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KR101919330B1 - 고감도의 면역크로마토그래프 방법 및 면역크로마토그래프용 키트 - Google Patents

고감도의 면역크로마토그래프 방법 및 면역크로마토그래프용 키트 Download PDF

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KR101919330B1
KR101919330B1 KR1020120056726A KR20120056726A KR101919330B1 KR 101919330 B1 KR101919330 B1 KR 101919330B1 KR 1020120056726 A KR1020120056726 A KR 1020120056726A KR 20120056726 A KR20120056726 A KR 20120056726A KR 101919330 B1 KR101919330 B1 KR 101919330B1
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KR
South Korea
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protein
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protease
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준이치 카타다
히로유키 치쿠
Original Assignee
후지필름 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 면역크로마토그래프 방법으로 시그널을 증폭시킬 때에 위양성의 발생을 억제함으로써 고감도이고 또한 위양성이 없는 검출을 행할 수 있는 면역크로마토그래프 방법을 제공한다. 피검물질과, 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질과 복합체를 형성시킨 상태에서, 이러한 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개하고; 상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 피검물질에 대한 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 포함하는 불용성 담체 상의 검출 부위에 있어서 피검물질과 표식물질을 포착하며; 포착한 표식물질을 증폭시켜서 피검물질을 검출하는 것을 포함하는 면역크로마토그래프 방법.

Description

고감도의 면역크로마토그래프 방법 및 면역크로마토그래프용 키트{HIGH SENSITIVITY IMMUNOCHROMATOGRAPHIC METHOD AND KIT FOR IMMUNOCHROMATOGRAPH}
본 발명은 표식 항체를 사용한 면역크로마토그래프 방법 및 면역크로마토그래프용 키트에 관한 것이다.
피검액 중의 특정 성분을 측정하는 방법으로서 항원항체반응을 이용한 면역 측정 방법이 수많이 존재한다. 면역 측정 방법에서는 측정하고 싶은 특정 성분에 대한 항체 또는 항원의 비특이적인 반응이 문제가 되는 경우가 많다. 따라서, 블록킹제를 사용해서 비특이적인 반응을 억제하는 방법이 통상 사용된다. 블록킹제를 사용한 비특이 반응 억제법으로서는, 예를 들면 ELISA의 경우에는 반응 용기를 블록킹제로 처리하는 것, 라텍스 응집법의 경우에는 라텍스 입자를 블록킹제로 처리하는 것이 행하여진다(특허문헌 1). 블록킹제로서는 소 혈청 알부민(이하, BSA로 약기한다), 카제인, 젤라틴 등이 사용된다.
또한, 특허문헌 2에는 EIA의 계에 있어서 pH7.2의 조건에서 100℃ 30분간 열처리를 행한 카제인을 사용함으로써 비특이 반응을 억제하는 담체를 제작할 수 있는 것이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는 프로테아제를 이용하여 분자량 약 1,000∼26,000으로 분해한 카제인을 면역 측정을 행하는 반응액 중에 첨가함으로써 비특이 반응을 억제하는 것이 개시되어 있다.
면역 측정 방법 중에서도 면역크로마토그래프법은 조작이 간편하고 단시간에 측정 가능하기 때문에 일반적으로 자주 이용되고 있다. 면역크로마토그래프법에서 사용되고 있는 면역반응으로서는 경합형 반응 또는 샌드위치형 반응이 널리 사용되고 있다. 그 중에서도, 면역크로마토그래프법에서는 샌드위치형 반응이 주류이며, 그 전형예에 있어서는 시료 중의 항원으로 이루어지는 피검물질을 검출하기 위해서 이하와 같은 조작이 행하여진다. 우선, 피검물질인 항원에 대한 항체에 의해 감작시킨 미립자를 고상 미립자로서 크로마토그래프 담체에 고정화함으로써, 또는 이 항체 자체를 크로마토그래프 담체에 직접 고정화함으로써 반응 부위를 갖는 크로마토그래프 담체를 조제한다. 한편, 표식 미립자에 피검물질과 특이적으로 결합 가능한 항체를 감작시켜서 감작 표식 미립자를 조제한다. 이 감작 표식 미립자를 시료와 함께 크로마토그래프 담체 상에서 크로마토그래프적으로 이동시킨다. 이상의 조작에 의해 크로마토그래프 담체에 형성된 반응 부위에 있어서 고정화된 항체가 고정화 시약이 되고, 이것에 피검물질인 항원을 통해서 감작 표식 미립자 특이적으로 결합하고, 그 결과 감작 표식 미립자가 반응 부위에 포착됨으로써 발생하는 시그널의 유무 또는 정도를 육안으로 판정함으로써 시료 중의 피검물질의 존재의 유무 또는 양을 측정할 수 있다. 또한, 면역크로마토그래프법에서는 비특이 흡착을 억제하기 위해서 검체 희석액에 단백질 등의 블록킹제를 첨가하는 것이 일반적으로 행하여지고 있다(특허문헌 4).
