BRPI0411059B1

BRPI0411059B1 - dispositivo de imunodiagnóstico para determinar a presença de um analito de interesse em uma amostra líquida, e, método de detecção de um anticorpo de interesse em uma amostra líquida

Info

Publication number: BRPI0411059B1
Application number: BRPI0411059A
Authority: BR
Inventors: David Charlton
Original assignee: Advantage Diagnostics Corp
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2016-08-23
Also published as: DE602004030693D1; WO2005003732A2; ATE492814T1; AT9863U1; AU2010201632A1; CZ16422U1; CN1902489A; WO2005003732A3; JP4851321B2; EP1658483A4; BRPI0411059A; UA19871U; EP1658483B1; CN1902489B; US20040248322A1; JP2007524813A; US7393697B2; DK200500290U4; PT2005003732W; HK1084183A1

Abstract

"tiras de teste diagnóstico para detecção de um analito de interesse em uma amostra líquida, para detecção de anticorpo de anti-hiv em uma amostra, e de teste de gravidez de imuno-diagnóstico, e, método de detecção de um anticorpo de interesse em uma amostra líquida". dispositivos de diagnóstico e métodos são providos. os dispositivos de diagnóstico compreendem, preferencialmente, uma tira de teste com uma área de teste 140. a amostra a ser analisada contata a área de teste, a qual compreende um parceiro de ligação específico para o analito de interesse. o analito, se presente na amostra, liga-se com parceiro de ligação imobilizado na área de teste e é, subseqüentemente, contactado com um conjugado. o conjugado liga especificamente o analito e provê uma indicação visual da presença do analito. os dispositivos podem ser usados para o diagnóstico de doenças ou disfunções particulares em um paciente, tal como hiv ou hepatite. eles também podem ser usados para determinar se uma pessoa está grávida.

Description

‘DISPOSITIVO DE IMUNODIAGNÓST1CO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM ANALITO DE INTERESSE EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA, E, MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM ANTICORPO DE INTERESSE EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA” Fundamentos da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um teste visual rápido de fluxo lateral para a detecção de analitos em uma amostra. Técnica Relacionada Dispositivos de teste de fluxo lateral são conhecidos na técnica e podem ser usados em diagnósticos clínicos para determinar a presença de uni analito de interesse em uma amostra, tal como um fluido corporal. Entretanto, esses dispositivos têm exigido, tipicamente, um volume de amostra relativamente grande e grandes quantidades de conjugado. Eles também têm um longo tempo de espera antes que os resultados do teste possam ser lidos.

Sumário da Invenção Em um aspecto, uma tira de teste de ímuno-diagnóstieo é provida para a detecção de um analito de interesse em uma amostra. Em alguns modos de realização, o analito é um anticorpo, tal como um anticorpo de vírus da imunodeficiência anti-humana (HIV) ou um anticorpo de vírus da anti-hepatite C (HVC). Em outros modos de realização o analito é um antígeno, tal como a gonadotropina coriônica humana (hCG). A tira de teste diagnóstico compreende, preferencialmente, uma área de fonte de conjugado que compreende um conjugado configurado para ligar o analito de interesse, uma área de aplicação de amostra localizada a jusante da área de fonte do conjugado e configurada para receber a mencionada amostra líquida e uma área de teste. A área de teste esta localizada a jusante da área de fonte de conjugado e compreende um agente de ligação imobilizado que é capaz de ligação específica para o analito de interesse. Por exemplo, se o analito de interesse é um anticorpo, a área de teste positivo compreende, preferencialmente, antígeno imobilizado. Se o analito de interesse é um antígeno, a área de teste positivo compreende, preferencialmente, anticorpo imobilizado. O conjugado compreende um primeiro agente de ligação que é capaz de ligar o analito de interesse e um segundo componente de visualização. A amostra usada no teste pode ser qualquer líquido. As amostras preferidas incluem, por exemplo, sangue, soro, plasma, saliva e urina. A amostra é aplicada à área de teste positivo e o conjugado é feito fluir, subseqüentemente, a partir da área de fonte de conjugado. O conjugado flui pela membrana e contata qualquer analito ligado para a área de teste positivo, produzindo um sinal visual.

Em um modo de realização preferido, a tira de teste compreende uma área de teste com antígeno de HIV imobilizado e é usada para a detecção dos anticorpos de anti-HIV. Nesse modo de realização, o teste é útil para o diagnóstico da infecção por HIV em um paciente. Em um outro modo de realização preferido, a tira de teste compreende uma área de teste com antígeno de HCV imobilizado e é usada para a detecção de anticorpos de anti-HCV em uma amostra. Nesse modo de realização, o teste é útil para o diagnóstico da infecção por HCV em um paciente. Em um modo de realização adicional a tira de teste compreende uma área de teste com anticorpos de anti-hCG imobilizados. Nesse modo de realização, o teste é útil para determinar se uma pessoa está grávida. A área de fonte de conjugado compreende, preferencialmente, conjugado seco. Por exemplo, a área de fonte de conjugado pode ser uma almofada de conjugado sobre a qual o conjugado tenha sido seco. A almofada de conjugado está, preferencialmente, em comunicação fluida com a membrana. Em alguns modos de realização, a almofada de conjugado é levada a uma comunicação fluida com a membrana após a adição da amostra à área de aplicação de amostra. Em um outro modo de realização, a área de fonte de conjugado é uma porção da membrana sobre a qual o conjugado foi seco. O conjugado seco é recolocado em suspensão e feito fluir, preferencialmente, contatando-se a área de fonte de conjugado com tampão de lavagem. Em um modo de realização o tampão de lavagem compreende cerca de 0,1% de agente bloqueador, preferencialmente, uma proteína bloqueadora como a caseína. O tampão de lavagem também compreende, preferencialmente, cerca de 0,1% de detergente, preferencialmente, um detergente não iônico como o Triton XI00™. Em um modo de realização, o tampão de lavagem compreende cerca de 0,025% de HEPES, cerca de 0,85% de cloreto de sódio, cerca de 0,1% de EDTA, cerca de 1% de manitol, cerca de 0,1% de caseína e cerca de 1% de detergente Triton XI00™.

Em um modo de realização adicional, o conjugado é suspenso em um tampão. O conjugado é feito fluir para a área de teste pela adição do tampão compreendendo o conjugado para a área de fonte de conjugado.

Em um modo de realização particular, o conjugado compreende a proteína A conjugada a ouro coloidal. Em outros modos de realização o conjugado compreende um anticorpo, preferencialmente, um anticorpo mono-clonal, conjugado a ouro coloidal. Preferencialmente, o ouro coloidal tem um tamanho de partícula de cerca de 20 a cerca de 80 nanômetros.

Em um outro modo de realização, a tira de teste compreende, adicionalmente, uma área de controle localizada sobre a membrana a jusante da área de teste. A área de controle compreende, preferencialmente, um agente de ligação de controle que é capaz de ligar o conjugado. Por exemplo, se o analito de interesse é um anticorpo e o conjugado compreende um agente de ligação de anticorpo como a proteína A, o agente de ligação de controle pode ser IgG de coelho. Se o analito de interesse é um antígeno e o conjugado compreende um anticorpo mono-clonal que é específico para o antígeno, o agente de ligação de controle pode ser, por exemplo, proteína A. A tira de teste pode compreender um ou mais componentes. Uma almofada de tampão pode estar em comunicação fluida com a área de fonte de conjugado, de modo que a adição do tampão de lavagem à almofada de estabilização de pH faça o conjugado fluir a partir da área de fonte de conjugado e pela membrana para contatar a área de teste. Uma tira absorvente e uma almofada absorvente podem ser localizadas a jusante da membrana para absorver o excesso de tampão quando ela passa pela membrana. Um tablete dessecante também pode estar em proximidade à membrana para absorver líquido e mistura em excesso. A tira de teste pode, opcionalmente, estar presente em um alojamento, tal como um alojamento plástico. O alojamento compreende, preferencialmente, uma janela de amostra localizada sobre as áreas de teste e controle, e uma janela de tampão, localizada a montante da área de teste.

Um método de detecção de um analito em uma amostra líquida também é provido, compreendendo a aplicação da amostra à área de teste de uma membrana e, subseqüentemente, o contato da área de teste com um conjugado que é capaz de ligar o analito de interesse e prover um sinal visual indicativo da ligação.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um cartão de teste de acordo com um aspecto da presente invenção. A Figura 2 mostra uma vista de topo de um cartão de teste de acordo com um aspecto da presente invenção. A Figura 3 mostra uma vista lateral de um cartão de teste de acordo com um aspecto da presente invenção. A Figura 4 mostra uma vista de corte dos componentes que compreendem uma tira de teste de acordo com um modo de realização. A Figura 5 mostra um cartão de teste com um resultado positivo indicando que o analito de interesse foi detectado na amostra. A Figura 6 mostra um cartão de teste com um resultado negativo indicando que o analito de interesse não foi detectado na amostra. A Figura 7 mostra uma tira de teste com um copo de amostra de acordo comum aspecto adicional da invenção.

Descrição do Modo de Realização Preferido Métodos e dispositivos de diagnóstico são providos para a rápida determinação da presença de um analito em uma amostra. Embora descrito, geralmente, em termos de um dispositivo de imuno-diagnóstico para a detecção de um anticorpo ou antígeno em uma amostra, alguém experiente na técnica reconhecerá que a presente invenção pode, prontamente, ser modificada para a detecção de qualquer analito de interesse.

