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KR102261179B1 - 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 - Google Patents

측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 Download PDF

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KR102261179B1
KR102261179B1 KR1020190069043A KR20190069043A KR102261179B1 KR 102261179 B1 KR102261179 B1 KR 102261179B1 KR 1020190069043 A KR1020190069043 A KR 1020190069043A KR 20190069043 A KR20190069043 A KR 20190069043A KR 102261179 B1 KR102261179 B1 KR 102261179B1
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Abstract

본 발명은 면역 검출용 접합체, 이를 포함하는 면역 검출 센서, 이를 사용한 면역 검출 방법 및 면역 검출 신호 증폭 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용하는 것을 기술적 특징으로 하며, 이를 통해 검출 감도가 현저히 향상되어 초고감도 검출이 가능하여 다양한 항원 및 질병을 간단하고 신속하면서도 효과적으로 진단할 수 있어 유용하게 사용될 수 있다.

Description

측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법{Conjugate for immunodetection based on lateral flow assay and immunodetective method by using the same}
본 발명은 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체, 이를 포함하는 면역 검출 센서, 이를 사용한 면역 검출 방법 및 면역 검출 신호 증폭 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 기술적 특징으로 한다.
항체-항원 반응을 신속하게 측정하는 방법으로 측면 흐름 분석(LFA, lateral flow assay) 시스템이 많이 사용된다. LFA는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류층에는 접합체 패드와 시료 패드가 연결되어 있고, 멤브레인의 하류층에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 접합체 패드에는 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 고정화된 금 나노입자 접합체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 시료물질과 특이적으로 반응하는 항체 및 금 나노입자에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 있다. 상기 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 멤브레인에 고정화된 항체와 금 나노입자에 고정화된 항체는 시료물질에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 잘 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 LFA 장치에 액체 시료용액을 샘플 패드에 떨어뜨리면, 시료가 존재할 경우 시료에 선택성을 가지는 항체-금 나노입자와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다. 이러한 방법은 항원 농도에 따라 신호 세기가 달라지므로 정량 가능하고, 일반적으로, 신호 세기는 항원 농도에 따라 Test Line에 고정되는 Nanoparticle (ex. AuNP, Latex bead 등) 색깔의 진하기에 따라 결정되어서, 대량생산이 가능하고, 검사의 신속성과 간편함 때문에 질병 진단과 현장 진단에 활발히 사용되고 있다.
하지만, 종래의 통상적인 LFA 방법은 나노입자-항체가 단일 개의 접합체를 형성하여 AuNP 색으로만 신호 검출 가능하기 때문에 낮은 민감도 (일반적으로, ~ 1 ng/mL)로 인해 고감도 검출을 필요로 하는 항원에는 적용이 어려운 한계점이 있다. 이러한 LFA의 감도 향상을 위해 나노입자-항체-효소 접합체가 제안되었고, 효소 종류에 따라 다양한 기질을 사용할 수 있고, 이로 인해 발색, 발광, 침전 반응 등에 의한 신호 증폭이 가능하고, 접합체 1개에 포함된 효소 개수가 많아짐에 따라 신호 세기도 함께 증가하여, 저농도 항원도 손쉽게 검출 가능하게 되었다.
이러한 감도를 증가시키 위해, 중합체 형태의 효소(ex. HRP)가 ELISA, Western blotting, Immunohistochemistry 등에서 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는데 주로 사용되어 왔다(비특허문헌 1). 일례로, 큰 크기의 다중 분자 또는 고분자 신호체(효소 중합체)와 항체 접합체가 제안되었으나(특허문헌 1), 효소 고분자-항체 접합체를 제작하는 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며, 결과물 분석 방법이 분명하지 않아 재현성이 떨어지고, 무색인 고분자 신호체 만으로는 신호 확인이 어려우므로, 결과 확인을 위해서는 1차 면역반응 후 2차 신호증폭반응이 필수적인 제한점이 있다. 또한, 효소가 흡착된 나노 입자 접합체가 제안되었으나(비특허문헌 2 및 3) 나노 입자 표면에 효소가 붙을 수 있는 공간이 한정적이고, 결과적으로 검출 감도 향상에 한계가 있다. 효소와 결합된 형태의 항체나 DNA를 사용하여 나노 입자와 접합하거나, 항체나 DNA같은 바이오 물질을 AuNP 표면에 붙인 후 남아 있는 공간에 효소를 붙이는 방법으로 접합을 설계하기 때문에 나노 입자 한 개당 포함할 수 있는 효소 개수가 매우 제한적이고, 나노 입자에 표적 물질과 결합하는 바이오 리셉터 (항체 또는 DNA)를 직접 접합하는 경우, 바이오 리셉터가 배향성 없이 흡착하기 때문에 표적 물질과 결합하는 활성 부위가 외부로 노출되지 않고 결합되어 표적 물질과의 결합이 수월하지 않을 수 있다는 제한점이 있다.
따라서, 종래에 알려진 방식이 갖는 기술적 한계를 극복하면서 샘플 내 미량의 검체를 높은 정확도 및 낮은 비용으로 진단 또는 검출할 수 있는 측면 흐름 분석-기반 면역 검출 센서에 대한 요구가 여전히 존재한다.
1. 한국등록특허 제10-1705480호
1. Anal. Chem.,　2017,　89　(11), pp 6248-6256 2. Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 412-416 3. Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 2018-2024
본 발명은 종래의 알려진 방식이 갖는 기술적 한계를 극복하면서 샘플 내 미량의 검체를 높은 정확도 및 낮은 비용으로 진단 또는 검출할 수 있는 측면 흐름 분석-기반 면역 검출 센서 효과적으로 항원을 검출할 수 있는 면역 검출 방법을 제공하고자 한다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 제공한다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자 및 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 스트렙타비딘일 수 있다. 본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 제1바인더와 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 효소일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 단백질, 더 구체적으로 트로포닌, 인터루킨일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 어느 하나의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (i) 흡수성 샘플 패드, (ii) 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 포함하는 접합 패드, (iii) 상기 접합체의 제1바인더와 결합되는 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1바인더와는 결합하는 제3바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드를, 순차적으로 일단으로부터 타단 방향으로 배치하여 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 제공한다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 제1바인더와 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다
상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 면역 검출 센서일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 효소일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 신호 증폭 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, S1) 나노입자 및 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체를 접합시키는 단계, 및 S2) 상기에서 제조된 나노입자-표지 매개 물질 중합체의 접합물에 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 상기 표지 매개 물질 중합체의 표면에 접합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 제1바인더와 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 면역 검출용 접합체의 제조 방법일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질은 효소일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체인 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법은 종래 면역 검출용 항체보다 검출 감도를 1000 내지 10000배 향상시키고, 검출하고자 하는 항원 농도에 따라 신호증폭반응 사용 여부를 조절할 수 있고, 신호증폭 전후로 모두 검출 여부 판별이 가능하므로, 검출 가능 범위(Dynamic Range)가 증가하고, 접합체 제작 과정이 단순하고 간편하고, 정형질인 나노입자를 기준으로 분석을 진행하므로, 접합체 분석과 정량 과정에서의 정확성과 재현성이 우수하고, 고분자 형태의 표지 매개 물질, 특히 스트렙타비딘 또는 효소를 이용하므로 개별 나노입자에 붙일 수 있는 표지 매개 물질의 수가 획기적으로 증가하여 초고감도 검출이 가능하고, 기존 기술 대비 상대적으로 짧은 시간 내에 저농도 항원까지 검출이 가능하고, 타겟 검체와 반응하는 바인더(항체)가 나노입자 표면에 직접 붙는 비율보다 표지 매개 물질 중합체가 나노입자 표면에 결합함으로써 표지 매개 물질 중합체에 결합되어 나노입자 표면에 직·간접적으로 붙는 바인더(항체)의 비율이 높기 때문에 배향성이 향상되어 표적 물질과의 반응성이 좋고, 구형인 나노입자를 중심으로 접합체가 제작되므로 선형 중합체 구조인 표지 매개 물질 중합체-항체 접합체 구조 대비 멤브레인과 패드로부터 받는 저항이 낮아 흐름 효율이 우수하여 낮은 비특이 반응과 배경신호로 인해 정확한 결과 신호 검출이 가능하여, 이를 통해 다양한 항원 및 질병을 간단하고 신속하면서도 효과적으로 진단할 수 있다.
