Procédé pour la préparation de l'acide 5,6,7, 8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-glutamique. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de l'acide 5,6,7,8-tétra- hydro-10-fox-myl-ptéroyl-glutaniique qui est un composé nouveau destiné à être utilisé en mé decine.
En 1918, Sauberlich et Baumann (Journal of Biological Chemistry, 176, p.165, 1948) reconnurent l'existence d'une substance stimu lant la croissance du Leuconostoc citrovorum. On trouva que cette substance inconnue était présente dans les extraits de foie industriels et également dans le foie et dans une grande variété de matières naturelles. Des travaux ultérieurs ont montré que le facteur de crois sance n'est pas l'acide ptéroylglutamique, ni la vitamine 1312, ni aucune des vitamines déjà reconnues que l'on rencontre dans le foie et d'autres produits naturels.
On a également trouvé par la suite que la substance inconnue petit satisfaire aux besoins d'acide folique des micro-organismes et des poussins. On a de plus trouvé que ce facteur de puissance in verse l'action des antagonistes de l'acide pté- roy1glutamique et, chose surprenante, inverse les effets toxiques de l'aminoptérine, c'est- à-dire de l'acide N-[4-1[ (\?,4-d iamino-6-pyrimido- [ 4, 5-b ] - pyr azyl)
méthyl ] -amino } benzoS#1 ] - glutamique, sur les souris et les bactéries, dans des condi tions dans lesquelles l'acide ptéroylglutamique est inefficace.
lie facteur citrovorunî, existe dans les pro duits naturels en quantité extrêmement faible, de sorte que sa récupération de ces produits naturels est excessivement difficile et prati quement impossible du point de vue indus triel. On a cependant découvert qu'il est pos sible de préparer un composé ayant une acti vité biologique identique ou voisine par un procédé rendant possible industriellement. la fabrication de quantités convenables de cet agent actif, de sorte qu'on peut utiliser celui-ci en médecine.
Comme on n'a pas encore aujour d'hui élucidé la structure chimique du facteur de croissance du Leuconostoc cit-rovorum dé crit par Sauberlich et d'autres, il n'est pas possible de dire actuellement si le produit obtenu par le procédé décrit ci-après est le même ou pas, bien qu'il ait la même activité biologique. Pour autant qu'on le sache, cepen dant, le produit obtenu par le procédé selon la présente invention est nouveau.
Selon la présente invention, on prépare l'acide 5,6,7,8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl- glutamique par hydrogénation de l'acide 10 formyl-ptéroyl-glutamiqne avec environ 2 moles d'hydrogène par mole d'acide.
L'acide 10-formyl-ptéroyl-gltttamique uti lisé comme produit de départ petit être pré paré par divers procédés y compris celui dé crit par Gordon et d'autres dans Journal of the American Chemical Society, 70, p. 878, 1918. Selon ce procédé, on prépare l'acide formyl- ptéroylglutamique en chauffant de l'acide for mique à 981/o et de l'anhydride acétique avec de l'acide folique (acide ptéroylglutamique ) pendant une heure à 100 C. On élimine sous vide les réactifs volatils et un produit jaune clair précipite d'une solution alcaline par addition d'acide acétique.
Le composé obtenu par le procédé suivant la présente invention répond à. la formule sui vante
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dans laquelle R représente le radical de l'acide glutamique.
On peut réaliser la réduction de l'acide 10-formy 1-ptéroyl-glutamique avec ou sans l'aide de catalyseurs. Quand on utilise une réduction catalytique, on peut utiliser une ;nnde variété de solvants comprenant l'eau, l'acide formique, l'alcool, le glycol, l'acide acé tique, le diméthylformamide et d'autres, selon naturellement la nature de l'agent catalytique. La température de la réduction peut être située dans un grand intervalle allant de 0 C à 150 C. Le pH peut varier dans un intervalle (en milieu aqueux) de 3 à 12.
