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La présente invention concerne un nouvel antibiotique soluble dans l'eau, présentant des propriétés basiques, qui sera désigné, dans ce qui va sui- vre, par la dénomination "lémacidine" ses composantes Bl, B2 et B3, leurs sels, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés ; concerne également un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" se forme lors de la culture d'un actinomycète de la famille du Streptomyces venezuelae, la souche A 9692. Cette sou- che a été isolée à partir d'une prise d'essai faite dans le sol à Roche, Canton de Waadt (Suisse) et elle est conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, Suisse),, Institut de Botanique Spé- ciale, sous cette désignation.
Le Streptomyces venezuelae A 9692 forme un mycélium aérien rose à brun-cannelle et porte des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typi- que de la famille des Streptomyces. Les chaînes de spores sont rigides, droites ou légèrement ondulées; on ne peut jamais observer la formation de spirales ou de verticilles. Les diverses spores, sont lisses. Il ne se forme pas d'exopigment apparent. Les milieux peptonés subissent une décoloration mélanodique en brun- noir. La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance de la souche A 9692 sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7, ainsi que 10, ont été préparés suivant W. Lindenbein, "Arch. Mikrobiol" 17, 361 (1952).
1) Gélose synthétique : Croissance grêle, voilée, jaune-clair.
Mycélium aérien, velouté, carmin pale.
2) Milieu synthétique liquide : Croissance peu abondante. Sédiment, flocons, jaune-clair.
3) Gélose-glucose Croissance grêle, voilée, brun-clair.
Le mycélium aérien fait défaut. Substratum brun-foncé.
4) Gélose-glucose à l'asparagine: Croissance grêle, voilée, brun-clair.
Mycélium aérien velouté, blanc-crayeux au début, plus tard brun-cannelle.
5) Gélose au malate de calcium : Croissance peu abondante, punctiforme, jaune- clair. Mycélium aérien d'un blanc neigeux.
6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C: Croissance superficielle, voilée, brun-clair.
Substratum brun-foncé. Liquéfaction sur
1,5 cm au bout de 14 jours.
7) Gélose à l'amidon : Croissance grêle, voilée, jaune-clair. Mycélium aérien d'un blanc neigeux au début, plus tard carmin pâle. Hydrolyse au bout de 10 jours
0,9 à 1,2 cm.
8) Pomme de terre : Croissance très abondante, voilée au début et jaune-clair, plus tard rugueuse et brun-clair.
Mycélium aérien brun-cannelle. Substratum brun fonc:é .
9) Carotte Croissance très peu abondante, punctiforme, jaune-clair. Le mycélium aérien fait défaut.
10) Lait de tournesol : Croissance bonne, pellicule jaune-clair.
Substratum bleu. Peptonisation lente. Coagula- tion bonne.
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche A 9692 sont celles de la catégoriè du Streptomyces venezuelae d'Ehrlich et autres.
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On sait que le Streptomyces venezuelae produit un antibiotique, notamment la chlo- romyoétine (Ehrlich J.. Barth Q.R., Smith R.M., Joslyn D.A et Burkholder P. R., Science 106, 417 1947 Cet antibiotique se distingue du nouvel antibiotique dénommé "lémacidine" déjà par le fait qu'à l'encontre de celui-ci il peut être extrait du filtrat de culture à l'aide de solvants organiques et que, de plus, il ne possède pas de propriétés basiques.
La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la pré- paration de l'antibiotique dénommé "lémacidine", à l'utilisation du Streptomyces venezuelae A 9692 ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'a- zote.
Pour obtenir l'antibiotique dénommé "lémacidine", on cultive de ma- nière aérobie une souche de Streptomycètes présentant les propriétés du Strep- tomyces venezuelae A 9692, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibiotique notable, puis on isole ensuite l'antibiotique dénommé "lémacidine".
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière-immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, s'avère appropriée une température compri- se entre 18 et 40 . En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet an- tibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Comme sources de carbone assimilable, on envisage par exemple le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon, la mannite, ainsi que la glycérine.
Comme substances nutritives azotées et comme substances favorisant le cas échéant la croissance, on citera : des acides aminés, des peptides et des protéines, ainsi que leurs produits de dégradation comme les peptones ou les tryptones, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais et le froment, des résidus de distillation provenant de la préparation d'alcools, des levures, des fèves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, etc...,mais aussi des nitrates. Comme autres sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer, par exemple, des chloru- res, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux, du magné- sium, du fer, du zinc et du manganèse.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" que l'on peut préparer suivant la présente invention est une substance soluble dans l'eau qui, d'après des examens effectués par chromatographie sur papier, est constitué par trois compo- sés vraisemblablement très proches. Il est complètement insoluble dans les sol- vants organiques,.surtout dans les solvants lipoides. L'antibiotique est basique et forme des sels qui, comme par exemple le chlorhydrate, sont en partie solu- bles dans certains solvants organiques comme les alcools aliphatiques inférieurs.
Lorsqu'on effectue la culture dans des milieux aqueux, 7.:'antibiotique se trouve presque complètement dans la solution nutritive alors que le mycélium séparé de cette dernière ne présente pratiquement pas d'activité antibiotique.
D'après ces propriétés, on ne peut pas, en vue d'obtenir l'antibioti- que dénommé "lémacidine", extraire celui-ci d'une solution de culture à l'aide de solvants organiques. On peut, par contre, dans les cas d'une réaction neutre ou faiblement alcaline, le soutirer à l'aide d'agents d'adsorptiôn et l'extraire des adsorbats à l'aide de liquides d'élution acides présentant avantageusement un pH inférieur à 4. Comme agents d'adsorption, on envisage, d'une part, du charbon actif, par exemple de la norite et, d'autre part, des échangeurs de ca- tions, notamment ceux renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple
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la résine échangeuse qu'on trouve dans le commerce sous la dénomination "Amberlite IRC-50".
Si l'on utilise du charbon actif comme agent d'adsorption, il est alors approprié d'utiliser comme liquides d'élution aussi bien des solutions acides aqueuses que des solvants miscibles à l'eau renfermant des acides, comme des al- cools aliphatiques inférieurs et des cétones. Un mélange à parties égales en vo- lume de méthanol et d'acide formique normal s'est avéré particulièrement avanta- geux.
Etant donné qu'en dehors de l'antibiotique le charbon actif adsorbe en- core de la solution de culture d'assez grandes quantités d'impuretés qui sont en partie colorées, on lave avantageusement la colonne d'adsorption, avant l'élution de l'antibiotique, les conditions restant quant au reste inchangées, avec de l'éthanol, ce qui fait qu'on élimine une grande partie des substances accompagna- trices, mais qu'on n'extrait toutefois pas l'antibiotique.
A partir de l'éluat acide, on peut obtenir sous la forme d'une poudre blanche une préparation forte- ment enrichie d'antibiotique, en concentrant l'éluat sous vide jusqu'à un petit volume, ce qui fait que le solvant organique ainsi que la majeure partie de 1' acide formique sont éliminés, et en ajoutant ensuite de 1' acétone au concentrât aqueux, avantageusement après avoir dilué avec 4 à 5 parties en volume de métha- nol, en lavant avec de l'acétone le précipité formé, puis finalement en séchant.
Etant donné que l'éluat obtenu au charbon, notamment à partir de cultures avec des solutions nutritives renfermant du carbonate de calcium, renferme des quanti- tés notables d'ions Ca, on sépare avantageusement le calcium à l'aide d'acide oxalique avant de précipiter l'antibiotique du concentrat.
Pour adsorber l'antibiotique avec un échangeur de cations, on utilise avantageusement ledit échangeur sous forme hydrogénée. L'élution a lieu avec une solution aqueuse diluée d'acide, le cas échéant après avoir préalablement lavé la colonne à l'eau distillée, ce qui fait qu'on élimine les substances accom- pagnatrices inactives. Comme agent d'élution, il est particulièrement approprié d'utiliser de l'acide chlorhydrique 0,2-normal. L'antibiotique est renfermé dans l'éluat sous la forme d'un sel. Les éluats obtenus avec des échangeurs de cations peuvent, en tant que tels, ou après concentration sous vide, le cas échéant après une neutralisation préliminaire, servir à l'obtention d'autres préparations en- richies en antibiotique.
Pour préparer à l'état pur l'antibiotique dénommé "lémacidine", à partir de préparations préalàblement purifiées par une adsorption effectuée avec du charbon ou des échangeurs d'ions, on ajoute, à leur solution aqueuse ajus- tée à un pH de 6,5 à 7,0, le volume, juste nécessaire pour une précipitation complète, d'une solution aqueuse du sel d'un colorant azolque renfermant des groupes sulfoniques, puis isole le sel de colorant de l'antibiotique difficile- ment soluble qui s'est formé.
Si l'on utilise comme sel de colorant azoïque le sel de sodium de l'acide 4'-diméthylamino-azobenzène -4-sulfonique qu'on trouve dans le commerce sous la dénomination Hélianthine ou Orange III, le sel de colorant "Hélianthate" se sépare alors totalement ou partiellement sous forme cristallisée en l'antibiotique dénommé "lémacidine". L'hélianthate de l'antibio- tique peut être recristallisé dans l'eau ou le méthanol ou dans des mélanges des deux, mais aussi dans du formamide et de l'eau. A l'état recristallisé, il constitue une poudre brun-rouge à l'oeil nu.