No passado, dispositivos de imuno-diagnóstico envolviam, tipicamente, a pré-mistura de um conjugado com a amostra a ser analisada para a presença de um anticorpo. Por exemplo, em alguns dispositivos o conjugado seco era dissolvido pela adição de uma amostra líquida, permitindo a pré-mistura da amostra e do conjugado. O anticorpo a ser detectado, se presente, aglutinava-se para o conjugado e era visualizado em uma área de teste a jusante compreendendo um antígeno imobilizado. Entretanto, nesse sistema, a interação não-específica do conjugado com outros anticorpos ou outros compostos na amostra levava a um apagamento do sinal conjugado. Como resultado, uma grande quantidade de conjugado era necessária. Devido à grande quantidade de conjugado usado, a reação levava um longo tempo para limpar, estendendo o tempo necessário para obter os resultados do teste. Em adição, a sensibilidade do teste era tal que uma quantidade significativa de antígeno era necessária na área de teste a fim de produzir um sinal positivo visível. A presente invenção supera os problemas na técnica anterior contatando a área de teste diretamente com a amostra, permitindo a qualquer analito de interesse ligar-se, especificamente, para o agente de ligação imobilizado. Por exemplo, um anticorpo de interesse pode ligar-se a antígeno imobilizado. Subseqüentemente, o conjugado é suprido à área de teste com um tampão. A frente de solvente do tampão empurra para fora os compostos não ligados na área de teste, reduzindo as interações não-específicas com o conjugado. Como resultado, a quantidade exigida de conjugado é significativamente reduzida e a velocidade da reação é aumentada desse modo. Em adição, a sensibilidade da reação é aumentada, permitindo o uso de menos antígeno na área de teste.

Os dispositivos e métodos descritos podem ser usados, por exemplo, para o diagnóstico de uma doença ou disfunção em um paciente, tal como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou o vírus da hepatite. Eles também podem ser usados para determinar se uma pessoa está grávida. Outros usos serão evidentes para aqueles experientes na técnica com base na revelação abaixo.

Definições A não ser que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado, como comumente entendido por alguém experiente na técnica a que esta invenção pertence. Quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática desta invenção.

Um “analito de interesse” é qualquer molécula ou composto cuja presença deva ser identificada em uma amostra. Os analitos podem incluir, sem limitação, antígenos virais, antígenos bacterianos, hormônios, tal como insulina, hormônio de simulação de folículo (FSH), tirotropina, relaxina, somatotropina e gonadotropina, enzimas, ímunoglobulmas, citocinas, drogas, antígenos de câncer, polissacarídeos antigênicos, e ácidos nucléicos. Outros analitos que podem ser identificados em amostras usando os métodos e aparelhos providos serão evidentes para alguém experiente na técnica. Analitos de interesse particularmente preferidos incluem anticorpos de anti-HIV, anticorpos de anti-HCV e gonadotropina coriônica humana (hCG). O termo “conjugado” refere-se a um composto que é configurado para ligar-se a um analito de interesse e produzir um sinal detectável. O conjugado compreende, tipicamente, um componente de ligação conjugado a um rótulo. O componente de ligação permite ao conjugado ligar-se com o analito de interesse e, opcionalmente, controlar o composto. O rótulo produz um sinal detectável, preferencialmente, um sinal visual. Em um modo de realização, o sinal visual é produzido somente quando da ligação do conjugado com o analito. Em um modo de realização preferido, o analito de interesse é um anticorpo e o conjugado compreende um componente de ligação que é capaz de ligar anticorpos. Por exemplo, o primeiro componente de ligação pode ser a proteína A, embora outras moléculas capazes de ligar anticorpos possam ser usadas. Em um outro modo de realização, o analito de interesse é um antígeno e o componente de ligação do conjugado compreende um anticorpo que é capaz de ligar o antígeno. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo mono-clonal. O rótulo é qualquer molécula ou composto que possa ser incorporado ou conjugado ao componente de ligação e que possa produzir um sinal detectável. Um rótulo preferido é o ouro coloidal. Altemativamente, o rótulo pode ser, por exemplo, partículas tingidas de látex, prata coloidal ou outros metais coloidais, negro coloidal, ou outros componentes conhecidos na técnica. Preferencialmente, o rótulo tem um tamanho de partícula tal que não interfere com a capacidade do componente de ligação de ligar o analito de interesse. Por exemplo, quando o componente de ligação é a proteína A, o rótulo tem, preferencialmente, um tamanho de partícula de cerca de 5 a cerca de 120 nanômetros, mais preferencialmente de cerca de 20 a cerca de 80 nanômetros. O conjugado é preparado, preferencialmente, em um “tampão de conjugado” que pode estabilizar e preservar o conjugado. Em um modo de realização, em seguida à preparação no tampão de conjugado, o conjugado pode ser seco sobre uma “almofada de conjugado”, como descrito em maior detalhe abaixo. O conjugado que é seco sobre um substrato é considerado como “difusamente ligado”. O conjugado é “difusamente ligado” se ele é capaz de ser feito difundir ou fluir, contatando-o com um tampão. Por exemplo, o conjugado que tenha sido difusamente ligado para a área de fonte de conjugado por secagem pode ser solubilizado com tampão e, desse modo, feito fluir ao longo da membrana da tira de teste.

Um “conjugado de controle” é um conjugado em que o componente de ligação é específico para um composto de controle. Um conjugado de controle é empregado, preferencialmente, quando for provável que todo o conjugado seja ligado sobre a linha de teste e não-disponível para servir como controle. O composto de controle é, tipicamente, algo que se sabe estar na amostra que está sendo analisada e é capaz de ligar o agente de ligação de controle sobre a tira de controle. Opcionalmente, o componente de ligação do conjugado de controle pode ser específico para um composto que está presente na área de controle da membrana de teste. O conjugado está presente, preferencialmente, em uma “área de fonte de conjugado”. A área de fonte de conjugado compreende, tipicamente, o conjugado que é difusamente ligado para a mesma, tal como o conjugado seco. Altemativamente, a área de fonte de conjugado pode compreender o conjugado que tenha sido suspenso no tampão, tal como o tampão de lavagem ou o tampão de conjugado. Em um modo de realização, a área de fonte de conjugado é uma almofada de conjugado, compreendendo conjugado seco, que fica em comunicação fluida com a membrana de teste. Em um outro modo de realização, a área de fonte de conjugado é uma porção da membrana de teste sobre a qual o conjugado tenha sido seco. Em um modo de realização adicional a área de fonte de conjugado é uma almofada de tampão, à qual tampão que compreende conjugado pode ser adicionado, que está em comunicação fluida com a membrana de teste. A área de fonte de conjugado está localizada, tipicamente, a montante da área de teste sobre a membrana de teste, de modo que, quando da adição de uma solução que compreende conjugado, ou da solubilização do conjugado difusamente ligado, o conjugado flua pela membrana de teste para contatar a área de teste. O conjugado é solubilizado, preferencialmente, com “tampão de lavagem”, como descrito em maior detalhe abaixo. Brevemente, o tampão de lavagem é uma solução tamponada que compreende, preferencialmente, um “agente bloqueador”. Agentes bloqueadores são bem conhecidos na técnica e incluem quaisquer moléculas ou compostos que reduzam interações não-específicas, tais como ligação de anticorpo não-específico. Os agentes bloqueadores preferidos são proteínas, tais como a caseína e albumina de soro bovina (BSA). Outros agentes bloqueadores que podem ser usados estão disponíveis comercialmente e serão evidentes para alguém experiente na técnica. O “tampão de amostra” é uma solução sujeita a tampão que, preferencialmente, não compreende conjugado. Em alguns modos de realização o tampão de amostra compreende um agente bloqueador, enquanto em outros modos de realização não compreende. O tampão de amostra pode, opcionalmente, ser aplicada à membrana anteriormente à adição da amostra, como examinado em maior detalhe abaixo.

Uma “membrana de teste” é um suporte sólido que compreende uma área de teste e, opcionalmente, uma área de controle. A amostra a ser analisada é aplicada, tipicamente, diretamente à membrana de teste de modo que ela contate a área de teste e a área de controle. A membrana de teste pode ser qualquer suporte sólido ao qual um agente de ligação de analito e um agente de ligação de controle podem ser incorporados. Preferencialmente, a membrana de teste é nitro-celulose. A membrana de teste provê um caminho de fluxo lateral para líquidos. A membrana de teste e outros componentes da tira de teste são mencionados como em “comunicação fluida” se um líquido, tal como uma amostra ou tampão de líquido, puder fluir de um componente para outro. Se os componentes da tira de teste estiverem em contato uns com os outros, eles estão em comunicação fluida. Entretanto, como será reconhecido por alguém experiente na técnica, o contato direto entre dois componentes particulares não é exigido para a comunicação fluida. A “área de teste”, a “tira de teste” e a “linha de teste” são usadas de modo intercambiável e se referem a uma área sobre a membrana de teste à qual um agente de ligação de analito é incorporado.

Um “agente de ligação de analito”, um “parceiro de ligação específico” ou um “componente de ligação” são qualquer molécula ou composto configurados para ligar-se, especificamente, a um analito de interesse. Por exemplo, e sem limitação, o agente de ligação de analito pode compreender antígenos, anticorpos, receptores, outros polipeptídeos, peptídeos, haptenos, lecitinas, ácido nucléico, incluindo oligonucleotídeos, ou moléculas pequenas. Em um modo de realização, o agente de ligação de analito é um antígeno que é específico para um anticorpo que deve ser detectado em uma amostra. Em um outro modo de realização, o composto de ligação de analito é um anticorpo que é específico para um antígeno de interesse. A “área de controle”, a “tira de controle” e a “linha de controle” são usadas de moído intercambiável e se referem a uma área sobre a membrana à qual o agente de ligação de controle é incorporado.

Um “agente de ligação de controle” é qualquer molécula ou composto que seja capaz de se ligar, especificamente, a um conjugado ou a um conjugado de controle. “Tira de teste” refere-se a um aparelho completo que pode ser usado para detectar a presença de um analito em uma amostra. A tira de teste compreende, preferencialmente, pelo menos uma membrana de teste com uma área de teste e uma área de controle. Como descrito abaixo, a tira de teste pode estar presente em um alojamento, tal como um alojamento plástico. Altemativamente, a tira de teste pode ser usada sem um alojamento. Se presente em um alojamento, a tira de teste e o alojamento juntos podem ser referidos como um “cartão de teste”. “Janela de cartão de teste” e “janela de amostra” se referem a um furo no alojamento plástico de um cartão de teste através do qual uma amostra pode ser aplicada. A janela de cartão de teste está localizada, preferencialmente, acima da área de teste e da área de controle. A janela de cartão de teste também permite, preferencialmente, a visualização dos resultados de teste. “Janela de tampão” refere-se a um furo no alojamento plástico de um cartão de teste através do qual um tampão pode ser aplicado. Em um modo de realização a janela de tampão é localizada, preferencialmente, para permitir à tampão ser aplicada a uma almofada de tampão. Em um outro modo de realização, a janela de tampão é localizada para permitir a aplicação do tampão diretamente à membrana de teste. “Janela de indicador de volume” refere-se a um furo no alojamento plástico de um cartão de teste através do qual um indicador de volume de amostra visível pode ser visto. A janela de indicador de volume está localizada a jusante da janela de amostra. O indicador de volume de amostra assinala que um volume de amostra aceitável contatou a área de teste.

