après la réduction, on sépare le catalyseur par filtration et. on conserve le filtrat en atmosphère d'azote pen dant 40 heures.
On chauffe le filtrat pendant une heure au bain-marie, puis on le refroidit et. on le verse dans environ 2500 cin3 d'eau contenant. 340 g de bicarbonate de sodium. On ajoute de la soude pour ajuster le pH à environ 12 et. on chauffe la solution pendant une demi-heure au bain-marie, on la refroidit et on la neutra lise à environ pH 7.
Le volume à ce moment est d'environ 2900 em3. On ajoute 300 g de sili cate (le magnésium ( 1lagnésol ) pulvérisé à la solution pour absorber la plus grande partie des impuretés. on agite à la température am biante pendant 15 minutes, puis on fltre. Le filtrat. a une couleur jaune clair et un volume de 3100 cm3. On ajuste son hH à 1 par addi tion d'acide chlorhydrique et d'acide acétique. On ajoute 150 g de charbon de bois activé pour absorber la plus grande partie de la subs tance désirée et on agite le mélange pendant 15 minutes à la température ambiante.
On sé pare le charbon de bois par filtration et on le lave soigneusement sur le filtre à l'eau dis tillée. On obtient un filtrat incolore.
On soumet le charbon de bois à une élu- tion en l'agitant pendant 15 minutes dans un mélange de 500 em3 d'alcool, 100 cms d'ammo niaque à 28% et 400 ema d'eau. On sépare le charbon de bois par filtration et on le lave soi gneusement à l'ammoniaque alcoolique aqueux. Le volume du filtrat jaune est de 1120 cm-. On l'évapore à sec sous pression réduite et en atmosphère d'azote pour obtenir un résidu sirupeux brun. On triture ce dernier avec de l'éthanol absolu, de sorte qu'il se forme un solide jaune clair.
On le sépare par filtration, on le lave à l'éthanol puis à l'éther, on le sèche 10 minutes à 50 C puis dans un dessic- ca.t.eur sous vide. Le rendement est de 2,9 g.
Le produit est très soluble dans l'eau à un pH de 3,5 à 4 et les solutions aqueuses ont une fluorescence bleu pâle. On dissout un échantillon de 0,2 g dans 1 cm-' de soude N/10 et on ajuste le pH à 12 par addition de quel ques gouttes de soude 5N. On chauffe la solu tion pendant -15 minutes au bain-marie. La fluorescence persiste.
Dans ces conditions, la matière de départ, elle, est. hydrolysée en un composé non fluorescent. On refroidit la solu tion et on la sépare par centrifugation d'une petite quantité de matière insoluble puis on l'acidifie à 0 C à pH 3,8. Z n produit. jaune clair précipite, que l'on filtre, lave à l'acétone et à l'éthanol et sèche pour obtenir 0,062 g de produit. En abaissant, le pH du filtrat à. 3,3 à. 0 C, on obtient 0,015 g de plus.
Le dernier produit obtenu, soumis à l'essai microbiologi- que sur l'organisme Lel(.conostoc citroL'orim1 <B>8081</B> a une activité de 3-5 millions d'unités par ing.
On détermine l'activité en -unités par l'essai microbiologique en utilisant le milieu synthé tique décrit par H. E Sauberlich et Baumann (Biological Chemistry 176, p. 165, 19-18) et. l'organisme Leuconostoc citro-z-orum 8081, cha que unité d'activité étant, prise arbitrairement comme équivalente de 16,6 inillimierogrammes d'une préparation standard initiale.
Cette acti vité, déterminée de cette façon, est. approxima- tivement égale à, deux fois l'activité définie par Sauberlich et Baumann, dont l'unité est la quantité de matière par ems de milieu de culture nécessaire pour provoquer la demi croissance maximum de l'organisme d'essai. <I>Exemple 2:</I> A une solution d'acide 10-formyl-ptéroyl- glutamique, obtenue en chauffant pendant.
une heure au bain-marie 100 g d'acide ptéroyl- glutamique dans 600 cm3 d'acide formique à 90 %, on ajoute, après refroidissement, 4,4 g d'oxyde de platine comme catalyseur et on hydrogène le mélange à la température am biante jusqu'à ce que deux moles d'hydrogène soient absorbées (deux heures) pour un mole d'acide à réduire. On sépare le catalyseur par filtration et on laisse reposer la solution jusqu'au lendemain à la température am biante.