도 1은 전형적인 멤브레인 기반 바이오 센서의 작동 원리를 도식화한 그림이다.
도 2는 본원 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 흡수 스펙트럼 결과이다.
도 4는 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 크기 분석 결과이다.
도 5는 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 감도를 평가한 결과이다.
도 6은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 상온 보관 시 안정성을 평가한 결과이다.
도 7은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 재현성을 검증한 결과이다.
도 8 및 도 9는 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체를 사용한 경우 감도 향상 정도를 평가한 결과이다.
도 10은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체(센서에서 AuNP-PolyHRPStA-Troponin I Antibody)의 검출 결과이다.
도 11은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체(센서에서 AuNP-PolyHRPStA-Interleukin 8 Antibody 또는 AuNP-PolyAPStA-Interleukin 8 Antibody)의 검출 결과이다.
도 12은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체의 면역 반응 후 잔류하는 효소에 대한 TMB 발색 반응 결과를 비교한 결과이다.
도 13은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 접합체가 대조군에 비하여 비특이적 반응 및 배경 신호를 감소시키는 원리에 대한 이론적 모식도이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 등을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"면역 검출 센서"는 생물학적 요소와 분석 대상 물질과의 반응에서 나타나는 전기화학적 변화, 열 에너지 변화, 형광 또는 색의 변화 등을 인식가능한 신호로 변환시켜주는 디바이스와 결합하여 제작된 디바이스를 의미할 수 있다.
"바인더"는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
"항원"은 특이한 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 물질(substance)로서, 구체적으로 적어도 하나의 항체에 의하여 인식 가능한 임의의 분자 또는 분자 그룹을 의미할 수 있다. 항원은 적어도 하나의 에피토프(epitope; 항체의 의하여 인식될 수 있는 특정 생화학적 유닛)을 함유한다.
"항체"는 완전한 다클론(또는 폴리클론) 또는 단클론(모노클론) 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬 (ScFv), 다이아바디, 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체, 그의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 요망되는 특이성의 항체 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 기타 변형 배열을 의미할 수 있다. 항체로는 임의의 범주에 해당되는 항체, 예를 들면 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 서브클래스), 및 특정 클래스에 속하지 않는 항체를 포함할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 표현은 결합 시약(reagent), 예를 들면 항체의 특이성을 의미하는 것으로, 정의된 검체 또는 타겟 물질에 우선적으로 결합하는 것을 의미할 수 있다. 다른 잠재적인 타겟의 존재 하에서 특정 검체 또는 타겟 물질의 결합 시약 또는 항체에 의하여 인식되는 것은 이러한 결합의 일 특징일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 검체에 특이적으로 결합하는 결합 시약은 검사하고자 하는 샘플 내의 다른 간섭 부분 또는 부분들과의 결합을 회피할 수 있다.
"샘플"(또는 "시료")은 검출하고자 하는 검체를 함유할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액(전혈), 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집괴로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다.
"검체(analyte)"는 검출될 샘플 내 분자 또는 기타 물질을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들면, 검체는 항원성 물질, 리간드(모노- 또는 폴리에피토프), 합텐(haptens), 항체 및 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 구체적으로, 검체는, 예를 들면 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 약물 중간체 또는 부산물, 세균, 바이러스 입자, 효모, 진균, 원생 동물 및 상기 물질들의 대사물 또는 그에 대한 항체를 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 통상적으로 항원 또는 항체일 수 있다. 이와 관련하여, 예시적인 검체로서, 페리틴; 크레아티닌키나아제 MB(CK-MB); 디곡신; 페니토인; 페노바르비톨; 카르바마제핀; 반코마이신; 젠타마이신; 테오필린; 발프로산; 퀴니딘; 황체화 호르몬(LH); 소포 자극 호르몬(FSH); 에스트라디올, 프로게스테론; C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP); 리포칼린; IgE 항체; 사이토카인; 비타민 B2 마이크로-글로블린; 당화 헤모글로빈(Gly.Hb); 코르티졸; 디지톡신; N-아세틸프로카인아미드(NAPA); 프로카인아미드; 풍진-IgG 및 풍진 IgM과 같은 풍진에 대한 항체, 예를 들면 톡(톡소-IgG) 및 톡소포자충증 IgM과 같은 톡소포자충증에 대한 항체; 테스토스테론; 살리실레이트; 아세트아미노펜; 간염 B 바이러스 표면 항원(HBsAgs); 간염 B 코어 항원에 대한 항체, 예를 들면 항-간염 B 코어 항원 IgG 및 IgM(항-HBC); 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2(HIV 1 및 2); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2(HTLV); 간염 Be 항원(HBeAg); 간염 B e 항원에 대한 항체(항-HBe); 인플루엔자 바이러스; 갑상선 자극 호르몬(TSH);티록신(T4); 총 트리요오도티로닌(총 T3); 자유 트리요오도티로닌(자유 T3); 암종배아 항원(CEA); 지질 단백질, 콜레스테롤, 및 트리글리세리드; 및 알파 페토단백질(AFP)을 예시할 수 있다. 오용 및 제어 물질의 약물로서, 구체적으로 암페타민; 메타암페타민; 바르바투레이트, 예를 들면 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예를 들면 리브리움 및 발리움; 칸나비노이드, 예를 들면 하쉬쉬 및 마리주아나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타쿠알론; 아편제, 예를 들면 헤로인, 몰핀, 코데인, 히드로몰폰, 히드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시몰폰 및 오피움; 펜시클리딘; 및 프로폭시헨을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"접합체(cojugate)"는 광의로는 특정 물질 및 이에 접합된 검출 가능한 표지(label) 를 의미할 수 있는 바, 본 개시 내용에서는 표지로서 금 나노입자를 사용하고, 이에 바인더 성분(구체적으로 제1바인더)이 접합된 것을 의미할 수 있다.
"접촉한다"는 용어는 협의상 2개의 물질간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 구성 요소와 액체 흐름 간의 접촉이 이루어지는 한, 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명은 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 제공한다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자 및 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 나노입자는 그 형상이 특별히 제한되지 않으며, 상기 나노입자는 구형 입자, 표면에 다양한 형태의 나노입자가 올라간 딸기형 또는 성게형의 구형 입자, 이방성 입자, 중공 입자, 비대칭형 입자 및 모서리가 있는 입자로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 나노입자는 예를 들어 나노 구체, 나노 로드, 나노 큐브 및 다수의 기하학적 및 비기하학적 형태를 가질 수 있다. 특히 막대형, 삼각형, 프리즘, 정육면체와 같은 형태의 이방성 입자나 모서리가 있는 입자의 경우 라만 산란에 있어서 구형 입자와 비교하여 보다 강화된 신호를 제공할 수 있다. 표면 플라즈몬의 극대화를 위해 나노입자의 모양뿐 아니라 크기도 적절히 제어할 수 있다. 상술한 다양한 형태의 나노입자들의 제조방법은 다수의 문헌에 공지되어 있다.