Um indicador de volume de amostra pode ser, por exemplo, azul de metileno ou outro composto colorido que tenha sido aplicado à membrana logo a montante da janela de indicador de volume. O indicador de volume de amostra é transportado pela janela de indicador de volume pelo movimento da amostra, produzindo um sinal visual na janela. Em outros modos de realização, o indicador de volume de amostra é um composto que muda de cor quando contatado pela amostra, tal como um indicador de pH. Tipicamente, um indicador de volume de amostra é usado quando um grande volume de amostra é necessário, tal como quando se presume a presença em uma amostra de um analito de interesse a uma baixa concentração. Por exemplo, um indicador de volume de amostra é usado, preferencialmente, quando urina está sendo analisada para a presença de hCG. “Amostra” refere-se a qualquer material a ser analisado para a presença de um analito de interesse. A amostra está, preferencialmente, em uma forma líquida. Exemplos de amostras incluem, sem limitação, fluidos corporais como sangue total, plasma, soro, saliva e urina. Como descrito em maior detalhe abaixo, a amostra pode ser um sólido. Entretanto, nesse caso a amostra é, preferencialmente, solubilizada ou extraída anteriormente ao uso no teste. A “área de aplicação de amostra” é a localização sobre a membrana à qual a amostra é aplicada. A área de aplicação de amostra está localizada, preferencialmente, a jusante da área de fonte de conjugado e a montante da área de teste. Mais preferencialmente, a área de aplicação de amostra compreende a área de teste. A amostra pode ser aplicada à área de aplicação de amostra diretamente, por uma pipeta, ou indiretamente, através de uma mecha que está em contato com a membrana. O termo “anticorpo” é usado em seu sentido mais grosseiro e inclui, por exemplo e sem limitação, anticorpos inteiros assim como anticorpos de cadeia única, fragmentos de anticorpo, e anticorpos quiméricos, pelo tempo que eles mantiverem a especificidade dé ligação desejada. O Cartão de Teste Os dispositivos de diagnóstico revelados aqui compreendem, preferencialmente, um cartão de teste 1, como ilustrado nas Figuras 1-3. A Figura 1 ilustra um cartão de teste 1 que compreende um alojamento plástico 10, com uma porção superior 15 e uma porção inferior 18 que engatam rápido juntas. Há duas aberturas dentro da porção superior 15 do alojamento plástico 10: uma janela de amostra 20 e uma janela de tampão 30. A janela de amostra 20 permite a aplicação de uma amostra à área de aplicação de uma membrana contida dentro do alojamento plástico 10. A área de aplicação de amostra compreende, preferencialmente, uma área de teste 140. Uma área de controle 150 está localizada, preferencialmente, a jusante da área de teste 140 sobre a membrana. A janela de tampão 30, permite a aplicação do tampão à área de fonte de conjugado 50. A membrana é parte de uma tira de teste que é descrita em detalhe abaixo.

Uma janela de indicador de volume opcional (não mostrada) fica localizada a jusante da área de teste em alguns modos de realização. A janela de indicador de volume, se presente, permite ao usuário visualizar um indicador, tal como uma mudança de cor, sobre a membrana a jusante da área de teste. O indicador assinala que um volume suficiente de amostra contatou a área de teste e que o usuário pode proceder para contatar a área de teste com o conjugado para detectar o analito ligado como descrito abaixo, pela aplicação de tampão à área de fonte de conjugado. A Figura 2 ilustra uma vista de topo do cartão de teste 1, mostrando a janela de amostra 20 e a janela de tampão 30 dentro do alojamento plástico 10. A área de teste da membrana 140 é acessível através da janela de amostra 20 e a área de fonte de conjugado 50 é acessível através da janela de tampão 30. Uma área de controle 150 está localizada a jusante da área de teste 140. Embora ilustrado com uma janela de amostra 40 que é retangular e uma janela de tampão 30 que é circular, as janelas podem ser de qualquer forma ou dimensão. Entretanto, elas são, preferencialmente, formadas e dimensionadas para direcionar a amostra para a área de aplicação de amostra da membrana 40 e o tampão para a área de fonte de conjugado 50. Em adição, a janela de amostra é configurada para permitir a visualização da área de teste 140, se for obtido um resultado de teste positivo, e da área de controle 150. A Figura 3 ilustra uma vista lateral de um exemplo de cartão de teste 1. A porção superior 15 e a porção inferior 18 do alojamento plástico 10 são mostradas. A extremidade alargada (60) da porção superior 15 do alojamento plástico 10 que é distai à janela de tampão (não mostrada) permite a colocação do material absorvente, tal como uma almofada absorvente ou tablete dessecante dentro do cartão de teste (1). O tamanho da extremidade alargada (60) vai variar dependendo da quantidade de material absorvente usado, o que, por sua vez, depende do volume de amostra e tampão empregadas no teste. A Tira de Teste Uma tira de teste compreende uma membrana de teste com pelo menos uma área de teste. Um agente de ligação de analito que é específico para um analito de interesse é ligado ou imobilizado de outro modo na área de teste. Pelo menos uma área de teste se toma visível quando da conclusão do teste se o analito de interesse estiver presente na amostra. Em um modo de realização particular a área de teste compreende antígeno imobilizado e o teste permite a identificação de anticorpos particulares em uma amostra como um fluido biológico. Em um outro modo de realização a área de teste compreende anticorpo ligado e o teste permite a identificação de um antígeno particular na amostra. A amostra é aplicada a uma área de aplicação de amostra que está localizada a jusante a partir da área de fonte de conjugado, por exemplo, a jusante da almofada de conjugado. No modo de realização preferido, a área de aplicação de amostra compreende a área de teste. Entretanto, em outros modos de realização a área de aplicação de amostra está localizada a jusante da área de teste e a amostra flui a partir da área de aplicação de amostra para a área de teste.

Um modo de realização preferido da tira de teste é diagramado na Figura 4. Uma tira de teste 100 para testar uma amostra para a presença de um analito de interesse, tal como um anticorpo, compreende, preferencialmente, uma almofada de tampão 110 em contato com uma almofada de conjugado 120. A almofada de conjugado 120 está, por sua vez, em contato com uma membrana de teste 130 que compreende uma área de teste 140 e uma área de controle 150. A membrana 130 está, por sua vez, em contato com uma almofada absorvente 160. A almofada absorvente 160 está, opcionalmente, em contato com um papel absorvente adicional 170. A almofada absorvente 160 e/ou o papel absorvente opcional 170 podem estar em contato adicional com um dessecante opcional 180, tal como um tablete dessecante.

Em alguns modos de realização, um depósito de filtro removível 190 é incorporado à tira de teste 100. O depósito de filtro 190 compreende um papel de filtro 200. Quando o depósito de filtro 190 é incorporado à tira de teste 100, o papel de filtro 200 é localizado diretamente acima da área de aplicação de amostra, a qual compreende, preferencialmente, a área de teste 140 e a área de controle 150.

Deve ser provida amostra suficiente à área de teste para assegurar uma leitura positiva visível quando da conclusão do teste se o analito estiver presente na amostra. Desse modo, para analitos que são suspeitos de estar em uma baixa concentração na amostra, por exemplo, antígenos como hCG na urina, um volume de amostra maior é exigido. A tira de teste 100 pode ser configurada para aceitar os volumes de amostra maiores.

Um. tal modo de realização é ilustrado na Figura 7, onde um copo de amostra 500 é incorporado à tira de teste 100. O copo de amostra 500 compreende um recipiente para reter um volume de uma amostra líquida. Tipicamente, o copo de amostra terá uma abertura no fundo que permite à amostra fluir para fora do copo de amostra 500 e contatar a membrana de teste 130. Desse modo, o copo de amostra 500 é localizado de modo que a amostra flua do copo de amostra 500 para a área de aplicação de amostra da membrana de teste 130 e contate a área de teste 140 e a área de controle 150. Preferencialmente, a área de aplicação de amostra compreende a área de teste 140 e a área de controle 150 e o copo de amostra 500 é localizado diretamente sobre a área de teste 140 e da área de controle 150. O copo de amostra 500 pode, opcionalmente, compreender um filtro através do qual a amostra passa anteriormente ao contato com a membrana de teste. A amostra pode ser depositada no copo de amostra enquanto ela é incorporada ao cartão de teste. Em um outro modo de realização a amostra é colocada no copo de teste e o copo de teste é, subseqüentemente, incorporado ao cartão de teste e à amostra é permitido fluir para a área de aplicação de amostra. É desejável assegurar que um volume da amostra que compreende uma quantidade detectável de analito, se presente, tenha contatado a área de teste 140 antes de fazer o conjugado fluir para a área de teste 140. Um indicador de volume de amostra, tal como uma tintura indicadora, localizado a jusante da área de teste 140 e da área de controle 150 pode ser usado para determinar que uma quantidade suficiente de amostra contatou a área de teste 140 e a área de controle 150. Por exemplo, uma tintura indicadora, como o azul de metileno, pode ser aplicada à almofada absorvente 160 ou ao papel absorvente 170 a jusante da membrana de teste. O fluxo da amostra líquida ao longo da almofada absorvente 160 ou do papel absorvente 170 faz a tintura fluir, criando um sinal visual, por exemplo, uma visível cor azul. O sinal pode ser observado através de uma janela de indicador de volume em uma janela no cartão de teste (não mostrado).

