KR102566305B1 - 개선된 분석물 검출을 위한 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
개선된 분석물 검출을 위한 분석 방법, 측면 유동 분석 검사 스트립, 및 장치가 본원에 개시된다. 표적에 대한 분석물 결합은 용액상(solution phase)에서 그리고 표적이 표면 상에 고정화되어 수행되어, 개선된 분석물 검출이 이루어진다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 8일에 출원된 미국 출원 제62/542,612호에 대한 우선권을 주장하고; 그 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 개선된 분석물 검출을 위한 분석 방법, 측면 유동 분석 스트립(lateral flow assay strip) 및 장치에 관한 것이다.
면역 분석법은 생성된 항체 시약의 특이성 및 선택성에 기초하여 생물학적 관심 분자를 정량화하기 위해 사용된다. 현장 검사의 경우, 면역 분석법은 종종 측면 유동 분석 포맷으로 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,192,555호 및 미국 특허 제6,303,081호 참조하도록 한다. 고체상(solid phase) 측면 유동 장치는 분석물-표적 쌍의 멤버를 결합하는 고체 지지 스트립을 포함한다. 나일론, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 유리 섬유, 종이, 및 기타 다공성 중합체와 같은 다공성 재료가 종종 고체 지지 스트립으로서 사용된다. 관심 분석물을 함유할 수 있는 샘플은 분석에 걸쳐 고체 지지체를 따라 유동한다. 분석물 또는 그 유도체가 고정화된 표적에 결합되고 분석물 또는 그 유도체의 존재가 검출되는 것을 포함하여 몇 개의 절차가 이용될 수 있거나, 또는 분석물 또는 그 유도체는 반응하여 생성물을 형성한 후 검출될 수 있다.
종래의 측면 유동 분석 스트립은 검사 라인에서 지향된 표적 분자에 의한 샘플 내 분석물의 포획을 사용하여 다양한 분석물을 검출하는데 사용되었다. 예를 들어, 하나의 HIV-1/2 측면 유동 분석 스트립에서, 스트렙타비딘(SA)을 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 앵커 단백질에 접합시키고 니트로셀룰로오스의 검사 라인 위치에 접합체(conjugate)에 대해 줄무늬를 생성(striping)함으로써 검사 라인이 제조되었다. 예를 들어, 미국 특허 제8,062,908호, 미국 특허 제7,192,555호, 미국 특허 제6,303,081호, 미국 특허 제7,541,194호 및 OraQuick ADVANCE® Rapid HIV-1/2 항체 검사 패키지 인서트를 참조하도록 한다. SA-BSA 접합체는 검사 라인 상에서 비오티닐화된 펩티드의 높은 반응성 및 안정적인 제시를 허용하였다. 그 측면 유동 분석 스트립에서, 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위는, HIV-1 및 HIV-2 펩티드가 SA의 부위에 이미 존재하고 라인 상에서 유동할 때 양성 환자 샘플에서 항-HIV 항체를 포획하도록 미리 로딩되었다. 시료가 스트립 위로 이동하여 검사 라인을 만날 때, 시료가 검사 라인에서 니트로셀룰로오스 막 상에 고정화된 합성 펩티드 항원과 반응하는 항체를 함유하는 경우, 시료에 HIV-1 및/또는 HIV-2에 대한 항체의 존재를 정성적으로 나타내는 가시적인 신호가 나타날 것이다. id를 참조하도록 한다.
전형적인 측면 유동 분석 장치에서, 검사 존(test zone)에서 분석물의 특이적 포획은 분석물을 함유하는 액체 검사 샘플이 검사 존을 통해 이동하고 고체/액체 계면에서 그의 표적에 결합할 때에만 발생한다. 이러한 장치는 분석물이 용액에서 그의 표적에 결합하는 결합 단계를 추가함으로써 개선될 수 있으며, 이것이 본 발명의 주제이다.
본 발명은 일반적으로 개선된 분석물 검출을 위한 분석 방법, 측면 유동 분석 스트립 및 장치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 분석 방법은 액체 생물학적 샘플로부터 관심 분석물을 검출한다. 본 발명에 따른 분석 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 액체 생물학적 샘플을 액체상(liquid phase)의 적어도 하나의 리간드-표적 접합체(conjugate)와 접촉시키는 단계 - 리간드-표적 접합체는 분석물의 적어도 일부에 결합하여 리간드-표적-분석물 복합체를 형성함 - ;
b) 생물학적 샘플 내의 분석물 및 단계 a)로부터의 복합체를 수용체-표지(label) 접합체와 접촉시켜, 분석물-수용체-표지 복합체 및 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성하는 단계;
c) 리간드에 결합할 수 있는 포획제를 포함하는 표면 상에서 단계 b)로부터의 표지된 복합체를 포획하는 단계 - 포획제의 리간드 결합 부위의 일부는 리간드-표적 접합체에 의해 점유되어, 표면 상에 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성함 - ; 및
d) 표면 상에 포획된 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 검출하는 단계. 따라서, 표적에 대한 분석물 결합은 용액상(solution phase)의 표적 및 표면 상에 고정화된 표적에 의해 수행되어, 개선된 분석물 검출이 이루어진다.
본 발명의 분석 방법은 측면 유동 분석 스트립을 사용하는 측면 유동 분석일 수 있다. 본 발명에 따른 측면 유동 분석 스트립은 액체 생물학적 샘플로부터 관심 분석물을 검출하도록 설계된다. 본 발명에 따른 측면 유동 스트립은 다음을 포함한다:
샘플 수용 영역(sample receiving area);
선택적으로 리간드-표적 접합체를 함유하는, 샘플 수용 영역의 하류에 있는 차단제 영역(blocker area);
표지-수용체 접합체를 함유하는, 차단제 영역의 하류에 있는 접합체 영역(conjugate area);
리간드에 결합할 수 있는 고정화된 포획제를 포함하는 접합체 영역의 하류에 있는 검사 존(test zone) - 리간드 결합 부위의 일부는 리간드-표적 접합체에 의해 점유됨 - ;
선택적으로, 분석 완료를 표시하도록 검사 존의 하류에 있는 측면 유동 분석 스트립 상의 제어 존(control zone); 및
선택적으로, 측면 유동 분석 스트립과 유동 연통(flow communication)하고, 제어 존의 하류에 위치되는 흡수성 패드(absorbent pad).
본 발명에 따른 측면 유동 장치는 본 발명에 따른 측면 유동 스트립을 수용하는 분석 부분, 및 검사 존 및 선택적인 제어 존을 보기 위한 개구(opening)를 포함할 수 있다.
도 1은 측면 유동 분석을 실시하기 전에, 항체, 예시적인 목적으로 항-HIV 항체의 개선된 검출을 위해 본 발명에 따른 측면 유동 스트립[102]을 수용하는 대표적인 장치[100]를 도시한다. 생물학적 샘플의 항-HIV 항체는 편평한 패드 샘플 수집기[103] 상에 표시된다. 차단제 패드[104]는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 및 비오티닐화 rAg 펩티드를 포함하는 것으로 도시되어 있다. 접합체 패드[105]는 콜로이드성 금에 접합된 단백질 A를 포함하는 것으로 도시되어 있다. 셀룰로오스 막[106] 상의 검사 라인[107]은 고정화된 소 혈청 알부민 및 스트렙타비딘과 함께, 스트렙타비딘 상의 비오틴 결합 부위의 일부가 비오티닐화 HIV-1 및 비오티닐화 HIV-2 펩티드에 결합된 것으로 도시되어 있다. 제어 라인[108]은 고정화된 항-인간 항체와 함께 도시되어 있다.
도 2는 샘플이 검사 라인[107]에 도달함에 따라, 측면 유동 분석 동안 항-HIV 항체의 개선된 검출을 위한 본 발명에 따른 측면 유동 스트립[102]을 수용하는 대표적인 장치[100]를 도시한다. 항-HIV 항체를 함유하는 샘플이 차단제 패드[104]로 이동함에 따라, 항-HIV 항체의 일부는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 및 비오티닐화 rAg 펩티드에 결합한다. 샘플이 접합체 패드[105]로 이동함에 따라, 비오티닐화에 결합된 항-HIV 항체는 단백질 A-콜로이드성 금 접합체에 추가로 결합한다. 결합되지 않은 항-HIV 항체 또한 단백질 A-콜로이드성 금 접합체에 결합한다.
도 3은 샘플이 제어 라인[108]을 지나 흡수성 패드[109] 내로 유동할 때 측면 유동 분석을 수행한 후, 항-HIV 항체의 개선된 검출을 위한 본 발명에 따른 측면 유동 스트립[102]을 수용하는 대표적인 장치[100]를 도시한다. 검사 라인[107]에서, 스트렙타비딘과 복합체화된 비오티닐화 HIV-1 및 비오티닐화 HIV-2 펩티드는 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체를 포획한다. 또한 검사 라인[107]에서, 스트렙타비딘은 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체와 복합체화된 비오티닐화 펩티드의 복합체를 포획한다. 제어 라인[108]에서, 항-인간 항체는 생물학적 샘플에서 임의의 인간 항체를 포획한다. 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체는 제어 라인[108] 상에서 항-인간 항체에 결합할 때 보여질 수 있다.
도 2는 샘플이 검사 라인[107]에 도달함에 따라, 측면 유동 분석 동안 항-HIV 항체의 개선된 검출을 위한 본 발명에 따른 측면 유동 스트립[102]을 수용하는 대표적인 장치[100]를 도시한다. 항-HIV 항체를 함유하는 샘플이 차단제 패드[104]로 이동함에 따라, 항-HIV 항체의 일부는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 및 비오티닐화 rAg 펩티드에 결합한다. 샘플이 접합체 패드[105]로 이동함에 따라, 비오티닐화에 결합된 항-HIV 항체는 단백질 A-콜로이드성 금 접합체에 추가로 결합한다. 결합되지 않은 항-HIV 항체 또한 단백질 A-콜로이드성 금 접합체에 결합한다.