Puis on la chauffe pendant une heure au bain-marie, on la refroidit et on la verse graduellement dans 9 litres d'eau contenant 1300 g de bicarbonate de sodium. On ajoute alors de la soude (50 %) jusqu'à une concen- tration d'environ 0,1 N et on chauffe la solu tion pendant 30 minutes au bain-marie.
Après refroidissement, on acidifie le mélange avec de l'acide acétique jusqu'à pH 6,6, on ajoute 900 g de Magnésol (silicate de magnésium), on agite le mélange pendant 15 minutes et on le filtre, ce qui donne un filtrat jaune rete nant la plus grande partie de l'activité de la solution initiale. On acidifie celle-ci à pH 4 et on l'agite pendant 20 minutes avec 450 g de Darco-G60 (charbon de bois activé), puis on la filtre.
On lave soigneusement le gâteau de charbon de bois avec de l'eau, puis on le met en suspension dans un mélange de 1500 cms d'éthanol, 300 ems d'ammoniaque à 28 % et 1200 em3 d'eau. On chauffe ce mé- lange pendant 30 minutes au bain-marie en agitant tout en y faisant barboter de l'azote. On filtre le mélange chaud et on le lave à l'ammoniaque alcoolique dilué.
Le filtrat con- tient 70 % de l'acivité initiale. On le concentre à sec sous pression réduite, ce qui donne un résidu de 37 g de matière avec un essai bio chimique de 1,6 million d'unités par milli gramme. On peut purifier cette matière encore davantage.
<I>Exemple 3:</I> On ajoute, à une solution d'acide 10-for- myl-ptéroyl-glutamique obtenue en chauffant 5 g d'acide ptéroylglutamique (900/0) pen- dant 45 minutes au bain-marie avec 100 cm3 d'acide formique à 90 %, et après avoir re- froidi la solution à la température ambiante, 1,0 g d'oxyde de platine, et on réduit le mé lange par l'hydrogène dans un autoclave à.
secousses jusqu'à ce que 2,0 moles d'hydrogène approximativement soient absorbées par mole d'acide 10-formyl-ptéroyl-ghitamique. A ce moment, on sépare le catalyseur par filtration et on divise le filtrat réactionnel en trois fractions. <I>Fraction</I> On verse cette fraction dans environ 250 cm3 d'eau contenant du bicarbonate de sodium en quantité telle que la solution résul tante présente un pH de 7-8.
La solution ré sultante selon l'essai microbiologique contient 880 000 unités d'activité par cm3. Fraction B: On laisse reposer la seconde fraction pen dant 19 heures dans la solution d'acide for mique, puis on la traite de façon similaire à la façon A avec une solution de bicarbonate de sodium. La solution résultante à l'essai microbiologique contient 1100000 unités d'ac tivité par cm3. Fraction. <I>C:</I> On laisse reposer la troisième fraction pen dant 91 heures en solution d'acide formique, puis on la traite de façon analogue à la frac tion 4 par une solution de bicarbonate de sodium.
La solution résultante à l'essai micro- biologique contient<B>1530000</B> unités d'activité par em3.
Le composé obtenu par le procédé suivant. la présente invention est un solide cristallin jaune clair qui est stable dans la soude caus tique 0,1 N, même chauffée pendant 30 mi nutes à 100 C. En solution aqueuse à pH 2 à la température ambiante, il est instable et rapidement transformé en une matière ayant la même activité biologique que l'acide ptéroy 1- glutamique avec la perte correspondante d'ac tivité envers l'organisme Leuconostoc citro- vorum. La nouvelle substance est. absorbée sur divers agents absorbants tels que le charbon de bois à pH acide et un silicate de magnésium alcalin activé à pH faiblement.
alcalin et on peut utiliser ces derniers pour purifier les produits de réaction bruts par des procédés d'absorption chromatographique. En solution dans la soude caustique 0,1 N, elle présente une absorption maximum à 275-285 mu. Elle est très soluble dans l'eau à pH 3,5 à 4,0. Elle forme un sel de baryum insoluble dans l'alcool aqueux dilué. Elle est partiellement précipitée sous forme de sel de zinc à pH 6,8 à 7,0.