Em alguns modos de realização, particularmente aqueles nos quais um grande volume de amostra (maior do que cerca de 50μ1) deve ser aplicado, a almofada de conjugado 120 não está em comunicação fluida com a membrana de teste 130. Um tal modo de realização é ilustrado na Figura 7. A separação da almofada de conjugado 120 e da membrana de teste 130 evita a mistura do conjugado e da amostra antes que a amostra contate a área de teste 140. Após a amostra ter contatado a área de teste 140 e a área de controle 150, a almofada de conjugado 120 é levada a estar em comunicação fluida com a membrana de teste 130. O tampão é, então, aplicada à almofada de tampão 110 para iniciar o teste. O tampão pode ser aplicado à almofada de tampão 110 diretamente através de uma janela de tampão, ou quebrando-se uma ampola 300 que retém o tampão, fazendo, desse modo, o tampão fluir para a almofada de tampão 110. Em um modo de realização, o tampão é aplicado à almofada de tampão 110 anteriormente à almofada de conjugado 120 ser levada a estar em comunicação fluida com a membrana 130, Em modos de realização alternativos o tampão é aplicada diretamente à almofada de conjugado 120. O método pelo qual a almofada de conjugado 120 é levada a comunicação fluida com a membrana 130 não é limitada em nenhum modo. Em um modo de realização o usuário desliza uma porção móvel do alojamento ao qual a almofada de conjugado 120 e, opcionalmente, a almofada de tampão 110 estão incorporadas, colocando, desse modo, a almofada de conjugado 120 em contato com a membrana 130. O mecanismo para levar a almofada de conjugado 120 a comunicação fluida com a membrana de teste 110 também faz, preferencialmente, com que a ampola de tampão 300 quebre. O mecanismo também pode fazer com que o copo de amostra 500 seja removido da tira de teste 110.

Um tablete dessecante 180 está, preferencialmente, em comunicação fluida com o papel absorvente 170. O tamanho do tablete dessecante 180 é escolhido para ser capaz de absorver o volume total da amostra aplicada à membrana de teste 130. O tablete dessecante e qualquer outro material absorvente ficam localizados a jusante da área de aplicação de amostra e facilitam o fluxo da amostra pela área de teste.

Em outro modo de realização, o copo de amostra é substituído por uma mecha que é contatada com uma amostra líquida. A amostra flui ao longo da mecha para a área de aplicação de amostra da membrana de teste e contata a área de teste e a área de controle. Em um modo de realização particular a mecha é colocada na corrente de urina para analisar a urina para a presença de um analito, tal como o hCG. Nesse modo de realização a almofada de conjugado, preferencialmente, não está em comunicação fluida com a membrana de teste durante o tempo que a amostra está sendo aplicada à mecha. Após amostra suficiente ter contatado a área de teste, a almofada de conjugado é levada a contatar a membrana de teste. O mecanismo para mover a almofada de conjugado também pode servir para remover a mecha. O tampão é, subseqüentemente, adicionado à almofada de tampão ou diretamente à almofada de conjugado para começar o teste. O tampão pode ser adicionado diretamente à almofada de tampão através de uma janela de tampão, como descrito acima. Altemativamente, o tampão está presente em uma ampola dentro do cartão de teste e é feita fluir para a almofada de tampão e/ou a almofada de conjugado pela quebra ou a abertura de outro modo da ampola. A tira de teste está contida, preferencialmente, dentro de um alojamento, como mostrado na Figura 2 e descrito acima. A Figura 5 ilustra um resultado de teste positivo, indicando a presença do analito de interesse em uma amostra. A área de teste 140 da membrana 130 é visível como uma linha através da janela de amostra 20. Em adição, a área de controle 150 é visível como uma linha através da janela de amostra 20, indicando que o conjugado fluiu da área de fonte de conjugado 50 através da área de teste 140. Em contraste, um resultado negativo é ilustrado na Figura 6. Com um resultado negativo, somente a área de controle 150 é visível como uma linha através da janela de amostra 20. Novamente, o controle indica que o conjugado fluiu da área de fonte de conjugado 50 através da área de teste 140. Desse modo, a falta de uma linha na área de teste 140 é o resultado da falta do analito de interesse ligado.

Uso da Tira de Teste Uma amostra a ser testada para a presença de um particular analito de interesse é aplicada à área de aplicação de amostra da membrana de teste de modo que contate a área de teste. No modo de realização preferido, a amostra é aplicada à membrana e deixada contatar a área de teste antes do conjugado contatar a área de teste. Desse modo, o analito de interesse na amostra, se presente, tem a oportunidade de ligar-se para o agente de ligação de analito na área de teste anteriormente a ligação de conjugado.

Se a tira de teste está em um alojamento, a amostra é aplicada, preferencialmente, através de uma janela de amostra. Nesse caso, a membrana compreende uma área de aplicação de amostra que é acessível através da janela de amostra. Preferencialmente, a área de aplicação de amostra compreende pelo menos uma área de teste positivo. Mais preferencialmente, a área de aplicação de amostra compreende uma área de teste e uma área de controle. Altemativamente, a amostra pode ser aplicada através de uma mecha ou copo, de modo que ela flua para a área de aplicação de amostra da membrana contate as áreas de teste e controle.

Se a tira de teste não está em um alojamento, a amostra.pode ser aplicada diretamente a área de aplicação de amostra da membrana, compreendendo, preferencialmente, a área de teste e a área de controle. Altemativamente, a amostra pode ser aplicada à membrana em uma área de aplicação de amostra a montante da área de teste e deixada fluir através da membrana para contatar a área de teste. Preferencialmente, contudo, a amostra é deixada contatar a área de teste anteriormente à adição do conjugado à membrana.

Em um modo de realização, a amostra é coletada ou colocada em um copo de amostra. O copo é incorporado ao alojamento e permite à amostra fluir para a área de aplicação de amostra da membrana e contatar a área de teste e a área de controle. Um copo de amostra é usada, preferencialmente, se um volume de amostra maior do que cerca de 10μ1 é usado. O copo de amostra pode, opcionalmente, compreender um filtro através do qual a amostra passa antes de contatar a membrana.

Em um modo de realização adicional, a amostra é aplicada a uma mecha que está em contato a membrana. A mecha permite à amostra deslocar-se para a área de aplicação de amostra da membrana e contatar as áreas de teste e controle. A mecha é compreendida, preferencialmente, de folha de lixa, poliéster, celulose, ou um outro material que permitirá à amostra migrar para a membrana que compreende a área de teste. Se o cartão de teste está em um alojamento, a mecha pode se projetar a partir do alojamento, permitindo o acesso à mecha para a aplicação da amostra. Por exemplo, se a presença de um analito particular deve ser determinada na urina, tal como o hCG, a mecha pode ser colocada na corrente de urina do sujeito que está sendo testado. Em um outro modo de realização, a mecha pode ser posta em contato com a amostra a ser analisada, por exemplo, fluidos corporais, tal como saliva. A amostra a ser testada é, preferencialmente, aplicada à área de aplicação de amostra da membrana na forma líquida. Exemplos de amostras que podem ser analisadas incluem, sem limitação, soro, plasma, sangue total, saliva e urina. Amostras sólidas ou semi-sólidas podem ser solubilizadas e aplicadas à membrana ou extraídas anteriormente à aplicação.

Em outros modos de realização, o tampão de amostra que, preferencialmente, não contém conjugado é aplicado à membrana anteriormente à aplicação da amostra. Em alguns modos de realização, o tampão de amostra compreende um agente de bloqueio. Preferencialmente, o tampão de amostra é aplicado à membrana na área de aplicação de amostra. De cerca de 1 a cerca de 25/xl de tampão de amostra são, preferencialmente, aplicados à membrana, mais preferencialmente, de cerca de 1 a cerca de 10μ1, ainda mais preferencialmente, cerca de 1 a 5μ1. Em um modo de realização particular, 5μ1 de tampão de amostra são aplicados à área de aplicação de amostra da membrana, seguidos por 5μ1 de soro, plasma, sangue total ou outra amostra líquida. A adição de tampão de amostra anteriormente à aplicação do tampão de lavagem é particularmente preferida no teste para HCV, como descrito abaixo, e quando amostras viscosas são usadas. O uso de tampão de amostra aumenta a sensibilidade do teste faz as amostras viscosas fluírem mais rápido. O tampão de amostra compreende, preferencialmente, um agente tamponante e um conservante. Opcionalmente, ela também pode conter um ou mais detergentes e/ou açúcares. Qualquer agente tamponante pode ser usado, preferencialmente, em uma quantidade que mantém o pH desejado da amostra. Preferencialmente, o pH do tampão de amostra é de cerca de 7,2 a cerca de 7,6. Por exemplo, e sem limitação, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de estabilizadores de pH de HEPES, Tris e fosfato. Em um modo de realização preferido, o tampão de amostra compreende de cerca de 0,01% a cerca de 0,5% de HEPES, mais preferencialmente, de cerca de 0,02 a cerca de 0,05% de HEPES. Em um outro modo de realização, o tampão de amostra compreende de cerca de 0,01% a cerca de 0,5% de fosfato, mais preferencialmente, de cerca de 0,02 a cerca de 0,05% de fosfato. Alguém experiente na técnica será capaz de ajustar a quantidade de agente tamponante para manter o pH desejado. O tampão de amostra também compreende, preferencialmente, um conservante, tal como azido de sódio ou Proclin. Em um modo de realização preferido, o tampão de amostra compreende de cerca de 0,1% a cerca de 1,0% de azido de sódio, mais preferencialmente, de cerca de 0,1% a cerca de 0,2% de azido de sódio, ainda mais preferencialmente, cerca de 0,2%.

Dependendo da natureza da amostra a ser testada, a amostra é, opcionalmente, aplicada à membrana através de um filtro. Exemplos de materiais de amostra que são, preferencialmente, filtrados incluem sangue total, amostras fecais, urina, extratos de alimentos e extratos contaminados. Em um modo de realização, o sangue total é aplicado através de um filtro de membrana. O filtro remove os contaminantes e permite aos analitos, como anticorpos, passarem através, aumentando, desse modo, a sensibilidade do teste. O filtro é encerrado em um depósito que pode ser incorporado ao cartão de teste ou à tira de teste quando necessário. Se incorporado a um cartão de teste, o filtro é incorporado, preferencialmente, diretamente acima da janela de amostra. Os meios de filtragem serão escolhidos com base no tipo de amostra a ser filtrada. Essa seleção está dentro da capacidade do técnico experiente. Por exemplo, para amostras de sangue total o material de filtro pode ser, sem limitação, o Pall BTS-SP300™.