도 3은 샘플이 제어 라인[108]을 지나 흡수성 패드[109] 내로 유동할 때 측면 유동 분석을 수행한 후, 항-HIV 항체의 개선된 검출을 위한 본 발명에 따른 측면 유동 스트립[102]을 수용하는 대표적인 장치[100]를 도시한다. 검사 라인[107]에서, 스트렙타비딘과 복합체화된 비오티닐화 HIV-1 및 비오티닐화 HIV-2 펩티드는 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체를 포획한다. 또한 검사 라인[107]에서, 스트렙타비딘은 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체와 복합체화된 비오티닐화 펩티드의 복합체를 포획한다. 제어 라인[108]에서, 항-인간 항체는 생물학적 샘플에서 임의의 인간 항체를 포획한다. 단백질 A-콜로이드성 금 접합체와 복합체화된 항-HIV 항체는 제어 라인[108] 상에서 항-인간 항체에 결합할 때 보여질 수 있다.
본 발명은 개선된 분석물 검출을 위한 분석 방법, 측면 유동 분석 스트립 및 장치에 관한 것이다. 용액상에서 표적에 결합된 분석물과 고체상에서 표적에 결합된 분석물을 조합함으로써 개선된 분석물 검출이 달성된다. 본 발명에 따른 액체 생물학적 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 분석 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 액체 생물학적 샘플을 액체상의 적어도 하나의 리간드-표적 접합체와 접촉시키는 단계 - 리간드-표적 접합체는 분석물의 적어도 일부에 결합하여 리간드-표적-분석물 복합체를 형성함 - ;
b) 생물학적 샘플 내의 분석물 및 단계 a)로부터의 복합체를 수용체-표지 접합체와 접촉시켜, 분석물-수용체-표지 복합체 및 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성하는 단계;
c) 리간드에 결합할 수 있는 포획제를 포함하는 표면 상에서 단계 b)로부터의 표지된 복합체를 포획하는 단계 - 포획제의 리간드 결합 부위의 일부는 리간드-표적 접합체에 의해 점유되어, 표면 상에 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성함 - ; 및
d) 표면 상에 포획된 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 검출하는 단계.
본 발명에 따른 분석 방법은 분석물을 표적에 결합시켜 이를 표면에 가져오는 2 개의 메커니즘을 제공한다: i) 샘플의 분석물을 표면 고정화된 표적에 결합시키는 단계; 및 ii) 액체상에서 분석물을 리간드-표적 접합체에 결합시킨 후, 분석물-표적-리간드 복합체를 표면에 포획하는 단계. 후자에서, 리간드와 표면 상의 포획제 사이의 높은 친화성은 분석물-표적 복합체가 용액으로부터 추출되도록 보장한다. 이러한 메커니즘의 조합은 분석물을 포획하기 위해 표면 상에 고정화된 표적의 매우 능동적이고 안정적인 제시를 제공하고, 또한 액체상으로 결합하기 위한 유리한 용액 동역학(solution kinetics)을 허용한다. 용액에 추가의 결합 단계를 포함시킴으로써, 특히 더 느리게 형성되는 복합체가 형성되는데 더 많은 시간이 주어지면 분석 감도가 개선된다.
본 발명의 분석 방법에서, 분석은 측면 유동 분석 스트립 상에서 수행된다. 상기 방법은 측면 유동 분석 스트립을 현상 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 접촉 시, 현상 용액은 측면 유동 분석 스트립을 가로질러 이동한다. 본 발명의 방법에서, 액체 생물학적 샘플은 현상 용액에 배치되고, 생물학적 샘플을 포함하는 생성된 현상 용액은 분석 스트립을 가로질러 측면 유동 분석 스트립의 하류에 있는 지점들로 이동한다. 본 발명의 다른 방법에서, 액체 생물학적 샘플은 측면 유동 분석 스트립의 샘플 수용 영역 상에 배치되고, 현상 용액은 측면 유동 분석 스트립과 접촉하여, 생물학적 샘플이 분석 스트립을 가로질러 샘플 수용 영역으로부터 하류 지점들로 유동하는 것을 촉진한다.
본 발명의 분석 방법을 사용하여 분석을 위해 취해진 액체 생물학적 샘플은 관심 항체를 함유할 수 있는 생물학적 유체와 같은 임의의 액체 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 유체의 예는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 경구 유체(oral fluids), 땀, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수, 모유 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 경구 유체는 구강에 존재하는 액체이다. 경구 유체는 타액과 구강 점막 누출액의 혼합물이다. 타액은 침샘에서 생성된다. 구강 점막 누출액은 모세 혈관으로부터 볼 점막을 가로질러 입으로 들어간다. 경구 유체에는 병원체 및 항체가 모두 포함되어 있다. 경구 유체, 전혈, 혈장 및 혈청과 같은 생물학적 유체 샘플은 본 발명의 면역 분석에 사용 가능한 바람직한 유형의 샘플이다. 이들 각각은 당업계에 공지된 수단 및 기술을 사용하여 획득될 수 있다.
HIV 바이러스로부터의 감염과 같은 바이러스 감염은 임상 징후 및 증상 및/또는 역학적 위험 인자를 갖는 환자로부터의 전혈(정맥 또는 핑거 스틱), 혈청 및 혈장, 구강 유체(예를 들어, 타액 및 구강 점막 누출액), 소변, 정액 및 모유와 같은 액체 생물학적 샘플을 포함할 수 있는 다수의 매트릭스에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 구강 유체 샘플을 측정하기 위한 방법에서, 피험자에게 검사 장치를 전달하고, 장치의 편평한 패드로 타액을 수집하기 위해 상부 및 하부 잇몸을 한 번 면봉으로 닦도록 지시한다. 전혈을 측정하는 것에 관한 본 발명의 방법에서, 적절한 양의 혈액이 건강 관리 종사자에 의해 장치 상에 배치된다. 사용되는 액체 생물학적 샘플의 양은 액체 생물학적 샘플 및 분석 포맷에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 분석 방법에서, 분석물은 항체일 수 있다. HIV 바이러스로부터의 감염과 같은 바이러스 감염은 환자에서 항-HIV 항체의 생성을 초래한다. 바람직한 분석 방법에서, 항체는 항-HIV 항체이다. 항-HIV 항체는 HIV-1 또는 HIV-2에 대한 항체일 수 있다. 본 발명의 분석 방법은 HIV와 관련하여 설명되어 있지만, 본 발명의 분석 방법은 임의의 감염의 식별, 결정 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 분석 장치, 측면 유동 분석 스트립 및 방법은 생물학적 유체 샘플에서 사실상 임의의 분석물의 검출 (양성 또는 음성, 및/또는 정량)에 사용될 수 있다. 또한, 장치, 측면 유동 분석 스트립 및 방법은 하나 이상의 분석물을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석물에는 HIV에 대한 항체, HPV에 대한 항체, HCV에 대한 항체, 에볼라에 대한 항체, 뎅기열에 대한 항체, 지카에 대한 항체, 헬리코박터 파일로리에 대한 항체, 간염에 대한 항체, 홍역에 대한 항체, 간염 항원, 터포네메스(terponemes)에 대한 항체, 숙주 또는 감염원에 대한 항체, 카디오리핀, 레시틴, 콜레스테롤, 리포폴리사카라이드 및 시알산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 병리학의 세포 마커, 볼거리에 대한 항체, 풍진에 대한 항체, 코티닌, 코카인, 벤조일엑고닌, 벤조디자즈핀, 테트라하이드로칸나비놀, 니코틴, 에탄올 테오필린, 페니토인, 아세트아미노펜, 리튬, 디아제팜, 노르트립틸린, 세코바르비탈, 페노바르비탈, 테오필린, 테스토스테론, 에스트라디올, 17-하이드록시프로게스테론, 프로게스테론, 티록신, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 변형 성장 인자 알파, 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II, 성장 호르몬 분비 억제 인자, IGA, 성 호르몬 결합 글로불린, 포도당, 콜레스테롤, 카페인, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, PSA, 및 DHEA-결합 당단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 관심 분석물 또는 분석물들에 따라, 분석물에 결합하는 표적 및 수용체는 당업계에 알려진 결합제들로부터 선택될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 항체는 면역 글로불린 유전자 또는 면역 글로불린 유전자들 또는 이것의 일부에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 복합체를 지칭한다. 인식된 면역 글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 구역(mu constant regions), 그리고 무수한 면역 글로불린 가변 구역 유전자를 포함한다. 경쇄(Light chains)는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄(Heavy chains)는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 또한 면역 글로불린 등급 (아이소 타입), IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다. 중쇄의 불변 도메인은 항체의 Fc 구역을 구성한다. 항체의 Fc 부분은 항체 등급을 결정한다.
전형적으로, 항체는 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직에 특이적으로 결합하여 이에 따라 이에 대해 상보적인 것으로 정의되는 영역을 그의 N-말단 표면 또는 공동(cavity)에 갖는 면역 글로불린이다. 항체는 다클론성이거나 또는 단일 클론성일 수 있다. 항체는 완전한 면역 글로불린 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 이의 일부는 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 항체는 또한 재조합 방법에 의해 제조된 키메라 항체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 항원은 관심 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 화합물이다. 항원과 관심 항체 사이의 특이적 결합은 두 분자가 그들의 서로의 결합이 다른 분석법 또는 샘플 성분의 결합을 구별할 수 있도록 관련되어 있다는 것을 의미한다.
표적은 분석물에 결합하는 성분을 지칭한다. 본 발명의 분석 방법에서, 분석물은 표적에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 분석 방법에서, 표적은 항원일 수 있다. 예를 들어, 분석물이 항체일 때, 표적은 이의 동족 항원일 수 있다. 대안적으로, 분석물이 항원인 경우, 표적은 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 바람직하게는, 표적은 펩티드이다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 표적은 HIV-1 펩티드, HIV-2 펩티드, rAg 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 항-HIV-1 항체는 HIV-1 펩티드 및 rAg에 특이적으로 결합한다. 항-HIV-2 항체는 HIV-2 펩티드에 특이적으로 결합한다. HIV-1 및 HIV-2 합성 펩티드는 엔벨로프(envelope) (gp120, 41) 또는 p24 또는 p17의 구역 또는 바이러스로부터의 다른 공지된 단백질에 해당할 수 있다.