일본 특허공개 평 6-313766호 공보 일본 특허공개 평 6-194366호 공보 일본 특허공개 평 2-36353호 공보 일본 특허공표 2004-503248호 공보
면역크로마토그래프법 중에는 감도가 낮기 때문에 피검물질인 항원이 검출되지 않는(위음성) 문제를 회피하기 위해서 검출 시그널을 증폭시키는 방법이 행하여질 경우가 있다. 시그널 증폭의 방법으로서 표식으로서 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등의 효소를 사용할 경우가 있지만, 금속 콜로이드 표식 및 금속 황화물 표식으로 이루어지는 군에서 선택한 표식에 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 이용하여 증감하는 것(은 증폭)에 의해 검출을 행할 경우도 있다. 그러나 이들 증폭법을 사용했을 경우, 검출 부위에 비특이적으로 흡착한 표식이 증감 되면 피검물질인 항원이 존재하지 않는데도 시그널이 검출되는(위양성) 문제가 발생할 경우가 있다. 특히 시그널의 증폭을 행하는 면역크로마토그래프법에서는 종래에는 문제가 되지 않았던 소량의 비특이 흡착에서도 위양성의 문제를 야기해버린다.
또한, 면역크로마토그래프법에서는 비특이 흡착을 억제하기 위해서 검체 희석액에 단백질 등의 블록킹제를 첨가하는 것이 일반적으로 행하지고 있지만(특허문헌 4), 이러한 소량의 비특이 흡착에 대하여 효과가 있는 것은 없었다.
또한, 특히 은 증폭을 이용한 면역크로마토그래프법에 있어서는 금속 콜로이드 표식물질 및 금속 황화물 표식물질을 사용한 면역크로마토그래프용 스트립에 검체를 적하해 전개시킨 후, (1) 환원제 용액을 전개시키고, (2) 은 함유 용액(은 증폭액)을 적하할 필요가 있다. 은 증폭 용액은 은이온의 안정성, 및 증폭 활성을 고려하면 통상 산성이 적합하다. 그것에 대해 단백질은 산성 조건에서 석출되어 버리는 것이 많기 때문에 은 증폭액에 단백질을 첨가하면 석출되어 버린다. 따라서, 검체 희석액에 단백질을 첨가했을 경우 산성 조건 하에서는 멤브레인 중에서 응집해 여기저기에서 액의 흐름을 방해하므로 증폭 후에 편차가 되어 버린다. 증폭 편차는 검출 부위의 발색과 구별이 되지 않는 경우가 있으므로 위양성으로 되어버릴 경우도 있고, 큰 문제였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 면역크로마토그래프 방법으로 시그널을 증폭할 때에 위양성의 발생을 억제함으로써 고감도 또한 위양성이 저감된 검출을 행할 수 있는 면역크로마토그래프 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 카제인 등의 단백질인 프로테아제 분해물의 존재 하에서 면역반응을 행함으로써 표식의 비특이 흡착을 억제하고, 증폭 후의 의양성을 억제할 수 있는 것을 찾아냈다.
본 발명에 의하면 피검물질과, 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서, 이러한 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개하고; 이러한 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 피검물질에 대한 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 포함하는 불용성 담체 상의 검출 부위에 있어서 피검물질과 표식물질을 포착하며; 포착한 표식물질을 증폭해서 상기 피검물질을 검출하는 것을 포함하는 면역크로마토그래프 방법이 제공된다.
바람직하게는, 단백질의 프로테아제 분해물의 분자량의 범위가 0.1kD∼15kD이다.
바람직하게는, 단백질의 프로테아제 분해물은 산성 조건 하에서 불용 성분으로서의 석출물이 존재하지 않는 분해물이다.
바람직하게는, 단백질의 프로테아제 분해물은 단백질의 프로테아제 분해물에 산을 첨가해서 pH를 4 이하로 하고, 석출된 석출물을 제거함으로써 얻어지는 단백질 분해물이다.