Process for the preparation of 5,6,7,8-tetrahydro-10-formyl-pteroyl-glutamic acid. The present invention relates to a process for the preparation of 5,6,7,8-tetrahydro-10-fox-myl-pteroyl-glutaniic acid, which is a new compound intended for use in medicine.
In 1918, Sauberlich and Baumann (Journal of Biological Chemistry, 176, p.165, 1948) recognized the existence of a substance stimulating the growth of Leuconostoc citrovorum. This unknown substance was found to be present in industrial liver extracts and also in the liver and in a wide variety of natural materials. Subsequent work has shown that the growth factor is not pteroylglutamic acid, vitamin 1312, or any of the already recognized vitamins found in the liver and other natural products.
It was also subsequently found that the small unknown substance satisfied the folic acid requirements of microorganisms and chicks. It has furthermore been found that this power factor reverses the action of the antagonists of petroylglutamic acid and, surprisingly, reverses the toxic effects of aminopterin, that is to say of the N acid. - [4-1 [(\ ?, 4-d iamino-6-pyrimido- [4, 5-b] - pyr azyl)
methyl] -amino} benzoS # 1] - glutamic, in mice and bacteria, under conditions in which pteroylglutamic acid is ineffective.
The citrovoruni factor is found in natural products in extremely low amounts, so that its recovery from these natural products is exceedingly difficult and practically impossible from an industrial point of view. It has however been discovered that it is possible to prepare a compound having an identical or similar biological activity by a process which makes it possible industrially. making suitable amounts of this active agent so that it can be used in medicine.
As the chemical structure of the growth factor of Leuconostoc cit-rovorum described by Sauberlich and others has not yet been elucidated to date, it is not yet possible to say whether the product obtained by the method described below is the same or not, although it has the same biological activity. As far as is known, however, the product obtained by the process according to the present invention is new.
According to the present invention, 5,6,7,8-tetrahydro-10-formyl-pteroyl-glutamic acid is prepared by hydrogenation of formyl-pteroyl-glutamic acid with about 2 moles of hydrogen per mole of. acid.
The 10-formyl-pteroyl-gltttamic acid used as a starting material can be prepared by various methods including that described by Gordon and others in Journal of the American Chemical Society, 70, p. 878, 1918. According to this process, formyl-pteroylglutamic acid is prepared by heating formyl-pteroylglutamic acid to 981% and acetic anhydride with folic acid (pteroylglutamic acid) for one hour at 100 ° C. The volatile reagents are removed in vacuo and a light yellow product precipitates from an alkaline solution by the addition of acetic acid.
The compound obtained by the process according to the present invention responds to. the following formula
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in which R represents the radical of glutamic acid.
The reduction of 10-formy 1-pteroyl-glutamic acid can be carried out with or without the aid of catalysts. When catalytic reduction is used, a variety of solvents can be used including water, formic acid, alcohol, glycol, acetic acid, dimethylformamide and others, of course depending on the nature. of the catalytic agent. The temperature of the reduction can be situated in a wide range going from 0 C to 150 C. The pH can vary in a range (in aqueous medium) from 3 to 12.
Many different reduction catalysts can be used, as will be seen in the examples which follow.
Generally, the reaction proceeds very quickly and appreciable yields of the desired product can be obtained in as little as 10 minutes at room temperature using, for example, as a catalyst, platinum in acid. form. Usually, the reduction is achieved in a period of 30 minutes to 2 hours.
The reaction is preferably carried out as follows: The starting material. is obtained from pteroylglutamic acid by formylation by heating it in 20 parts of 90-100% formic acid for 30 minutes to 1 hour at 80-95 C; it is isolated, if it is desired to carry out the reduction in a different solvent.
It is, however, generally more convenient to continue the reaction by cooling the solution and adding the catalyst to the solution, after which hydrogen can be passed into the reaction mixture by shaking or stirring. In some cases, it may be advantageous to activate the catalyst with hydrogen before mixing it with formyl pteroylglutamic acid although this process is not necessary. The pressure of hydrogen in the reaction vessel can be 1 to 100 atm. on more, but usually a pressure of 1 to. 3 atm. East. sufficient to obtain a good return.