본 발명의 상기 나노입자는 신호발생물질로서의 기능도 수행하여, 금속 나노입자일 경우에는 면역 검출용 접합체와 검체의 선택적인 반응에 의한 금속 나노입자의 색변화를 통해 항원을 검출할 수 있으며, 멤브레인 상에서 검체와 특이적으로 결합된 면역 검출용 접합체의 결합체의 흡광도, 전기 전도도 등을 측정함으로써 분석대상물질을 정량적으로 분석할 수도 있다. 이러한 금속 나노입자는, 예를 들어, 금, 은, 구리, 팔라듐, 백금, 알루미늄, 니켈, 철, 티타늄 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 금속 나노입자는 금 나노입자일 수 있고, 상기 금 나노입자는 크기가 2nm~100nm일 수 있다. 상기 금 나노입자는 금 이온과 환원제를 혼합하여 제조할 수 있으며, Sigma와 같은 시약회사에서도 상업적으로 용이하게 입수 가능하다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다. 이들 차단제는 필요에 따라 열, 산 또는 알칼리에 의한 부분 개질 등의 전처리를 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 검출 가능한 표지 매개 물질은 형광, 발색, 발광, 전기화학, 열 또는 자성의 신호를 단일로 혹은 표지 매개 물질을 중복사용하여 다중으로 발생하는 것일 수 있다. 구체적으로, 형광인 경우, 형광 물질을 이용하는 것으로, 형광 물질이 특정 파장의 빛을 받으면, 내부 전자 에너지가 여기(excited)되어 들뜬 상태가 되고, 이 전자 에너지가 특정 파장의 광자(photon)를 방출하면서 바닥 상태(ground state)로 이완되는데, 형광 스캐너를 이용해 특정 파장에서 방출되는 이 광자를 측정하는 방법이다. 발색은, 나노 내지는 마이크론 크기의 유색 입자(금 입자, 라텍스 비드 등) 혹은 효소를 이용하는 방법으로써, 효소의 경우 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 (HRP, Horse Radish Peroxidase) 와 알카린 포스파테이즈(ALP, Alkaline Phosphatase)가 대표적이다. HRP 효소인 경우 TMB (Tetramethylbezidine) 나 DAB(Diaminobenzidine)를, ALP 효소인 경우 NBT (NitroBlue Tetrazolium)를 기질(substrate)로 공급하면, 효소가 기질을 분해하여, 색을 내는 물질인(chromogenic) 효소 산물(product)을 만드는데, 이 산물을 특정 파장에서 흡광도(absorbance) 및 진하기(intensity)를 이용해 측정하는 방법이다. 발광은, 화학발광을 의미하는 것으로써, 이 역시 효소를 이용하는 방법이 대표적이다. 이 경우 빛(luminescence)을 내는 효소 산물을 만들도록 루미놀 기질을 공급하여 빛의 세기(intensity)를 측정하는 방법이다. 전기화학 방법은, 생물학적 특이성을 지니는 물질(biospecific reagents: 효소, 항원, 항체, 생화학물질 등)을 전극 표면에 고정시키거나 함유하게 함으로써 생물학적 인식 현상을 정량적인 전류, 전도도 혹은 전위 변화로 변화시켜 측정하는 방법이다. 열 신호의 경우 물리센서의 일종으로써, 써미스터(thermister)로 흡열 혹은 발열을 감지하여 전기신호로 변화시켜 측정하거나, 혹은 생물학적 특이성을 지니는 물질을 (효소, 항원, 항체, 생화학물질 등) 이용해 생물학적 인식 현상을 저항의 변화와 이에 따른 열의 발생 변화를 측정하는 방법이다. 자성 신호의 경우는, 자기장의 변화를 측정하는 것으로써, 다수의 자성 표지(자기 입자 또는 비드)에 서로 상보성(complementary) 이 있는 탐지 분자(target molecule) 또는 검지 분자(probe molecule)를 부착하고, 이들의 결합에 의해 센서 주변의 잔류하는 자성 표지의 표유 자기장을 감지하는 방법이다). 이러한 신호 측정 방법은 적절히 수정 및 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘의 중합체일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
상기 표지 매개 물질 중합체의 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변형을 촉매하여 검출 가능하다. 예를 들어, 효소는 분광 광도계로 측정할 수 있는 기질의 색 변화를 촉매하거나, 기질의 형광 또는 화학 발광을 변화시킬 수 있다. 화학 발광 기판은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 그 다음에 측정 될 수 있는 광을 방출하거나 (예를 들어, 화학 발광 광도계를 사용하여) 또는 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다.
상기 표지 매개 물질 중합체를 구성하는 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 적절한 방법을 통하여 중합된다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 공유 결합, 예컨데 가교 결합제를 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소는 단백질 성분을 포함한다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 단백질 성분을 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소 분자는 다당류 성분을 포함한다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 다당류 성분을 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 다당류 및 단백질 성분을 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 비공유 결합되어 있다. 일례로, 효소 중합체의 복수 개의 효소 분자는 다중 효소를 포함한다. 일례로, 다수의 효소 분자는 효소 응집체를 포함한다.
일반적으로, 중합 절차는 미리 선택된 크기의 중합 효소의 제어되고 재현 가능한 형성을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 효소의 농도, 완충액의 pH, 가교 시약에 대한 자유 작용기의 화학량 론, 온도 및 반응 시간은 이 조절 가능한 공정을 달성하는 모든 중요한 요소이다.
일례로, 효소 중합체는 약 5 내지 약 500 개의 효소 분자를 포함한다. 일례로, 효소 중합체는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 또는 250 개의 효소 분자를 포함한다. 일례로, 효소 중합체는 약 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 또는 5 미만의 효소 분자를 포함한다.
일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 효소 중합체 가교 결합제를 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 길이가 0 인 가교 결합제를 통해 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 선형 방식으로 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 분지 방식으로 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 혼합 선형 및 분지형 방식으로 공유 결합된다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 공유 결합으로 연결되어 선형 구조를 형성한다. 일례로, 효소 중합체의 효소 분자는 공유 결합되어 구형 구조를 형성한다.
일례로, 효소 중합체는 약 500 kDa 내지 약 5 mega Dalton (MDa)의 분자량을 갖는다. 일례로, 효소 중합체는 적어도 약 500 kDa의 분자량을 갖는다. 일례로, 효소 중합체는 약 5 MDa 이하의 분자량을 갖는다. 일례로, 효소 중합체는 적어도 약 750 kDa의 분자량을 갖는다. 일례로, 효소 중합체는 적어도 약 1, 2, 3 또는 4 MDa의 분자량을 갖는다.
일례로, 효소 중합체는 항체에 접합되기 전에 먼저 형성된다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다. 이를 통해 본원발명은 현저한 검출 신호 증폭을 제공할 수 있다.
상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid), 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch)일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있고, 구체적으로 항체일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체에서, 제1바인더, 일례로 항체는 표지 매개 물질 중합체, 일례로 스트렙타비딘 중합체 또는 효소 중합체에 접합된다. 일례로, 하나보다 많은 항체가 표지 매개 물질 중합체의 표면에 분산되어 결합된다.
본 발명의 면역 검출용 접합체는 항체가 2차 결합 리간드 및/또는 발색 기질과 접촉시 착색된 생성물을 생성시키는 효소 (효소 태그)에 연결되는 시험 관내에서 사용하기 위한 것들을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 우레아제, 알칼리성 인산 가제, 호스래디쉬 퍼옥시데이즈, 및/또는 글루코스 옥시다제가 있다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및/또는 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다.
상기 제1바인더와 표지 매개 물질 중합체는 적절한 방법에 의하여 접합될 수 있다. 예를 들어, 연결 고리를 통해 접합될 수 있으며, 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 뉴클레오타이드 결합, 리간드-바인더 등 생물 반응을 통한 물리적 결합 및 화학적 결합에 의한 연결 고리일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제1바인더, 일례로 항체는 표지 매개 물질 중합체, 일례로 스트렙타비딘 중합체 또는 효소 중합체에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 항체 또는 그의 단편상의 특정 부위에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 항체 또는 그의 단편상의 하나 이상의 특정 부위에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 항체 또는 그의 단편상의 무작위 부위에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 항체 또는 그의 단편상의 하나 이상의 랜덤 부위에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 아미노산의 내재적 또는 외인성 화학적 특성을 통해 항체 또는 그의 단편에 접합된다. 일 구현예에서, 효소 중합체는 아미노산 잔기의 내재적 또는 외인성 화학적 특성을 통해 항체 또는 그의 단편에 접합된다.