바람직하게는, 단백질의 프로테아제 분해물이 카제인의 프로테아제 분해물이다.
바람직하게는, 단백질로서 사용되는 카제인이 αS1 카제인, αS2 카제인, β 카제인, 또는 κ 카제인에서 선택되는 1 이상의 카제인이다.
바람직하게는, 카제인의 프로테아제 분해물에 αS1 카제인 유래 펩티드 배열(YLGYLEQLLR, FFVAPFPEVFGK, HQGLPQEVLNNLLR), αS2 카제인 유래 펩티드 배열(FALPQYLK), β 카제인 유래 펩티드 배열(AVPYPQR, YPVEPFTER), κ 카제인 유래 펩티드 배열(YIPIQYVLSR) 중 적어도 1개 이상이 포함된다.
바람직하게는, 불용성 담체가 다공성 담체이다.
바람직하게는, 금속을 포함하는 표식물질이 금속 콜로이드이다.
바람직하게는, 금속 콜로이드가 금 콜로이드이다.
바람직하게는, 제 1 결합물질 및 제 2 결합물질 중 적어도 어느 한쪽이 항체이다.
바람직하게는, 포착한 표식물질을 증폭하는 공정을 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 포함하는 증폭액을 이용하여 행한다.
바람직하게는, 피검물질과, 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서, 이러한 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개한 후에 세정액을 불용성 담체상에 전개하고, 그 후에 포착한 표식물질을 증폭시킨다.
바람직하게는, 검출시에 평균 입자 사이즈가 1㎛ 이상 20㎛ 이하의 사이즈를 갖는 표식물질을 검출한다.
또는, 본 발명에 의하면 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질과, 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 피검물질에 대한 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 포함한 불용성 담체를 구비하는 면역크로마토그래프용 키트가 제공된다.
바람직하게는, 제 1 결합물질 및 제 2 결합물질 중 적어도 어느 한쪽이 항체이다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 면역크로마토그래프 방법의 은 증폭에 있어서 증폭 후의 위양성을 억제할 수 있어 명료하고 또한 고감도의 측정을 행할 수 있다.
도 1은 제 1 불용성 담체(면역크로마토그래프용 스트립)의 일형태를 모식적으로 나타내는 평면도이다.
도 2는 도 1에서 나타내어진 제 1 불용성 담체(면역크로마토그래프용 스트립)의 일형태의 종단면을 나타내는 모식도이다.
도 1 및 도 2에 있어서 1은 백 점착 시트, 2는 표식물질 유지 패드, 3은 크로마토그래프 담체(항체 고정화 멤브레인), 3a는 포착 부위, 31은 검출 부위, 32는 컨트롤 부위, 4는 흡수 패드, 5는 시료 첨가 패드, 10은 면역크로마토그래프용 스트립을 나타낸다. 피검물질을 함유하는 피검시료가 크로마토그래프 담체 상을 전개하는 방향을 화살표 A로 나타낸다. 본 발명에 있어서는 화살표 A의 근원 방향을 상류, 화살표 A의 선단 방향을 하류라고 정의한다.
도 3은 본 발명에서 사용할 수 있는 면역크로마토그래프 키트의 일형태를 모식적으로 나타낸다. 51은 도 1 및 도 2에서 나타낸 제 1 불용성 담체(면역크로마토그래프용 스트립), 52는 액체 저장 포드, 53은 제 2 불용성 담체(세정액 첨가 패드), 54는 제 3 불용성 담체, 55는 제 1 디바이스 부품, 56은 제 2 디바이스 부품, 57은 점착 구멍을 나타낸다.
이하, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 면역크로마토그래프 방법에 있어서는, 피검물질과 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서, 이러한 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개시킨다.
상기 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 있어서 전개시키는 방법으로서는, 피검물질을 포함하는 피검시료를 흘렸을 때에 단백질의 프로테아제 분해물이 피검물질을 포함하는 피검시료와 함께 흐르는 방법이면 된다. 사용 형태로서는 피검물질을 포함하는 피검시료와 단백질의 프로테아제 분해물을 포함하는 용액을 불용성 담체 상에 있어서 전개시키는 방법 등을 들 수 있다.