Examiné au microscope, il se pré- sente sous la forme de paillettes jaunes irrégulièrement formées qui sont dis- posées en couche, ou également sous la forme d'aiguilles, qui fondent à 202- 203 en se décomposant.,
Pour récupérer l'antibiotique du sel de colorant, on ajoute à celui- ci, en milieu aqueux ou alcoolique, le sel obtenu à partir d'un acide inorganique ou organique et d'une base organique, ce qui fait qu'il se forme le sel de 1' antibiotique avec l'acide correspondant et le sel de colorant de la base. Si 1' on utilise, pour cette réaction, du sulfate de triéthylamine, par exemple, et si l'on effectue ladite réaction avec une suspension aqueuse de l'hélianthate
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de l'antibiotique, on obtient alors le sulfate de l'antibiotique qui est soluble dans l'eau, ainsi que l'hélianthate de triéthylamine qui est insoluble.
En ajou-: tant une quantité suffisante de méthanol, à la solution réactionnelle, cette dernière passe en solution, tandis qu'il se sépare le sulfate de l'antibiotique qui n'est soluble que dans l'eau, mais est par contre complètement insoluble dans les alcools inférieurs, ledit sulfate pouvant, par exemple, être isolé par fil- tration. La réaction peut cependant être également entreprise dans une solution alo.oolique ou dans une solution alcoolique aqueuse, le sulfate précipitant aussi- tôt et pouvant être séparé de la solution de colorant.
Le sulfate de l'antibioti- que dénommé "lémacidine" que l'on obtient constitue une poudre incolore d'une haute activité antibiotique, qui est facilement soluble dans l'eau et le forma- mide, mais est par contre insoluble dans les solvants organiques comme les al- cools et les cétones.
A partir du sulfate, on peut, par réaction en solution aqueuse sur du chlorure de baryum et par isolement à partir de la solution débarrassée du sul- fate de baryum, obtenir par exemple le chlorhydrate de l'antibiotique sous la forme d'une poudre à peine colorée qui est facilement soluble dans l'eau, ainsi que dans le méthanol, mais est plus difficilement soluble dans l'éthanol. Par ailleurs, il est également possible de préparer le chlorhydrate directement à partir de l'hélianthate de l'antibiotique, en ajoutant, à une solution ou sus- pension de ce dernier dans du méthanol, un excès d'acide chlorhydrique concentré ou d'une solution de gaz chlorhydrique dans le méthanol, en précipitant à l'éther le chlorhydrate formé et en isolant.
Pour débarrasser de minimes impuretées co- lorées le chlorhydrate préparé suivant ces méthodes, on filtre une solution mé- thanolique dudit chlorhydrate à travers une colonne de charbon actif, de préfé- rence de suie de gaz, ce qui fait qu'après évaporation du solvant le chlorhydra- te est obtenu à partir du filtrat sous la forme d'une poudre d'un blanc pur qui, lors d'une très lente évaporation, se sépare, en solution aqueuse ou méthanoli- que, en partie sous forme cristalline.
La préparation sous forme pure de l'antibiotique dénomme "lémacidine" peut aussi avoir lieu en précipitant celui-ci sous la forme d'un sel difficile- ment soluble à partir de solutions aqueuses, à l'aide d'un acide organique, par exemple du type de l'acide picrique, comme l'acide picrique proprement dit ou l'acide styphnique, ou bien à l'aide d'acide picrolonique. Le picrate et le styph- nate précipitent d'abord sous forme liquide, à l'état de gouttelettes huileuses qui se solidifient peu à peu par un repos à la température ambiante ; on n'a pu toutefois jusqu'à présent les amener à cristallisation. Par contre, on peut cristalliser le picrolonate. Les bâtonnets jaunes, irréguliers, rassemblés en druses fondent, après suintement préalable, à 202 C en se décomposant.
Ces sels difficilement solubles peuvent, par traitement avec des acides comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique par exemple, en milieu aqueux ou dans un sol- vant organique non-miscible à l'eau comme le méthanol ou l'acétone, être trans- formés en sels correspondants et être isolés comme tels. Suivant ce procédé d' enrichissement, on peut obtenir l'antibiotique, par exemple à partir du sulfa- te purifié en passant par l'hélianthate, mais aussi à partir des adsorbats ob- tenus au charbon ou avec des échangeurs de cations.
Un autre sel cristallisé, difficilement soluble dans l'eau, de l'antibiotique dénommé "lémacidine", est constitué par le Reineckate qui cristallise en paillettes irrégulières et présen- te un point de décomposition de 198-2000C.
La base libre de l'antibiotique dénommé "lémacidine" est facilement accessible à partir de ces sels, à partir du sulfate par exemple par réaction en milieu aqueux avec de l'hydroxyde de baryum, par neutralisation de la bary- te en excès avec du dioxyde de carbone ainsi que par séparation du précipité de carbonate de baryum et de sulfate de baryum, et par isolement de l'antibio- tique-base à l'aide d'un séchage par réfrigération.
La préparation à partir des sels a lieu plus simplement en utilisant un échangeur d'anions fortement basique, par exemple la forme hydrogénée du produit qu'on trouve dans le commerce sous la
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dénomination "Dowex -2". '
L'antibiotique dénomme "lémacidine" est une base amorphe, incolore, qui est facilement soluble dans l'eau et dans les milieux aqueux, mais est par contre insoluble dans les solvants organiques. La solution aqueuse de la base présente une réaction alcaline. Une solution à 1% d'une préparation obtenue à l'aide d'échangeurs d'ions présente un pH de 8,6.
Avec les acides, l'antibiotique dénommé "lémacidine" forme des sels parmi lesquels, par exemple, le sulfate incolore et le chlorhydrate sont très facilement solubles dans l'eau. Le chlorhydrate se dissout, en outre, dans les alcools aliphatiques inférieurs, notamment dans le méthanol.
Lors d'une évaporation très lente de solutions aqueuses ou méthano- liques, on peut obtenir le chlorhydrate de l'antibiotique sous forme cristalline.
Il présente la composition élémentaire suivant : C = 37,3 %, H = 7,0 %, N = 16,8 %, 0 = 20,8 % (calculé), Cl = 18,1 %; [a]20D = + 24,4 (o = 1,0 dans 1' eau).
Les valeurs correspondantes pour le sulfate de l'antibiotique sont les suivantes ; C = 35,0 %, H = 6,9 % N = 11,6 %, 0 = 38,2 % (calculé), S = 8,3 %; [a] 27D = + 56 (c = 0,95 dans l'eau).
Le sel coloré de la base avec l'acide 4'-diméthyl-amino-azobenzène- 4-sulfonique ( hélianthate) est difficilement soluble aussi bien dans les mi- lieux aqueux que dans les milieux alcooliques. A partir de solutions saturées chaudes de ce genre, il se sépare sous la forme de paillettes de couleur jaune irrégulièrement formées qui, vues au microscope, sont disposées en couches, et aussi sous la forme d'aiguilles, qui après recristallisation présentent un point de décomposition de 202-203 C.
D'autres sels de l'antibiotique dénommé "lémacidine" dérivent, par exemple, des acides acétique, palmitique, succinique, citrique, pantothénique, ascorbique, ou d'acides aminés comme la leucine ou la méthionine .
Le chlorhydrate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" donne une réaction positive à la ninhydrine, une réaction faiblement positive au biuret et une réaction d'Elson-Morgan faiblement positive, tandis que le test au maltol et le test de Sakaguohi sont négatifs. Comme le montre un examen comparatif effectué par chromatographie sur papier, il est différent des antibiotiques incolores, solubles dans l'eau, qui sont actifs contre les bactéries Gram-positives et Gram- négatives.
Le chlorhydrate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" peut, par une chromatographie sur papier, être scindé en trois composants Bl, B2 et B3 qui sont vraisemblablement très proches. Si l'on utilise, par exemple, comme système sol- vant un mélange de 3 parties d'éthanol et d'une partie d'eau renfermant 2 % de chlorure de sodium, et fait égale à l'unité la valeur de Rf ( = RB) de la compo- sante B3 migrant le plus rapidement (substance de référence), il en résulte .alors pour les deux autres composantes Bl et B2 des'valeurs de RB de 0,34 et 0,61, res- pectivement.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" possède une forte activité antibi- otique vis-à-vis de divers organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode-test in vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37 pendant 24 heures, on a les concentrations suivantes qui sont en- core inhibantes :
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L'antibiotique dénommé "lémacidine: est également actif in vivo. Cinq injections sous-cutanées de 1 mg/kg pratiquées sur des souris infectées au Micro- coccus pyognes, var. aureus donnent 100 % de survivantes.
Lorsqu'on administre de manière identique 5 mg/kg à des souris infectuées à l'Escherichia coli, on observe un effet analogue, de même qu'on observe un effet chez les souris infec- tées au Salmonella typhi murium.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" présente à vrai dire une certai- ne toxicité; toutefois, une administration sous-cutanée de 50 mg de chlorhydrate d'antibiotique par kg est relativement bien supportée par les souris. Le sulfate et le pantothénate sont un peu moins toxiques que le chlorhydrate et le sel de l'acide L(+)-ascorbique ainsi que les sels des acides aminés que sont la L(-)-leu- cine et la L(-)-méthionine sont notablement moins toxiques que le chlorhydrate.