After the reduction, the following can be carried out: The catalyst is removed by filtration, the solution is buffered with aqueous sodium bicarbonate, the desired substance being in the resulting solution. When it is desirable to remove excess formic acid from the reduction solution after removal of the catalyst, the solution can be poured into ether and the desired insoluble product isolated by filtration of the mixture.
When metals or metal combinations such as sodium amalgam, zinc, aluminum amalgam, sodium borohydride, magnesium amalgam, are used for the reduction by hydrogen. magnesium, etc., the solvent is usually water or essentially aqueous in nature in which alcohol, benzene or other organic solvents may be present.
The pH of the solution can be in the range of 3 to 12, the preferred conditions varying with the particular reducing agents used. The temperature can vary from 0 to 150 C, and the time required can vary from approximately 10 minutes until. 1 hour or more.
The invention will be better understood by referring to the following examples. Example <I> 1: </I> Is added to a solution of 10-formyl-pteroyl-glutamic acid obtained by heating for 15 minutes in a water bath 20 g of pteroyl-glutamic acid (90%) with 200 cm3 90% formic acid,
1 g of ascorbic acid and 0.5% of platinum oxide, and the melanze is hydrogenated in a shaker at 15.9 atni. of hydrogen pressure until approximately 1 moles of hydrogen per mole of 10-forniyl-pteroyl-glutainic acid are consumed. After reduction, the catalyst is separated by filtration and. the filtrate is stored in a nitrogen atmosphere for 40 hours.
The filtrate is heated for one hour in a water bath, then cooled and. it is poured into about 2500 cin3 of water containing. 340 g of sodium bicarbonate. Soda is added to adjust the pH to about 12 and. the solution is heated for half an hour in a water bath, cooled and neutralized to about pH 7.
The volume at this time is around 2900 em3. 300 g of silicate (magnesium (1lagnesol) powdered to the solution is added to absorb most of the impurities, stirred at room temperature for 15 minutes, then filtered. The filtrate has a light yellow color and a volume of 3100 cm3. Its hH is adjusted to 1 by adding hydrochloric acid and acetic acid. 150 g of activated charcoal are added to absorb most of the desired substance and the mixture is stirred. for 15 minutes at room temperature.
The charcoal is separated by filtration and washed thoroughly on the filter with distilled water. A colorless filtrate is obtained.
The charcoal is eluted by stirring for 15 minutes in a mixture of 500 cc of alcohol, 100 cc of 28% ammonia and 400 cc of water. The charcoal is separated by filtration and washed thoroughly with aqueous alcoholic ammonia. The volume of the yellow filtrate is 1120 cm 3. It is evaporated to dryness under reduced pressure and in a nitrogen atmosphere to obtain a brown syrupy residue. The latter is triturated with absolute ethanol, so that a light yellow solid is formed.
It is separated by filtration, washed with ethanol and then with ether, and dried for 10 minutes at 50 ° C. then in a desiccator under vacuum. The yield is 2.9 g.
The product is very soluble in water at a pH of 3.5 to 4 and aqueous solutions have a pale blue fluorescence. A 0.2 g sample is dissolved in 1 cm 3 of N / 10 sodium hydroxide and the pH is adjusted to 12 by adding a few drops of 5N sodium hydroxide. The solution is heated for -15 minutes in a water bath. Fluorescence persists.
Under these conditions, the starting material is. hydrolyzed to a non-fluorescent compound. The solution is cooled and separated by centrifugation of a small amount of insoluble material and then acidified at 0 C to pH 3.8. Z n produces. light yellow precipitates, which is filtered, washed with acetone and with ethanol and dried to obtain 0.062 g of product. By lowering the pH of the filtrate to. 3.3 to. 0 C, we obtain 0.015 g more.
The last product obtained, subjected to the microbiological test on the organism Lel (.conostoc citroL'orim1 <B> 8081 </B> has an activity of 3-5 million units per ing.