일 구현예에서, 면역 검출용 접합체는 하나 이상의 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 검출용 접합체는 복수의 효소 중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 검출용 접합체는 다수의 효소 중합체를 포함하며, 효소 중합체 각각은 거의 동일한 수의 효소 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 검출용 접합체는 복수의 효소 중합체를 포함하며, 복수의 효소 중합체는 각각의 효소 중합체의 효소 분자의 수에 분포를 나타낸다. 일 구현예에서, 면역 검출용 접합체는 복수의 효소 중합체를 포함하며, 복수의 효소 중합체는 효소 중합체의 형태에 차이를 나타낸다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 어느 하나의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 제공한다. 이와 관련하여, 도 1은 예시적인 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서의 개략적인 구성을 도시한다.
도시된 바와 같이, 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서의 전형적인 예는 스트립의 길이를 기준으로 일단으로부터 타단 방향으로, (i) 흡수성 샘플 패드(sample pad), (ii) 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 면역 검출용 접합체를 포함하는 접합 패드(conjugate pad), (iii) 상기 접합체의 제1바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정된 테스트 영역(test line) 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1바인더와는 결합하는 제3바인더가 고정된 컨트롤 영역(control line)을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드를, 순차적으로 배치하여 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 제공한다. 이러한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서를 구성하는 4개의 영역은 전형적으로 플라스틱 접착제에 의하여 백킹 카드 또는 백킹 시트상에 적층되어 있다. 또한, 각각의 패드는 상호 간에 접촉되거나 중첩된(overlapped) 형태로 배치될 수 있는 바, 이는 분석 과정에서 샘플 용액이 측면 흐름 분석-기반 면역 검출 센서를 따라 이동할 수 있도록 하기 위함이다. 전형적으로, 중첩된 영역의 폭은, 예를 들면 약 1 내지 3 mm, 구체적으로 약 1.5 내지 2 mm 범위일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 샘플(또는 샘플 용액)은 샘플 패드를 거쳐 접합(conjugate) 패드를 통과하고, 또한 멤브레인 형태의 검출 영역을 거치면서 테스트 영역 및 컨트롤 영역에 도달할 때까지 흐르게 된다. 이처럼, 샘플 패드, 접합 패드, 멤브레인 형태의 검출 영역 및 흡수 패드는 모두 유체 연통되어 있다.
일 구현예에서, 샘플 내 타겟 검체의 최소량(즉, 검출 한계; 검출 시 샘플 또는 샘플 용액에 존재해야 하는 타겟 검체의 최소량)은, 예를 들면, 적어도 약 0.01 ng/ml, 구체적으로 적어도 약 0.1 ng/ml, 보다 구체적으로 적어도 약 1 ng/ml 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로서 타겟 검체의 종류, 특성 등에 따라 변화 가능하다.
구체적으로, 샘플 패드는 전형적으로 샘플(구체적으로 액상의 분석용 샘플)을 균일하게 분포시키고, 또한 이를 인접하는 접합 패드로 전달하는 복수의 기능을 담당한다. 샘플은 모세관 현상에 의하여 샘플 패드로부터 화살표로 표시된 바와 같이 흡수 패드 방향으로 이동하게 된다. 일 구현예에 따르면, 샘플 패드는 완충 염, 단백질, 계면 활성제 및 샘플의 유속을 조절할 수 있는 다른 액체를 포함하는 조성물로 함침될 수 있다. 또한, 샘플 패드의 포어는 잉여 성분(예를 들면, 적혈구 세포)을 필터링하는 기능을 수행할 수 있다.
접합 패드의 경우, 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 면역 검출용 접합체를 보유하고, 테스트가 수행될 때까지 접합체가 기능적으로 안정하도록 유지하는 역할을 담당할 수 있다. 구체적으로, 접합체가 건조된 상태로 존재하다가 타겟 검체를 함유하는 샘플(또는 샘플 용액)이 흡수됨에 따라 유동성을 부여하여 하류에 위치하는 멤브레인 재질의 검출 영역으로 이동하도록 한다. 이를 위하여, 예를 들면 탄수화물(예를 들면, 수크로오스) 및 재용해제(resolubilization agent)를 함유하는 접합 완충액 조성을 이용할 수 있다. 이 경우, 접합체 입자가 당의 존재하에서 건조될 경우에는 당 분자가 입자 주변에 층을 형성하여 안정화시킬 수 있다. 샘플 용액이 접합 패드로 도입됨에 따라, 당 분자는 신속하게 용해되어 접합체 입자를 유체 흐름 내로 운반할 수 있다.
일 구현예에서, 접합 패드는 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체, 및 상기 중합체의 표면에 접합되어 있고 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 포함하는 면역 검출용 접합체를 포함하는 바, 이를 위하여 스프레이, 함침 등의 방법을 이용할 수 있다. 이때, 제1바인더는 타겟 검체와 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 것일 수 있고, 이러한 특이적 결합은 상보적 결합을 수반할 수 있다. 즉, 제1바인더는 특정 타겟 검체에만 결합하고(즉, 특이적으로 결합하고), 샘플 내에 있는 다른 분자 등과는 결합하지 않는 것일 수 있다. 예시적으로, 제1바인더는 항체(또는 항체 단편)일 수 있으며, 상기 항체는 타겟 검체인 항원에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 것이다. 접합체 내에서 제1바인더와 접합되는 금 나노입자의 경우, 검출 가능한 특성은 색상이며, 예를 들면 오렌지색, 적색, 자주색 등일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 접합체(제1바인더와 금 나노입자의 접합체)는 샘플 내 타겟 검체와 결합되어(샘플 내에 타겟 검체가 존재하는 경우) 검출 영역으로 이동한다.
일 구현예에서, 상기 검출 영역은 멤브레인, 구체적으로 다공성의 멤브레인 형태로 이루어지는 바, 예시적으로 셀룰로오스, 유리 섬유, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하변형된 나일론, 폴리에테르 설폰 등으로부터 선택될 수 있다. 보다 전형적으로는 니트로셀룰로오스가 사용될 수 있다. 상기 검출 영역에는 샘플의 흐름 방향으로 순차적으로 테스트 영역 및 컨트롤 영역이 배열되어 있는 바, 예시적으로 상기 테스트 영역 및 컨트롤 영역 각각은 멤브레인 상에서 가로질러 연장되는 라인 패턴으로 형성될 수 있다. 또한, 컨트롤 영역은 샘플의 흐름 방향 기준으로 테스트 영역의 하류에 위치할 수 있다.
상기 테스트 영역에서는 상기 접합체 내 제1바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정되어 있다. 이때, 제2바인더 역시 제1바인더와 유사하게 타겟 검체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 바, 구체적으로 접합체의 제1바인더와 특이적으로 결합되어 있는 타겟 검체(샘플 내에 타겟 검체가 존재하는 경우)를 경유하여 상기 접합체를 포획할 수 있다(샌드위치 방식). 이와 관련하여, 타겟 검체가 항원인 경우에 제2바인더는 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 접합체는 모세관 현상을 통하여 다공성 재질의 검출 영역 내에서 흡수 패드 방향으로 이동한다. 이때, 다공성 재질의 멤브레인의 포어 사이즈는, 예를 들면 약 0.05 내지 12 ㎛, 구체적으로 약 0.1 내지 7 ㎛ 범위일 수 있다.