L'antibiotique, ses composantes Bl, B2 et B3 et leurs sels peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques. Ces dernières renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale. Pour la formation de cette matiè- re de support, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux com- posés comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magné- sium, le talc, des huiles végétales, les alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline,'.la cholestérine ou autres excipients connus.
Les préparations peuvent se présenter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, de poudres , d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires, telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsi- fiants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutique- ment précieuses.
L'invention concerne également,à titre de produits industriels nou- veaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades.
EXEMPLE 1.
On cultive le Streptomyces A 9692 suivant le procédé de culture im- mergée. On utilise une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, les substances additionnelles suivantes :
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<tb> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
La solution nutritive est stérilisée pendant 20 à 30 minutes, sous une pression d'une atmosphère effective, dans le ballon d'ensemencement ou dans les fermenteurs. La solution nutritive stérilisée présente un pH de 7,0 à 7,5.
L'ensemencement a lieu avec jusqu'à 10 % d'une culture végétative, partiellement sporulente, de l'organisme. On incube à 21-27 , en secouant bien ou en agitant, les cultures étant aérées dans les fermenteurs avec environ un volume d'air sté- rile par volume de solution et par minute : après 30 à 50 heures d'incubation, la solution de culture atteint sa valeur inhibante maximum vis-à-vis des organismes- tests (Bacillus megatherkun, Escherichia coli, Candida vulgaris). On interrompt la culture et sépare pai filtration ou centrifugation de la solution renfermant l'antibiotique le mycélium qui n'est que faiblement actif, ainsi que d'autres composantes solides, en ajoutant le cas échéant à la solution de culture, avant
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la filtration, environ 1 % d'un auxiliaire de filtration, par exemple de l'Hy- flosupercel.
Le pH du filtrat de culture n'est, en général, pas modifié ou ne 1' est que peu, en comparaison de la solution nutritive stérilisée.
Si l'on utilise, à la place de la solution nutritive indiquée ci- dessus, une solution renfermant, par litre d'eau du robinet, les mélanges de sub- stances nutritives qui sont indiqués sous a) à g), on obtient alors, après une culture et un traitement analogues, des filtrats de culture d'une activité anti- biotique aussi forte. Au lieu d'obtenir une filtration rapide de la solution de culture en y ajoutant de l'Hyflo Supercel ou un autre auxiliaire de filtration, on peut aussi l'obtenir en ajustant la solution de culture, avant filtration, à un pH de 5 à l'aide d'acide chlorhydrique, puis ensuite en l'ajustant, par ad- dition d'une solution aqueuse de sulfate d'aluminium, à une concentration de 0,5 % en ce sel.
Les mélanges de substances nutritives renfermant, par litre d'eau, les substances additionnelles suivantes, sont également appropriés :
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<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 40 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Distillers <SEP> Solubles <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> dE;
<SEP> sodium <SEP> 20 <SEP> g
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<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> b) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> (eau <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> gonflement <SEP> du <SEP> mais)
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<tb>
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Un filtrat ou un centrifugeât (obtenu suivant les indications ci- dessus) d'une culture de Streptomyces A 9692 présente, en général, un pH de 7,0 à 7,5.
Si ce n'est pas le cas, on ajuste, pour l'enrichissement suivant du nouvel
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antibiotique, le pH à cette valeur à l'aide d'une solution décanormale d'hydroxyde de sodium. Le filtrat faiblement alcalin est ensuite, en vue de l'adsorption de l'antibiotique, additionné de l% de charbon actif (norite) et la masse est agi- tée mécaniquement pendant une heure, la totalité de la substance actice du point de vue antibiotique étant adsorbée par le charbon. Ce dernier est séparé par fil- tration , avantageusement avec addition d'un peu d'un auxiliaire de filtration, comme par exemple de l'HyfloSupercel, de la solution complètement insctive qui est presque limpide comme de l'eau.
Outre l'antibiotique, le charbon adsorbe encore de grandes quanti- tés d'autres substances organiques inactives du point de vue antibiotique, sur- tout des produits de dégradation fortement colorés qui proviennent de la solu- tion nutritive, mais également des sels inorganiques. Ces substances accompagna- trices sont, avant l'élution de l'antibiotique, avantageusement éliminées du char- bon. A cet effet, la masse de charbon filtrée, encore humide, est introduite dans une quantité quintuple d'éthanol à 95% et la suspension est agitée pendant une demi-heure. Le charbon ainsi préalablement lavé peut, par filtration, être facilement séparé du liquide de lavage. Le filtrat de couleur brune ne présente pas d'activité antibiotique.
L'élution du nouvel antibiotique a lieu avec une solution acide- aqueuse de méthanol, avantageusement avec un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'acide formique normal, en utilisant 2 cm3 du liquide d'élution par gramme de l'agent d'adsorption. La suspension est bien agitée mécaniquement pendant une demi-heure, puis filtrée, après quoi le résidu de charbon est à nou- veau extrait à trois reprises de la même manière. Les éluats, parmi lesquels seul le premier est de couleur faiblement jaunâtre alors que les autres sont incolores, présentent la totalité de l'activité antibiotique. On les réunit et les concentre sous vide, à une basse température de bain, par exemple à 40-60 , jusqu'au centième du volume initial, ce qui fait qu'en dehors du méthanol et de beaucoup d'eau on élimine également la majeure partie de l'acide formique.
Le pH du concentrât de couleur jaunâtre, mais fluide, est en général de 4.
Le concentrat renferme, notamment lorsque la culture a été effectuée suivant le premier paragraphe ou suivant a) à d), d'assez grandes quantités de calcium. On élimine celui-ci sous la forme de l'oxalate difficilement soluble, en ajoutant au concentrât, tout en agitant, une solution aqueuse à 10 % d'acide oxalique. La quantité de la solution d'acide oxalique qui est nécessaire pour une précipitation complète est exactement déterminée dans une partie aliquote.
Pour des concentrats de cultures avec du carbonate de calcium, on a besoin, en général, de 300 à 500 em3 de solution d'acide oxalique par litre de concentrât, ce qui correspond à 3-5 cm3 par litre du filtrat de culture initial, tandis que les concentrats obtenus à partir de solutions de culture, sans addition de car- bonate de calcium, nécessitent des quantités moindres.
A partir du concentrat débarrassé du calcium, on obtient l'antibio- tique sous la forme d'une poudre blanche, fortement enrichie, en diluant le concen- trat aqueux d'abord avec 4 à 5 volumes de méthanol, puis en précipitant ensuite la matière active avec 20 volumes d'acétone. On sépare le précipité par filtra- tion, le lave à deux reprises avec de l'acétone et finalement le débarrasse sous vide des restes de solvant. On obtient une poudre d'un blanc pur qui présente à peu près la totalité de l'activité antibiotique du filtrat de culture. Le ren- dement est d'environ 300 mg par litre de filtrat de culture.
EXEMPLE 2.
On peut obtenir un enrichissement de l'antibiotique dénommé "lémaci- dine" notablement plus fort que suivant la précipitation à l'acétone qui est décrite dans l'exemple 1, en préparant son sel d'hélianthine cristallisé. A cet effet, on dilue avec 2 volumes d'eau le concentrat exempt de calcium que l'on
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obtient suivant l'exemple 1, ajuste le pH de la solution à une valeur de 6,7 à 7,0 à l'aide d'une solution décanormale d'hydroxyde de sodium, puis, tout en agitant vigoureusement, on ajoute en un fin jet le volume, nécessaire pour une précipita- tion complète, d'une solution aqueuse presque saturée d'hélianthine, renfermant par litre 3,5 g d'hélianthine (orange III, sel de sodium de l'acide 4'-diméthyla- mino-azobenzène-4-sulfonique),
la solution de précipitation étant avantageuse- ment introduite directement dans la solution d'antibiotique. Le volume de la solution d'hélianthine qui est nécessaire pour une précipitation complète est déterminé dans un essai préalable avec une partie aliquote. Ce volume varie, suivant la teneur en antibiotique, en général entre une quantité vingtuple à centuple du concentrat non-dilué qui est utilisé. L'hélianthate qui se forme (sel d'hélianthine de l'antibiotique) précipite en majeure partie à l'état cris- tallisé, sous la forme de minces paillettes et également d'aiguilles. On laisse la solution de précipitation reposer pendant quelques heures à basse température, à 0 , ce qui fait que le précipité se dépose complètement.
On sépare ensuite du précipité la majeure partie de la solution limpide qui surnage, par décantation, et le reste par centrifugation. En vue de son lavage, le précipité est agité une fois avec environ la même quantité d'eau glacée, puis il est ensuite isolé à l'aide d'un entonnoir-séparateur. Le lavage est répété à deux reprises de la même manière, mais à 1 acétone. L'hélianthate ainsi lavé du nouvel antibiotique est séché sous vide. Le rendement est compris entre 100 et 180 mg d'hélianthate par cm3 de concentrat. Le produit sec constitue une poudre d'un brun-rouge ; cet- te poudre est assez difficilement soluble dans l'eau et dans le méthanol, plus facilement soluble, par contre, dans le formamide, mais insoluble ou très peu soluble dans les solvants lipoïdes comme l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme et autres.
On peut la recristalliser aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, mais également dans des mélanges de ces solvants, ce qui fait qu' elle se présente au microscope en paillettes jaunes, irrégulièrement formées, qui sont disposées en couches et fondant à 202-203 en se décomposant.
