Procédé de traitement de mélanges réactionnels bruts contenant des ptéridines. La présente invention se rapporte à un procédé de traitement de mélanges réaction nels bruts contenant des ptéridines, en vue d'en séparer les ptéridines voulues.
La ptéridine appelée acide folique est. un facteur promoteur de croissance dont. les pro priétés sont analogues à. celles des vitamines. On sait qu'elle exerce une action stimulante sur la croissance du poulet, du rat et autres animaux, et. sur les bactéries telles que Strep- tococeus laetis, Lactobaeillus casei et autres. lie produit isolé des sources naturelles a reçu des noms divers tels que acide folique, vita mine B, facteur L, facteur Lactobacillus casei, facteur de croissance du poulet et ana logues.
On a dernièrement fait la synthèse d'une substance possédant une activité biolo gique identique et. on a montré qu'elle stimu lait efficacement la formation de l'hémoglo bine et était active dans le traitement de l'agranulocytose et autres maladies ana logues.
La production synthétique de substances possédant une activité biologique identique ou analogue à celle de l'acide folique provenant des sources naturelles a été effectuée par réac tion de la 2.4.5-triamino-6-hydroxypyrimicline, d'un aminoacide dérivé de l'acide para aminobenzoïque, tel que L'acide para-amino- benzoy1glutamique, et. d'un composé à trois atomes de carbone approprié possédant. une fonction aldéhyde et (ou) halogène, particu lièrement l'a, f3-dibromopropionaldéhyde. Le produit de la réaction biologiquement actif le plus important. porte le nom chi mique de:
acide N-[4- 1 [ (2-amino-4-hy droxy- 6-ptéridyl)-méthy,1]-amino 1-benzoyl]i-gluta- mique. D'autres produits étroitement appa rentés possédant une activité à divers degrés peuvent se préparer au moyen de ce procédé en utilisant des matières premières appro priées, notamment un aminoacide dérivé de l'acide para:
aminobenzoïque comportant, au lieu du reste acide glutamique, le reste d'un dérivé polypeptidique de celui-ci, par exem ple l'acide para-aminobenzoylglutamylglut- amy lglutamique. Ces ptéridines, y compris l'acide folique et les produits apparentés, peuvent être représentés par la formule:
EMI0001.0035
dans laquelle R désigne le reste d'acide glutamique ou plusieurs restes d'acide gluta mique rattachés les uns aux autres par des chaînes peptidiques.
La chimie du processus de préparation des ptéridines de la formule représentée ci-dessus, comme par exemple l'acide folique synthé tique, est très complexe, particulièrement en raison de ce que les différents intermédiaires cirdessus mentionnés peuvent réagir de diffé- rentes manières. Les chimistes familiarisés avec la chimie des composés organiques hété- rocycliques de ce type s'attendront - et ceci a été vérifié par l'expérience - à ce qu'il se produise de nombreuses réactions secondaires en même temps que ou après la réaction prin cipale.
Le produit de la réaction contient donc une proportion relativement importante de substances indésirables comprenant des intermédiaires inaltérés, -des produits de con densation -et (ou) de polymérisation de deux ou plus des intermédiaires, -des isomères de position, des produits d'oxydation, divers produits hypothétiques de dégradation, des produits d'hydrolyse et analogues.
Nombre de ces produits non identifiés contiennent un noyau pyrimido-pyrazine et peuvent être dé signés par le terme générique de ptéridines. Certains de ces sous-produits de la réaction peuvent être nuisibles et le produit devant être utilisé -comme agent thérapeutique, il est évident que les ptéridines indésirables doivent être séparées des ptéridines biologiquement actives désirées, par exemple de l'acide fo lique.
Bien que l'acide folique ait été isolé à partir de sources naturelles, avec des diffi cultés considérables, les procédés utilisables dans ce but ne conviennent pas à la sépara tion de l'acide folique synthétique, par exem ple, des diverses impuretés qui lui sont asso ciées, en raison des réactions secondaires que l'on vient de mentionner.
Malheureusement, nombre de ptéridines associées à l'acide fo lique synthétique dans le produit réactionnel brut possèdent certaines propriétés chimiques et physiques identiques à celles du produit bio- logiquement actif désiré et on a trouvé qu'il était extrêmement difficile de séparer ces impuretés sans provoquer une perte inquié tante de matière active.
La présente invention a pour but de surmonter, dans une certaine me sure au moins, cette difficulté et permet d'ob tenir des ptéridines synthétiques de la for mule représentée ci-dessus, par exemple de l'acide folique, à un :degré de pureté tel qu'elles puissent être utilisées pour les besoins médicaux.