On peut utiliser de nombreux catalyseurs de réduction différents, comme on le verra clans les exemples qui suivent.
D'une faon générale, la réaction se pro duit très rapidement et on peut obtenir des rendements appréciables du produit désiré en un temps aussi court que 10 minutes à la tem pérature ambiante en utilisant par exemple, comme catalyseur, du platine dans l'acide for mique. Ordinairement, on réalise la réduction dans une période de 30 minutes à 2 heures.
La réaction est réalisée de préférence de la manière suivante: La matière de départ. est obtenue à partir de l'acide ptéroylgluta- mique, par formylation en le chauffant dans 20 parties d'acide formique à 90-100 % pen- dant 30 minutes à 1 heure à 80-95 C; elle est isolée, si on désire effectuer la réduction dans un solvant différent..
Il est cependant généralement plus commode de continuer la réaction en refroidissant la solution et en ajou tant le catalyseur à la solution, après quoi on peut faire passer de l'hydrogène dans le mé lange réactionnel en secouant ou en agitant. Dans certains cas, il peut être avantageux d'activer le catalyseur par l'hydrogène avant de le mélanger à l'acide ptéroylglutamique formylé bien que ce processus ne soit pas né cessaire. La pression d'hydrogène dans le réci pient de réaction peut être de 1 à 100 atm. on davantage, mais ordinairement une pression de 1 à. 3 atm. est. suffisante pour obtenir un bon rendement.
Après la réduction, on peut opérer de la faeon suivante: On élimine le catalyseur par filtration, on tamponne la solu tion par du bicarbonate de sodium aqueux, la substance désirée se trouvant dans la solu tion résultante. Quand il est désirable d'élimi ner l'excès d'acidë formique de la solution de réduction après élimination du catalyseur, on peut verser la solution dans l'éther et isoler le produit désiré, insoluble, par filtration du mélange.
Quand on utilise, pour la, réduction par l'hydrogène, des métaux ou des combinaisons métalliques telles que l'amalgame de sodium, le zinc, l'amalgame d'aluminium, le bor- hydrure de sodium, l'amalgame de magnésium. le magnésium, etc., le solvant est ordinaire ment l'eau ou de nature essentiellement aqueuse dans lequel de l'alcool, du benzène ou d'autres solvants organiques peuvent être présents.
Le pH de la solution peut être situé dans l'intervalle de 3 à 12, les conditions pré- férées variant avec les agents réducteurs par ticuliers utilisés. La température peut varier de 0 à 150 C, et le temps nécessaire peut varier depuis approximativement 10 minutes jusqu'à. 1 heures ou davantage.
On comprendra mieux l'invention en se référant aux exemples suivants. Exemple <I>1:</I> On ajoute, à une solution d'acide 10-formyl- ptéroyl-glutamique obtenue en chauffant 15 minutes au bain-marie 20 g d'acide ptéroyl- glutamique (90%) avec 200 cm3 d'acide for- mique à 90%,
1 g d'acide ascorbique et 0,5 Z d'oxyde de platine, et on hydrogène le mé- lan;ze dans un appareil à secousses sous 15,9 atni. de pression d'hydrogène jusqu'à ce chie '1 moles d'hydrogène par mole d'acide l0-forniyl-ptéroyl-glutainique soient, approxi mativement consommés. Après la réduction, on sépare le catalyseur par filtration et. on conserve le filtrat en atmosphère d'azote pen dant 40 heures.
On chauffe le filtrat pendant une heure au bain-marie, puis on le refroidit et. on le verse dans environ 2500 cin3 d'eau contenant. 340 g de bicarbonate de sodium. On ajoute de la soude pour ajuster le pH à environ 12 et. on chauffe la solution pendant une demi-heure au bain-marie, on la refroidit et on la neutra lise à environ pH 7.