Como examinado acima, o filtro é, preferencialmente, incorporado à tira de teste por meio de um depósito de filtro removível, embora, para aplicações particulares, o filtro possa ser fixado permanentemente. O depósito de filtro é, tipicamente, um dispositivo que engata rápido por cima do alojamento do cartão de teste. O projeto e tipo do dispositivo podem variar, mas ele é formado, tipicamente, de poliestireno, polietileno, polipropileno ou outro plástico. A área de teste é a porção da membrana que é coberta com um agente de ligação, preferencialmente uma proteína, que é capaz de ligação específica para o analito de interesse. Por exemplo, a area de teste positivo pode ser coberta com antígeno que é específico para um anticorpo de interesse. Em modos de realização particulares, a área de teste compreende antígeno de HIV ligado ou antígeno de hepatite, como descrito em maior detalhe nos Exemplos abaixo. Quando a área de teste compreende antígeno, preferencialmente, de cerca de 0,025 a cerca de 0,4^g de antígeno são usados.

Em outro modo de realização, um anticorpo que é específico para um antígeno de interesse é imobilizado na área de teste. O anticorpo pode ser um anticorpo poli-clonal ou mono-clonal. Quando a área de teste compreende anticorpo, preferencialmente, de cerca de 0,1 a cerca de 20μg do anticorpo são aplicados, mais preferencialmente, de cerca de 0,2 a cerca de 2jUg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 0,5 a cerca de l/xg. Em um modo de realização particular a área de teste compreende um anticorpo para hCG, preferencialmente, um anticorpo mono-clonal para hCG. O agente de ligação pode ser aplicado à membrana em qualquer padrão desejado; desse modo, o resultado visível de um teste positivo pode ser de qualquer formato. Em um modo de realização preferido a área de teste é linear, formando uma linha que se estica de um lado da membrana ao outro, de modo que uma linha vertical apareça cruzando a janela de amostra se um resultado positivo for obtido, indicando a presença do analito na amostra. Em outros modos de realização, a área de teste é formada como um símbolo, tal como um “+”. É possível testar para mais do que um tipo de analito em uma única tira de teste. Nesse caso, áreas de teste positivo adicionais são preparadas sobre a membrana de teste. Por exemplo, uma segunda área de teste positivo pode compreender o antígeno para um segundo tipo de anticorpo ou um anticorpo para um segundo tipo de antígeno. O agente de ligação em uma área de teste positivo adicional não é, necessariamente, do mesmo tipo que o agente de ligação em uma primeira área de teste. Desse modo, o agente de ligação em uma primeira área de teste pode ser um anticorpo, enquanto um agente de ligação em uma segunda área de teste pode ser um antígeno. Dessa maneira, uma amostra pode se analisada para a presença de mais do que um tipo de analito.

Cada área de teste positivo adicional pode ser uma forma diferente da primeira área de teste, para permitir ao usuário distinguir facilmente a natureza do resultado positivo. Dependendo do tipo dos analitos adicionais a serem testados, conjugados adicionais que aglutinam os vários analitos podem ser necessários. Por exemplo, se os analitos de interesse são dois anticorpos diferentes, um único conjugado compreendendo a proteína A pode ser usado. Entretanto, se um analito é um anticorpo e um segundo analito é um antígeno, dois conjugados diferentes seriam exigidos, um que aglutina especificamente o anticorpo e um que aglutina especificamente o antígeno. A área de controle compreende, preferencialmente, um agente de ligação de controle que ligará para o conjugado. Localizando-se a área de controle a jusante da área de teste positivo, uma reação na área de controle indicará que o conjugado migrou passando da área de teste, onde estava disponível para reagir se o analito de interesse estivesse presente. Se o conjugado é projetado para reconhecer um anticorpo, a área de controle compreende, preferencialmente, uma imunoglobulina, tal como a IgG de coelho. Se o conjugado compreende um anticorpo, a área de controle compreende, preferencialmente, um agente de ligação de anticorpo como uma proteína A. A área de controle pode ser de qualquer formato desejado, tal como uma linha ou um símbolo, por exemplo Em outros modos de realização a área de controle compreende um agente de ligação de controle que aglutina para um conjugado de controle. Por exemplo, a área de controle pode compreender β-gal e o conjugado de controle pode compreender /3-galactosidase conjugada a ouro. O agente de ligação e o agente de controle podem ser aplicados à membrana de teste por meio de qualquer método conhecido na técnica. Eles são aplicados, tipicamente, contatando-se a membrana de teste com o agente de ligação, borrifando ou contatando sobre a membrana de teste usando-se um sistema de dispensa por bomba. Esses sistemas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir da Kinematic Automation.

Quando a amostra contata a área de teste, se o analito de interesse estiver presente na amostra, ele ligará para o agente de ligação sobre a área de teste. O analito não-ligado em excesso é lavado da área de teste pela migração do tampão ao longo da membrana como descrito abaixo.

Depois que a amostra é aplicada à membrana, o tampão de lavagem é aplicada à membrana de teste. Preferencialmente, de cerca de 1 a cerca de 20, mais preferencialmente, de cerca de 1 a cerca de 5 gotas de tampão de lavagem são aplicadas inicialmente. Tampão de lavagem adicional pode, subseqüentemente, ser aplicada se necessário para limpar a reação. O tampão de lavagem, preferencialmente, porta o conjugado para a área de teste. Tampão de lavagem pode ser aplicada diretamente à membrana de teste. No modo de realização preferido, contudo, tampão de lavagem é aplicado a uma almofada de tampão a montante, a partir da qual ela flui para a membrana de teste. A almofada de tampão pode ser feita de qualquer material que possa conter o tampão e permitir-lhe fluir através para a membrana a uma taxa desejada. Por exemplo, a almofada de tampão pode ser compreendida de um ou mais materiais selecionados a partir do grupo que consiste de folha de lixa, celulose e poliéster. Em um modo de realização preferido a almofada de tampão é folha de lixa de Whatman GF/DVA. O técnico experiente será capaz de selecionar um material apropriado para a almofada de tampão com base em fatores como o projeto do alojamento da tira de teste de fluxo lateral, a taxa de fluxo desejada, e a quantidade de tampão que deve ser retida pela almofada de tampão. O tampão de lavagem pode ser aplicado diretamente à almofada de tampão, com uma pipeta ou conta-gotas. Entretanto, em um outro modo de realização, a quantidade apropriada de tampão de lavagem está presente em um recipiente que é adjacente à almofada de tampão. Por exemplo, o tampão de lavagem pode estar contido em uma ampola de vidro ou de plástico. Em seguida à adição da amostra de teste, o recipiente que compreende o tampão de lavagem é quebrado ou aberto de outro modo, permitindo ao tampão de lavagem contatar a almofada de tampão. A composição do tampão de lavagem pode ser variada para aumentar a sensibilidade do teste. Preferencialmente, o tampão de lavagem compreende um agente tamponante, um conservante, um detergente, açúcar e outros materiais que atuam para reduzir a ligação de segundo plano e/ou não-específica.

Pode ser usado qualquer agente tamponante que mantenha o pH desejado do tampão, preferencialmente, de cerca de 7,2 a cerca de 7,6. Por exemplo, e sem limitação, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de tampão de HEPES, Tris e fosfato. Em um modo de realização preferido, o tampão de lavagem compreende de cerca de 0,01% a cerca de 0,5% de HEPES, mais preferencialmente, de cerca de 0,02 a cerca de 0,2% de HEPES e, ainda mais preferencialmente, de cerca de 0,02% a cerca de 0,05% de HEPES. Em um modo de realização particularmente preferido, o tampão de lavagem compreende 0,025% de HEPES. O tampão de lavagem também pode compreender um conservante, tal como azido de sódio ou Proclin. Em um modo de realização preferido, o tampão de lavagem compreende de cerca de 0,1 a cerca de 0,5% de azido de sódio, mais preferencialmente, de cerca de 0,1 a cerca de 0,2%. O cloreto de sódio ou um sal comparável está, preferencialmente, presente em uma concentração de cerca de 1%, mais preferencialmente, de cerca de 0,85%. EDTA pode estar presente, preferencialmente, a uma concentração de cerca de 0,1%. Um açúcar, como o manitol, também pode estar presente. As concentrações de manitol preferidas são de cerca de 1% a cerca de 5%. Em um modo de realização preferido a concentração de manitol é de cerca de 1%.

Um agente de bloqueio está, preferencialmente, igualmente presente no tampão de lavagem. O agente de bloqueio pode ser qualquer agente de bloqueio conhecido na técnica. Preferencialmente, o agente de bloqueio é uma proteína, tal como caseína ou albumina de soro bovina (BSA). O agente de bloqueio está, preferencialmente, presente no tampão de lavagem a uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5%, mais preferencialmente, de cerca de 0,02 a cerca de 0,2%. Em um modo de realização preferido particular, a caseína está presente no tampão de lavagem a uma concentração de cerca de 0,1%. O tampão de lavagem, tipicamente, também compreende um detergente, preferencialmente, um detergente não iônico como o Triton XI00™ ou o Tween. Preferencialmente, o detergente está presente a uma concentração de cerca de 0,05 a cerca de 1%, mais preferencialmente, de cerca de 0,1 a cerca de 0,5%. Em um modo de realização particularmente preferido, o tampão de lavagem compreende Triton XI00 a uma concentração de cerca de 0,1%. O pH do tampão de lavagem é ajustado para entre cerca de 7 e 8, mais preferencialmente, para entre cerca de 7,2 a 7,6. Em um modo de realização particularmente preferido, o pH do tampão de lavagem é de cerca de 7,2. A tira de teste também compreende uma área de fonte de conjugado. Em um modo de realização preferido, a tira de teste compreende uma almofada de conjugado sobre a qual conjugado foi seco, como descrito abaixo. O tampão de lavagem flui da almofada de tampão para a almofada de conjugado, com a qual ela está em contato, a almofada de conjugado está, por sua vez, em contato com a membrana de teste. Em aiguns modos de realização, contudo, a almofada de conjugado é posta em contato com a membrana após a adição da amostra. Em particular, quando um grande volume de amostra é usado, a almofada de conjugado é, preferencialmente, posta em contato com a membrana depois da amostra ter contatado a área de teste.