La présente invention est fondée sur la dé couverte que les sels des métaux alcalino-ter reux .des ptéridines indésirables sont peu solubles dans l'eau, moins que les sels des pté- ridines voulues, comme par exemple les fo- lates alcalino-terreux, cette différence étant encore accentuée en solution hydroalcoolique.
Conformément à l'invention, le procédé de traitement d'im mélange de réaction brut con tenant une ptéridine de formule:
EMI0002.0034
dans laquelle R représente le reste d'acide glutamique ou plusieurs restes d'acide gluta mique rattachés entre eux par des liaisons peptidiques et, comme impuretés indésirables, des ptéridines de formule autre, en vue de séparer la ptéridine de la formule représentée ci-dessus ,d'avec le mélange réactionnel, est ca ractérisé en ce qu'on ajoute,
au mélange un composé de métal alcalino-terreux soluble dans l'eau pour transformer les ptéridines pré sentes dans le mélange en sels d'un métal alcalino-terreux et qu'on élimine la matière insoluble de la solution contenant le sel de métal alcalino-terreux de la ptéridine de la formule représentée ci-dessus et régénère cette ptérIdine.
Avantageusement, on opère en solution aqueuse contenant'au plus 25 % en poids envi ron d'im alcool miscible à l'eau, afin de dimi nuer la solubilité des sels alcalino-terreux des ptéridines indésirables.
Pour mettre en aeuvre le procédé de la présente invention, notamment dans son appli cation à la purification de l'acide folique, on préfère préparer une solution du produit réac tionnel brut à un pA supérieur à 8 en em ployant un alcali pour solubiliser l'acide fo lique et autres ptéridines contenues dans le mélange réactionnel.
La solution est alors traitée au moyen d'im composé alcalino-ter reux soluble dans l'eau, de manière à former les sels alcalino-terreux de l'acide folique et des ptéridines qui lui sont associées. Nombre de ces ptéridines indésirables précipitent à l'état. de sel alcalino-terreux et peuvent être éliminées par filtration.
La solubilité de ces sels alcalino-terreux peut encore être abaissée par addition d'al cools miscibles à l'eau, tels que les alcools mé thylique, éthylique, isopropylique, etc., à la solution, avant ou après précipitation desdits sels.
La quantité d'alcool doit. être. soigneuse ment réglée, étant donné qu'une quantité supérieure à 25 % en poids d'alcool diminue également la solubilité des folates alcalino- terreux à un degré tel qu'ils précipitent. et sont perdus en même temps que les autres ptéridines insolubles.
On préfère habituellement ajouter à la solution de folate alcalino-terreux une quan tité d'alcool suffisante pour donner une solu tion d'une concentration allant de 10 à 20 0/0 environ en poids d'alcool. Quand on isole des dérivés biologiquement actifs de l'acide fo lique possédant plus d'un reste d'acide glu tamique dans la. molécule comme l'acide N-[4-{ [ (2-amino-4-hydroxy -6t-j;
ptéridyl)-mé- thyl] -amino } -benzoy l ] -glutamy lglutamy lgluta- mique, on doit employer moins d'alcool, en rai son de ce que les sels alcalino-terreux de ces polypeptides sont. plus insolubles et qu'un excès d'alcool tend à diminuer par trop leur solubilité. Par conséquent, ,dans ces cas, on emploie dans la solution de 5 à 10 1110 d'alcool pour diminuer la solubilité des ptéridines inactives y associées.
La précipitation sélective des ptéridines indésirables sous forme de sels alcalino-ter reux rend donc possible l'élimination de la plupart des impuretés moyennant une perte négligeable en produit. actif. On peut alors procéder à une nouvelle purification par traitement au moyen de charbon actif ou par extraction des sels libres d'acides foliques de manière à éliminer les ptéridines an moyen d'autres solvants organiques. -Mais le charbon actif absorbant l'acide folique presque autant que les ptéridines qui le contaminent, cette technique n'est pas souhaitable, sauf éven tuellement comme opération finale.
On pré- fère par conséquent effectuer la nouvelle purification au moyen de solvants organiques.
La majeure partie des ptéridines conta- minantes ayant été éliminées par précipita tion à l'état de sels alcalino-terreux, la solu tion contenant le folate du métal alcalino-ter reux est traitée par un acide qui pré cipite le métal alcalino-terreux sous forme d'un sel insoluble. La solution résul tante peut être purifiée davantage au moyen d'extraction par le butanol. On a découvert que les ptéridines contaminantes qu'on cherche à éliminer sont plus solubles dans le butanol que ne l'est l'acide folique par exemple.