단백질의 프로테아제 분해물의 분자량의 범위는, 바람직하게는 0.1kD∼15kD이며, 특히 바람직하게는 1kD∼15kD이다. 단백질의 프로테아제 분해물의 분자량 및 그 함유율의 측정방법으로서는, 당업계에서 자주 사용되는 겔 전기영동법에 의해 단백질을 분자량에 따라 분리하고, 염색액으로 염색하며, 그 염색된 밴드를 촬상하여 농도의 적분값을 구하는 방법 등으로 측정할 수 있다. 본 발명에 있어서의 단백질의 프로테아제 분해물 분자량의 범위란, 상기와 같은 방법으로 분자량 및 함유율을 구하고, 총 단백질량 중 50% 이상을 포함하는 분자량의 범위를 말한다.
단백질의 프로테아제 분해물을 사용했을 경우 분자량이 작아져 있음으로써 산성 조건에서도 석출되기 어려워져 있지만, 발생하는 석출물이 증폭 후의 편차의 원인이 될 가능성이 있다. 본 발명에서는 단백질 분해물 중에 포함되는 산성 조건 하에서의 불용 성분을 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 사용하는 단백질의 프로테아제 분해물로서는 산성 조건 하에서 불용 성분을 실질적으로 석출하지 않는 분해물인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 20℃ pH4의 수용액에서 1g/5ml의 농도로 불용 성분을 석출하지 않는 분해물이다. 예를 들면, 단백질의 프로테아제 분해물에 산을 첨가해서 pH를 4 이하로 하고, 석출물을 제거함으로써 얻어지는 산 불용물을 제거한 단백질 분해물을 단백질의 프로테아제 분해물로서 사용할 수 있다. 석출물 제거로서는 디캔테이션, 초원심, 필터 여과 등의 방법을 선택할 수 있다.
단백질의 종류는 본 발명의 효과를 달성하기 위해서는 카제인, 젤라틴, 소 혈청 알부민 등이 바람직하게 사용되고, 더욱 바람직하게는 카제인을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 카제인의 종류는, 바람직하게는 αS1 카제인, αS2 카제인, β 카제인, 또는 κ 카제인으로부터 선택되는 1개 이상의 카제인을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 카제인의 프로테아제 분해물로서는, 예를 들면 αS1 카제인 유래 펩티드 배열(YLGYLEQLLR, FFVAPFPEVFGK, HQGLPQEVLNNLLR), αS2 카제인 유래 펩티드 배열(FALPQYLK), β 카제인 유래 펩티드 배열(AVPYPQR, YPVEPFTER), κ 카제인 유래 펩티드 배열(YIPIQYVLSR) 중 적어도 1개가 포함되는 것을 사용할 수 있다.
1. 크로마토그래프
일반적으로, 크로마토그래프 방법이란 이하와 같은 방법으로 피검물질을 간편·신속·특이적으로 판정·측정하는 방법이다. 즉, 피검물질과 결합 가능한 제 2 결합물질인 고정화 시약(항체, 항원 등)을 포함하는 적어도 1개의 반응 부위를 갖는 크로마토그래프 담체(불용성 담체)를 고정상으로서 사용한다. 이 크로마토그래프 담체 상에서 피검물질과 결합 가능한 제 1 결합물질인 시약에 의해 수식된 표식물질이 분산되어서 이루어지는 분산액을 이동층으로 해서 크로마토그래프 담체 중을 크로마토그래프적으로 이동시킴과 아울러, 피검물질과 표식물질이 특이적으로 결합하면서 반응 부위까지 도달한다. 반응 부위에 있어서 피검물질과 표식물질의 복합체가 고정화 시약에 특이적 결합함으로써 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에만 고정화 시약 부위에 표식물질이 농축되는 것을 이용하여, 그것들을 육안 또는 적당한 기기를 이용하여 피검시료 중에 피검물질이 존재하는 것을 정성 및 정량적으로 분석하는 방법이다.
본 발명에 있어서의 크로마토그래프 방법을 행하는 키트나 장치는 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 내장하고 있는 것이 바람직하고, 고정화 시약에 결합한 피검물질과 표식물질의 복합체를 핵으로 해서 증폭 반응에 의해 시그널을 증폭하여, 결과적으로 고감도화를 달성할 수 있다. 본 발명에 의하면 신속한 고감도 크로마토그래프를 행할 수 있다.
2. 피검시료
본 발명의 크로마토그래프 방법으로 분석할 수 있는 피검시료로서는 피검물질을 포함할 가능성이 있는 시료인 한 특별하게 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 생물학적 시료, 특히는 동물(특히 인간)의 체액(예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 골수액, 눈물, 땀, 소변, 고름, 콧물, 또는 객담) 또는 배설물(예를 들면, 분변), 장기, 조직, 점막이나 피부, 그것들을 포함한다고 생각되는 찰과검체(면봉), 양치액, 또는 동식물 그 자체 또는 그것들의 건조체를 들 수 있다.