Pour préparer le sulfate du nouvel antibiotique à partir de l'hélian- thate, on met par exemple 30 g de la poudre sèche d'hélianthate en suspension dans 150 cm3 d'eau, ajoute à la suspension 33 cm3 d'une solution aqueuse à 80 % de sulfate de triéthylamine, puis agite la masse pendant une heure, ce qui fait qu'elle prend peu à peu une teinte rouge-brun par suite de la formatio n du sel triéthylaminique de l'hélianthine qui est difficilement soluble. La réaction peut être notablement accélérée par chauffage. A cet effet, on ajoute au mélange ré- actionnel 20 volumes de méthanol, ce qui fait que le sulfate de l'antibiotique se forme à l'état d'un précipité blanc, tandis que l'hélianthate de triéthylamine passe en solution.
On débarrasse du colorant adhérant le sulfate d'antibiotique obtenu par centrifugation ou filtration, en le précipitant à deux reprises dans de l'eau avec du méthanol, le lave finalement encore avec du méthanol pur, puis ensuite le sèche. Il constitue une poudre amorphe, d'un blanc pur, qui est inso- luble dans les solvants organiques, mais est par contre facilement soluble dans l'eau. Le rendement est de 5,6 g.
EXEMPLE 3.
En vue de transformer le sulfate, du nouvel antibiotique, en un chlorhydrate facilement soluble aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, on dissout ledit sulfate dans une quantité décuple d'eau puis traite la solution aqueuse jusqu'à précipitation complète par une solution à 20 % de chlorure de baryum, 4 cm3 environ étant nécessaire par gramme de sulfate. On élimine par centrifugation le précipité de sulfate de baryum et, à partir de la solution incolore qui surnage, on isole le chlorhydrate à l'aide d'un séchage par réfri- gération. On obtient ainsi un peu plus d'un gramme de chlorhydrate par gramme de sulfate.
Pour obtenir une autre purification du chlorhydrate, on dissout celui-ci dans peu de méthanol, verse la solution concentrée sur une colonne de chromatographie remplie de suie de gaz et lavée au méthanol, puis élue avec le
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même solvant. Le résidu d'évaporation de l'éluat constitue une poudre d'un blanc pur facilement soluble dans le méthanol et dans l'eau qui, à partir de ces sol- vants et lors d'une très lente évaporation, se sépare en partie sous forme cris- talline.
Au lieu de préparer le chlorhydrate en passant par le sulfate, on peut aussi l'obtenir directement à partir de l'hélianthate. A cet effet, on met ce dernier, à l'état sec et finement divisé, en suspension dans une quantité à peu près décuple de méthanol absolu, ajoute encore à la suspension 2 volumes d'une solution méthanolique déoanormale d'acide chlorhydrique, puis fait ensuite bouillir 'brièvement. Après avoir décoloré avec un peu de norite, on filtre, con- centre ensuite sous vide le filtrat limpide comme de l'eau jusqu'au quart environ de son volume initial, puis, à partir du concentrat, précipite le chlorhydrate avec 10 à 20 volumes d'éther ou d'acétone.
EXEMPLE 4.
L'antibiotique obtenu suivant l'exemple 2 à l'état de sulfate brut est, en passant par le picrate, purifié davantage comme suit : A une solution bien agitée d'un gramme de sulfate dans 20 cm3 d'eau, on ajoute lentement 130 cm d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, quantité qui est juste suffisante pour une précipitation complète. Il se forme un précipité huileux qu'on sépare par centrifugation, qu'on' lave à une reprise avec un peu d'une solution saturée d'acide picrique et à l'eau, puis sèche en- suite sous vide dans un exsiccateur, ce qui fait que le picrate se transforme en une masse solide qui n'est toutefois pas cristallisée. Le rendement est de 1,2 g.
Pour transformer le picrate de l'antibiotique en son chlorhydrate, on dissout le premier dans du méthanol chaud acidifié avec de l'acide chlorhydrique concentré et verse la solution dans 10 volumes d'éther, ce qui fait que le chlor- hydrate insoluble précipite sous la forme d'une masse blanche. On débarrasse cette dernière des restes d'acide picrique qui adhérent encore, en la dissolvant dans une quantité de méthanol bouillant qui est nécessaire pour la dissolution et en répétant la précipitation à l'éther. On obtient ainsi environ 0,6 g de chlorhydrate pulvérulent d'un blanc pur.
EXEMPLE 5.
Au lieu d'obtenir l'antibiotique à l'état pur, par exemple sous la for- me de son chlorhydrate, en passant par le picrate qu'on n'a pas pu cristalliser jusqu'à présent, on peut l'obtenir en passant par le picrolonate cristallisé, au- quel cas on procède comme suit :
A une solution, dans 100 cm3 d'eau, de 1,0 g du sulfate obtenu sui- vant l'exemple 2, on ajoute goutte-à-goutte au cours d'une heure, en agitant, 700 cm3 d'une solution aqueuse concentrée d'acide picrolonique, renfermant 2,4 g par litre. On essore le précipité amorphe de picrolonate qui s'est formé et, en vue de le cristalliser, le dissout dans 150 cm3 d'eau bouillante et filtre la solution à chaud. Par un lent refroidissement à la température ambiante, le pi- crolonate se sépare du filtrat sous une forme partiellement cristallisée.
On rassemble le précipité sur l'entonnoir filtrant, le lave avec peu d'eau glacée et, en vue de le recristalliser, le dissout dans 100 cm3 d'eau bouillante. A par- tir de la solution filtrée à chaud, le picrolonate précipite alors complètement sous la forme de fins bâtonnets jaunes disposés en druses qui, après avoir été lavés avec peu d'eau glacée et avcir été séchés so-qs vide sur du pentoxyde de phos- phore, présentent, après suintement, un point de décomposition net à 202 . Le rendement en picrolonate recristallisé à deux reprises est de 0,64 g.
A partir du picrolonate obtenu précédemment, on obtient le chlorhydra- te pur lorsque tout en agitant vigoureusement, on ajoute, par portions, à une sus- pension finement divisée de 0,6 g de picrolonate dans 10 cm3 de méthanol glacé,
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0,6 cm3 d'une solution décanormale de gaz chlorhydrique dans le méthanol absolu et, après réaction complète, précipite complètement le chlorhydrate partiellement séparé qui s'est formé, en ajoutant au mélange réactionnel 20 volumes d'éther absolu. On essore le chlorhydrate, le lave une fois avec un peu d'éther sur l'en- tonnoir filtrant et ensuite, en vue d'éliminer les restes d'acide picrolonique qui adhérent encore, dissout dans 2 cm3 de méthanol, puis sépare à nouveau à 1' éther et lave.
Le chlorhydrate maintenant pur de l'antibiotique constitue, après séchage sous vide, une poudre amorphe d'un blanc pur. Le rendement est de 0,25 g.
D'après des examens effectués par chromatographie sur papier, le chlorhydrate ainsi obtenu de l'antibiotique dénommé "lémacidine" est formé par un mélange de trois composés vraisemblablement très proches (B1, B2 et B3). Si l'on utilise, par exemple, comme système solvant un mélange de 3 parties d'éthanol et d'une partie d'eau renfermant 2 % de chlorure de sodium, et fait égale à 1' unité la valeur de Rf ( = RB) du composant B3 (substance de référence) migrant le plus rapidement, on a alors pour les deux autres composantes Bl et B2 des va- leurs de RB qui sont respectivement de 0,34 et de 0,61.
EXEMPLE 6.
La préparation de la base libre du nouvel antibiotique peut avoir lieu aussi bien à partir de son sulfate avec de l'hydroxyde de baryum, qu'en utilisant également un échangeur d'ions faiblement basique. Dans le premier cas on ajoute par exemple à une solution, dans 5 cm3 d'eau, d'un gramme du sulfate d'antibio- tique obtenu suivant l'exemple 2, un léger excès d'une solution saturée chaude d'hydroxyde de baryum, c'est-à-dire jusqu'à ce que le mélange réactionnel pré- sente un pH de 9 environ. On neutralise ensuite aussit8t l'hydroxyde de baryum en excès en faisant passer dans la solution du dioxyde de carbone.
Ensuite, en vue de transformer le bicarbonate de baryum formé, on maintient le mélange réac-' tionnel pendant quelques minutes dans un bain-marie à 60 , après quoi le car- bonate de baryum précipité est séparé par centrifugation conjointement avec le sulfate de baryum. A partir de la solution alcaline de centrifugation, limpide comme de l'eau, qui surnage, on isole la base libre du nouvel antibiotique à l'aide d'un séchage par réfrigération. Elle constitue une poudre blanche qui est soluble dans l'eau en donnant une réaction fortement alcaline et qui est insolu- ble dans les solvants organiques. Le rendement est de 0,5 g.
Pour obtenir la base libre à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement basique, on procède comme suit :
A travers une colonne remplie de l'échangeur d'ions faiblement basi- que qu'est le "Dowex-2", on percole une solution aqueuse, à 20 % environ, de 0,2 g du sulfate brut du nouvel antibiotique obtenu suivant l'exemple 2, en utilisant à peu près une quantité trentuple de la résine échangeuse d'ions, lavée à plu- sieurs reprises dans l'ordre d'abord avec de l'acide chlorhydrique dilué, avec de l'eau, avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium et à nouveau à l'eau.