La solution aqueuse d'acide folique est épuisée au moyen de butanol à un pg com pris entre 6 et 7,5, de manière à éliminer les ptéridines restantes de l'acide folique par tiellement purifié. Plusieurs extractions peu vent être nécessaires pour réduire la quantité de substances contaminantes au niveau désiré. On peut alors traiter la solution aqueuse d'acide folique au moyen de charbon actif. pour éliminer les ptéridines restantes.
L'acide folique peut être alors récupéré de la solu tion par précipitation à<B>pH',</B> de manière à ob tenir un produit d'une pureté suffisante pour les emplois en médecine. <I>Exemple:</I> On dissout 500 mg de produit réactionnel brut contenant 109,8 mg d'acide folique, le reste étant constitué par des ptéridines inac tives et autres produits de la réaction, dans 300 cms de solution de soude caustique 0,2 N. On ajoute alors du chlorure de baryum solide jusqu'à une concentration de 0,2 N.
On en lève par filtration le précipité insoluble qui se forme et on ajoute au filtrat de l'alcool éthy- lique jusqu'à une concentration de 20 % en poids. Le précipité est alors enlevé par filtra tion et rejeté.
Le filtrat provenant. de l'opération ci- dessus est traité au moyen d'une quantité d'acide sulfurique suffisante pour précipiter le baryum présent. à l'état de sulfate de ba ryum, en ajoutant de temps en temps, si né cessaire, un excès de soude caustique pour maintenir le pH de la solution au-dessus de 8. Le filtrat est alors étendu à 1200 cm' et ajusté à un pg de 7 environ, le plus favorable pour la précipitation des ptéridines indésirables.
A cette dilution la solution présente une concen tration @de 50 gammas d'acide folique par cm & . La précipitation des ptéridines inso lubles à neutralité se fait ,de préférence dans une solution ne contenant pas plus de 200 gammas environ par cm3 en raison de ce que le précipité tend à entraîner avec lui une forte quantité d'acide folique quand il est présent à forte concentration.
A ce stade du processus le filtrat contient 61,8 mg d'acide folique et 31,05 mg seulement des ptéridines indésirables. Il est donc évi dent que celà représente une purification con sidérable du produit brut.
Des ptéridines peuvent encore être éli minées du filtrat ci-dessus par traitement au moyen de 200 mg de charbon activé. Mais le charbon activé absorbe à peu près une égale quantité d'acide folique et il est préférable Be ne pas procéder à cette absorption ou de la réserver pour la purification finale.
La méthode préférée consiste à épuiser la solution aqueuse à pH 7 au moyen de 10 vo lumes de butanol. Cette extraction est renou velée à trois reprises et on enlève ainsi à peu près 90 % des ptéridines restantes. On ajoute alors une petite quantité de charbon activé, environ 1 g par fraction de 80 mg des ptéri- dines indésirables, à la solution aqueuse et on filtre la solution.
Un traitement ultérieur ali moyen de charbon actif pourra éliminer tout pigment résiduel présent moyennant une perte légère d'acide folique.
La solution aqueuse est alors concentrée sous vide jusqu'à -une concentration en acide folique de 200 à 400 gammas par cm. S'il se forme de l'insoluble à ce stade, on le dissout en tiédissant la solution, puis on ajuste celle-ci < < un pH de 3 environ. Cette concentration en ions hydrogène correspond à une solubilité minimum d'acide folique dans l'eau, lequel précipite facilement de la solution. On peut, si on<B>le</B> désire, le faire recristalliser dans l'eau. Le produit ainsi obtenu a une pureté atteignant 94%.
On peut réaliser quelque économie de buta- nol en effectuant l'extraction à température élevée.
Process for the treatment of crude reaction mixtures containing pteridines. The present invention relates to a process for treating crude reaction mixtures containing pteridines, with a view to separating the desired pteridines therefrom.
The pteridine called folic acid is. a growth promoting factor including. the properties are analogous to. those of vitamins. It is known that it exerts a stimulating action on the growth of chickens, rats and other animals, and. on bacteria such as Streptoceus laetis, Lactobaeillus casei and others. This product isolated from natural sources has received various names such as folic acid, vitamin B, factor L, factor Lactobacillus casei, chicken growth factor and the like.