샘플 내에 타겟 검체가 존재할 경우, 접합체에 결합된 제1바인더와 특이적으로 결합하여 일종의 접합체(예를 들면, 항원-항체-효소 중합체-금 나노입자)를 형성한다. 이와 같이 형성된 접합체는 테스트 영역 상에 고정되어 있는 제2바인더(예를 들면, 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 항체)에 의하여 포획되며, 그 결과 테스트 영역에 금 나노입자가 축적하여 특정 색상을 발현하게 된다(양성 테스트 결과). 이때, 금 나노입자의 사이즈는 다공성 멤브레인의 검출 영역의 포어를 통하여 이동할 수 있도록 설계된다. 또한, 금 나노입자는 제1바인더(예를 들면, 항체)에 용이하게 결합 또는 코팅될 수 있다. 이와 같이, 테스트 라인에 금 나노입자가 포획될 경우, 가시광선과 상호작용하여 육안 또는 다양한 검출 장치(또는 분석 장치)에 의하여 검출 가능한 변화(구체적으로 색상)를 일으키게 된다. 반면, 접합체가 타겟 검체와 결합되지 않은 경우, 상기 접합체는 샘플의 흐름과 함께 테스트 영역을 통과하게 된다.
한편, 검출 영역 중 컨트롤 영역의 경우, 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나, 제1바인더와 결합하는 제3바인더가 고정될 수 있다. 예를 들면, 제3바인더는 제1바인더와 특이적으로 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 제1바인더는 타겟 검체와 결합되어 있는 1차 항체일 수 있다. 따라서, 접합체가 타겟 검체와 결합되지 않은 관계로 테스트 영역을 지나치더라도 제3바인더와 결합되어 컨트롤 영역 상에서 포획될 수 있다. 예를 들면, 샘플 내에 타겟 검체가 존재하지 않는 경우, 테스트 영역에서 색상 등이 발현하지 않더라도 컨트롤 영역에서는 색상 등이 발현하게 된다. 이처럼, 상기 컨트롤 영역에서의 응답(response)은 액상 샘플이 센서를 적절히 통과하고 있음(즉, 컨트롤 영역으로부터의 시그널은 접합체가 존재하고 제3바인더가 이러한 접합체와 결합(binding)되어 있음을 지시하므로 면역 검출 센서가 적절히 작동하고 있음)을 의미한다.
구체적으로, 제3바인더는 샘플에 타겟 검체의 존재에 관계없이, 접합체 중 금 나노입자와 접합되어 있는 제1바인더와 결합하여 컨트롤 영역 상에 축적된다. 일 구현예에 따르면, 상기 제3바인더는 2차 항체로서 Fc영역 또는 Fab 영역과 같은 항체 단편 또는 전체 Ig 분자에 대하여 특이성을 나타내는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 예를 들면, 접합체로서 금 나노입자와 마우스 항-휴먼 IgG(mouse-anti human IgG)의 접합체가 사용될 경우, 컨트롤 영역에서의 제3바인더는 항체로서 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG), 예를 들면 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체 등일 수 있다.
전술한 바와 같이, 컨트롤 영역을 통과한 샘플(또는 샘플 용액)은 하류에 위치하면서 멤브레인 재질의 검출 영역에 접촉되어 있는 흡수 패드 내로 흡수된다. 상기 흡수 패드는 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반 면역 검출 센서의 단부에 부착되어 과량의 반응 시약을 흡수하여 액체의 역흐름(backflow)을 방지하고 처리된 액체를 수집하는 기능을 하는 바, 흡수 패드는 보다 큰 샘플 용액의 체적의 사용을 허용함으로써 테스트의 감도를 증가시킨다. 일 구현예에서, 흡수 패드는 셀룰로오스 필터 등의 재질일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 제1바인더와 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 면역 검출 센서일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질은 효소일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid), 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch)일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 면역 검출 센서에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 상술한 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 신호 증폭 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, S1) 나노입자 및 검출 가능한 표지 매개 물질 중합체를 접합시키는 단계, 및 S2) 상기에서 제조된 나노입자-표지 매개 물질 중합체의 접합물에 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 복수 개의 제1바인더를 상기 표지 매개 물질 중합체의 표면에 접합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법은 나노입자에 표지 매개 물질 중합체를 접합하면서 접합체를 제조하기 때문에, 세척 및 정제를 수행하는 과정에서 예컨대 원심분리기를 사용하여 신속하고 빠르게 세척 및 정제할 수 있다. 이와 달리 나노입자 없이 효소 중합체 같은 표지 매개 물질 중합체만으로 접합체를 제조하려는 경우에는 세척 및 정제를 위하여 투석 과정을 거쳐야 하기 때문에 최소 12시간이 소요된다. 따라서 본 발명은 접합체 제조에 소요되는 세척 및 정제 시간을 단축한다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 S1) 단계 이후, S2) 단계 이전에 농축하는 단계를 수행할 수 있다. 농축 과정을 수행하면 AuNP-PolyEnzyme 접합체와 항체 사이의 거리를 줄여 반응할 수 있는 확률을 높일 수 있고 이를 통해 제조 효율을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 농축 후 S2 단계 수행을 위해 최적의 조건을 제공하는 버퍼로 교체한 후 S2 단계를 수행할 수 있다. 일례로, S1 단계의 수득물을 원심분리하여 농축한 후 상등액을 제거한 후 1x PBS (pH 7.4)를 적당량 가하여, 항체에 붙어있는 비오틴과 AuNP-PolyEnzyme의 스트렙타비딘간의 결합이 가장 잘 일어날 수 있는 환경(pH, 이온 농도)을 만들어주어 수율을 높일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질은 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 제1바인더와 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 면역 검출용 접합체의 제조 방법일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질은 효소일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체인 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 상기 효소 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 것이다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 표지 매개 물질 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것일 수 있다.
상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid), 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch)일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 따르면, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 면역 검출용 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 표지 매개 물질 중합체는 알카린 포스파테이즈 및 스트렙타비딘이 덱스트란 중합체 골격에 결합된 알카린 포스파테이즈 중합체, 제1바인더는 비오틴이 접합된 항체로서, 상기 표지 매개 물질 중합체 및 제1바인더는 비오틴-스트렙타비딘의 결합으로 결합된 것일 수 있다.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조
본 발명의 면역 검출용 접합체는 다음의 과정을 통하여 제조하였다.
1) 1.5 mL EP 튜브에 1x 농도 (1.40 × 1012 / mL)의 금 나노입자 1 mL에 0.1 M 보레이트 버퍼(borate buffer, pH 8.5) 100 mL를 차례로 추가하고, 30초 동안 볼텍스 믹싱한 후 10초 동안 스핀-다운(spin-down) 하여 25°C에서 10분간 정류하였다.
2) 상기 용액에 HRP-StA 중합체 1 mg/mL을 10 mL 첨가한 후 30초 동안 볼텍스 믹싱한 후 10초 동안 스핀-다운하고, 회전교반기(25 rpm)를 이용하여 25°C에서 1시간 동안 반응시켰다.
3) 블로킹을 위해 20 % (g/g) BSA 함유 1x PBS (pH 7.4), 5 mL를 첨가 후 30초 동안 볼텍스 믹싱, 10초 동안 스핀-다운하고 4°C에서 30분간 정류하여 반응시켰다.
4) 원심분리기를 이용하여 세척을 진행하였다. 이때, 15 nm 금 나노입자 기준 15,000 rpm, 10 °C 에서 25분간 원심분리한 후 상등액을 버리고, 10 mM 보레이트 버퍼 (pH 8.5) 1mL를 추가한 후 EP 튜브 하단부에 있는 펠렛이 잘 풀어 섞여지도록 한 뒤, 다시 원심분리기를 이용한 세척을 진행한다. 이 과정은 3회 반복하여 실시하였다.
5) 마지막 세척 과정이 끝나면 상등액을 제거하여 농축한 후 1x PBS (pH 7.4) 100 mL를 첨가하여 펠렛을 잘 풀어주었다.
6) 상기 용액에 비오틴과 결합된 항체 1 mg/mL, 10 mL를 첨가하고 10초 동안 볼텍스 믹싱한 후 10초 동안 스핀-다운하여 25 °C에서 2시간 동안 정류하여 반응시켰다.
7) 블로킹을 위해 5 mg/mL 비오틴-BSA, 5 mL 를 추가하고 25°C에서 30분 동안 정류하여 반응시켰다.