Le volume à ce moment est d'environ 2900 em3. On ajoute 300 g de sili cate (le magnésium ( 1lagnésol ) pulvérisé à la solution pour absorber la plus grande partie des impuretés. on agite à la température am biante pendant 15 minutes, puis on fltre. Le filtrat. a une couleur jaune clair et un volume de 3100 cm3. On ajuste son hH à 1 par addi tion d'acide chlorhydrique et d'acide acétique. On ajoute 150 g de charbon de bois activé pour absorber la plus grande partie de la subs tance désirée et on agite le mélange pendant 15 minutes à la température ambiante.
On sé pare le charbon de bois par filtration et on le lave soigneusement sur le filtre à l'eau dis tillée. On obtient un filtrat incolore.
On soumet le charbon de bois à une élu- tion en l'agitant pendant 15 minutes dans un mélange de 500 em3 d'alcool, 100 cms d'ammo niaque à 28% et 400 ema d'eau. On sépare le charbon de bois par filtration et on le lave soi gneusement à l'ammoniaque alcoolique aqueux. Le volume du filtrat jaune est de 1120 cm-. On l'évapore à sec sous pression réduite et en atmosphère d'azote pour obtenir un résidu sirupeux brun. On triture ce dernier avec de l'éthanol absolu, de sorte qu'il se forme un solide jaune clair.
On le sépare par filtration, on le lave à l'éthanol puis à l'éther, on le sèche 10 minutes à 50 C puis dans un dessic- ca.t.eur sous vide. Le rendement est de 2,9 g.
Le produit est très soluble dans l'eau à un pH de 3,5 à 4 et les solutions aqueuses ont une fluorescence bleu pâle. On dissout un échantillon de 0,2 g dans 1 cm-' de soude N/10 et on ajuste le pH à 12 par addition de quel ques gouttes de soude 5N. On chauffe la solu tion pendant -15 minutes au bain-marie. La fluorescence persiste.
Dans ces conditions, la matière de départ, elle, est. hydrolysée en un composé non fluorescent. On refroidit la solu tion et on la sépare par centrifugation d'une petite quantité de matière insoluble puis on l'acidifie à 0 C à pH 3,8. Z n produit. jaune clair précipite, que l'on filtre, lave à l'acétone et à l'éthanol et sèche pour obtenir 0,062 g de produit. En abaissant, le pH du filtrat à. 3,3 à. 0 C, on obtient 0,015 g de plus.
Le dernier produit obtenu, soumis à l'essai microbiologi- que sur l'organisme Lel(.conostoc citroL'orim1 <B>8081</B> a une activité de 3-5 millions d'unités par ing.
On détermine l'activité en -unités par l'essai microbiologique en utilisant le milieu synthé tique décrit par H. E Sauberlich et Baumann (Biological Chemistry 176, p. 165, 19-18) et. l'organisme Leuconostoc citro-z-orum 8081, cha que unité d'activité étant, prise arbitrairement comme équivalente de 16,6 inillimierogrammes d'une préparation standard initiale.
Cette acti vité, déterminée de cette façon, est. approxima- tivement égale à, deux fois l'activité définie par Sauberlich et Baumann, dont l'unité est la quantité de matière par ems de milieu de culture nécessaire pour provoquer la demi croissance maximum de l'organisme d'essai. <I>Exemple 2:</I> A une solution d'acide 10-formyl-ptéroyl- glutamique, obtenue en chauffant pendant.
une heure au bain-marie 100 g d'acide ptéroyl- glutamique dans 600 cm3 d'acide formique à 90 %, on ajoute, après refroidissement, 4,4 g d'oxyde de platine comme catalyseur et on hydrogène le mélange à la température am biante jusqu'à ce que deux moles d'hydrogène soient absorbées (deux heures) pour un mole d'acide à réduire. On sépare le catalyseur par filtration et on laisse reposer la solution jusqu'au lendemain à la température am biante.
Puis on la chauffe pendant une heure au bain-marie, on la refroidit et on la verse graduellement dans 9 litres d'eau contenant 1300 g de bicarbonate de sodium. On ajoute alors de la soude (50 %) jusqu'à une concen- tration d'environ 0,1 N et on chauffe la solu tion pendant 30 minutes au bain-marie.