Tampão de lavagem suficiente é aplicada à almofada de tampão para dissolver o conjugado difusamente ligado para a almofada de conjugado e fazer o conjugado fluir ao longo da membrana de teste para a linha de teste e a linha de controle. A quantidade de tampão a ser usada pode ser determinada por alguém experiente na técnica com base em fatores como a quantidade de conjugado ligado na almofada de conjugado, o tamanho da membrana e a quantidade de amostra a ser analisada. Preferencialmente, de 1 a 10 gotas de solução de tampão são aplicadas à almofada de tampão quando a almofada de tampão é de aproximadamente 2cm por 5mm, mais preferencialmente, de 2 a cinco gotas e, ainda mais preferencialmente, de 3 a 4 gotas.

Em modos de realização alternativos, uma almofada de conjugado não está presente. Em um modo de realização alternativo o conjugado está presente no tampão de lavagem a uma concentração no âmbito de cerca de 0,2 OD a cerca de 1,0 OD/ml. O tampão de lavagem que contém o conjugado pode ser aplicado à almofada de tampão. O conjugado, desse modo, flui com o tampão de lavagem da almofada de tampão para a membrana, onde contata a área de teste e a área de controle. Em um outro modo de realização, o tampão de lavagem que contém o conjugado é aplicado diretamente à membrana de teste. O tampão de lavagem que contém o conjugado pode estar presente em uma ampola, e ser feita fluir para a membrana quebrando-se ou abrindo-se de outro modo a ampola. O tampão de lavagem que contém o conjugado é, preferencialmente, aplicada à membrana em um ponto a montante da área de teste. Entretanto, em alguns modos de realização, o tampão de lavagem que compreende o conjugado é aplicado diretamente à área de teste após a amostra ter sido aplicada.

Em um outro modo de realização, o conjugado é difusamente ligado, por meio de secagem, diretamente sobre a membrana que compreende a área de teste e a área de controle. O tampão de lavagem pode, então, ser aplicada a uma almofada de tampão que está em contato com a membrana, ou diretamente à membrana de teste. O tampão de lavagem dissolve o conjugado seco e o transporta ao longo da membrana de teste para a área de teste e para a área de controle. O tampão de lavagem que compreende um conjugado, preferencialmente, contata a área de teste após a amostra ter sido aplicada e qualquer analito presente na amostra ter tido a oportunidade de ligar o agente de ligação imobilizado. Desse modo, o tampão de lavagem, preferencialmente, é aplicado à tira de teste após a aplicação da amostra à área de teste. O conjugado, descrito em detalhe acima, é preparado para o uso no teste pela diluição no tampão de conjugado. Preferencialmente, o conjugado de forças é preparado pela diluição do conjugado em tampão de conjugado para 3 OD/ml. A composição do tampão de conjugado pode ser variada dependendo da natureza do conjugado. Exemplo de tampão de conjugado compreende um tampão como HEPES, Tris, fosfato ou outro tampão semelhante conhecida na técnica. Um tampão de conjugado preferido compreende cerca de 0,02 a 0,2% de tampão de HEPES, mais preferencialmente, cerca de 0,025% de HEPES. O tampão de conjugado também pode compreender um sal, preferencialmente cloreto de sódio. O cloreto de sódio é adicionado a uma concentração de cerca de 0,1%, mais preferencialmente, cerca de 0,85%. Um conservante também pode ser incluído no tampão de conjugado, tal como azido de sódio ou Proclin, a uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 0,2%. O tampão de conjugado também compreende, preferencialmente, EDTA (cerca de 0,1%), caseína a uma concentração de cerca de 0,02 a cerca de 0,2%, mais preferencialmente cerca de 0,15%, albumina de soro bovina (BSA) a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 3%, mais preferencialmente de cerca de 1%, manitol a uma concentração de cerca de 1% a cerca de 5%, mais preferencialmente de cerca de 1%, sacarose a uma concentração de cerca de 1% a cerca de 5%, mais preferencialmente de cerca de 1%. O Triton XI00 pode ser incluído no tampão, preferencialmente, a uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 0,5%, mais preferencialmente de cerca de 0,1%. O tampão de conjugado é, preferencialmente, ajustada a um pH de cerca de 7,2 a cerca de 7,6, mais preferencialmente, a um pH de cerca de 7,2.

Em um modo de realização, em seguida à preparação do conjugado de forças pela diluição do conjugado no tampão de conjugado, o conjugado de forças é seco sobre uma almofada de conjugado, por secagem a vácuo. A almofada de conjugado é, preferencialmente, cortada em tiras de tamanho apropriado para o uso na tira de teste. Nos exemplos abaixo, a almofada de conjugado é cortada em tiras de 5mm x 5mm. A almofada de conjugado é compreendida, preferencialmente, de fibra de vidro, folha de lixa, poliéster ou papel de celulose. Esses materiais são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis, por exemplo, a partir de Milipore, S&S e Whatman. Em um modo de realização preferido a almofada de conjugado é uma almofada de conjugado de fibra de vidro GFCP203000 (Milipore) disponível comercialmente.

Como descrito acima, o tampão de lavagem dissolve o conjugado seco e o faz fluir a partir da almofada de conjugado e ao longo da membrana de teste passando pela área de teste e pela área de controle. A membrana de teste pode ser de qualquer material ao qual uma proteína ou outro agente de ligação possa ser incorporado, seja covalentemente ou não-covalentemente, e ao longo do qual o conjugado possa fluir com o tampão de lavagem. A membrana de teste é, preferencialmente, uma membrana de nitro-celulose. Outras membranas com taxas de fluxo mais altas ou mais baixas podem ser selecionadas para o uso como membrana de teste por alguém experiente na técnica com base em fatores tais como a sensibilidade desejada e os tempos e custos de teste.

Quando o conjugado flui com o tampão de lavagem pela membrana, ele contata a área de teste. Se o analito de interesse está presente e ligado para o agente de ligação sobre a área de teste, o conjugado no tampão se ligará para o analito. O tampão de lavagem compreendendo conjugado que não aglutina na área de teste continuará a fluir pela membrana para a área de controle. O conjugado ligará para o agente de ligação de controle. O tampão de lavagem também carregará a amostra não aglutinada das áreas de teste e de controle. O tampão de lavagem que inclui o conjugado não ligado e a amostra não ligada fluirá, então, para uma almofada absorvente que está em contato com a extremidade a jusante da membrana. A almofada absorvente pode ser feita de qualquer material absorvente conhecido na técnica. Preferencialmente, a almofada absorvente é um papel absorvente, tal como o papel S&S 900™. Outros papéis absorventes são bem conhecidos na técnica e podem ser escolhidos pelo técnico experiente dependendo da configuração final da tira de teste. O tampão de lavagem pode continuar a fluir através da almofada absorvente e para um papel absorvente que está em contato com a almofada absorvente. O papel absorvente é usado, preferencialmente, se uma grande quantidade de tampão deve ser absorvida.

Um tablete dessecante de peneira molecular também pode ser incorporado na tira de teste. Em um modo de realização, o tampão com o conjugado não ligado flui a partir do papel absorvente para o tablete dessecante com a qual o papel está em contato. O tablete dessecante retém o fluido absorvido e evita o retomo de fluxo para a tira de teste. O tablete dessecante também pode manter a tira de teste seca anteriormente ao uso. Um tablete dessecante preferido é um tablete Tri-Sorb de 0,395g, disponível a partir da Sud-Chemie (número do produto 43-01). O técnico experiente pode selecionar o tamanho e o material apropriado para a almofada absorvente, papel absorvente e tablete dessecante dependendo da configuração final da tira de teste, incluindo o volume total da amostra que será usada. A inteira tira de teste está contida, preferencialmente, dentro de um alojamento, tal como um alojamento plástico. Como descrito acima, em um modo de realização o alojamento compreende uma janela de amostra através da qual a amostra pode ser adicionada à membrana contendo as áreas de teste e de controle. O alojamento também pode compreender uma janela de tampão através da qual tampão pode ser aplicado à almofada de tampão ou à membrana. O alojamento também pode compreender uma janela de indicador de volume, através da qual um sinal pode ser visto indicando que um volume de amostra suficiente contatou a área de teste. Um volume de amostra suficiente é um volume de amostra que se estima contenha bastante analito de interesse, se presente, que um sinal visível será produzido no teste quando da conclusão do teste se o analito estiver presente na amostra. Por exemplo, para um teste detectar hCG na urina, um volume de amostra suficiente é de cerca de 200μ1 de urina.

Os resultados do teste são lidos, preferencialmente, a partir de cerca de 1 a cerca de 5 minutos após a adição do tampão de lavagem à tira de teste. Em um modo de realização, os resultados são lidos a partir de cerca de 2 a 4 minutos após a adição do tampão de lavagem, mais preferencialmente, a partir de cerca de 3 a 4 minutos após a adição do tampão de lavagem, em um modo de realização particularmente preferido, os resultados são lidos 1 minuto após a adição do tampão de lavagem. Como mostrado na Figura 7, para um resultado positivo, a linha de teste (300) se tomará visível. Uma tira de controle visível (400) indica que o teste funcionou corretamente. Como ilustrado na Figura 6, se a linha de controle (400) é visível, mas a linha de teste não é, é indicado um resultado negativo.

Exemplo 1, Construção de um Cartão de Teste de HIV

Um teste visual rápido de fluxo lateral para a detecção de anticorpos para o víms da imunodeficiência humana foi preparado. O arranjo das tiras de teste foi, essencialmente, como ilustrado na Figura 1.