8) 원심분리기를 이용하여 세척을 진행하였다. 이때, 15 nm 금 나노입자 기준 15,000 rpm, 10 °C 에서 25분간 원심분리한 후 상등액을 버리고, 10 mM 보레이트 버퍼 (pH 8.5) 1mL를 추가한 후 EP 튜브 하단부에 있는 펠렛이 잘 풀어 섞여지도록 한 뒤, 다시 원심분리기를 이용한 세척을 진행하였다. 이 과정은 3회 반복하여 실시하였다.
9) 마지막 세척 과정이 끝나면 상등액을 제거하고 접합체 보관버퍼 50 mL를 첨가하여 펠렛을 잘 풀어주어 보관하였다. 이때, 접합체의 농도를 20x로 정의한다. 본 발명의 AuNP-PolyAPStA-Ab 접합체 및 AuNP-PolyStA-Ab 접합체도 동일한 방식으로 제조하였으며, 상기 2)에 사용된 HRP -StA 중합체 대신 각각 AP-StA 중합체 및 StA 중합체를 사용하였다.
[실시예 2] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 분석 결과
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 흡수 스펙트럼을 다음의 방법을 통하여 측정하였다.
금 나노입자와 각 접합체 농도가 최종 0.5x (1 mL)가 되도록 10 mM 보레이트 버퍼 (pH 8.5)를 사용하여 희석하였다. 예를 들어, 20x 접합체 25 mL와 10 mM 보레이트 버퍼 (pH 8.5) 975 mL 를 섞어 0.5x 농도 (1 mL) 에 해당하도록 희석하였다. 분광광도계를 이용하여 각 샘플의 400 - 700 nm 구간에서의 흡광도를 측정한다. 이때, 희석제로 사용된 10 mM 보레이트 버퍼 (pH 8.5)를 참조(reference)로 사용하고, 측정은 25 °C에서 수행하였다. 400 - 700 nm 구간에서 각 샘플의 최대 흡광도에 대응하는 파장을 확인하였다.
상기 방법으로 본 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 도 3a 및 3b에 나타냈다. 컨쥬게이션이 진행될수록 장파장으로 Localized surface plasmon resonance (LSPR) peak shift가 발생하여, 각 스텝별로 반응이 잘 이루어짐을 확인하였다.
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 크기를 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)를 이용하여 측정하였고, 그 결과는 도 4에 나타냈다.
상기 DLS 측정을 통해 PolyHRPStA 크기와 접합체 크기를 측정하여, 각 스텝에 따라 접합체 크기가 증가함을 확인하였고, AuNP와 PolyHRPStA 간의 흡착 반응에 의한 크기 증가와 AuNP-PolyHRPStA과 항체의 스트렙타비딘-비오틴 결합에 의한 접합체 크기 증가가 확인 가능하였다. 본 발명의 AuNP-PolyAPStA-Ab 접합체의 크기 증가도 동일한 방식으로 확인하였다.
[실시예 3] 본 발명 면역 검출용 접합체의 반응 감도
AuNP-poly HRP 접합체 및 AuNP-HRP 접합체의 반응 감도 분석
AuNP-PolyHRP 접합체의 HRP 반응 감도를, PolyHRP와 HRP를 동일한 양(단백질 농도 기준)을 추가하여 제작한 단일 효소 AuNP 접합체(AuNP-HRP)와 동일한 농도에서 HRP 반응의 감도를 비교하였다.
실험 결과, PolyHRP에서는 HRP가 Polymer에 연결된 형태로 존재하기 때문에, 단일 개의 AuNP에 일반적인 HRP를 흡착시켰을 때 보다 더 많은 수의 HRP를 흡착시키는 효과로 인해 향상된 민감도를 보였다(도 5 a). 이를 통해 효소 중합체를 사용한 접합체(AuNP-PolyHRP)의 감도가 단일 효소를 사용한 접합체(AuNP-HRP)의 감도보다 우수함을 알 수 있었다.
AuNP-polyStA 접합체 및 AuNP-StA 접합체의 반응 감도 분석
PolyStA를 사용하는 본 발명 면역 검출용 접합체의 컬러리메트릭(Colorimetric, color) 검출 신호의 세기 증가와 감도 향상 효과를 확인하였다. StA(Streptavidin)과 PolyStA(다수의 StA이 한 개의 고분자에 연결된 형태)을 각각 매개로 하여 제작한 접합체를 사용하여 LFA에서 IL-8을 검출한 결과를 비교하였다. 항체는 비오틴으로 표지되어 있고, StA 한 개에 비오틴이 최대 4개가 특이적으로 결합할 수 있어, StA 또는 PolyStA을 사용한 경우 AuNP와 항체를 직접 흡착시킨 접합체보다 AuNP 개당 대응하는 항체 수를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 5b, 5c). 본 발명에 의한 PolyStA 을 접합 매개체로 사용한 경우 일반적인 AuNP-Ab 접합체 대비 동일 농도 항원에 대해 신호 세기가 대폭 증가하고 검출 감도도 약 100배 정도 향상되었다. 이는 StA 단일 분자를 접합 매개체로 사용하여 항체와 AuNP를 접합했을 때의 결과(약 10배 검출 감도 향상)로부터 추가로 10배 향상된 결과를 나타낸다. 이는 표지 매개 물질 중합체(PolyStA)를 사용하여 AuNP에 대응하는 항체의 개수를 획기적으로 증가시켜 LFA에서의 검출 감도를 획기적으로 향상시킬 수 있음을 나타낸다(도 5b, 5c).
[실시예 4] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상온 안정성
AuNP-PolyHRP 접합체의 상온 안정성을 다음의 방법을 통하여 평가하였다.
상온에서 보관중인 접합체 1 μL를 NC 멤브레인에 떨어뜨려 처리한 후, 37℃에서 15분 동안 건조하였다. 샘플 패드와 흡수 패드를 부착한 스트립에 루미놀 용액 90 μL를 로딩하고, 5분 후에 화학발광 시그널을 측정하였다. 1 일차에서 측정된 시그널 세기를 100%로 하여 측정된 시그널과 비교하여 % 수치로 환산하였다. 대조군은 AuNP-HRP 접합체를 사용하였다.
실험 결과는, 대조군 AuNP-HRP 접합체는 보관 기간이 경과할수록 안정성이 저하된 반면, AuNP-PolyHRP 접합체는 장기간의 상온 보관에서도 안정함을 확인할 수 있었다(도 6).
[실시예 5] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 재현성 검증
본 발명의 AuNP-PolyHRP-Ab 접합체 제작과 분석 결과의 재현성을 증명하기 위해서 세 가지 배치(batch)에 대해 검증을 수행하였다.
검증 결과, 컬러리메트릭 (Colorimetric, Color) 방법과 화학발광(Chemiluminescence, CL) 방법에서 모두 우수한 재현성이 확인되었다. 특히, Inter-batch CV(Coefficient of variation, %)는 Color와 CL 각각 2.67 %와 2.32 %로 확인되었다(도 7).
[실시예 6] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 성능 평가 1
멤브레인에 접합체를 농도별로 희석한 용액을 스폿팅한 이후, 컬러리메트릭(Colorimetric) 방식과 화학발광(Chemiluminescence) 방식을 사용했을 때, 각각의 방식에서 어느 농도까지 신호 검출이 가능한지 확인하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1) 접합체 보관 버퍼를 희석제로 사용하여 접합체를 1x 이하 농도로 순차적으로 희석한 후, 흡수 패드와 샘플 패드가 결합된 3.8 mm 간격의 NC 멤브레인에 접합체 희석 용액들을 1 mL씩 떨어뜨리고 37 °C 오븐에서 15분 동안 건조시켰다.
2) 컬러리메트릭 방식 측정은 샘플 패드에 1x PBS (pH 7.4) 100 mL를 떨어뜨리고 5분 후에 Chemidoc-MP image system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 컬러리메트릭 모드를 이용하여 0.12초 노출 조건에서 진행되었다.