용어 rAg는 임의의 항원성 HIV 재조합 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,156,949호, 미국 특허 제5,217,861호, 미국 특허 제6,428,952호, 미국 특허 제5,830,641호, 미국 특허 제5,886,319호, 및 미국 특허 제6,544,728호은 HIV에 대한 항체에 대한 면역 분석에 유용한 재조합 항원을 설명한다. SEQ ID NO 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 ORA-1, HIV-1 (hSOD1-HIV1gp120-41)로도 알려진 재조합 항원 rAg에 대해 인코딩한다. SEQ ID NO 2는 rAg에 대한 아미노산 서열이다. HIV의 성숙 엔벨로프 단백질(Env)은 비-공유적으로 결합된 gp120-gp41 이질 이량체의 동종 삼량체로 구성된다. 생성된 복합체는 바이러스 표면에서 스파이크로서 돌출된다. 표면 단백질 gp120은 인간 CD4, CCR5 및 CXCR4와 상호 작용하여, P4HB/PDI-CD4-CXCR4-gp120 복합체를 형성한다. rAg의 이러한 재조합 디자인은 HIV-1 펩티드 서열 상에서 확장되고 이를 포함한다. rAg 항원은 항-HIV-1 항체에 의해 인식된다.
본 발명의 방법에서, 표적은 리간드에 접합되어, 리간드-표적 접합체를 형성한다. 리간드-표적 접합체와 분석물의 결합은 리간드-표적-분석물 복합체의 형성을 초래한다. 본 발명의 방법 중 단계 a)에서, 분석물의 일부 또는 전부는 리간드-표적 접합체에 결합한다. 모든 분석물이 리간드-표적 접합체에 결합하는 것이 아니라면, 분석물의 일부는 결합되지 않은 상태로 유지된다.
리간드는 리간드와 관련된 재료를 표면 고정화된 포획제로 향하게 하는 역할을 한다. 예를 들어, 리간드-표적-분석물 복합체 내의 리간드는 복합체를 고정화된 포획제로 안내하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 방법에서, 리간드는 비오틴이고, 리간드-표적 접합체는 비오티닐화된 펩티드이다. 펩티드의 비오티닐화는 당업계에 공지된 방법 및 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, NHS-비오틴을 사용하여 펩티드의 1 차 아민기를 표지할 수 있다. 비오티닐화의 정도는 4'-하이드록시아조벤젠-2-카르복실산 시약을 사용하여 검사될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 리간드-표적 접합체는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 비오티닐화 rAg 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 리간드-표적-분석물 복합체는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 또는 비오티닐화 rAg에 결합된 항-HIV 항체의 복합체이다. 비오틴은 스트렙타비딘과 강한 비-공유 상호 작용이 가능하다. 본 발명의 방법에서, 스트렙타비딘은 바람직한 포획제이다.
액체 생물학적 샘플을 리간드-표적 접합체와 접촉시키는 단계는 액체상에서 이루어진다. 바람직하게는, 리간드-표적 접합체는 측면 유동 분석 스트립 상에, 차단제 패드 상에 존재하고, 액체가 리간드-표적 접합체와 접촉함에 따라, 차단제 패드로부터 용리된다. 측면 유동 분석 스트립의 제조 동안, 리간드-표적 접합체는 차단제 패드 상에 배치되고, 막 상에서 건조될 수 있다. 액체상의 분석물이 차단제 패드를 가로질러 이동함에 따라, 리간드 표적 접합체는 차단제 패드로부터 액체상으로 용리되고, 분석물에 결합하기 위해 이용 가능하다. 본 발명의 방법에서, 리간드-표적 접합체는 액체상 결합을 위해 차단제 패드 상에 배치된다. 본 발명의 다른 방법에서, 리간드-표적 접합체가 현상 용액에 첨가된다. 본 발명의 또 다른 방법에서, 리간드-표적 접합체는 차단제 패드 상에 그리고 현상 용액 내에 배치된다.
표지는 그 자체로 가시적이거나 또는 시각적 또는 도구적 수단에 의해 검출될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 특정 표지의 선택은 본 발명에 중요하지 않지만, 그러나 표지는 그 자체로 검출 가능한 신호를 생성할 수 있어야 하거나, 또는 기기에 의해 검출될 수 있어야 하거나, 또는 효소/기질 신호 생성 시스템과 같은, 하나 이상의 추가의 신호 생성 성분과 관련하여 검출될 수 있어야 한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 표지 유형의 선택은 검출될 분석물 및 원하는 검출 수단의 고려를 포함한다. 검출 가능한 표지의 검출은 선택된 모이어티(moiety) 또는 시약에 의존할 것이며, 예를 들어 육안 검사, 자외선 및 가시광선 분광 광도법, 형광 측정법, 방사능 계수법 등과 같은, 종래 기술에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 시각적으로 검출 가능한 표지가 사용된다. 이를 통해 추가적인 신호 생성 성분에 대한 필요성 없이도 샘플에 존재하는 분석물의 존재 또는 양을 직접 시각적으로 또는 기기에 의해 판독할 수 있다. 관련 기술 분야에 공지되어 있고 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다양한 표지는 그 자체로 가시적이거나 또는 화학적 또는 물리적 수단을 통해 신호를 생성하는 표지를 포함한다. 이러한 표지는 효소 및 기질, 발색체, 촉매, 형광 화합물, 화학 발광 화합물, 및 방사성 표지를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 적합한 표지는 콜로이드성 금과 같은 콜로이드성 금속 입자, 셀레늄 또는 텔루륨과 같은 콜로이드성 비-금속성 입자, 염색된 플라스틱 또는 변색된 미생물과 같은 염색된 또는 착색된 입자, 유기 중합체 라텍스 입자 및 리포좀, 착색된 비드, 중합체 마이크로캡슐, 낭(sacs), 적혈구, 파열 적혈구, 또는 직접적으로 보이는 물질을 함유하는 다른 소포 등과 같은 미립 표지들을 포함한다. 미국 특허 제4,313,734호는 항체에 대한 표지로서 금 졸의 사용을 설명하고 있다. 본 발명에 따른 바람직한 분석 방법에서, 검출 가능한 표지는 금속 콜로이드 입자, 예를 들어 금 미세 입자 또는 금 나노 입자이며, 이들은 사람의 눈뿐만 아니라 기구 판독에 의해서도 볼 수 있다. 본 발명의 분석 방법에서, 검출 가능한 표지로서 사용되는 콜로이드 입자는 입자 크기 직경이 20 nm 내지 80 nm 이다. 기기 판독 분석의 경우, 입자의 농도는 분광 광도계를 사용하여 특정 파장에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 측정된다. 이 경우, OD는 표지된 항원의 총량의 척도로 사용된다. 본 발명에 따른 분석 방법에서, 표지된 항원의 양은 바람직하게는 완전한 표지를 허용하기 위해 검출되는 항체를 초과해야 한다.
수용체-표지 접합체는 검출 가능한 복합체를 생성하기 위해 분석물에 결합하는 역할을 한다. 분석물에 따라, 수용체는 분석물에 특이적으로 또는 비-특이적으로 결합하는 임의의 분자일 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 수용체는 단백질 A이다. 단백질 A는 여러 면역 글로불린의 Fc 부분에 결합할 수 있다. 본 발명의 분석 방법에서, 수용체-표지 접합체는 단백질 A-금 콜로이드 접합체이다. 단백질은 당업계에 공지된 기술을 통해 콜로이드성 금에 부착될 수 있다. 단백질 A-금 콜로이드 접합체는 시그마 알드리치®(Sigma Aldrich®)로부터 상업적으로 구할 수 있으며, 예를 들어 P-6730이 있다. 수용체-표지 접합체의 다른 예는 금 접합된 항원 (브리징 분석) 및 이차 항-인간 중쇄 또는 경쇄 특이적 금 접합체를 포함한다.
본 발명의 분석 방법에서, 수용체는 또한 분석물에 결합한다. 수용체는 분석물이 또한 표적에 결합되어 있는지 여부에 관계없이 분석물에 결합한다. 따라서, 수용체-표지 접합체는 분석물에 결합하여 분석물-수용체-표지 복합체를 형성하고, 수용체-표지 접합체는 또한 리간드-표적-분석물-복합체에 결합하여 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성한다. 수용체 표지를 분석물 또는 리간드-표적-분석물 복합체와 반응시키는 단계는 액체상에서 이루어진다. 측면 유동 분석 스트립을 사용하는 본 발명의 방법에서, 바람직하게는, 리간드-표적 접합체는 접합체 패드 상에 존재하고, 액체가 수용체-표지 접합체와 접촉함에 따라, 접합체 패드로부터 용리된다. 측면 유동 분석 스트립의 제조 동안, 수용체-표지 접합체는 접합체 패드 상에 배치되고, 막 상에서 건조될 수 있다. 액체상의 분석물이 접합체 패드를 가로질러 이동함에 따라, 수용체-표지 접합체는 접합체 패드로부터 액체상으로 용리되고, 분석물 및 분석물-표적-리간드 복합체에 결합하기 위해 이용 가능하다. 본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체는 단백질 A 접합된 콜로이드성 금에 결합된 항체에 결합된 비오티닐화 펩티드이다.
본 발명의 분석 방법에서, 포획제는 리간드에 결합하고, 분석물을 포함하는 표지된 복합체를 검출을 위한 고체 지지체 상에 제공하는 역할을 한다. 바람직하게는, 포획제는 고체 지지체 상에 고정화된다. 포획제는 고정화될 수 있거나, 또는 이들이 용액으로부터 분리될 수 있게 하는 다른 성분에 부착될 수 있다. 포획제의 고정화 및 부착 및 배치는 분석 포맷에 의존한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 분석 방법에서, 포획제는 측면 유동 분석 검사 스트립 상의 특정 구역, 존(zones) 또는 라인 상에, 막의 특정 구역 내에, 크로마토그래피 컬럼의 고체 지지체 상에, 또는 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 웰에 고정화될 수 있다. 본 발명에 따른 다른 분석 방법에서, 포획제는 또한 용액에서 샘플의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있도록 비드 또는 다른 입자에 코팅될 수 있다. 본 발명의 분석 방법에서, 포획제 상의 리간드 결합 부위의 일부는 표적-리간드 접합체에 결합된다. 본 발명의 바람직한 분석 방법에서, 포획제는 측면 유동 분석 스트립 상의 검사 라인에 위치되고, 포획제의 일부는 표적-리간드에 결합되어, 분석물의 포획을 가능하게 하고, 나머지 리간드 결합 부위는 자유롭게 리간드를 포획한다.