La colonne chargée avec la solution de sulfate est ensuite lavée à l'eau, ce qui fait que la base est facilement éluée. En vue d'obtenir la base l'éluat est, comme précédemment, avantageusement lyophilisé. Le rendement est de 0,65 g. La base constitue une poudre blanche amorphe.
EXEMPLE 7.
A travers une colonne d'une résine échangeuse d'ions faiblement acide et renfermant des groupes carboxyliques, telle par exemple de l'Amberlite IRC-50, on filtre une solution de culture de l'antibiotique dénommé "lémacidine" solu- tion qui est obtenue suivant l'exemple 1 et est débarrassée du mycélium, en utili- sant par litre de la solution d'antibiotique 100 g de la fomme hydrogénée de 1' échangeur et en ajustant à 5 litres environ par heure la vitesse de traversée.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" est adsorbé, conjointement avec des substan- ces accompagnatrices inactives qui sont en partie fortement colorées en brun;
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la solution qui s'écoule et qui présente un pH de 3 à 3,5 ne possède qu'une très, faible activité antibiotique. On lave ensuite la colonne d'Amberlite avec un volu- me d'eau distillée correspondant au cinquième du volume de la solution de cultu- re filtrée, ce qui fait qu'on élimine une partie des substances accompagnatrices inactives colorées, mais qu'on n'élue toutefois pas l'antibiotique proprement dit.
Pour obtenir ce dernier à partir de l'adsorbat, on fait passer, à travers la co- lonne préalablement lavée, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,2-normal et à savoir au total le quart du volume de la solution de culture utilisée.
L'éluat fortement acide est neutralisé, soit avec une solution concentrée d'hy- droxyde de sodium, soit à l'aide d'un échangeur d'ions basique. La solution ainsi obtenue peut, comme telle ou après concentration sous vide à basse température, être utilisée comme solution de départ pour l'obtention d'autres préparations enrichies de l'antibiotique dénommé "lémacidine", par exemple suivant les procé- dés décrits dans les exemples 2 - 3 ou 4.
EXEMPLE 8.
Le pantothénate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" peut être ob- tenu, par exemple, à partir du sulfate préparé suivant l'exemple 2. A cet effet, on ajoute à une solution de 1,0 g du sulfate dans 10 cm3 d'eau, 8,0 cm3 d'une solution aqueuse à 10 % de pantothénate de calcium, débarrasse le précipité for- mé du sulfate de calcium par filtration ou centrifugation, puis lyophilise le filtrat ou le centrifugeât, ou l'évapore à sec sous vide. Le résidu sec du pan- tothénate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" constitue une poudre blanche amorphe qui est très facilement soluble dans l'eau.
D'une manière analogue, on peut préparer d'autres sels de l'anti- biotique dénommé "lémacidine" avec des acides organiques, comme par exemple l' acide L(+)-ascorbique, ou avec des acides ,aminés comme la L(-)-leucine ou la L(-)-méthionine. Dans ce cas, on part avantageusement de la base de l'antibioti- que obtenue à l'état libre suivant l'exemple 6, en ajoutant à sa solution aqueuse concentrée une solution saturée chaude de l'acide organique, auquel cas on utili- se par exemple, pour un gramme de la base, 1,2 g d'acide ascorbique ou 0,9 g de leucine ou 1,05 g de méthionine.
REVENDICATIONS.
I. Un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique., caractérisé par le fait qu'on cultive dans des conditions aérobies du Streptomyces venezuelae A 9692, ou une variété de cette souche, dans une solution nutritive aqueuse ren- fermant une source de carbone et d'azote ainsi que des substances inorganiques, jusqu'à ce que ladite solution présente une forte activité antibiotique, qu'on isole ensuite de la solution nutritive l'antibiotique dénommé "lémacidine" et qu' on prépare éventuellement ses sels.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants
1) La croissance a lieu en culture immergée.
2) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température com- prise entre 18 et 40 , de préférence à 21-27
3) L'antibiotique est isolé du filtrat de culture par adsorption à un pH faiblement alcalin, avantageusement à un pH de 7,5 à 8, de préférence à l'aide de charbon actif.
4) L'antibiotique est extrait de l'adsorbat à l'aide d'un agent d' élution acide, de préférence à l'aide d'un agent d'élution renfermant de l'acide formique.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates to a novel water-soluble antibiotic, exhibiting basic properties, which will be designated, in what follows, by the name “lemacidin”, its components B1, B2 and B3, their salts, as well as pharmaceutical preparations containing these compounds; also relates to a process for the preparation of such substances and mixtures of substances.
The antibiotic called "lemacidin" is formed during the culture of an actinomycete of the Streptomyces venezuelae family, strain A 9692. This strain was isolated from a test sample made in soil at Roche, Canton of Waadt (Switzerland) and it is kept in the Laboratories of the Applicant and at the Federal Polytechnic School (Zurich, Switzerland), Institute of Special Botany, under this designation.
Streptomyces venezuelae A 9692 forms a pink to cinnamon-brown aerial mycelium and carries chains of conidia which are a typical feature of the Streptomyces family. The spore chains are rigid, straight or slightly wavy; one can never observe the formation of spirals or whorls. The various spores are smooth. No apparent exopigment is formed. Peptone media undergo melanodic brown-black discoloration. Growth is relatively little temperature dependent, and the fungus thrives at 18 as well as at 40; however the optimum growth is between 25 and 32.
To give other characteristics, the growth of strain A 9692 on different nutrient media will be described in what follows. Nutrient media 1-7, as well as 10, were prepared according to W. Lindenbein, "Arch. Mikrobiol" 17, 361 (1952).
1) Synthetic agar: Growth slender, hazy, light yellow.
Aerial mycelium, velvety, pale carmine.
2) Liquid synthetic medium: Sparse growth. Sediment, flakes, light yellow.
3) Glucose agar Growth slender, hazy, light brown.
The aerial mycelium is lacking. Substratum dark brown.
4) Asparagine Glucose Agar: Growth slender, hazy, light brown.
Velvety aerial mycelium, chalky white at first, later cinnamon brown.
5) Calcium malate agar: Scanty growth, punctiform, light yellow. Snowy white aerial mycelium.
6) Agar medium (gelatin) at 18 C: Superficial growth, hazy, light brown.
Substratum dark brown. Liquefaction on
1.5 cm after 14 days.
7) Starch agar: Growth slender, hazy, light yellow. Aerial mycelium snowy white at first, later pale carmine. Hydrolysis after 10 days
0.9 to 1.2 cm.
8) Potato: Very abundant growth, hazy at first and light yellow, later rough and light brown.
Cinnamon-brown aerial mycelium. Dark brown substrate: é.
9) Carrot Very scanty growth, punctiform, light yellow. The aerial mycelium is lacking.
10) Sunflower milk: Good growth, light yellow skin.
Blue substrate. Slow peptonization. Good coagulation.
The morphological and physiological characteristics of strain A 9692 are those of the Streptomyces venezuelae category of Ehrlich et al.
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It is known that Streptomyces venezuelae produces an antibiotic, in particular chlo- romyoetin (Ehrlich J .. Barth QR, Smith RM, Joslyn DA and Burkholder PR, Science 106, 417 1947 This antibiotic is distinguished from the new antibiotic called "lemacidin" already by the fact that, in contrast to this, it can be extracted from the culture filtrate with the aid of organic solvents and that, moreover, it does not have basic properties.
The present invention is not limited, as regards the preparation of the antibiotic called "lemacidin", to the use of Streptomyces venezuelae A 9692 or other strains corresponding to the description, but it also relates to the 'use of varieties of these organisms, as obtained, for example, by selection or mutation, in particular under the influence of ultra-violet radiation or x-rays, or under the action of nitrogen mustard .
To obtain the antibiotic called "lemacidin", a strain of Streptomycetes exhibiting the properties of Streptomycetes A 9692 is aerobically cultivated in an aqueous nutrient solution containing a source of carbon and nitrogen, as well as inorganic salts, until this solution exhibits a notable antibiotic action, then the antibiotic called "lemacidin" is then isolated.
The culture takes place aerobically, that is to say for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner with shaking or agitation with air or oxygen in the shaken flasks. or in known fermenters. As a temperature, a temperature between 18 and 40 is suitable. By operating in this way, the nutrient solution exhibits a noticeable antibacterial effect, generally after one and a half to five days.
As sources of assimilable carbon, for example glucose, sucrose, lactose, starch, mannite, as well as glycerin are envisaged.
Nitrogenous nutrients and, where appropriate, growth promoting substances include: amino acids, peptides and proteins, as well as their degradation products such as peptones or tryptones, as well as meat extracts, soluble fractions in the water of grains of cereals such as corn and wheat, distillation residues resulting from the preparation of alcohols, yeasts, beans, in particular soybeans, seeds, for example cotton, etc., but also nitrates. Like other inorganic salts, the nutrient solution may contain, for example, chlorides, carbonates, alkali and alkaline earth metal sulfates, magnesium, iron, zinc and manganese.
The antibiotic called "lemacidin" which can be prepared according to the present invention is a water soluble substance which, according to examinations carried out by chromatography on paper, consists of three compounds which are probably very similar. It is completely insoluble in organic solvents, especially in lipoid solvents. The antibiotic is basic and forms salts which, such as the hydrochloride, are partly soluble in certain organic solvents such as lower aliphatic alcohols.