3) 화학발광 방식 측정은 샘플 패드에 루미놀 반응용액 (10 mM luminol, 5 mM 4-iodophenol, 1 mM H2O2 in 0.1M pH 8.5 Tris-HCl)을 100 mL를 떨어뜨리고 5분 후에 Chemidoc-MP image system의 화학발광 모드를 이용하여 60초 노출 조건에서 진행되었다.
실험 결과, 접합체 내의 AuNP 양에 따라 색 강도를 검출하는 컬러리메트릭방법(신호 증폭 전)으로는 0.25x 까지만 검출이 가능했지만, 접합체 내의 효소를 사용하여 발생되는 발광 반응을 검출하는 화학발광 방법(신호 증폭 후)으로는 0.00025x 까지 검출 가능함을 확인하였다(도 8 및 9).
[실시예 7] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 성능 평가 2
본 발명의 면역 검출용 접합체를 이용하여 카디악 트로포닌 I(cardiac troponin I, cTnI), 인터루킨-8(Interleukin-8, IL-8)을 검출하여 성능을 평가하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1) 본 실험에 사용된 멤브레인 스트립 센서는 샘플 패드, 접합체 패드, NC 멤브레인, 흡수패드로 구성하였다. 샘플 패드는 1 % (g/g) 카제인 용액으로 블로킹처리하고, 접합체 패드는 AuNP-PolyHRPStA-TnI 검출 항체 접합체로 동결건조 처리하고, NC 멤브레인의 test line은 TnI 포획(capture) 항체 (1 mg/mL, 1.19 mL/cm)를 고정하고 control line에는 Anti-ms-IgG 항체 (0.1 mg/mL, 1.00 mL/cm)를 고정하였다. IL-8 실험에 사용된 스트립도 검출/포획 항체를 제외하고는 TnI 실험에 사용된 스트립과 동일한 구성으로 제작하였다. IL-8 실험에서는 AuNP-PolyHRPStA-IL-8 검출 항체 접합체를 사용한 실험과(도 11a, 11b) AuNP-PolyAPStA-IL-8 검출 항체 접합체를 사용한 실험(도 11 c, 11d)을 수행하였다.
2) cTnI 또는 IL-8 항원은 실험 직전 인간 혈청에 농도별로 스파이킹 하였고, 샘플 로딩 시에는 분석 버퍼에 1/10로 희석되어 샘플 패드에는 100 mL 로딩하였다.
3) 10분동안 반응 후, 1x PBS (pH 7.4), 50 mL를 샘플 패드에 추가하여 5분 동안 세척과정이 일어나도록 하였다.
4) 스트립 센서에서 접합체 패드와 샘플 패드를 제거하고, 루미놀 반응 용액 13 mL를 NC 멤브레인 하단부에 로딩하고 3분 후에 Chemidoc-MP image system의 화학발광 모드를 이용하여 60초 노출 조건에서 신호 측정을 하였다.
실험 결과, 매우 낮은 수준의 항체 농도에서도 본 발명의 복합체를 사용하면 효과적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 10 및 11).
[실시예 8] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 성능 평가 3
본 발명의 면역 검출용 접합체에 대하여, 측면 흐름 분석으로 항원을 검출한 후, 컨쥬게이트 패드와 NC 멤브레인에 잔류하는 접합체 양을 비교하고 test spot 신호 세기와 배경 신호 세기 분석을 수행하여 면역 검출의 성능을 평가하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1) PolyHRP-Ab 접합체(대조군)와 AuNP-PolyHRP-Ab 접합체(실시예)의 PolyHRP와 Ab양이 동일하도록 준비한 시료를 컨쥬게이트 패드 (3.8 × 6mm2)에 처리하여 37℃에서 30분 동안 건조시켰다.
2) 위의 컨쥬게이트 패드를 0.9 μg cTnI Ab와 0.08 μg Anti-ms-IgG Ab가 처리된 NC 멤브레인에 흡수패드, 샘플패드와 함께 부착하여 LFA 스트립을 제작하였다.
3) cTnI 0.1 ng/mL 항원 용액 100 ul를 스트립의 샘플패드에 로딩하여 15분간 반응시켰다.
4) 반응이 끝난 스트립을 37℃에서 15분 동안 건조시켰다.
5) 반응 이후에도 NC 멤브레인과 컨쥬게이트 패드에 잔류하는 HRP양을 비교하기 위해서, 건조된 스트립을 분리한 후 TMB 용액을 NC 멤브레인과 컨쥬게이트 패드에 각각 20 ul, 10 ul씩 처리한 후 5분 동안 반응시켜 색 변화를 확인하였다.
6) NC 멤브레인은 Chemi-Doc MP 측정장비의 Colorimetric 측정 모드로 촬영하여 Test spot과 Background 세기 분석을 진행하였다.
컨쥬게이트 패드(conj. pad)의 TMB 발색 반응 전후를 비교한 결과, 본원발명 실시예(AuNP-PolyHRP-Ab 접합체)를 처리한 패드는 TMB 발색 반응 전후로 육안으로 확인시 색 변화가 미미하게 일어난 반면, 대조군(PolyHRP-Ab 접합체)을 처리한 패드는 TMB 반응 전후로 색 변화가 매우 강하게 일어났다. 이를 통해, LFA 반응 과정에서 본원발명은 컨쥬게이트 패드에서 쉽게 방출되었음을 확인할 수 있다. 반면, 대조군 PolyHRP-Ab 접합체는 컨쥬게이트 패드로부터 방출되지 않고 잔류하는 접합체가 존재함을 확인하였다(도 12a 하단). 이를 통해, 본원발명(AuNP-PolyHRP-Ab 접합체)가 컨쥬게이트 패드로부터 방출되는 효율이 효소중합체-항체 접합체 대비 매우 우수함을 알 수 있다.
또한, NC 멤브레인의 TMB 발색 반응 전후 비교를 통해 NC 멤브레인에서의 TMB 반응을 통해 테스트 스팟(test spot)과 배경(background) 부분에서의 발색 정도를 확인하고, 이를 통해 면역 반응의 정도와 배경 부분에 잔류하는 HRP양을 비교하였다. 비교 결과, 본원발명 실시예(AuNP-PolyHRP-Ab 접합체)을 사용하여 면역 반응을 진행한 NC 멤브레인은 TMB 발색 반응 후에도 test spot과 control spot을 제외한 배경 부분의 색 변화가 크지 않았다. 이를 통해, 본원발명 AuNP-PolyHRP-Ab 접합체는 특이 반응이 일어나는 test spot과 control spot 이외의 배경 부분에서 NC 멤브레인과의 비특이 반응이 거의 없이 NC 멤브레인을 통과함을 확인할 수 있다. 반면, 대조군(PolyHRP-Ab 접합체)을 사용하여 면역 반응을 진행한 NC 멤브레인은 TMB 발색 반응 후 test spot과 control spot을 제외한 배경 부분에서도 뚜렷한 색 변화가 발생하였다(도 12a 상단). 이는 PolyHRP-Ab 접합체가 NC 멤브레인을 통과하지 못하고 잔류한 HRP가 반응했기 때문이다.
결과적으로, 본원발명의 AuNP-PolyHRP-Ab 접합체는 NC 멤브레인을 잘 통과해 비특이반응을 최소화 할 수 있지만, PolyHRP-Ab 접합체는 NC 멤브레인을 잘 통과하지 못하고 잔류하는 양이 많아 배경 신호를 증가시키고 비특이반응을 유발할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 TMB 반응 후 Test spot과 배경 부분의 시그널 세기를 수치적으로 나타낸 결과를 도 12b에 도시하였다. 대조군(PolyHRP-Ab 접합체)의 경우, test spot과 배경 부분의 시그널 세기가 전반적으로 본원발명의 실시예(AuNP-PolyHRP-Ab 접합체) 보다 높게 확인되었으나, 배경 신호의 영향을 제거한 test spot의 실제 시그널 세기 (Test spot 시그널 세기-배경 신호 시그널 세기)를 계산한 결과, 동일 항원 농도에 대해 본원발명의 실시예의 신호 세기가 대조군의 신호 세기보다 우수함을 확인하였다(도 12b).