포획제와 리간드 사이의 친화성은 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체가 표면 상에 고정화된 포획제에 의해 포획될 수 있게 한다. 또한, 분석물과 표적 사이의 친화성은 분석물-수용체-표지 복합체가 표면 상에 고정화된 표적에 결합할 수 있게 한다. 본 발명의 바람직한 분석 방법에서, 포획제는 비오틴 결합 단백질, 예를 들어 아비딘, 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 및 이들의 단백질 접합체이다. 바람직하게는, 포획제는 BSA에 접합되어 있는 스트렙타비딘이고, 니트로셀룰로오스 표면에 고정화되어 있다. 본 발명의 방법에서, 비오티닐화 HIV-1 및 HIV-2 펩티드는, 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위의 일부가 비어 있는 상태로, 표면 상에 고정화된 스트렙타비딘-BSA에 결합됨으로써 표면 상에 고정화된다.
본 발명에 따른 바람직한 분석 방법은 액체 생물학적 샘플로부터 항-HIV-1 및 항-HIV-2 항체를 검출한다. 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 항-HIV-1 및 항-HIV-2 항체를 함유하는 것으로 의심되는 액체 생물학적 샘플을 액체상의 비오티닐화 HIV-1, HIV-2 및/또는 rAg 펩티드와 접촉시키는 단계 - 샘플로부터의 항-HIV-1 및 항-HIV-2 항체의 적어도 일부는 비오티닐화 펩티드에 결합하여 항체-비오티닐화 펩티드 복합체: 항-HIV-1-비오티닐화 HIV-1 펩티드, 항-HIV-1-비오티닐화 rAg 펩티드, 및/또는 항-HIV-2-비오티닐화 HIV-2 펩티드 복합체를 형성함 - ;
b) 생물학적 샘플 내의 결합되지 않은 항-HIV-1 및 항-HIV-2 항체 및 단계 a)에서 형성된 복합체를 단백질 A-금 콜로이드 접합체와 접촉시켜, 표지된 항체 복합체 및 표지된 항체-비오티닐화 펩티드 복합체를 형성하는 단계;
c) 표면 상에 고정화된 스트렙타비딘에 의해 단계 b)로부터의 복합체를 포획하는 단계 - 스트렙타비딘 상의 비오틴 결합 부위의 일부는 비오티닐화된 HIV-1 및 HIV-2 펩티드에 의해 점유됨 - ;
d) 표면 상에 포획된 단계 c)로부터의 금 콜로이드-단백질 A-항체-펩티드-비오틴 복합체를 검출하는 단계.
본 발명에 따른 바람직한 방법은 측면 유동 분석 방법이다. 측면 유동 분석은 측면 유동 분석 스트립 상에서 수행된다. 본 발명의 측면 유동 분석 방법에서, 액체 생물학적 샘플은 측면 유동 분석 스트립 상에 적용되고, 생물학적 샘플에서의 분석물의 존재는 측면 유동 분석 스트립 상의 검사 라인에서 검출된다.
측면 유동 분석 스트립은 측면 유동 크로마토그래피에 사용되는 스트립을 지칭한다. 측면 유동 (크로마토그래피) 분석은 전형적으로 측면 유동 (면역 크로마토그래피) 분석 스트립의 샘플 수용 영역에 검출될 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 액체 생물학적 샘플을 적용하는 것을 포함한다. 분석 스트립은 매트릭스 재료(예를 들어, 종이, 니트로셀룰로오스 등. 예를 들어, 미국 특허 제5,569,608호 참조)를 포함하며, 이 매트릭스 재료를 통해, 검사 유체 및 그 안에 현탁되어 있거나 또는 용해되어 있는 분석물이 모세관 작용에 의해 샘플 수용 영역으로부터, 가시적인 신호 또는 그의 부존재가 분석물의 존재 또는 부존재를 나타내는 하나 이상의 포획 존으로 유동할 수 있다. 현상 용액은 측면 유동 분석 스트립을 가로질러 샘플의 유동을 촉진한다. 분석물의 검출이 항체 또는 항체 부분을 이용하는 경우, 분석은 측면 유동 면역 크로마토그래피 분석으로 지칭될 수 있고, 스트립은 측면 유동 면역 크로마토그래피 스트립으로 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 측면 유동 스트립은 검사 라인에서 관심 분석물에 대한 2 개의 포획 메커니즘을 제공한다: i) 검사 라인 위치에서, 지향된 리간드-표적 접합체, 예를 들어 비오티닐화 펩티드에 의해 샘플 내의 분석물, 예를 들어 항체를 포획; 및 ii) 이동 용액상에서 분석물과 복합체화된 리간드-표적 접합체, 예를 들어 비오티닐화 펩티드의 포획. 표적-리간드 접합체는 현상 용액에 첨가 또는 패드 성분(예를 들어, 차단제 패드)으로부터 용리됨으로써 액체상으로 분석물에 제공된다. 각각의 경우에, 현저하게 (> 5X) 더 적은 양의 펩티드가 놀랍게도 유사한 반응성 샘플 반응을 초래한다는 것이 아래에서 입증된다. 본 발명에 따른 측면 유동 스트립에서, 부분적으로 점유된 스트렙타비딘-BSA(SA-BSA)의 혼합물은 검사 라인을, 샘플과 함께 검사 라인 위치로 운반된 비오티닐화된 종에 대한 포획 기능에 대해 개방된 상태로 남겨둔다. 검사 라인은 또한 단백질-A-금 접합체에 복합체화된 항-HIV 항체를 포획하기 위해, 비오티닐화 HIV-1, HIV-2 펩티드, 재조합 HIV 항원(rAg) 펩티드 또는 이들의 조합을 함유한다.
용액 중에서 분석물 및 표적의 결합은 액체상 결합을 허용하며, 여기서 이들은 표적이 샘플로부터의 분석물과 효과적으로 배양될 수 있게 하도록 검사 실행 시간으로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 항-HIV 항체를 함유하는 환자 샘플이 패드 성분을 수화시키고 용리하는 현상 용액에 의해 장치 내로 운반될 때, HIV 에피토프를 나타내는 비오티닐화 펩티드 및 재조합 단백질은 용액 동역학 및 검사 라인으로의 유동 시간을 이용하여 샘플에서의 항-HIV 항체와 더욱 완전하게 복합체를 형성할 수 있다. 이 경우, 고 친화성 비오틴-스트렙타비딘 결합은 검사 라인에서 스트렙타비딘 상의 고정화된 유리 비오틴 결합 부위에 의해 용액으로부터 이들 복합체가 추출되는 것을 보장한다.
본 발명에 따른 액체 생물학적 샘플로부터 분석물을 검출하기 위한 측면 유동 분석 스트립은 다음을 포함한다:
샘플 수용 영역;
선택적으로 리간드-표적 접합체를 함유하는, 샘플 수용 영역의 하류에 있는 차단제 영역;
표지 수용체 접합체를 함유하는, 차단제 영역의 하류에 있는 접합체 영역;
리간드에 결합할 수 있는 고정화된 포획제를 포함하는 접합체 영역의 하류에 있는 검사 존 - 리간드 결합 부위의 일부는 리간드-표적 접합체에 의해 점유됨 - ;
선택적으로, 분석 완료를 표시하도록 검사 존의 하류에 있는 측면 유동 분석 스트립 상의 제어 존; 및
선택적으로, 측면 유동 분석 스트립과 유동 연통하고, 제어 존의 하류에 위치되는 흡수성 패드. 바람직하게는, 본 발명의 측면 유동 스트립은 액체 샘플 유동 방향으로 연속적으로 샘플 수용 영역, 차단제 영역, 접합체 영역, 검사 라인, 제어 라인 및 흡수성 패드를 통해 설계된다. 흡수성 패드는 스트립의 막을 통해 일-방향으로 모세관 작용 및 유체 유동을 촉진하는데 도움이 되고, 분석물을 함유하는 액체를 스트립의 일 단부로부터 다른 단부로 막을 따라 당긴다.
도 1 내지 도 3은 본 발명에 따른 측면 유동 장치를 도시한다. 측면 유동 장치[100]는 하우징[101]을 갖는다. 장치[100]는 그의 포획 존으로서 검사 라인[107] 및 그의 선택적인 제어 존으로서 제어 라인[108]을 갖는 셀룰로오스 막[106] 상에 배치된 접합 패드[105] 및 차단제 패드[104]와 유동 연통하는 하우징[101] 외부에 부분적으로 노출된 편평한 패드[103]를 갖는 측면 유동 분석 스트립[102]을 포함한다. 셀룰로오스 막[106]은 선택적인 흡수성 패드[109]와 유동 연통한다. 유동 방향은 화살표로 표시된다. 피험자로부터의 샘플의 액적이 편평한 패드[103]에 적용된다. 샘플은 장치 하우징[101] 내의 측면 유동 스트립[102]을 가로질러 위킹되고(wicked), 편평한 패드[103]로부터 접합 패드[105]로 그리고 셀룰로오스 막[106]을 가로질러 유동한다. 여기에 도시된 바와 같이, 편평한 패드[103]는 액체 생물학적 제제를 차단제 패드[104]로 전달하는 심지(wick)로서 작용한다.