As tiras de teste compreendiam um suporte plástico (6cm x 5mm) com adesivo em ambos os lados. O suporte plástico era entre cerca de 50,8 μτη e cerca de 508 μτη em espessura.

Uma linha de teste e uma linha de controle foram preparadas sobre membrana de nitro-celulose (Milipore HF09004) borrifando-se com um sistema de dispensa de bomba (Kinematic Automation). A linha de teste compreendia uma linha vertical de antígeno de HIV. O antígeno de HIV era uma mistura de antígenos de glico-proteína recombinante de HIV-1 (GP120 (cerca de 0,15mg/ml) e P24 (cerca de 0,lmg/ml)) e antígeno de glico-proteína recombinante de HIV-2 (GP36 (cerca de 0,5 mg/ml), a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de l,0mg/ml preparado em PBS compreendendo 5% de trealose. Uma quantidade total de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,5/zg de antígeno foi aplicada à área de teste em uma linha vertical.

Outras tiras de teste foram preparadas compreendendo um único antígeno de HIV-1 ou HIV-2 sobre a linha de teste.

Para todas as tiras de teste a área de controle compreendeu uma linha vertical de anticorpo de controle. O anticorpo de controle foi IgG de coelho diluído a lmg/mL em PBS compreendendo 5% de Trealose. Uma quantidade total de antígeno de controle suficiente para produzir uma linha de controle visível quando da ligação de conjugado foi aplicada à área de controle.

Para cada tira de teste, a membrana de nitro-celulose apropriada foi cortada a um tamanho de cerca de 2,5cm x 5mm e incorporada ao suporte plástico. A proteína A incorporada ao ouro coloidal, disponível comercialmente a partir de Sigma, foi usada como o conjugado para o teste. O conjugado foi diluído em tampão de conjugado a uma concentração de, aproximadamente, 3 OD/ml. O tampão de conjugado compreendeu 0.25% de HEPES, 0,85% de cloreto de sódio, 0,1% de azido de sódio, 0,1% de EDTA, 0,1% de caseína, 1% de albumina de soro bovina, 1% de manitol, 5% de sacarose, e 0,1% de Triton X100. O tampão foi ajustado para um pH de 7,2. O conjugado foi aplicado a uma almofada de conjugado de fibra de vidro (Milipore GFCP203000), a qual foi seca e cortada em tiras de 5mm x 5mm. Uma tira foi incorporada à extremidade da membrana de nitro-celulose mais próxima à área de teste de cada tira de teste.

Uma almofada de tampão de papel de vidro Whatman GF/DVA (2cm x 5mm) foi, então, incorporada à almofada de conjugado seca de cada tira de teste para servir como almofada de tampão.

Uma almofada absorvente (2cm x 5mm) feita de papel S&S 900 foi incorporada à extremidade da membrana de nitro-celulose mais próxima à área de controle e um papel absorvente (2,5cm x 5mm; S&S 470) adicional foi incorporado à almofada absorvente. O papel absorvente estava, por sua vez, em contato com um tablete dessecante de 0,395g (Tri-Sorb, Sud-Chemie).

A tira de teste foi colocada em um alojamento plástico para produzir um cartão de teste semelhante àquele ilustrado nas Figuras 1-6. O alojamento plástico (10) compreendeu uma janela de teste (20) que expôs a área de teste (140) e a área de controle (150), bem como uma janela de tampão (30) diretamente sobre a almofada de tampão. O alojamento plástico também foi etiquetado para indicar a localização da linha de teste e da linha de controle.

Os cartões de teste foram embalados individualmente em folha.

Exemplo 2. Teste para HIV

Soro ou plasma foi preparado a partir de uma amostra de sangue total obtida de um paciente a ser testado para HIV usando-se técnicas de venipuntura apropriadas. As amostram foram armazenadas de 2°C a 8°C e usadas dentro de 24 horas ou congeladas a —20°C para o uso em 2 semanas. As amostras congeladas foram descongeladas antes do uso.

Um cartão de teste de HIV como descrito no Exemplo 1, compreendendo uma mistura de antígenos de HIV-1 e HIV-2 sobre a área de controle, foi removido da embalagem em folha.

Aproximadamente 5μΕ de tampão de amostra compreendendo 0,025% de HEPES e 0,2% de azido de sódio foram aplicados à membrana através do centro da janela de cartão de teste.

Uma pipeta de amostra contendo soro ou plasma a ser testado foi mantida em uma posição vertical sobre a janela de teste no cartão de teste e 5μί^ de amostra foram colocados por cima da membrana no centro da janela.

Quatro gotas de solução de tampão de lavagem (0,025% de HEPES, 0,85% de cloreto de sódio, 0,1% de EDTA, 1% de manitol, 0,1% de caseína, 0,1% de Triton XI00, pH de 7,2) foram adicionadas à almofada de tampão. Após 3 minutos, se a reação não estava limpa 1 gota adicional de tampão era adicionada à almofada de tampão.

Os resultados do teste foram lidos a partir de 1 a 5 minutos após a adição do primeiro tampão.

Como mostrado na Figura 5, um resultado positivo compreende duas linhas visíveis cmzando a janela de amostra: uma linha de teste (140) e uma linha de controle (150). Um resultado positivo é obtido se duas linhas são visíveis, mesmo se uma das linhas é mais escura do que a outra. Um resultado negativo é indicado por uma linha de controle única visível através da janela de amostra, como ilustrado na Figura 6.

Exemplo 3. Cartão de Teste de HCV

Uma tira de teste para o diagnóstico do vírus da hepatite C foi preparada como no Exemplo 1. Entretanto, uma mistura de antígeno de hepatite C compreendendo essência (0,3mg/ml), NS3 (0,4mg/ml), e NS4 (0,lmg/ml) foi borrifada em uma linha de teste sobre a membrana para produzir a área de teste, em vez do antígeno de HIV. Um total de cerca de 0,4/tg de mistura de antígeno de HCV foi aplicada na linha de teste. IgG de coelho diluído a lmg/ml foi borrifado em uma linha de controle.

Exemplo 4. Teste para HCV

Um cartão de teste de HCV como descrito no Exemplo 3, compreendendo um antígeno de HCV sobre a área de teste, foi removido da embalagem em folha.

Aproximadamente 5μΕ de tampão de amostra compreendendo tampão de fosfato e 0,2% de azido de sódio foram aplicados à membrana através do centro da janela de cartão de teste.

Soro ou plasma foi preparado a partir de uma amostra de sangue total. Uma pipeta de amostra contendo soro ou plasma a ser testado foi mantida em uma posição vertical sobre a janela de teste no cartão de teste e 5μΕ de amostra foram colocados por cima da membrana no centro da janela.

Quatro gotas de solução de tampão de lavagem (0,025% de fosfato, 0,85% de cloreto de sódio, 0,1% de EDTA, 1% de manitol, 0,1% de caseína, 0,1% de Triton XI00, pH de 7,2) foram adicionadas à almofada de tampão. Após 3 minutos, se a reação não estava limpa 2 gotas adicionais de tampão eram adicionadas à almofada de tampão.

Como mostrado na Figura 5, um resultado positivo compreende duas linhas visíveis cruzando a janela de amostra: uma linha de teste (140) e uma linha de controle (150). Um resultado positivo é obtido se duas linhas são visíveis, mesmo se uma das linhas é mais escura do que a outra. Um resultado negativo é indicado por uma linha de controle única visível através da janela de amostra, como ilustrado na Figura 6.

Exemplo 5. Teste de Gravidez Testes visuais rápidos de fluxo lateral para gravidez são preparados. O arranjo das tiras de teste foi, essencialmente, como ilustrado na Figura 7.

Cada tira de teste compreende um suporte plástico (6cm x 5mm) com adesivo em ambos os lados. O suporte plástico está entre cerca de 50,8 pm e cerca de 508 pm em espessura.

Uma linha de teste e uma linha de controle são preparadas sobre membrana de nitro-celulose (Milipore HF09004) borrifando-se com um sistema de dispensa de bomba (Kinematic Automation). A linha de teste compreende uma linha vertical de um anticorpo para a gonadotropina coriônica humana (hCG), preferencialmente um anticorpo mono-clonal. Anticorpos para hCG são amplamente disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir da Research Diagnostics Inc. (RDI-CBL74; New Jersey, US), Charles River Labs e outras fontes ou podem ser preparados usando-se procedimentos padrão. Uma quantidade total de a partir de cerca de 0,2 a cerca de 1/xg de anticorpo é aplicada à área de teste em uma linha vertical. A linha de controle compreende uma linha vertical de proteína A. Uma quantidade total de proteína A suficiente para produzir um sinal visível quando da ligação de conjugado é aplicada à linha de controle, tipicamente, cerca de 0,25/rg.

Para cada tira de teste, a membrana de nitro-celulose apropriada foi cortada a um tamanho de cerca de 2,5cm x 5mm e incorporada ao suporte plástico.

Um segundo anticorpo para hCG é incorporado a ouro coloidal para o conjugado para o teste. Conjugados de ouro coloidal-anticorpo de hCG estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir da Research Diagnostics Inc. Altemativamente, conjugados de anticorpo de hCG podem ser preparados usando-se métodos bem conhecidos (ver, por exemplo, a patente US 6.485.982, incorporada aqui a título de referência). O conjugado é diluído em tampão de conjugado a uma concentração de, aproximadamente, 3 OD/ml. O tampão de conjugado compreende 0.25% de HEPES, 0,85% de cloreto de sódio, 0,1% de azido de sódio, 0,1% de EDTA, 0,1% de caseína, 1% de albumina de soro bovina, 1% de manitol, 5% de sacarose, e 0,1% de Triton XI00. O tampão é ajustado para um pH de 7,2. O conjugado é aplicado a uma almofada de conjugado de fibra de vidro (Milipore GFCP203000), a qual foi seca e cortada em tiras de 5mm x 5mm.

Uma almofada de tampão de papel de vidro Whatman GF/DVA (2cm x 5mm) é, então, incorporada à almofada de conjugado seca de cada tira de teste para servir como almofada de tampão.