When cultured in aqueous media, the antibiotic is almost completely present in the nutrient solution while the mycelium separated from the latter exhibits practically no antibiotic activity.
According to these properties, in order to obtain the antibiotic called "lemacidin", it is not possible to extract the latter from a culture solution using organic solvents. On the other hand, in the case of a neutral or weakly alkaline reaction, it can be withdrawn using adsorbents and extracted from the adsorbates using acidic elution liquids advantageously having a pH less than 4. Suitable adsorption agents are, on the one hand, activated carbon, for example norite, and, on the other hand, cation exchangers, especially those containing carboxylic groups, as by example
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the exchange resin which is commercially available under the name "Amberlite IRC-50".
If activated carbon is used as an adsorption agent, then it is suitable to use as elution liquids both aqueous acidic solutions and water-miscible solvents containing acids, such as aliphatic alcohols. lower and ketones. Particularly advantageous has been found to be a mixture of equal parts by volume of methanol and normal formic acid.
Since, apart from the antibiotic, the activated charcoal still adsorbs from the culture solution rather large quantities of impurities which are partly colored, the adsorption column is advantageously washed, before elution of the antibiotic, the conditions remaining unchanged, with ethanol, which eliminates a large part of the accompanying substances, but does not however extract the antibiotic.
From the acid eluate, a strongly enriched antibiotic preparation can be obtained in the form of a white powder, by concentrating the eluate in vacuo to a small volume, whereby the organic solvent as well as most of the formic acid are removed, and then adding acetone to the aqueous concentrate, preferably after diluting with 4 to 5 parts by volume of methanol, washing the precipitate with acetone. formed, then finally drying.
Since the eluate obtained with charcoal, in particular from cultures with nutrient solutions containing calcium carbonate, contains significant amounts of Ca ions, the calcium is advantageously separated using oxalic acid before to precipitate the antibiotic from the concentrate.
To adsorb the antibiotic with a cation exchanger, said exchanger is advantageously used in hydrogenated form. The elution takes place with a dilute aqueous acid solution, if necessary after having previously washed the column with distilled water, whereby the inactive accompanying substances are removed. As the eluting agent, it is particularly suitable to use 0.2-normal hydrochloric acid. The antibiotic is enclosed in the eluate in the form of a salt. The eluates obtained with cation exchangers can, as such, or after concentration in vacuo, if necessary after preliminary neutralization, be used to obtain other preparations enriched with antibiotics.
To prepare in the pure state the antibiotic called "lemacidin", from preparations previously purified by adsorption carried out with carbon or ion exchangers, is added to their aqueous solution, adjusted to a pH of 6 , 5 to 7.0, the volume, just necessary for complete precipitation, of an aqueous solution of the salt of an azolc dye containing sulphonic groups, then isolates the dye salt of the difficult- ly soluble antibiotic which s 'is formed.
If the sodium salt of 4'-dimethylamino-azobenzene -4-sulfonic acid, which is commercially available under the name Helianthine or Orange III, is used as the azo dye salt, the "Helianthate" dye salt then separates completely or partially in crystallized form in the antibiotic called "lemacidin". The helianthate of the antibiotic can be recrystallized from water or methanol or mixtures of the two, but also from formamide and water. In the recrystallized state, it constitutes a brown-red powder to the naked eye.
When viewed under a microscope, it appears as irregularly shaped yellow flakes which are layered, or also as needles, which melt at 202-203 as they decompose.,
To recover the antibiotic from the dye salt, the salt obtained from an inorganic or organic acid and an organic base is added to it, in an aqueous or alcoholic medium, which causes it to form the salt of the antibiotic with the corresponding acid and the dye salt of the base. If, for example, triethylamine sulfate is used for this reaction, and if said reaction is carried out with an aqueous suspension of the helianthate
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of the antibiotic, the sulfate of the antibiotic which is soluble in water is then obtained, as well as triethylamine helianthate which is insoluble.
By adding a sufficient quantity of methanol to the reaction solution, the latter goes into solution, while the sulfate of the antibiotic is separated, which is only soluble in water, but is on the other hand completely insoluble in lower alcohols, said sulfate being capable, for example, of being isolated by filtration. The reaction can, however, also be carried out in an alooolic solution or in an aqueous alcoholic solution, the sulfate also precipitating early and being able to be separated from the dye solution.
The sulphate of the antibiotic called "lemacidin" which is obtained constitutes a colorless powder with high antibiotic activity, which is easily soluble in water and formamide, but is on the other hand insoluble in solvents. organic like alcohols and ketones.
From the sulphate it is possible, by reaction in aqueous solution with barium chloride and by isolation from the solution freed from barium sulphate, to obtain, for example, the hydrochloride of the antibiotic in the form of a powder. barely colored which is easily soluble in water, as well as in methanol, but is more sparingly soluble in ethanol. On the other hand, it is also possible to prepare the hydrochloride directly from the helianthate of the antibiotic, by adding, to a solution or suspension of the latter in methanol, an excess of concentrated hydrochloric acid or of a solution of hydrochloric gas in methanol, precipitating the hydrochloride formed with ether and isolating.
To rid the hydrochloride prepared according to these methods of minimal colored impurities, a methanol solution of said hydrochloride is filtered through a column of activated carbon, preferably gas soot, so that after evaporation of the solvent the hydrochloride is obtained from the filtrate in the form of a pure white powder which, on very slow evaporation, separates, in aqueous or methanolic solution, partly in crystalline form.
The preparation in pure form of the antibiotic called "lemacidin" can also take place by precipitating the latter in the form of a hardly soluble salt from aqueous solutions, with the aid of an organic acid, for example. example of the type of picric acid, such as picric acid proper or styphnic acid, or else using picrolonic acid. Picrate and styphenate first precipitate in liquid form, in the form of oily droplets which gradually solidify on standing at room temperature; up to now, however, it has not been possible to bring them to crystallization. On the other hand, the picrolonate can be crystallized. The yellow, irregular sticks, collected in druses, melt, after previous seepage, at 202 C while decomposing.
These hardly soluble salts can, by treatment with acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid for example, in aqueous medium or in an organic solvent immiscible with water such as methanol or acetone, be transformed into corresponding salts and be isolated as such. According to this enrichment process, the antibiotic can be obtained, for example from purified sulphate via helianthate, but also from adsorbates obtained with carbon or with cation exchangers.
Another crystallized salt, hardly soluble in water, of the antibiotic called "lemacidin", consists of Reineckate which crystallizes in irregular flakes and has a decomposition point of 198-2000C.
The free base of the antibiotic called "lemacidin" is easily accessible from these salts, from sulphate for example by reaction in aqueous medium with barium hydroxide, by neutralization of the excess barium with sodium. carbon dioxide as well as by separating the precipitate of barium carbonate and barium sulfate, and isolating the antibiotic-base using refrigeration drying.
Preparation from the salts takes place more simply by using a strongly basic anion exchanger, for example the hydrogenated form of the product which is commercially available under
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denomination "Dowex -2". '
The antibiotic called "lemacidin" is an amorphous, colorless base which is easily soluble in water and in aqueous media, but is on the other hand insoluble in organic solvents. The aqueous solution of the base exhibits an alkaline reaction. A 1% solution of a preparation obtained using ion exchangers has a pH of 8.6.
With acids, the antibiotic called "lemacidin" forms salts among which, for example, the colorless sulfate and the hydrochloride are very easily soluble in water. The hydrochloride also dissolves in lower aliphatic alcohols, especially in methanol.
Upon very slow evaporation of aqueous or methanol solutions, the hydrochloride of the antibiotic can be obtained in crystalline form.
It has the following elemental composition: C = 37.3%, H = 7.0%, N = 16.8%, 0 = 20.8% (calculated), Cl = 18.1%; [a] 20D = + 24.4 (o = 1.0 in water).
The corresponding values for the antibiotic sulfate are as follows; C = 35.0%, H = 6.9% N = 11.6%, 0 = 38.2% (calculated), S = 8.3%; [a] 27D = + 56 (c = 0.95 in water).
The salt of the base colored with 4'-dimethyl-amino-azobenzene-4-sulfonic acid (helianthate) is hardly soluble both in aqueous media and in alcoholic media. From hot saturated solutions of this kind it separates in the form of irregularly formed yellow-colored flakes which, when seen under a microscope, are arranged in layers, and also in the form of needles, which after recrystallization exhibit a point of decomposition of 202-203 C.
Other salts of the antibiotic called "lemacidin" are derived, for example, from acetic, palmitic, succinic, citric, pantothenic, ascorbic acids, or from amino acids such as leucine or methionine.
The hydrochloride of the antibiotic called "lemacidin" gave a positive ninhydrin reaction, a weak positive reaction to biuret and a weakly positive Elson-Morgan reaction, while the maltol test and the Sakaguohi test were negative. As shown by comparative examination by paper chromatography, it is different from colorless, water-soluble antibiotics, which are active against Gram-positive and Gram-negative bacteria.
The hydrochloride of the antibiotic called "lemacidin" can, by paper chromatography, be split into three components B1, B2 and B3 which are probably very similar. If, for example, a mixture of 3 parts ethanol and one part water containing 2% sodium chloride is used as the solvent system, and the value of Rf ( = RB) of the most rapidly migrating component B3 (reference substance), then for the other two components B1 and B2 RB values of 0.34 and 0.61, respectively, result.