본 발명의 측면 유동 스트립을 사용하여 분석된 액체 생물학적 샘플은 관심 항체를 함유할 수 있는 생물학적 유체와 같은 임의의 액체 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 유체의 예는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 경구 유체, 땀, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수, 모유 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 경구 유체는 구강에 존재하는 액체이다. 경구 유체는 타액과 구강 점막 누출액의 혼합물이다. 타액은 침샘에 의해 생성된다. 구강 점막 누출액은 모세 혈관으로부터 볼 점막을 가로질러 입으로 들어간다. 경구 유체에는 병원체 및 항체가 모두 함유되어 있다. 경구 유체, 전혈, 혈장 및 혈청과 같은 생물학적 유체 샘플은 본 발명의 면역 분석에 사용될 수 있는 바람직한 유형의 샘플이다. 이들 각각은 당업계에 공지된 수단 및 기술을 사용하여 획득될 수 있다. 사용되는 액체 생물학적 샘플의 양은 당업계에 공지된 바와 같이 액체 생물학적 샘플에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 측면 유동 스트립은 항체인 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 항-HIV 항체이다. 항-HIV 항체는 HIV-1 또는 HIV-2에 대한 항체일 수 있다. 본 발명의 측면 유동 스트립은 HIV와 관련하여 설명되지만, 본 발명의 측면 유동 스트립은 임의의 감염의 식별, 결정 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
측면 유동 분석 스트립의 "샘플 수용 영역"은 샘플이 우선 적용되는 측면 유동 분석 검사 스트립의 영역을 지칭한다. 샘플을 수용하는 것 외에도, 샘플 수용 영역의 기능은 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 적용되는 샘플의 pH 제어/변형 및/또는 비중(specific gravity) 제어/변형, 분석에서 비-특이적 결합을 방해하거나 또는 유발할 수 있는 샘플의 성분의 제거 또는 변경, 또는 검사 구역으로의 샘플 유동 지시 및 제어. 여과 양태는, 존재하는 경우, 관심 분석물이 약간의 간섭 물질과 함께(간섭 물질이 존재하는 경우) 제어된 방식으로 측면 유동 분석 검사 스트립을 통해 또는 측면 유동 분석 검사 스트립을 가로질러 이동할 수 있게 한다. 여과 양태는, 존재하는 경우, 종종 더 높은 성공 확률 및 정확성을 갖는 검사를 제공한다. 본 발명의 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 샘플 수용 영역은 또한 액체 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 비-표적 분석물과의 교차 반응성을 회피하고 그리고/또는 샘플을 컨디셔닝하는데 유용한 시약을 포함할 수 있으며; 특정 실시예에 따라, 이들 시약은 특히 항-RBC 시약, 트리스 기반 완충제, EDTA를 포함할 수 있다. 전혈의 사용이 고려될 때, 항-RBC 시약이 종종 이용된다. 본 발명의 또 다른 분석 스트립에서, 샘플 수용 영역은 보조 특이적 결합 멤버, 유체 샘플 전처리 시약, 및 신호 생성 시약과 같은 다른 시약을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 측면 유동 분석 장치에서, 편평한 패드[103]는 샘플 수용 영역으로서 기능한다.
본 발명에 따른 일부 측면 유동 분석 스트립에서, 샘플 수용 영역은 샘플 패드일 수 있으며, 액체 생물학적 샘플을 수용할 수 있고, 액체 샘플이 적용될 때 액체 샘플을 흡수할 수 있고, 액체 샘플을 차단제 패드에 통과시킬 수 있는 임의의 재료로 제조될 수 있다. 샘플 수용 영역의 패드는 유체 샘플에서 발생할 수 있는 세포 성분, 호르몬, 미립자 및 기타 특정 물질에 대한 필터로서 역할을 하도록 구성될 수 있다. 본 발명의 분석 스트립에 사용하기에 적합한 샘플 패드 재료는 또한 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,075,078호에 개시되어 있는 그들 적용 패드 재료를 포함한다. 샘플 적용 영역에 적합한 재료는 친수성 폴리에틸렌 재료 또는 패드, 아크릴 섬유, 유리 섬유, 여과 종이 또는 패드, 건조지, 종이 펄프, 직물 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
샘플 수용 영역은 샘플 적용 멤버(예를 들어, 심지 또는 편평한 패드)로 구성될 수 있다. 샘플 수용 존은 샘플 적용 멤버뿐만 아니라 샘플 적용 패드를 포함할 수도 있다. 종종 샘플 적용 멤버는 본 명세서에서 고려되는 다양한 유체 샘플 중 임의의 것을 쉽게 흡수하고 물리적 형태로 강건하게 유지되는 재료로 구성된다. 종종, 샘플 적용 멤버는 백색 결합 폴리에스테르 섬유와 같은 재료로 구성된다. 샘플 적용 멤버는 또한 친수성 마감제로 처리될 수 있다. 또한, 샘플 적용 멤버는 측면 유동 분석 스트립의 차단 패드와 유체 유동 접촉 상태로 위치된다. 이러한 유체 유동 접촉은 중첩, 인접 또는 인터레이스 유형의 접촉을 포함할 수 있다. 종종, 샘플 적용 멤버는, 존재하는 경우, 유사한 시약을 포함할 수 있으며, 예시적인 샘플 적용 패드에 사용된 것들과 유사한 재료로 구성될 수 있다. 액체 생물학적 샘플은 편평한 패드[103]에 직접 적용될 수 있다. 예를 들어, 편평한 패드[103]는 피험자의 입에 삽입될 수 있고, 구강 유체를 위한 수집 패드로서 사용될 수 있다. 다른 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청은 편평한 패드[103] 상에 직접 배치될 수 있다. 액체 생물학적 샘플은 또한 바이알에서 현상 용액으로 희석될 수 있고, 편평한 패드[103]는 바이알에 배치될 수 있다.
본 발명의 분석 스트립은 하나 이상의 표적-리간드 접합체를 함유하는 차단제 영역을 포함한다. 본 발명의 측면 유동 스트립에서, 차단제 영역은 차단제 패드이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 차단제 패드[104]는 편평한 패드[103]의 하류에 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 차단제 패드는 다양한 샘플 매트릭스에 존재하는 비-특이적 또는 간섭 물질에 대한 장치 내의 최소 반응성을 보장하기 위해 시약을 함유한다. 차단제 패드는 측면 유동 분석 검사 스트립의 하류에서 구강 유체의 유동을 방해하지 않는 한 매우 다양한 재료로 구성될 수 있다. 이러한 재료는 종이, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 유리 섬유 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 크로마토그래피 검사 스트립으로부터 모세관 매트릭스로 시약 또는 경구 유체의 역류를 감소시키거나 또는 제거하기 위해 재료가 선택될 수 있다. 완충제 및 존재하는 염은 차단제 패드에 존재하여 표적과 분석물을 복합체화하기 위한 pH 및 이온 강도를 조정하는 것을 돕는다. 차단제 패드는 측면 유동 분석법과의 호환성을 위해 그리고 액체 생물학적 샘플이 유동할 때 액체 생물학적 샘플의 샘플 pH를 조정하기 위해 완충제로 함침될 수 있다. 차단제 패드는 또한, 분석의 분석물 및/또는 시약의 비-특이적 결합을 감소시키고 이에 따라 거짓 양성(false positives)의 발생을 감소시키는 하나 이상의 차단제를 포함할 수 있다. 예시적인 차단 시약은 소 혈청 알부민(BSA), 메틸화된 BSA, 카세인, 무-지방 분유, 디옥시콜레이트, 및 n-라우로일 사르코신을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 차단 용액은 또한 계면 활성제, 방부제 및 기타 시약을 포함하여 검사 스트립에 걸친 유동을 향상시키고, 분석 결과를 개선하며 샘플 무결성을 보호할 수 있다. 전형적으로, 차단제 패드는 적절한 부피의 차단 용액을 패드 상에 적용하고 이것을 측면 유동 분석 스트립 상에 위치시키기 전에 건조시킴으로써 제조된다.
본 발명의 측면 유동 분석 검사 스트립의 차단제 패드는 선택적으로 리간드-표적 접합체 시약을 안정한 상태로 유지하고 액체 생물학적 샘플에 잠재적으로 존재하는 관심 분석물과의 신속하고 효과적인 가용화(solubilization), 고정화 및 특이적 반응을 용이하게 하는 역할을 한다. 도 1 내지 도 3은 차단제 패드가 또한 표적-리간드 접합체를 함유하는 본 발명에 따른 측면 유동 스트립을 수용하는 장치[100]를 도시한다. 생물학적 샘플과 함께 현상 용액이 측면 유동 스트립[102]에 걸쳐 유동하면, 표적-리간드 접합체는 차단제 패드[104]에서 용리되고, 생물학적 샘플에 존재하는 분석물의 적어도 일부는 액체상에서 표적-리간드 접합체에 결합한다. 본 발명의 측면 유동 스트립에서, 표적은 항원이다. 바람직하게는, 항원은 HIV-1 펩티드, HIV-2 펩티드, rAg, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 리간드는 비오틴이다. 따라서, 차단제 패드 상의 바람직한 표적-리간드 접합체는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 비오티닐화 rAg, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
측면 유동 분석 검사 스트립의 접합체 영역은 표지 시약 및 제어 시약을 안정한 상태로 유지하고 액체 생물학적 샘플에 잠재적으로 존재하는 관심 분석물과의 신속하고 효과적인 가용화, 고정화 및 특이적 반응을 촉진하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 접합체 영역은 접합체 패드일 수 있다. 접합체 패드는 액체 생물학적 샘플이 검사 존 또는 라인으로 이동하기 위해 접합체 패드를 가로질러 또는 이를 통해 통과해야 하도록 측면 유동 분석 검사 스트립 상에 위치된다. 대안적으로, 접합체 영역은 측면 유동 분석 검사 스트립 내로 직조될 수 있거나 또는 측면 유동 분석 검사 스트립과 동일한 위치에 일 직선으로 배치될 수 있다. 차단제 패드에서와 같이, 접합체 패드는 분석에 적합하고 구강 유체 및 시약의 유동을 실질적으로 방해하지 않는 임의의 편리한 재료(예를 들어, 니트로셀룰로오스)로 형성될 수 있다. 본 발명에 의해 사용하기에 적합한 접합체 패드 재료는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,075,078호에 개시되어 있는 그들 크로마토그래픽 재료를 포함한다.