Après refroidissement, on acidifie le mélange avec de l'acide acétique jusqu'à pH 6,6, on ajoute 900 g de Magnésol (silicate de magnésium), on agite le mélange pendant 15 minutes et on le filtre, ce qui donne un filtrat jaune rete nant la plus grande partie de l'activité de la solution initiale. On acidifie celle-ci à pH 4 et on l'agite pendant 20 minutes avec 450 g de Darco-G60 (charbon de bois activé), puis on la filtre.
On lave soigneusement le gâteau de charbon de bois avec de l'eau, puis on le met en suspension dans un mélange de 1500 cms d'éthanol, 300 ems d'ammoniaque à 28 % et 1200 em3 d'eau. On chauffe ce mé- lange pendant 30 minutes au bain-marie en agitant tout en y faisant barboter de l'azote. On filtre le mélange chaud et on le lave à l'ammoniaque alcoolique dilué.
Le filtrat con- tient 70 % de l'acivité initiale. On le concentre à sec sous pression réduite, ce qui donne un résidu de 37 g de matière avec un essai bio chimique de 1,6 million d'unités par milli gramme. On peut purifier cette matière encore davantage.
<I>Exemple 3:</I> On ajoute, à une solution d'acide 10-for- myl-ptéroyl-glutamique obtenue en chauffant 5 g d'acide ptéroylglutamique (900/0) pen- dant 45 minutes au bain-marie avec 100 cm3 d'acide formique à 90 %, et après avoir re- froidi la solution à la température ambiante, 1,0 g d'oxyde de platine, et on réduit le mé lange par l'hydrogène dans un autoclave à.
secousses jusqu'à ce que 2,0 moles d'hydrogène approximativement soient absorbées par mole d'acide 10-formyl-ptéroyl-ghitamique. A ce moment, on sépare le catalyseur par filtration et on divise le filtrat réactionnel en trois fractions. <I>Fraction</I> On verse cette fraction dans environ 250 cm3 d'eau contenant du bicarbonate de sodium en quantité telle que la solution résul tante présente un pH de 7-8.
La solution ré sultante selon l'essai microbiologique contient 880 000 unités d'activité par cm3. Fraction B: On laisse reposer la seconde fraction pen dant 19 heures dans la solution d'acide for mique, puis on la traite de façon similaire à la façon A avec une solution de bicarbonate de sodium. La solution résultante à l'essai microbiologique contient 1100000 unités d'ac tivité par cm3. Fraction. <I>C:</I> On laisse reposer la troisième fraction pen dant 91 heures en solution d'acide formique, puis on la traite de façon analogue à la frac tion 4 par une solution de bicarbonate de sodium.
La solution résultante à l'essai micro- biologique contient<B>1530000</B> unités d'activité par em3.
Le composé obtenu par le procédé suivant. la présente invention est un solide cristallin jaune clair qui est stable dans la soude caus tique 0,1 N, même chauffée pendant 30 mi nutes à 100 C. En solution aqueuse à pH 2 à la température ambiante, il est instable et rapidement transformé en une matière ayant la même activité biologique que l'acide ptéroy 1- glutamique avec la perte correspondante d'ac tivité envers l'organisme Leuconostoc citro- vorum. La nouvelle substance est. absorbée sur divers agents absorbants tels que le charbon de bois à pH acide et un silicate de magnésium alcalin activé à pH faiblement.
alcalin et on peut utiliser ces derniers pour purifier les produits de réaction bruts par des procédés d'absorption chromatographique. En solution dans la soude caustique 0,1 N, elle présente une absorption maximum à 275-285 mu. Elle est très soluble dans l'eau à pH 3,5 à 4,0. Elle forme un sel de baryum insoluble dans l'alcool aqueux dilué. Elle est partiellement précipitée sous forme de sel de zinc à pH 6,8 à 7,0.