The activity in -units is determined by the microbiological test using the synthetic medium described by H. E Sauberlich and Baumann (Biological Chemistry 176, p. 165, 19-18) et. the organism Leuconostoc citro-z-orum 8081, each unit of activity being, taken arbitrarily as equivalent of 16.6 inillimierograms of an initial standard preparation.
This activity, determined in this way, is. approximately equal to twice the activity defined by Sauberlich and Baumann, the unit of which is the amount of material per ms of culture medium necessary to induce the half maximum growth of the test organism. <I> Example 2: </I> To a solution of 10-formyl-pteroyl-glutamic acid, obtained by heating for.
one hour in a water bath 100 g of pteroyl-glutamic acid in 600 cm3 of 90% formic acid, 4.4 g of platinum oxide are added after cooling as catalyst and the mixture is hydrogenated at temperature am biante until two moles of hydrogen are absorbed (two hours) for one mole of acid to be reduced. The catalyst is filtered off and the solution is left to stand overnight at room temperature.
Then it is heated for one hour in a water bath, cooled and gradually poured into 9 liters of water containing 1300 g of sodium bicarbonate. Soda (50%) is then added to a concentration of about 0.1 N and the solution is heated for 30 minutes in a water bath.
After cooling, the mixture is acidified with acetic acid to pH 6.6, 900 g of Magnesol (magnesium silicate) are added, the mixture is stirred for 15 minutes and filtered to give a filtrate. yellow retaining most of the activity of the initial solution. This is acidified to pH 4 and stirred for 20 minutes with 450 g of Darco-G60 (activated charcoal), then filtered.
The charcoal cake is washed thoroughly with water, then it is suspended in a mixture of 1500 cms of ethanol, 300 ems of 28% ammonia and 1200 ems of water. This mixture is heated for 30 minutes in a water bath with stirring while bubbling nitrogen through it. The hot mixture is filtered and washed with dilute alcoholic ammonia.
The filtrate contains 70% of the initial activity. It was concentrated to dryness under reduced pressure to give a residue of 37 g of material with a biochemical test of 1.6 million units per milligram. This matter can be further purified.
<I> Example 3: </I> Was added to a solution of 10-formyl-pteroyl-glutamic acid obtained by heating 5 g of pteroylglutamic acid (900/0) for 45 minutes in a bath. It is mixed with 100 cc of 90% formic acid, and after cooling the solution to room temperature, 1.0 g of platinum oxide, and the mixture is reduced with hydrogen in an autoclave at.
shaking until approximately 2.0 moles of hydrogen were absorbed per mole of 10-formyl-pteroyl-ghitamic acid. At this time, the catalyst is filtered off and the reaction filtrate is divided into three fractions. <I> Fraction </I> This fraction is poured into approximately 250 cm3 of water containing sodium bicarbonate in an amount such that the resulting solution has a pH of 7-8.
The resulting solution according to the microbiological test contains 880,000 activity units per cm3. Fraction B: The second fraction is allowed to stand for 19 hours in the solution of formal acid, then it is treated in a similar manner to method A with a solution of sodium bicarbonate. The resulting solution in the microbiological test contains 1,100,000 activity units per cm3. Fraction. <I> C: </I> The third fraction is left to stand for 91 hours in a solution of formic acid, then it is treated in a manner analogous to fraction 4 with a solution of sodium bicarbonate.
The resulting microbiological test solution contains <B> 1530000 </B> activity units per em3.
The compound obtained by the following process. the present invention is a light yellow crystalline solid which is stable in 0.1 N caustic soda, even heated for 30 minutes at 100 C. In aqueous solution at pH 2 at room temperature, it is unstable and rapidly transformed into a material having the same biological activity as pteroyl-glutamic acid with the corresponding loss of activity towards the organism Leuconostoc citrovorum. The new stuff is. absorbed on various absorbent agents such as charcoal at acidic pH and alkaline magnesium silicate activated at low pH.
alkaline and can be used to purify the crude reaction products by chromatographic absorption methods. When dissolved in 0.1 N caustic soda, it exhibits maximum absorption at 275-285 mu. It is very soluble in water at pH 3.5 to 4.0. It forms a barium salt which is insoluble in dilute aqueous alcohol. It is partially precipitated in the form of a zinc salt at pH 6.8 to 7.0.