본 발명에 따른 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 접합체 패드는 검사 존 또는 라인에서 항원의 검출을 허용하기 위해 수용체-표지 접합체뿐만 아니라 방출제 및 안정화제도 보유한다. 분석물에 따라, 수용체는 분석물에 특이적으로 또는 비-특이적으로 결합하는 임의의 분자일 수 있다. 본 발명의 바람직한 측면 유동 분석 스트립에서, 수용체는 단백질 A이고, 표지는 금 콜로이드이다. 생물학적 샘플과 함께 현상 용액이 측면 유동 스트립을 가로질러 유동할 때, 수용체-표지 접합체는 접합체 패드에서 용리되고, 수용체-표지는 분석물 또는 분석물-표적-리간드 복합체에 결합한다.
본 발명에 따른 분석 스트립은 검사 유체 및 그 안에 현탁되어 있거나 또는 용해되어 있는 분석물이 모세관 작용에 의해 유동할 수 있는 매트릭스 재료(예를 들어, 종이, 니트로셀룰로오스 등, 예를 들어 미국 특허 제5,569,608호 참조)를 포함한다. 매트릭스 재료는 폴리사카라이드(예를 들어, 종이와 같은 셀룰로오스 재료 및 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체)와 같은 합성 변형된 천연, 합성 또는 천연 발생 재료; 폴리에테르 설폰; 나일론; 실리카; 불-활성화된 알루미나, 규조토, 황산 마그네슘 또는, 염화 비닐, 염화 비닐-프로필렌 공중합체, 및 염화 비닐-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 기타 무기 미분된 재료와 같은 무기 재료; 천연 발생 (예를 들어, 면) 및 합성 (예를 들어, 레이온)의 천; 실리카겔, 아가로스, 덱스트란, 및 젤라틴과 같은 다공성 겔; 폴리아크릴아미드 등과 같은 중합체 필름을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 분석 스트립에서, 매트릭스 재료는 니트로셀룰로오스 막이다. 상업적으로 이용 가능한 상이한 유형의 니트로셀룰로오스 막(예를 들어, Millipore, HF90, GE FF120, Sartorius)은 상이한 흡수 용량 및 모세관 유동을 갖는다.
본 발명의 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 매트릭스 재료는 라미네이트 백킹(backing)에 부착될 수 있다. 백킹은 예를 들어 마일라 또는 PVC 또는 폴리스티렌과 같은 플라스틱 재료일 수 있다. 분석 스트립을 제조할 때, 매트릭스 재료는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 플라스틱 카드 상에 적층될 수 있다. 라미네이트 백킹을 갖는 니트로셀룰로오스 막은 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명에 따른 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 접합체 영역의 하류에 있는 검사 존 또는 검사 라인은 분석물의 존재를 나타내는 역할을 한다. 검사 존 또는 라인은 측면 유동 분석 스트립 상에 고정화된 포획제 및 리간드-표적 접합체 분자를 포함한다. 포획제는 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 측면 유동 분석 검사 스트립에서, 고정화된 포획제는 스트렙타비딘이다. 검사 라인에는 고정화된 표적도 또한 포함된다. 표적은 비오티닐화되고, 스트렙타비딘에 결합되어, 검사 존에 고정화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 측면 유동 분석 스트립에서, 검사 라인은 비오틴 결합 부위의 일부가 비오티닐화된 표적에 의해 점유되는 스트립 상에 고정화된 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면 유동 스트립에서, 검사 존은, 샘플을 첨가하기 전에, 이용 가능한 비오틴 결합 부위를 갖는 스트렙타비딘, 및 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 비오티닐화 rAg 또는 이들의 혼합물에 결합된 스트렙타비딘을 포함한다. 니트로셀룰로오스 상의 스트렙타비딘과 같은 단백질의 부착은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 측면 유동 분석 스트립에서, 스트렙타비딘-BSA는 검사 라인에서 니트로셀룰로오스 상에 배치된다. 샘플이 검사 라인으로 이동하면, 비오티닐화된 표적, 비오티닐화된 표적-분석물 복합체, 및 비오티닐화된 표적-분석물-수용체-표지 복합체는 검사 존 상의 스트렙타비딘 및 분석물에 결합할 것이고, 분석물-수용체-표지 복합체는 검사 라인 상의 고정화된 표적에 결합할 것이다. 분석물의 존재는 검사 라인에서 표지의 시각화를 통해 검출된다.
제어 존 또는 제어 라인은 또한 검사 존의 하류에 있는 측면 유동 분석 검사 스트립 상에 배치될 수 있다. 제어 라인은 검사 존에서 포획되지 않은 표지된 항원에 결합한다. 양성 제어 라인은 장치가 적절하게 작동했다는 것을 나타낸다. 인간으로부터의 액체 생물학적 샘플에서 항체를 검사하는 본 발명에 따른 측면 유동 분석 스트립에서, 니트로셀룰로오스 막 상의 제어 라인은 항-인간 항체에 의해 줄무늬가 생긴다(striped).
측면 유동 분석 검사 장치에서 제어 라인의 하류에 흡착제 패드가 존재할 수 있다. 흡수성 패드는 장치 유체의 최종 저장소로서 역할을 할 뿐만 아니라 측면 유동 분석 검사 스트립을 가로질러 유체를 끌어들일 수도 있다. 흡수성 패드는 분석 스트립에서 상류의 액체의 역류를 방지하기에 충분한 위킹(wicking) 특성을 가져야 한다. 흡수성 패드는 당업계에 공지된 재료로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 분석 검사 스트립은 전술한 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조되고 조립될 수 있다. 본 발명에 따른 분석 검사 스트립은 하우징 내에 있을 수 있다. 본 발명에 따른 분석 장치는 하나 이상의 포획 존 및 제어 존을 보기 위한 개구 또는 윈도우를 갖는 하우징을 포함한다.
본 발명에 따른 측면 유동 분석 방법은 현상 용액을 사용한다. 본 발명의 일 실시예는 본 발명의 측면 유동 분석 스트립 및 현상 용액을 포함하는 키트이다. 현상 용액은 생체 샘플이 장치 내로 그리고 분석 스트립 상으로 모세관 유동하는 것을 용이하게 한다. 본 발명의 분석 방법에서, 경구 유체가 수집되어 생물학적 샘플로서 제공될 수 있다. 구강 유체 수집을 위해, 장치의 샘플 적용 멤버 또는 수집 패드는 우선 생물학적 액체 샘플을 수용하거나 또는 수집하는데 사용된다. 예를 들어, 피험자의 입으로부터 구강 유체 샘플을 수집하도록 장치의 수집 패드가 사용될 수 있고, 그 후 현상 용액의 바이알 내에 배치될 수 있다. 수집 패드는 측면 유동 분석 검사를 위해 구강 유체 샘플을 보유하는 현상 용액을 흡수한다(wick up). 전혈, 혈청 또는 혈장 집합과 같은 다른 생물학적 샘플의 경우, 샘플은 현상 용액을 함유하는 바이알 내로 또는 수집 패드 상에 직접 첨가되고, 이어서 수집 패드는 현상액 바이알 내에 배치되어 샘플을 측면 유동 분석 검사를 통해 유동시켜 이로써 샘플을 운반한다. 본 발명에 따른 특정 분석 방법에서, 전혈은 샘플 적용 영역에 직접 적용되는데, 예를 들어 임의의 유형의 사전 희석 또는 치료 없이 핑거 스틱 또는 정맥 천자 또는 바늘로부터 얻어진 전혈 액적(5 μL 내지 50 μL)이 직접 적용된다. 현상 용액은 일반적으로 당업계에 공지된 계면 활성제, 염, 방부제, 완충제 등의 수용액이다. 포스페이트, 트리스-Cl 보레이트, 중탄산염 등과 같은 완충 시스템이 사용될 수 있다. Tween 20, Triton X-100 또는 다른 비-이온성 세제와 같은 계면 활성제가 사용될 수 있다. 항균제 및 항진균성 물질, 예를 들어 아지드화 나트륨을 포함하는 방부제가 현상 용액에 사용될 수 있다. 사용된 현상 용액의 양은 샘플을 운반하기에 충분해야 하지만, 그러나 분석을 힘들게 하거나(swamp) 또는 결과를 희석시켜 결과가 측정될 수 없을 정도로 많지는 않아야 한다.
예들
예 1
측면 유동 분석 장치가 제조되었다. 줄무늬가 있는 니트로셀룰로오스, 차단제 패드, 접합체 패드 및 흡착제 패드가 분석 카드 백킹 상에 조립되었다.
줄무늬가 있는 니트로셀룰로오스: FF120 니트로셀룰로오스는 제어 라인에서 항-인간 항체 (F(ab')2, 염소 항-인간 IgG)의 용액에 의해 라인 줄무늬가 생기고, 검사 라인에서는 비오티닐화 HIV-1 및 HIV-2 펩티드로 부분적으로 사전 복합체화된 SA-BSA에 의해 라인 줄무늬가 생긴다.
차단제 패드: 비오티닐화 rAg가 비오티닐화 HIV-1 및 HIV-2와 함께 차단제 패드 용액에 첨가되었다. 차단제 패드는 공통 차단제 베이스 완충제 및 비오티닐화 HIV-1 및 HIV-2 펩티드 및 비오티닐화 rAg로 처리되었다.
접합체 패드: 콜로이드성 금은 단백질 A로 수동적으로 코팅된 시트레이트 감소 공정(citrate reduction process)(터케비치법(Turkevich method))을 사용하여 제조되었다. 접합체 패드는 제조된 금 접합체 용액을 접합체 패드 재료 상에 분무함으로써 제조되었다. 이러한 접합체 패드는 분석 카드 상의 차단제 패드 바로 위에 위치되기 전에 적절히 건조되었다.