Uma almofada absorvente (2cm x 5mm) feita de papel S&S 900 é incorporada à extremidade da membrana de nitro-celulose mais próxima à área de controle e um papel absorvente (2,5cm x 5mm; S&S 470) adicional foi incorporado à almofada absorvente. O papel absorvente está, por sua vez, em contato com um tablete dessecante (por exemplo, Tri-Sorb, Sud-Chemie), que é capaz de absorver uma porção significativa do volume de amostra e, desse modo, puxar a amostra e o analito pela área de teste.

Azul de metileno, ou um outro indicador, é depositado sobre uma das almofadas absorventes ou papel absorvente, a jusante da área de teste. O movimento desse indicador de volume é um sinal de que amostra suficiente contatou a área de teste para permitir um teste acurado. A tira de teste é colocada em um alojamento plástico para produzir um cartão de teste. O alojamento plástico compreende uma janela de teste sobre a área de teste e a área de controle, para permitir a visualização dos resultados de teste. O alojamento também compreende uma janela de indicador de volume, através da qual o movimento do indicador de volume pode ser observado.

Em alguns cartões de teste, um copo de amostra é incorporado sobre a janela de teste. O copo de amostra compreende um recipiente para reter a amostra com uma saída para permitir à amostra fluir para a área de aplicação de amostra da membrana de teste através da janela de amostra. O copo de amostra também pode compreender um filtro na saída. Após a adição da amostra à membrana, o copo é removido de modo que os resultados do teste possam ser vistos.

Em outros cartões de teste, está presente uma mecha que se projeta a partir da extremidade ou lado do alojamento. A mecha provê um caminho ao longo do qual a amostra pode fluir para a área de aplicação de amostra e para a área de teste. O alojamento também tem um mecanismo que permite à almofada de conjugado ser levada a comunicação fluida com a membrana.

Em alguns cartões de teste uma ampola contendo tampão de lavagem também é localizada no alojamento a montante da almofada de conjugado. Em outros cartões de teste o tampão é adicionado à almofada de tampão através de uma janela de tampão. A ativação do mecanismo que leva a almofada de conjugado ao contato com a membrana de teste quebra a ampola, permitindo à tampão fluir para a almofada de conjugado. Preferencialmente, cerca de 5 gotas de tampão de lavagem contatam a almofada de conjugado. A ativação do mecanismo também remove o copo de amostra ou a mecha do alojamento. O alojamento plástico é etiquetado para indicar a localização da linha de teste e da linha de controle na janela de amostra.

Exemplo 6. Uso do Teste de Gravidez com Copo de Amostra Testes de gravidez de visualização rápida de fluxo lateral com um copo de amostra são preparados como descrito no Exemplo 5. A urina do sujeito é colhida e aproximadamente 500μ1 são adicionados a um copo de amostra, a qual é incorporada ao cartão de teste acima da janela de amostra. Quando uma cor azul é observada na janela de indicador de volume o mecanismo é ativado trazendo a almofada de conjugado para comunicação fluida com a membrana. Isso quebra a ampola que contém o tampão e inicia o teste. O copo de amostra é removido e os resultados do teste são visualizados na janela de amostra a partir de 1 a 5 minutos mais tarde.

Como mostrado na Figura 5, um resultado positivo compreende duas linhas visíveis cruzando a janela de amostra: uma linha de teste 140 e uma linha de controle 150. Um resultado positivo é indicado se duas linhas são visíveis, mesmo se uma das linhas é mais escura do que a outra. Um resultado negativo é indicado por uma linha de controle 150 única visível através da janela de amostra, como ilustrado na Figura 6.

Exemplo 6. Uso do Teste de Gravidez com Mecha Testes de gravidez de visualização rápida de fluxo lateral com uma mecha são preparados como descrito no Exemplo 5. O sujeito coloca a mecha em seu fluxo de urina. Uma cor azul observada na janela de indicador de volume indica que um volume de amostra suficiente contatou a área de teste.

Um mecanismo no alojamento é ativado, trazendo a almofada de conjugado para comunicação fluida com a membrana. Isso também quebra a ampola que contém o tampão dentro do alojamento e inicia o teste fazendo o tampão fluir para a almofada de conjugado. A mecha é removida e os resultados do teste são visualizados na janela de amostra a partir de 1 a 5 minutos mais tarde.

Como mostrado na Figura 5, um resultado positivo compreende duas linhas visíveis cruzando a janela de amostra: uma linha de teste 140 e uma linha de controle 150. Um resultado positivo é indicado se duas linhas são visíveis, mesmo se uma das linhas for mais escura do que a outra. Um resultado negativo é indicado por uma linha de controle única visível através da janela de amostra, como ilustrado na Figura 6.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a certos modos de realização preferidos, será entendido por aqueles experientes na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos por elementos do mesmo sem se afastar do escopo da invenção. Em adição, muitas modificações podem ser feitas para adaptar os ensinamento neste relatório a uma situação particular sem se afastar do escopo essencial da invenção. Portanto, pretende-se que a invenção não seja limitada a qualquer modo de realização particular revelado, mas que a invenção inclua todos os modos de realização que recaiam dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Dispositivo de imunodiagnóstico para determinar a presença de um analito de interesse em uma amostra líquida, caracterizado pelo fato de que compreende: uma almofada de tampão (110) para receber uma solução de tampão; uma almofada de conjugado (120) em comunicação fluida com a almofada de tampão (110), a referida almofada de tampão (120) compreendendo conjugados secos dispostos na mesma, os conjugados sendo imobilizáveis pela solução de tampão, em que os conjugados compreendem rótulos visual mente detectáveis e agentes de ligação capazes de se ligar ao analito; uma membrana de teste (130) compreendendo uma área de teste (140), a área de teste (140) estando em contato direto com a amostra e compreendendo um agente de ligação ao analito imobilizado na mesma para formar um complexo imobilizado com o analito; um depósito de filtro removível (190) compreendendo um papel de filtro (200), em que o depósito de filtro removível (190) está ligado ao dispositivo e o papel de filtro (200) está localizado acima da área de teste (140); e em que a almofada de conjugado é ligeiramente móvel entre um estado sem comunicação fluida com membrana de teste (130) e um segundo estado em comunicação fluida com a membrana de teste (130); e o dispositivo fornece um caminho de fluxo ao longo do qual a solução de tampão flui para a almofada de conjugado (120) para mobilizar os conjugados e formar uma mistura compreendendo o tampão e conjugados mobilizados quando a almofada de conjugado (120) está no primeiro estado, e ao longo do caminho de fluxo no qual a mistura pode fluir para a membrana de teste (130) e a área de teste (140) quando a almofada de conjugado (120) está no segundo estado, em que a solução de tampão flui para a membrana de teste (130) e a solução de tampão lava componentes não ligados para fora da área de teste (140).

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um anticorpo para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o agente de ligação ao analito é selecionado do grupo que consiste em um antígeno de HIV-1 e um antígeno de HIV-2.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os rótulos visualmente detectáveis são selecionados do grupo que consiste em ouro coloidal, prata coloidal, negro coloidal e partículas de látex tingidas.

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os rótulos visualmente detectáveis são ouro coloidal.

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ouro coloidal tem um tamanho de partícula de cerca de 20 a cerca de 80 nanômetros.

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido conjugado compreende proteína A.

7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um anticorpo.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um anticorpo para o vírus da imunodeficiência humana (HIV).

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um anticorpo para o vírus da hepatite C (HCV).

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um antígeno.

11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é uma gonadotropina coriônica humana (hCG).

12. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende proteína A conjugada a ouro coloidal.

13. Dispositivo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende um anticorpo conjugado a ouro coloidal.

14. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma área de controle (150) localizada a jusante da área de teste (140), a área de controle (150) compreendendo um agente de ligação de controle imobilizado capaz de se ligar aos conjugados.

15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a área de controle (150) compreende IgG de coelho imobilizado.

16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a área de controle compreende proteína A imobilizada.

17. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a membrana de teste (130) compreende membrana de nitro-celulose.

18. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma saída de um recipiente (500) para receber a amostra de líquido compreende o papel de filtro (200).

19. Dispositivo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o recipiente (500) é removível da membrana de teste (130).

20. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma almofada absorvente (160) em comunicação fluida com a membrana (130) em uma posição a jusante da área de teste (140).

21. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo fato de que é para detecção de anticorpo anti-HIV em uma amostra, em que compreende um antígeno imobilizado ligado na referida área de teste (140), o antígeno imobilizado compreendendo cerca de 0,1 a cerca de 0,5 pg de antígeno de HIV; e um conjugado difusamente ligado na referida almofada de conjugado (120), e o conjugado é configurado para se ligar a um anticorpo.

22. Dispositivo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo fato de que o antígeno de HIV compreende um ou mais antígenos selecionados a partir do grupo que consiste de GP120, P24 e GP36.

23. Dispositivo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende a proteína A.

24. Dispositivo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína A é conjugada a ouro coloidal.

25. Método de detecção de um anticorpo de interesse em uma amostra líquida, caracterizado pelo fato de que compreende: o contato da área de teste (140) de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-24 com a amostra, onde a área de teste (140) compreende antígeno imobilizado que é específico para o anticorpo de interesse; e o contato subsequentemente da área de teste (140) com um conjugado configurado para se ligar ao anticorpo de interesse.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende a proteína A.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a proteína A é conjugada a ouro coloidal.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse é um anticorpo de anti-HIV.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a área de teste (140) compreende antígeno imobilizado selecionado a partir do grupo que consiste de antígenos de HIV-1 e HIV-2.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o antígeno de HIV-1 é selecionado a partir do grupo que consiste de GP120 e P24.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o antígeno de HIV-2 é GP36.

32. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a amostra líquida é selecionada a partir do grupo que consiste de sangue total, soro e plasma.

33. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um teste de gravidez de imunodiagnóstico, em que a referida área de teste (140) compreende um primeiro anticorpo de anti-hCG imobilizado; e a referida almofada de conjugado (120) compreende um conjugado configurado para ligar o hCG.

34. Dispositivo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, um copo para coletar uma amostra de urina.

35. Dispositivo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende um segundo anticorpo de hCG.

36. Dispositivo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo de hCG é conjugado a ouro coloidal.