The antibiotic called "lemacidin" possesses strong antibiotic activity against various test organisms. If we use as an in vitro test method dilution series (in power of 10) in glucose broth, incubated at 37 for 24 hours, we have the following concentrations which are still inhibiting:
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The antibiotic called "lemacidin: is also active in vivo. Five subcutaneous injections of 1 mg / kg carried out on mice infected with Micro-coccus pyognes, var. Aureus give 100% survivors.
When 5 mg / kg is administered identically to mice infected with Escherichia coli, a similar effect is observed, as is an effect observed in mice infected with Salmonella typhi murium.
The antibiotic called "lemacidin" actually exhibits some toxicity; however, a subcutaneous administration of 50 mg of antibiotic hydrochloride per kg is relatively well tolerated in mice. Sulfate and pantothenate are somewhat less toxic than hydrochloride and salt of L (+) - ascorbic acid as well as salts of amino acids L (-) - leu- cine and L (-) -methionine are notably less toxic than hydrochloride.
The antibiotic, its components B1, B2 and B3 and their salts can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations. These contain the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or local application. For the formation of this support material, substances which do not react with the new compounds, such as for example gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, are considered. , benzyl alcohols, gums, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterin or other known excipients.
The preparations can be presented, for example, in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form in the form of solutions, suspensions or emulsions. Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They may also contain still other therapeutically valuable substances.
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The invention is described in more detail in the following non-limiting examples, in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
EXAMPLE 1.
Streptomyces A 9692 is cultured by the submerged culture method. A nutrient solution is used that contains, per liter of tap water, the following additional substances:
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<tb> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g
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The nutrient solution is sterilized for 20 to 30 minutes, under a pressure of an effective atmosphere, in the seed flask or in the fermenters. The sterilized nutrient solution has a pH of 7.0 to 7.5.
Seeding takes place with up to 10% of a vegetative, partially sporulent culture of the organism. Incubate at 21-27, shaking well or shaking, the cultures being aerated in the fermenters with about one volume of sterile air per volume of solution per minute: after 30 to 50 hours of incubation, the solution of culture reaches its maximum inhibiting value with respect to test organisms (Bacillus megatherkun, Escherichia coli, Candida vulgaris). The culture is stopped and the mycelium which is only weakly active, as well as other solid components, is separated by filtration or centrifugation of the solution containing the antibiotic, before adding it to the culture solution, if necessary.
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filtration, about 1% of a filter aid, for example Hyflosupercel.
The pH of the cultured filtrate is generally not or only slightly changed compared to the sterilized nutrient solution.
If one uses, instead of the nutrient solution indicated above, a solution containing, per liter of tap water, the mixtures of nutrients indicated under a) to g), then one obtains , after similar cultivation and processing, culture filtrates of such strong antibiotic activity. Instead of obtaining rapid filtration of the culture solution by adding Hyflo Supercel or other filter aid, it can also be achieved by adjusting the culture solution, before filtration, to a pH of 5 to using hydrochloric acid, followed by adjusting it, by adding an aqueous solution of aluminum sulphate, to a concentration of 0.5% of this salt.
Mixtures of nutrients containing the following additional substances per liter of water are also suitable:
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<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
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A filtrate or centrifugeate (obtained as described above) of a culture of Streptomyces A 9692 generally has a pH of 7.0 to 7.5.
If this is not the case, we adjust, for the next enrichment of the new
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antibiotic, the pH to this value using a decanormal solution of sodium hydroxide. The weakly alkaline filtrate is then, for the adsorption of the antibiotic, added 1% of activated carbon (norite) and the mass is stirred mechanically for one hour, all of the active substance from the point of view. antibiotic being adsorbed by charcoal. The latter is separated by filtration, advantageously with the addition of a little of a filter aid, such as for example HyfloSupercel, from the completely insctive solution which is almost as clear as water.
Besides the antibiotic, charcoal still adsorbs large amounts of other antibiotically inactive organic substances, mainly strongly colored degradation products which originate from the nutrient solution, but also inorganic salts. These accompanying substances are, before the elution of the antibiotic, advantageously removed from the carbon. For this purpose, the mass of filtered charcoal, still wet, is introduced into a quintuple amount of 95% ethanol and the suspension is stirred for half an hour. The carbon thus washed beforehand can, by filtration, be easily separated from the washing liquid. The brown colored filtrate does not show antibiotic activity.
The elution of the new antibiotic takes place with an acid-aqueous solution of methanol, preferably with a mixture of equal parts by volume of methanol and normal formic acid, using 2 cm3 of the elution liquid per gram of the agent. adsorption. The suspension is stirred well mechanically for half an hour, then filtered, after which the charcoal residue is again extracted three times in the same way. The eluates, of which only the first is slightly yellowish in color while the others are colorless, exhibit all of the antibiotic activity. They are combined and concentrated in vacuo at a low bath temperature, for example at 40-60, up to one hundredth of the initial volume, so that apart from the methanol and a lot of water, the most of the formic acid.
The pH of the yellowish-colored but fluid concentrate is generally 4.
The concentrate contains, in particular when the culture has been carried out according to the first paragraph or following a) to d), relatively large amounts of calcium. This is removed in the form of the sparingly soluble oxalate by adding to the concentrate, while stirring, a 10% aqueous solution of oxalic acid. The amount of the oxalic acid solution which is necessary for complete precipitation is exactly determined in an aliquot.
For culture concentrates with calcium carbonate, we generally need 300 to 500 em3 of oxalic acid solution per liter of concentrate, which corresponds to 3-5 cm3 per liter of the initial culture filtrate, while the concentrates obtained from culture solutions, without the addition of calcium carbonate, require smaller amounts.
From the concentrate free of calcium, the antibiotic is obtained in the form of a white powder, highly enriched, by diluting the aqueous concentrate first with 4 to 5 volumes of methanol, then by precipitating the mixture. active ingredient with 20 volumes of acetone. The precipitate is filtered off, washed twice with acetone and finally freed from solvent residues in vacuo. A pure white powder is obtained which exhibits almost all of the antibiotic activity of the culture filtrate. The yield is about 300 mg per liter of culture filtrate.
EXAMPLE 2.
Significantly stronger enrichment of the antibiotic called "lemacidine" than following the acetone precipitation which is described in Example 1 can be obtained by preparing its crystallized helianthine salt. For this purpose, the calcium-free concentrate is diluted with 2 volumes of water and
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obtained according to Example 1, adjust the pH of the solution to a value of 6.7 to 7.0 using a decanormal solution of sodium hydroxide, then, while stirring vigorously, one adds in a fine jet the volume, necessary for complete precipitation, of an almost saturated aqueous solution of helianthine, containing per liter 3.5 g of helianthine (orange III, sodium salt of 4'-dimethylacid. mino-azobenzene-4-sulfonic acid),
the precipitating solution being advantageously introduced directly into the antibiotic solution. The volume of the helianthine solution which is necessary for complete precipitation is determined in a preliminary test with an aliquot. This volume varies, depending on the antibiotic content, generally between twentyfold to hundredfold of the undiluted concentrate which is used. The helianthate that forms (helianthine salt of the antibiotic) precipitates mostly in the crystallized state, in the form of thin flakes and also of needles. The precipitation solution is allowed to stand for a few hours at low temperature, at 0, which causes the precipitate to settle completely.
The majority of the clear solution which floats on the surface is then separated from the precipitate by decantation and the remainder by centrifugation. For washing, the precipitate is stirred once with approximately the same amount of ice-water, and is then isolated using a funnel-separator. The washing is repeated twice in the same way, but with 1 acetone. The helianthate thus washed from the new antibiotic is dried under vacuum. The yield is between 100 and 180 mg of helianthate per cm3 of concentrate. The dry product is a reddish brown powder; this powder is quite difficult to soluble in water and in methanol, more easily soluble, on the other hand, in formamide, but insoluble or very slightly soluble in lipoid solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform and others.
It can be recrystallized both in water and in methanol, but also in mixtures of these solvents, so that it appears under the microscope in yellow flakes, irregularly formed, which are arranged in layers and melt at 202 -203 by decomposing.
To prepare the sulfate of the new antibiotic from the helitatte, for example 30 g of the dry powder of helianthate are suspended in 150 cm3 of water, added to the suspension 33 cm3 of an aqueous solution to 80% triethylamine sulfate, then the mass is stirred for one hour, which gradually takes on a red-brown tint as a result of the formation of the triethylamine salt of helianthine which is hardly soluble. The reaction can be significantly accelerated by heating. For this purpose, 20 volumes of methanol are added to the reaction mixture, whereby the sulfate of the antibiotic forms as a white precipitate, while the triethylamine helianthate goes into solution.
The dye adhering to the antibiotic sulfate obtained is freed by centrifugation or filtration, by precipitating it twice in water with methanol, finally washed again with pure methanol and then dried. It is an amorphous powder, pure white, which is insoluble in organic solvents, but is on the other hand easily soluble in water. The yield is 5.6 g.
EXAMPLE 3.
In order to convert the sulfate, of the new antibiotic, into a hydrochloride which is easily soluble both in water and in methanol, said sulfate is dissolved in a tenfold quantity of water and then the aqueous solution is treated until complete precipitation with a 20% solution of barium chloride, approximately 4 cm3 being required per gram of sulfate. The barium sulfate precipitate is removed by centrifugation and from the colorless solution which supersedes the hydrochloride is isolated by means of refrigeration drying. A little more than one gram of hydrochloride is thus obtained per gram of sulfate.