분석 카드의 모든 주요 성분(차단제 패드, 접합체 패드, 니트로셀룰로오스, 라미네이트 백킹, 흡수성 패드)이 이용할 수 있게 되면, 재료들은 라미네이트 백킹 카드 상의 분석 카드로 조립되었다. 분석 카드는 분석 스트립으로 절단되고, 분석 스트립은 장치 하우징 베이스에 설정되고, 수집 패드는 장치 하우징 베이스의 분석 스트립의 상단에 배치되었다. 장치 하우징 상단은 함께 가압되어 베이스의 핀을 상단의 소켓과 결합시켜 조립을 완료하였다. 조립된 장치는 조립 시에 밀봉되었다.
생물학적 샘플의 수집, 샘플을 현상 완충액 내로 삽입한 후, 검사 장치의 삽입 및 대략 20 내지 40 분 후의 분석 결과의 해석에 의해 분석 방법이 수행되었다. 검사 장치의 편평한 샘플 수집 패드를 사용하여 경구 유체 시료가 수집된 후, 검사 장치를 현상 용액의 바이알 내로 삽입하였다. 현상 용액은 시료가 장치 내로 그리고 측면 유동 분석 검사 스트립 상으로 유동하는 것을 촉진시켰다.
예 2
혈청 전환 패널: 표 1은 OraQuick ADVANCE® Rapid HIV-1/2 항체 검사를 위한 패키지 인서트로부터 혈청 전환 패널의 성능을 요약한 것이다. 표 2는 본 발명에 따른 측면 유동 분석 장치로 검사된 혈청 전환 패널의 요약이다.
| 패널의 개수 | 일치 결과의 개수 | 장치에 의해 이전에 검출된 개수 | EIA에 의해 이전에 검출된 개수 | 평균 일수 장치(Average Days device) | 평균 일수 EIA(Average Days EIA) | 지연 일수 |
| 23 | 7 | 3 | 13 | 36.46 | 34.99 | 1.48 (95% Cl - 0.1 내지 3.1) |
| 패널의 개수 | 일치 결과의 개수 | 장치에 의해 이전에 검출된 개수 | EIA에 의해 이전에 검출된 개수 | 평균 일수 장치a | 평균 일수 EIAa | 지연 일수 EIAb |
| 21 | 11 | 4 | 6 | 36.19 | 35.95 | 0.24 (95% Cl: - 1.34 내지 1.81) |
| a MiniTab® 통계 소프트웨어를 사용하여 계산됨. | ||||||
| b 지연 일수는 장치와 미국 FDA 승인 EIA 간의 평균 차등 감도와 동등하다. | ||||||
현재 승인된 검사 장치용 패키지 인서트는 OraQuick이 HIV에 대한 항체를 검출할 때와 EIA(ELISA Immunoassay)가 항체를 검출할 때 사이에 1.48 지연 일수를 나타내며, 본 발명에 따른 장치는 0.24 지연 일수를 나타내고, 이는 실험실 기반 항체 검사와 본질적으로 동등한 감도를 나타낸다. HIV는 주로 성적 접촉, 감염된 혈액, 혈액 제제 또는 인간 조직과의 접촉을 통해 그리고 어머니에서 자녀로 전염된다(Smith DK, Grohskopf LA, Black RJ, et al, MMWR Recomm. Rep. 54:1-20 2005; Kourtis AP, Lee FK, Abrams EJ, et al, Lancet Infect Dis. 6:726-732 2006). 전 세계적으로, 대부분의 HIV 전염은 보호되지 않은 성적 접촉의 결과로서 발생한다. 감염된 파트너와의 성교 행위 당 HIV 전염률은 상대적으로 낮은 것으로 추정되지만, 그러나 소스 환자(source patient)의 바이러스 부하(viral load)가 높은 경우 위험이 실질적으로 증가할 수 있다(예를 들어, 급성 HIV 감염 동안: Cohen MS, Pilcher CD, J. Infect. Dis. 191:1391-1393 2005). 그러한 개인에 대한 검출에는 증강된 감도가 중요하다.
예 3
분석 방법에 사용된 항원의 양은 그것이 줄무늬가 생겼는지, 패드에서 용리되었는지, 또는 현상 용액에 첨가되었는지에 기초하여 평가되었다. 아래의 각 조건에 대해, 3 μL의 샘플(PM2 = HIV-1 혈장 샘플; PM6 = HIV-2 혈장 샘플; PM10 = HIV 음성 혈장; 9012-8-혈청 전환 혈장 샘플)이 액체상(현상액)에 첨가되었고, 검사를 시작하기 위해 장치가 이 혼합물 내에 배치되었다.
조건 1에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 펩티드는 니트로셀룰로즈 상에 줄무늬가 생겼다. 각 펩티드의 장치당 레벨은 82.1 ng의 비오티닐화 HIV-1 및 33.2 ng의 비오티닐화 HIV-2에서 추정되었다.
| 니트로/조건 | HIV 펩티드와 복합체화된 줄무늬가 있는 변형된 아비딘 / 조건 1 |
| 현상액 | 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | HIV 차단제 |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM 2 | 반응성 |
| PM 6 | 반응성 |
표 4에 나타낸 조건 2에서, 펩티드는 현상 용액에 첨가되었다. 검사 라인에 미리 결합된 비오티닐화된 펩티드는 없었다. 각 펩티드의 장치당 레벨은 13.3 ng의 비오티닐화 HIV-1 및 5.3 ng의 비오티닐화 HIV-2에서 추정되었다.
| 니트로/조건 | 줄무늬가 있는 비오틴 결합 단백질 / 조건 2 |
| 현상액 | 100 ng HIV-1 및 40 ng HIV-2 비오티닐화 펩티드가 첨가된 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | HIV 차단제 |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM 2 | 반응성 |
| PM 6 | 반응성 |
| PM 10 | 비-반응성 |
표 5에 나타낸 조건 3에서, 펩티드는 차단제 패드에 첨가되었다. 각 펩티드의 장치당 레벨은 14.4 ng의 비오티닐화 HIV-1 및 5.8 ng의 비오티닐화 HIV-2에서 추정되었다.
| 니트로/조건 | 줄무늬가 있는 비오틴 결합 단백질 / 조건 3 |
| 현상액 | 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | 비오티닐화 HIV-1: 1800ng/mL 비오티닐화 HIV-2: 720ng/mL |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM 2 | 반응성 |
| PM 6 | 반응성 |
| PM 10 | 비-반응성 |
조건 2 및 3에서, 비오티닐화 펩티드는 액체상(현상 용액)에 존재하거나 또는 패드 성분으로부터 용리되고, 각각의 경우, 유의미하게 (>5X) 더 적은 양의 펩티드는 펩티드가 검사 라인 상에서 줄무늬가 생겼을 때와 비교하여 놀랍도록 유사한 반응성 샘플 반응을 초래한다(조건 1)는 것이 입증되었다. 측면 유동 플랫폼의 액체상 동역학을 이용하면 장치 반응성 반응을 확보하는데 필요한 면역 반응성 재료의 양이 크게 감소된다.
예 5
재조합 단백질을 사용하여 에피토프 커버리지를 확장시키는 것은 또한 용액상 대 고체상 제시로부터 이익을 얻었다. 이는 p24 및 HIV EIA 양성으로 특성화되고 급성 감염을 나타내는 샘플인 젭토매트릭스(Zeptomatrix) 혈청 전환 샘플(9012-8)의 사용을 통해 입증되었다.
조건 4에서, rAg는 니트로셀룰로오스 스트립 상에 줄무늬가 생겼다. 재조합 항원(rAg)의 장치당 레벨은 비오티닐화 rAg의 189 ng에서 추정되었다.
| 니트로/조건 | 1mg/mL rAg / 조건 4 |
| 현상액 | 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | HIV 차단제 |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM2 | 반응성 |
| 9012-8 | 비-반응성 |
조건 5에서, rAg는 현상 완충액에 첨가되었다. BBP는 임의의 비오티닐화된 펩티드와 결합되지 않고, 니트로셀룰로오스 상에서 줄무늬가 생겼다. rAg의 장치당 레벨은 비오티닐화된 HIV-1 rAg의 50 ng에서 추정되었다. PM2 및 혈청 전환 샘플 9012-8은 이 조건 하에서 장치 상에서 반응성이었다. 대조적으로, 비오티닐화된 펩티드가 현상액 단독에 첨가되었을 때(조건 6), 9012-8은 비-반응성이었다(표 8).
| 니트로/조건 | 줄무늬가 생긴 비오틴 결합 단백질 / 조건 5 |
| 현상액 | 50ng 비오티닐화 rAg가 첨가된 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | HIV 차단제 |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM2 | 반응성 |
| 9012-8 | 반응성 |
| 니트로/조건 | 줄무늬가 생긴 비오틴 결합 단백질 (BBP) / 조건 6 |
| 현상액 | 50ng 비오티닐화 HIV-1 펩티드가 첨가된 현상액 A (750μL) |
| 차단제 패드 | HIV 차단제 |
| 샘플 | 검사 라인 응답 |
| PM2 | 반응성 |
| 9012-8 | 비-반응성 |
예 6
니트로셀룰로오스 상에 줄무늬를 나타내는 펩티드의 일부를 갖는 것에 놀라운 장점이 있다. 하기 표 9에는 HIV EIA 양성인 일련의 혈청 전환 샘플, 샘플 9012-7, 9077-14, 965-4, 109-7 및 204-3이 도시되어 있고, 여기서 펩티드가 차단제 패드에만 존재하지만 검사 라인에 사전 결합되지 않은 경우에는 반응성이 없다. 니트로셀룰로오스 상에서 펩티드의 비율이 증가함에 따라, 이들 샘플에서의 반응성이 얻어지고, HIV 음성 샘플은 음성으로 유지된다.
| 니트로셀룰로오스 | 줄무늬가 생긴 BBP (Striped BBP) | 25% 펩티드로 줄무늬가 생긴 BBP (Striped BBP with 25% Peptides) | 50% 펩티드로 줄무늬가 생긴 BBP(Striped BBP with 50% Peptides) |
| 현상액 | HIV 현상액 | ||
| 차단제 패드 | 비오티닐화 HIV 펩티드 및 비오티닐화 rAg를 갖는 차단제 패드 | ||
| 샘플 | 검사 라인 응답 | ||
| PM 2 | 반응성 | 반응성 | 반응성 |
| PM 6 | 반응성 | 반응성 | 반응성 |
| PM 10 | 비-반응성 | 비-반응성 | 비-반응성 |
| 9012-7 | 반응성 | 반응성 | 반응성 |
| 9077-14 | 비-반응성 | 반응성 | 반응성 |
| 965-4 | 비-반응성 | 비-반응성 | 반응성 |
| 109-7 | 비-반응성 | 반응성 | 반응성 |
| 204-3 | 비-반응성 | 반응성 | 반응성 |
SEQUENCE LISTING
<110> ORASURE TECHNOLOGIES, INC.