상기 결과를 통해 본원발명의 접합체가 LFA 면역 검출 반응 이후 멤브레인의 배경부분과 컨쥬게이트 패드에 남아있는 접합체 양이 최소이고, LFA 면역 검출 이후 test spot 또는 line에서 동일 농도 항원에 대해 배경 신호 대비 가장 높은 시그널 세기를 보여 우수한 LFA 면역 검출용 접합체가 되기 위한 조건을 충족하였음을 알 수 있다.
구체적으로, LFA에 사용되는 NC 멤브레인이나 각종 패드는 이들을 구성하는 섬유 다발과 기공이 모인 다공성 구조로 구성되고, 액체 상태의 샘플을 샘플 패드에 흘려주면, 이 샘플은 모세관 현상에 의해 기공을 따라 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, NC 멤브레인, 흡수 패드 순서로 이동하게 된다. 이때, PolyHRP-Ab 접합체의 경우 길게 뻗어있는 선형 중합체 모양의 구조로 인해 멤브레인과 패드의 섬유 다발이나 기공에 걸릴 수 있는 가능성이 증가하고, 멤브레인이나 패드로부터의 저항 증가하고, 이는 멤브레인이나 패드에서 PolyHRP-Ab 접합체의 통과 효율을 감소시켜, 샘플 용액의 지속적인 흐름에 의한 세척 이후에도 멤브레인이나 패드에 접합체가 남아 비특이적 반응이나 높은 배경 신호를 유발할 가능성을 높인다. 그러나, 본원발명의 면역 검출용 접합체는 나노입자의 구형(sphere) 구조를 중심으로 선형의 표지 매개 물질 중합체가 모여, 일례로 AuNP-PolyHRP-Ab 접합체가 제작되고, 나노입자를 중심으로 중합체와 항체가 모여 있는 형태로 접합체를 형성하므로 멤브레인과 패드의 섬유 다발에 걸릴 가능성을 감소시켜 멤브레인이나 패드로부터의 저항 감소시켜 기공을 통과할 수 있다(도 13). 이로써 본원발명의 면역 검출용 접합체의 멤브레인이나 패드에서의 통과 효율이 좋아지고, 나노입자를 이용한 접합체의 경우 샘플 용액의 지속적인 흐름에 의한 세척 과정에 의해 멤브레인과 패드에 접합체가 잔류할 가능성을 최소화하여 비특이적 반응과 배경 신호 발생 가능성이 낮아지는 효과를 발휘함을 알 수 있다.
결론적으로 상기 실험들을 통하여, 본 발명에 따른 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법은 종래 면역 검출용 항체보다 검출 감도를 1000 내지 10000배 향상시키고, 검출하고자 하는 항원 농도에 따라 신호증폭반응 사용 여부를 조절할 수 있고, 신호증폭 전후로 모두 검출 여부 판별이 가능하므로, 검출 가능 범위 (Dynamic Range)가 증가하고, 접합체 제작 과정이 단순하고 간편하고, 정형질인 나노입자를 기준으로 분석을 진행하므로, 접합체 분석과 정량 과정에서의 정확성과 재현성이 우수하고, 고분자 형태의 효소를 이용하므로 개별 나노입자에 붙일 수 있는 효소의 수가 획기적으로 증가하여 초고감도 검출이 가능하고, 기존 기술 대비 상대적으로 짧은 시간 내에 저농도 항원까지 검출이 가능하고, 타겟 검체와 반응하는 바인더(항체)가 나노입자 표면에 직접 붙는 비율보다 효소 중합체와의 결합에 의해 효소 중합체와 결합되는 비율이 높기 때문에 배향성이 향상되어 표적물질과의 반응성이 증가함을 확인하고, 구형인 나노입자를 중심으로 접합체가 제작되므로 선형 중합체 구조인 표지 매개 물질 중합체-항체 접합체 구조 대비 멤브레인과 패드로부터 받는 저항이 낮아 흐름 효율이 우수하여 낮은 비특이 반응과 배경신호로 인해 정확한 결과 신호 검출이 가능함을 확인하였다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (39)

  1. 나노입자; 상기 나노입자에 접합되고 복수 개의 효소 및 스트렙타비딘이 결합된 중합체; 및 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 비오틴이 접합된 복수 개의 제1바인더;를 포함하며, 상기 제1바인더는 스트렙타비딘 및 비오틴의 결합으로 상기 중합체의 표면에 결합되고, 나노입자를 중심으로 상기 중합체와 제1바인더가 모여있는 형태인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
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  6. 제1항에 있어서, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  14. (i) 흡수성 샘플 패드,
    (ii) 나노입자, 상기 나노입자에 접합되고 복수 개의 효소 및 스트렙타비딘이 결합된 중합체, 및 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 비오틴이 접합된 복수 개의 제1바인더를 포함하며, 상기 제1바인더는 스트렙타비딘 및 비오틴의 결합으로 상기 중합체의 표면에 결합되고, 나노입자를 중심으로 상기 중합체와 제1바인더가 모여있는 형태인 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체를 포함하는 접합 패드,
    (iii) 상기 접합체의 제1바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1바인더와는 결합하는 제3바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및
    (iv) 흡수 패드를, 순차적으로 일단으로부터 타단 방향으로 배치하여 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  15. 제14항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  16. 제14항에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  20. 제14항에 있어서, 상기 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  21. 제14항에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  22. 제14항에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  23. 제14항에 있어서, 상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 센서.
  24. 삭제
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  26. 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출 방법.
  27. 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체와 시료를 혼합하여 시료 내 타겟 검체와 특이적 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 신호 증폭 방법.
  28. S1) 복수 개의 효소 및 스트렙타비딘이 결합된 중합체를 나노입자에 접합시키는 단계, 및
    S2) 상기에서 제조된 나노입자-중합체의 접합물에 타겟 검체와 특이적으로 결합하고, 비오틴이 접합된 복수 개의 제1바인더를 스트렙타비딘 및 비오틴 결합을 통하여 상기 중합체의 표면에 접합시키는 단계를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제28항에 있어서, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스퍼옥시데이즈(arthromyces ramosus peroxidase), β-락타메이즈(β-lactamase), 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지네이즈(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 루시퍼레이즈(luciferase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase), 갈락토즈 옥시데이즈(galactose oxidase), 아세틸콜린-스테라제(acetylcholine-sterase), 엔테로키나아제(enterokinase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소의 중합체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  34. 제28항에 있어서, 상기 중합체는 효소 분자들이 중합체 골격에 결합되어 중합체의 공간 내부로 유입되는 복수 개의 기질과 복수 개의 검출 반응이 가능한 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 제1바인더는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 타겟 검체는 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
  37. 제28항에 있어서, 상기 중합체 골격은 아민 기, 알데하이드 기 또는 카르복실 기 등이 분자 내에 존재하여 화학 반응을 통하여 본 발명의 효소와 결합할 수 있는 것으로, 일례로 덱스트란(Dextran), 덱스트린(Dextrin), 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride)), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드(Poly(vinylamine) hydrochloride), 폴리(L-리신 하이드로브로마이드(Poly(L-lysine hydrobromide)), 폴리(알릴아민)(Poly(allylamine)), 폴리(아크릴아민)(Poly(acrylamine)),폴리(알릴아민 하이드로클로라이드(Poly(allylamine hydrochloride)), 폴리(4-아미노스티렌)(Poly(4-aminostyrene)), 폴리(N-메틸비닐아민)(Poly(N-methylvinylamine)), 폴리(에틸렌 글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride)), 키토산(Chitosan), 폴리시알릭산(Polysialic acids), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline)), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 하이드록시에틸-전분(Hydroxyethyl-Starch) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체의 제조 방법.
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