We recently synthesized a substance with identical biological activity and. it has been shown to effectively stimulate the formation of hemoglobin and to be active in the treatment of agranulocytosis and other similar diseases.
Synthetic production of substances with the same or analogous biological activity as folic acid from natural sources has been effected by the reaction of 2.4.5-triamino-6-hydroxypyrimicline, an amino acid derived from the acid para-aminobenzoic acid, such as para-amino-benzoylglutamic acid, and. a suitable three-carbon compound having. an aldehyde and (or) halogen function, particularly α, f3-dibromopropionaldehyde. The most important biologically active reaction product. bears the chemical name of:
N- [4- 1 [(2-Amino-4-hy droxy-6-pteridyl) -methyl, 1] -amino 1-benzoyl] i-glutamic acid. Other closely related products with varying degrees of activity can be prepared by this process using suitable raw materials, including an amino acid derived from para acid:
aminobenzoic acid comprising, instead of the residue glutamic acid, the residue of a polypeptide derivative thereof, for example para-aminobenzoylglutamylglutamylglutamic acid. These pteridines, including folic acid and related products, can be represented by the formula:
EMI0001.0035
in which R denotes the residue of glutamic acid or several residues of glutamic acid attached to each other by peptide chains.
The chemistry of the process for the preparation of pteridines of the formula shown above, such as for example synthetic folic acid, is very complex, particularly because the various intermediates mentioned above can react in different ways. Chemists familiar with the chemistry of heterocyclic organic compounds of this type will expect - and this has been verified by experience - that many side reactions will occur simultaneously with or after the main reaction. .
The reaction product therefore contains a relatively large proportion of undesirable substances comprising unaltered intermediates, -condensation products -and (or) polymerization of two or more intermediates, -position isomers, oxidation products , various hypothetical degradation products, hydrolysis products and the like.
Many of these unidentified products contain a pyrimido-pyrazine nucleus and may be referred to by the generic term pteridines. Some of these reaction by-products may be harmful and the product to be used as a therapeutic agent, it is obvious that the unwanted pteridines must be separated from the desired biologically active pteridines, for example folic acid.
Although folic acid has been isolated from natural sources with considerable difficulty, the methods which can be used for this purpose are not suitable for the separation of synthetic folic acid, for example, from the various impurities which it contains. are associated, because of the side reactions just mentioned.
Unfortunately, many of the pteridines associated with synthetic fo lic acid in the crude reaction product possess certain chemical and physical properties identical to those of the desired biologically active product and it has been found to be extremely difficult to separate these impurities without causing a worried loss of active ingredient.
The object of the present invention is to overcome, to some extent at least, this difficulty and make it possible to obtain synthetic pteridines of the formula shown above, for example folic acid, to a degree of purity as they can be used for medical purposes.
The present invention is based on the discovery that the alkaline earth metal salts of the undesirable pteridines are poorly soluble in water, less than the salts of the desired petidines, such as, for example, the alkaline earth forms. , this difference being further accentuated in hydroalcoholic solution.
In accordance with the invention, the process for treating a crude reaction mixture containing a pteridine of formula:
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in which R represents the residue of glutamic acid or several residues of glutamic acid linked together by peptide bonds and, as unwanted impurities, pteridines of the formula other, with a view to separating the pteridine of the formula represented above , with the reaction mixture, is ca ractérisé in that one adds,
mixing a water-soluble alkaline earth metal compound to convert the pteridines in the mixture into salts of an alkaline earth metal and removing the insoluble material from the solution containing the alkaline metal salt earthiness of the pteridine of the formula shown above and regenerates this pterIdine.
Advantageously, the operation is carried out in an aqueous solution containing at most 25% by weight approximately of im alcohol miscible with water, in order to reduce the solubility of the alkaline earth salts of the undesirable pteridines.
In order to carry out the process of the present invention, in particular in its application to the purification of folic acid, it is preferable to prepare a solution of the crude reaction product at a pA greater than 8 by employing an alkali to dissolve it. fo lic acid and other pteridines contained in the reaction mixture.
The solution is then treated with an alkaline earth compound soluble in water, so as to form the alkaline earth salts of folic acid and of the pteridines associated with it. Many of these unwanted pteridines precipitate in the state. of alkaline earth salt and can be removed by filtration.
The solubility of these alkaline earth salts can be further lowered by adding alcohols miscible with water, such as methyl, ethyl, isopropyl alcohols, etc., to the solution, before or after precipitation of said salts.
The amount of alcohol must. be. Carefully controlled, since an amount greater than 25% by weight of alcohol also decreases the solubility of the alkaline earth folates to such an extent that they precipitate. and are lost along with the other insoluble pteridins.