<120> ASSAY METHOD FOR IMPROVED ANALYTE DETECTION
<130> FPA13699
<150> US 62/542,612
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt 180
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gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420
gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aagttttccg tcctggcggt 480
ggcgatatga gagacaactg gagaagcgaa ttatacaaat acaaagtgat taagattgaa 540
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ctggcagtag aacgttatct gcgtgatcag caactgttag gtatttgggg ctgtagcggt 780
aaattgatct gcaccactgc cgttccgtgg aatgcgtctt ggtcaaacaa gagtttagaa 840
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ttatag 966
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Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Val Phe Arg Pro Gly Gly
145 150 155 160
Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val
165 170 175
Ile Lys Ile Glu Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg
180 185 190
Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile
195 200 205
Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His
210 215 220
Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val
225 230 235 240
Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp
245 250 255
Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala
260 265 270
Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Asp Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp
275 280 285
Met Gln Trp Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Asn Thr Ile Tyr Thr
290 295 300
Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu
305 310 315 320
Leu
Claims (27)
- 액체 생물학적 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 분석 방법으로서,
a) 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 상기 액체 생물학적 샘플을 액체상(liquid phase)의 적어도 하나의 리간드-표적 접합체(conjugate)와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 리간드-표적 접합체는 상기 분석물의 적어도 일부에 결합하여 리간드-표적-분석물 복합체를 형성함;
b) 상기 생물학적 샘플 내의 분석물 및 단계 a)로부터의 상기 복합체를 수용체-표지(label) 접합체와 접촉시켜, 분석물-수용체-표지 복합체 및 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성하는 단계;
c) 리간드에 결합할 수 있는 포획제를 포함하는 표면 상에서 단계 b)로부터의 표지된 복합체를 포획하는 단계, 여기서 상기 포획제는 i) 리간드-표적 접합체와 결합된 포획제 및 ii) 리간드-표적 접합체와 결합되지 않은 포획제로 구성되며, 상기 i)에서 결합된 포획제-리간드-표적 접합체는 분석물-수용체-표지 복합체에 결합하여 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 형성하고; 상기 ii)에서 포획제는 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체에 결합함; 및
d) 상기 표면 상에 포획된 상기 리간드-표적-분석물-수용체-표지 복합체를 검출하는 단계
를 포함하는, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석물은 항체이고, 상기 표적은 항원인 것인, 분석 방법. - 제2항에 있어서,
상기 분석물은 항-HIV-1 및 항-HIV-2로부터 선택된 항-HIV 항체이고, 상기 항원은 HIV-1 펩티드, HIV-2 펩티드, rAg 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 리간드는 비오틴인 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 액체 생물학적 샘플은 경구 유체(oral fluid), 전혈 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 수용체는 단백질 A인 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표지는 콜로이드성 금인 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획제는 스트렙타비딘인 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 리간드-표적 접합체는 비오티닐화(biotinylated) HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 비오티닐화 rAg 펩티드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석 방법은 측면 유동 분석 스트립(lateral flow assay strip) 상에서 수행되며, 상기 측면 유동 분석 스트립을 현상 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 접촉 후, 상기 현상 용액은 상기 측면 유동 분석 스트립을 가로질러 이동하는 것인, 분석 방법. - 제10항에 있어서,
액체 생물학적 샘플은 현상 용액에 첨가되거나 또는 측면 유동 분석 스트립의 샘플 수용 부분(sample receiving portion)에 첨가되는 것인, 분석 방법. - 제10항에 있어서,
표적-리간드 접합체는 현상 용액에 첨가되는 것인, 분석 방법. - 제10항에 있어서,
표적-리간드 접합체는 샘플 수용 영역의 하류에 있는 측면 유동 분석 스트립의 일부로부터 용리되어 분석물에 결합하는 것인, 분석 방법. - 액체 생물학적 샘플로부터 분석물을 검출하기 위한 측면 유동 분석 스트립으로서,
샘플 수용 영역;
선택적으로 리간드-표적 접합체를 함유하는, 상기 샘플 수용 영역의 하류에 있는 차단제 영역(blocker area);
표지-수용체 접합체를 함유하는, 상기 차단제 영역의 하류에 있는 접합체 영역(conjugate area);
리간드에 결합할 수 있는 고정화된 포획제를 포함하는 상기 접합체 영역의 하류에 있는 검사 존(test zone), 여기서 상기 포획제는 i) 리간드-표적 접합체와 결합된 포획제 및 ii) 리간드-표적 접합제와 결합되지 않은 포획제로 구성됨;
선택적으로, 분석 완료를 표시하도록 상기 검사 존의 하류에 있는 상기 측면 유동 분석 스트립 상의 제어 존(control zone); 및
선택적으로, 상기 측면 유동 분석 스트립과 유동 연통(flow communication)하고, 상기 제어 존의 하류에 위치되는 흡수성 패드(absorbent pad)
를 포함하는, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 분석물은 항체이고, 상기 표적은 항원인 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제15항에 있어서,
상기 분석물은 항-HIV-1 및 항-HIV-2로부터 선택되는 항-HIV 항체이고, 상기 항원은 HIV-1 펩티드, HIV-2 펩티드, rAg 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 리간드는 비오틴인 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 액체 생물학적 샘플은 경구 유체, 전혈 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 수용체는 단백질 A인 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 표지는 콜로이드성 금인 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 포획제는 스트렙타비딘인 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 제어 존은 항-인간 항체를 포함하는 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 제14항에 있어서,
상기 리간드-표적 접합체는 비오티닐화 HIV-1 펩티드, 비오티닐화 HIV-2 펩티드, 비오티닐화 rAg 펩티드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 키트로서,
a) 하기를 포함하는 액체 생물학적 샘플로부터 분석물을 검출하기 위한 제14항에 따른 측면 유동 분석 스트립;
샘플 수용 영역;
선택적으로 리간드-표적 접합체를 함유하는, 상기 샘플 수용 영역의 하류에 있는 차단제 영역;
표지-수용체 접합체를 함유하는, 상기 차단제 영역의 하류에 있는 접 합체 영역;
리간드에 결합할 수 있는 고정화된 포획제를 포함하는 상기 접합체 영 역의 하류에 있는 검사 존, 여기서 리간드 결합 부위의 일부는 리간드-표적 접합체에 의해 점유됨;
선택적으로, 분석 완료를 표시하도록 상기 검사 존의 하류에 있는 상 기 측면 유동 분석 스트립 상의 제어 존; 및
선택적으로, 상기 측면 유동 분석 스트립과 유동 연통하고, 상기 제어 존의 하류에 위치되는 흡수성 패드;
및
b) 현상 용액
을 포함하는, 키트. - 제1항에 있어서,
상기 분석물은 HIV에 대한 항체, HPV에 대한 항체, HCV에 대한 항체, 에볼라에 대한 항체, 뎅기열에 대한 항체, 지카에 대한 항체, 헬리코박터 파일로리에 대한 항체, 간염에 대한 항체, 홍역에 대한 항체, 간염 항원, 터포네메스(terponemes)에 대한 항체, 숙주 또는 감염원에 대한 항체, 카디오리핀, 레시틴, 콜레스테롤, 리포폴리사카라이드 및 시알산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 병리학의 세포 마커, 볼거리에 대한 항체, 풍진에 대한 항체, 코티닌, 코카인, 벤조일엑고닌, 벤조디자즈핀, 테트라하이드로칸나비놀, 니코틴, 에탄올 테오필린, 페니토인, 아세트아미노펜, 리튬, 디아제팜, 노르트립틸린, 세코바르비탈, 페노바르비탈, 테오필린, 테스토스테론, 에스트라디올, 17-하이드록시프로게스테론, 프로게스테론, 티록신, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 변형 성장 인자 알파, 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II, 성장 호르몬 분비 억제 인자, IGA, 성 호르몬 결합 글로불린, 포도당, 콜레스테롤, 카페인, 코르티코스테로이드 결합 글로불린, PSA, DHEA-결합 당단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분석 방법. - 제14항에 있어서,
상기 분석물은 HIV에 대한 항체, HPV에 대한 항체, HCV에 대한 항체, 에볼라에 대한 항체, 뎅기열에 대한 항체, 지카에 대한 항체, 헬리코박터 파일로리에 대한 항체, 간염에 대한 항체, 홍역에 대한 항체, 간염 항원, 터포네메스에 대한 항체, 숙주 또는 감염원에 대한 항체, 카디오리핀, 레시틴, 콜레스테롤, 리포폴리사카라이드 및 시알산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 병리학의 세포 마커, 볼거리에 대한 항체, 풍진에 대한 항체, 코티닌, 코카인, 벤조일엑고닌, 벤조디자즈핀, 테트라하이드로칸나비놀, 니코틴, 에탄올 테오필린, 페니토인, 아세트아미노펜, 리튬, 디아제팜, 노르트립틸린, 세코바르비탈, 페노바르비탈, 테오필린, 테스토스테론, 에스트라디올, 17-하이드록시프로게스테론, 프로게스테론, 티록신, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 변형 성장 인자 알파, 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II, 성장 호르몬 분비 억제 인자, IGA, 성 호르몬 결합 글로불린, 포도당, 콜레스테롤, 카페인, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, PSA, DHEA-결합 당단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 측면 유동 분석 스트립. - 삭제
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Legal Events
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20221129 Patent event code: PE09021S01D |
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