To obtain a further purification of the hydrochloride, it is dissolved in a little methanol, the concentrated solution is poured onto a chromatography column filled with gas soot and washed with methanol, then eluted with the
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same solvent. The evaporation residue of the eluate constitutes a pure white powder easily soluble in methanol and in water which, from these solvents and on very slow evaporation, partly separates under crystalline form.
Instead of preparing the hydrochloride by passing through the sulfate, it can also be obtained directly from the helianthate. For this purpose, the latter, in the dry and finely divided state, is suspended in an approximately tenfold quantity of absolute methanol, further added to the suspension 2 volumes of a deoanormal methanolic solution of hydrochloric acid, then then boil briefly. After having decolorized with a little norite, it is filtered, then the water-clear filtrate is concentrated under vacuum to about a quarter of its initial volume, then from the concentrate the hydrochloride is precipitated with 10 to 20 volumes of ether or acetone.
EXAMPLE 4.
The antibiotic obtained according to Example 2 in the form of crude sulfate is, passing through the picrate, further purified as follows: To a well-stirred solution of one gram of sulfate in 20 cm3 of water is slowly added 130 cm 3 of a saturated aqueous solution of picric acid, an amount which is just sufficient for complete precipitation. An oily precipitate forms which is separated by centrifugation, which is washed once with a little saturated solution of picric acid and with water, then dried under vacuum in an exsiccator, so that the picrate turns into a solid mass which is not crystallized, however. The yield is 1.2 g.
To convert the picrate of the antibiotic to its hydrochloride, the first is dissolved in hot methanol acidified with concentrated hydrochloric acid and the solution is poured into 10 volumes of ether, whereby the insoluble hydrochloride precipitates under the form of a white mass. The latter is freed from the remains of picric acid which still adheres by dissolving it in an amount of boiling methanol which is necessary for the dissolution and by repeating the precipitation with ether. In this way approximately 0.6 g of pure white pulverulent hydrochloride is obtained.
EXAMPLE 5.
Instead of obtaining the antibiotic in the pure state, for example in the form of its hydrochloride, by passing through the picrate which has not been able to crystallize so far, it can be obtained by passing through the crystallized picrolonate, in which case the procedure is as follows:
To a solution in 100 cm3 of water of 1.0 g of the sulfate obtained according to Example 2 is added dropwise over the course of one hour, with stirring, 700 cm3 of a solution. concentrated aqueous of picrolonic acid, containing 2.4 g per liter. The amorphous precipitate of picrolonate which has formed is filtered off with suction and, with a view to crystallizing it, dissolved in 150 cm 3 of boiling water and the solution filtered while hot. On slow cooling to room temperature, the picrolonate separates from the filtrate in a partially crystallized form.
The precipitate is collected on the filter funnel, washed with little ice-cold water and, with a view to recrystallizing it, dissolved in 100 cm3 of boiling water. From the hot-filtered solution, the picrolonate then precipitates completely in the form of fine yellow sticks arranged in druses which, after having been washed with a little ice-water and dried so-qs vacuum over pentoxide of phosphorus, show, after oozing, a net decomposition point at 202. The yield of twice recrystallized picrolonate is 0.64 g.
From the picrolonate obtained above, pure hydrochloride is obtained when, while stirring vigorously, 0.6 g of picrolonate in 10 cm3 of ice-cold methanol is added in portions to a finely divided suspension.
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0.6 cm3 of a decanormal solution of hydrochloric gas in absolute methanol and, after complete reaction, completely precipitates the partially separated hydrochloride which has formed, adding to the reaction mixture 20 volumes of absolute ether. The hydrochloride is filtered off, washed once with a little ether on the filter funnel and then, in order to remove the residues of picrolonic acid which still adhere, dissolved in 2 cm3 of methanol, then separated with again with ether and washing.
The now pure hydrochloride of the antibiotic constitutes, after vacuum drying, a pure white amorphous powder. The yield is 0.25 g.
According to examinations carried out by chromatography on paper, the hydrochloride thus obtained of the antibiotic called “lemacidin” is formed by a mixture of three compounds which are probably very close (B1, B2 and B3). If one uses, for example, as solvent system a mixture of 3 parts of ethanol and of one part of water containing 2% of sodium chloride, and make equal to 1 unit the value of Rf (= RB ) of the component B3 (reference substance) migrating the most rapidly, we then have for the other two components B1 and B2 values of RB which are respectively 0.34 and 0.61.
EXAMPLE 6.
The preparation of the free base of the new antibiotic can take place both from its sulfate with barium hydroxide, and also using a weakly basic ion exchanger. In the first case, for example, a slight excess of a hot saturated solution of sodium hydroxide is added to a solution in 5 cm3 of water of one gram of the antibiotic sulphate obtained according to Example 2. barium, that is, until the reaction mixture has a pH of about 9. The excess barium hydroxide is then immediately neutralized by passing carbon dioxide into the solution.
Then, in order to convert the barium bicarbonate formed, the reaction mixture is kept for a few minutes in a water bath at 60, after which the precipitated barium carbonate is separated by centrifugation together with the barium sulfate. . From the water-clear alkaline centrifuge solution which floats on the surface, the free base of the new antibiotic is isolated by refrigeration drying. It constitutes a white powder which is soluble in water giving a strongly alkaline reaction and which is insoluble in organic solvents. The yield is 0.5 g.
To obtain the free base using a weakly basic ion exchanger, we proceed as follows:
Through a column filled with the weakly basic ion exchanger "Dowex-2", an aqueous solution, at about 20%, of 0.2 g of the crude sulfate of the new antibiotic obtained below is percolated. Example 2, using about a threefold amount of the ion exchange resin, washed several times in sequence first with dilute hydrochloric acid, with water, with a dilute sodium hydroxide solution and again with water.
The column loaded with the sulfate solution is then washed with water, whereby the base is easily eluted. In order to obtain the base, the eluate is, as above, advantageously lyophilized. The yield is 0.65 g. The base is an amorphous white powder.
EXAMPLE 7.
Through a column of a weakly acidic ion exchange resin containing carboxylic groups, such as, for example, Amberlite IRC-50, a culture solution of the antibiotic called "lemacidin" is filtered, which solution is obtained according to Example 1 and is freed of mycelium, using per liter of the antibiotic solution 100 g of the hydrogenated form of the exchanger and adjusting the flow rate to about 5 liters per hour.
The antibiotic termed "lemacidin" is adsorbed together with inactive accompanying substances which are partly strongly stained brown;
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the solution which flows and which has a pH of 3 to 3.5 has only a very low antibiotic activity. The Amberlite column is then washed with a volume of distilled water corresponding to one-fifth of the volume of the filtered culture solution, thereby removing some of the inactive colored accompanying substances, but leaving does not, however, elect the antibiotic itself.
To obtain the latter from the adsorbate, an aqueous solution of 0.2-normal hydrochloric acid is passed through the previously washed column, namely in total a quarter of the volume of the culture solution. used.
The strongly acidic eluate is neutralized either with a concentrated solution of sodium hydroxide or with the aid of a basic ion exchanger. The solution thus obtained can, as such or after concentration under vacuum at low temperature, be used as a starting solution for obtaining other preparations enriched with the antibiotic called “lemacidin”, for example according to the processes described in examples 2 - 3 or 4.
EXAMPLE 8.
The pantothenate of the antibiotic called "lemacidin" can be obtained, for example, from the sulfate prepared according to Example 2. For this purpose, a solution of 1.0 g of the sulfate in 10 cm3 of sodium is added to this end. water, 8.0 cm3 of a 10% aqueous solution of calcium pantothenate, frees the precipitate formed from calcium sulphate by filtration or centrifugation, then lyophilizes the filtrate or centrifugeate, or evaporates to dryness under empty. The dry residue of the antibiotic pantothenate called "lemacidin" constitutes an amorphous white powder which is very easily soluble in water.
In an analogous manner, other salts of the antibiotic called "lemacidin" can be prepared with organic acids, such as for example L (+) - ascorbic acid, or with amino acids, such as L. (-) - leucine or L (-) - methionine. In this case, one starts advantageously with the base of the antibiotic obtained in the free state according to Example 6, by adding to its concentrated aqueous solution a hot saturated solution of the organic acid, in which case one uses For example, for one gram of the base, 1.2 g of ascorbic acid or 0.9 g of leucine or 1.05 g of methionine.
CLAIMS.
I. A process for the preparation of a novel antibiotic, characterized in that Streptomyces venezuelae A 9692, or a variety of this strain, is grown under aerobic conditions in an aqueous nutrient solution containing a carbon source. and nitrogen as well as inorganic substances, until the said solution exhibits a strong antibiotic activity, the antibiotic called "lemacidin" is then isolated from the nutrient solution and its salts are optionally prepared.
The present process can be further characterized by the following points
1) Growth takes place in submerged culture.
2) Cultivation takes place for 36 to 120 hours, at a temperature between 18 and 40, preferably at 21-27
3) The antibiotic is isolated from the culture filtrate by adsorption at a weakly alkaline pH, preferably at a pH of 7.5 to 8, preferably using activated carbon.
4) The antibiotic is extracted from the adsorbate using an acid eluting agent, preferably using an eluting agent containing formic acid.
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