It is usually preferred to add to the alkaline earth folate solution a sufficient amount of alcohol to give a solution of a concentration of from about 10 to 20% by weight of alcohol. When isolating biologically active derivatives of fo lic acid having more than one residue of glutamic acid in the. a molecule such as N- [4- {[(2-amino-4-hydroxy -6t-j;
pteridyl) -methyl] -amino} -benzoy 1] -glutamy lglutamy lglutamic less alcohol must be used, because the alkaline earth salts of these polypeptides are. more insoluble and an excess of alcohol tends to reduce their solubility too much. Therefore, in these cases, 5 to 10 1110 alcohol is employed in the solution to decrease the solubility of the inactive pteridines associated therewith.
The selective precipitation of the undesirable pteridines in the form of alkaline earth salts therefore makes it possible to eliminate most of the impurities with negligible loss of product. active. A further purification can then be carried out by treatment with activated carbon or by extraction of the free salts of folic acids so as to remove the pteridines by means of other organic solvents. -But the activated carbon absorbs folic acid almost as much as the pteridines which contaminate it, this technique is not desirable, except possibly as a final operation.
It is therefore preferred to carry out the further purification using organic solvents.
Most of the contaminating pteridines having been removed by precipitation as alkaline earth salts, the solution containing the folate of the alkaline earth metal is treated with an acid which precipitates the alkaline earth metal under form of an insoluble salt. The resulting solution can be further purified by means of butanol extraction. It has been discovered that the contaminating pteridines which one seeks to eliminate are more soluble in butanol than is folic acid, for example.
The aqueous solution of folic acid is exhausted by means of butanol at a pg comprised between 6 and 7.5, so as to remove the remaining pteridines from the folic acid by tially purified. Several extractions may be necessary to reduce the amount of contaminants to the desired level. The aqueous folic acid solution can then be treated with activated charcoal. to remove the remaining pteridins.
The folic acid can then be recovered from the solution by precipitation at <B> pH ', </B> so as to obtain a product of sufficient purity for use in medicine. <I> Example: </I> 500 mg of crude reaction product containing 109.8 mg of folic acid, the remainder being constituted by inactive pteridines and other products of the reaction, are dissolved in 300 cms of sodium hydroxide solution caustic 0.2N. Solid barium chloride is then added to a concentration of 0.2N.
The insoluble precipitate which forms is filtered off and ethyl alcohol is added to the filtrate to a concentration of 20% by weight. The precipitate is then removed by filtration and discarded.
The filtrate from. of the above operation is treated with a sufficient quantity of sulfuric acid to precipitate the barium present. in the form of ba ryum sulphate, adding from time to time, if necessary, an excess of caustic soda to maintain the pH of the solution above 8. The filtrate is then extended to 1200 cm 3 and adjusted at about 7 pg, most favorable for the precipitation of unwanted pteridines.
At this dilution the solution exhibits a concentration of 50 gammas of folic acid per cm 3. The precipitation of the insoluble pteridines to neutrality is carried out, preferably in a solution containing not more than approximately 200 gammas per cm3 because of what the precipitate tends to carry with it a large quantity of folic acid when it is present at high concentration.
At this stage of the process the filtrate contains 61.8 mg of folic acid and only 31.05 mg of unwanted pteridines. It is therefore evident that this represents a considerable purification of the crude product.
Pteridines can be further removed from the above filtrate by treatment with 200 mg of activated charcoal. But the activated charcoal absorbs roughly an equal amount of folic acid, and it is best not to take this absorption or to reserve it for final purification.
The preferred method is to deplete the aqueous solution at pH 7 with 10 volumes of butanol. This extraction is repeated three times and approximately 90% of the remaining pteridines are thus removed. A small amount of activated charcoal, about 1 g per 80 mg portion of the unwanted pteridins, is then added to the aqueous solution and the solution filtered.
Subsequent treatment with activated carbon may remove any residual pigment present with slight loss of folic acid.
The aqueous solution is then concentrated in vacuo to a folic acid concentration of 200 to 400 gammas per cm. If insoluble matter forms at this stage, it is dissolved by warming the solution, then the solution is adjusted to <<pH of about 3. This concentration of hydrogen ions corresponds to a minimum solubility of folic acid in water, which easily precipitates from solution. It can be recrystallized in water if it is <B> </B> desired. The product thus obtained has a purity of up to 94%.
Some saving of butanol can be achieved by carrying out the extraction at elevated temperature.