3. 피검시료의 전처리
본 발명의 크로마토그래프 방법에서는 피검시료를 그대로, 또는 피검시료를 적당한 추출용 용매를 이용하여 추출해서 얻어지는 추출액의 형태로, 또한 추출액을 적당한 희석제로 희석해서 얻어지는 희석액의 형태, 또는 추출액을 적당한 방법으로 농축한 형태로 사용할 수 있다. 추출용 용매로서는 통상의 면역학적 분석법에서 사용되는 용매(예를 들면, 물, 생리식염액, 또는 완충액 등), 또는 용매로 희석함으로써 직접 항원항체반응을 실시할 수 있는 물 혼화성 유기용매를 사용할 수도 있다.
4. 구성
본 발명의 크로마토그래프 방법에 있어서 사용할 수 있는 크로마토그래프용 스트립으로서는, 예를 들면 도 1, 도 2에 나타내는 바와 같이, 피검시료를 전개하는 방향(도 1의 A 화살표의 방향)을 따라 시료 첨가 패드, 표식물질 유지 패드(예를 들면, 금 콜로이드 항체 유지 패드), 크로마토그래프 담체(불용성 담체, 예를 들면 항체 고정화 멤브레인), 및 흡수 패드를 이 순서로 백 점착 시트 상에 배치할 수 있다. 크로마토그래프 담체는 포착 부위를 갖고, 분석 대상물과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 고정화한 영역인 검출 부위(검출 존으로 기재하는 경우도 있다)를 갖고, 소망에 따라 컨트롤용 항체 또는 항원을 고정화한 영역인 컨트롤 부위(컨트롤 존으로 기재하는 경우도 있다)를 더 가질 수 있다. 상기 표식물질 유지 패드는 표식물질을 포함하는 현탁액을 조제하고, 그 현탁액을 적당한 흡수 패드(예를 들면, 유리섬유 패드)에 도포한 후에 그것을 건조함으로써 조제할 수 있다. 시료 첨가 패드로서는 본 발명에 있어서는 유리섬유 패드를 바람직하게 사용할 수 있다.
4-1. 표식물질
본 발명에서 사용하는 표식물질로서는 피검물질(항원)과 특이적으로 결합하는 제 1 결합물질을 표식하는데에 사용하는 표식으로서, 금속을 포함하는 표식물질을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 금속의 종류로서는, 바람직하게는 금, 은, 백금의 귀금속이나, 철, 납, 구리, 카드뮴, 비스무트, 안티몬, 주석, 또는 수은을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 금, 은, 백금의 귀금속을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 금속을 포함하는 표식물질의 바람직한 형태로서는 금속 콜로이드 표식 또는 금속 황화물 표식를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 금속 콜로이드 표식으로서는, 바람직하게는 백금 콜로이드, 금 콜로이드, 은 콜로이드, 철 콜로이드, 또는 수산화알루미늄 콜로이드 등을 사용할 수 있고, 금속 황화물 표식으로서는, 바람직하게는 철, 은, 납, 구리, 카드뮴, 비스무트, 안티몬, 주석, 또는 수은의 각 황화물을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 더욱 바람직하게는 백금 콜로이드, 금 콜로이드, 은 콜로이드를 사용할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래프법에 있어서는 이들 금속 콜로이드 표식 및/또는 금속 황화물 표식의 하나 또는 그 이상을 표식으로서 사용할 수 있다. 금속 콜로이드와 특이결합 물질의 결합은 종래 공지의 방법[예를 들면, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 30, No.7, pp691-696,(1982)]에 따라 행할 수 있다.
4-2. 결합물질
본 발명에서는, 표식물질은 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식되어 있다. 제 1 결합물질이란, 예를 들면 상기 피검물질(항원)에 대한 항체, 피검물질(항체)에 대한 항원, 피검물질(단백질, 저분자 화합물 등)에 대한 압타머(aptamer) 등, 피검물질에 대하여 친화성을 갖는 화합물 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 불용성 담체는 (a) 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 (b) 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 갖고 있다. 상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질이란, 예를 들면 피검물질(항원)에 대한 항체, 피검물질(항체)에 대한 항원, 피검물질(단백질, 저분자 화합물 등)에 대한 압타머 등, 피검물질에 대하여 친화성을 갖는 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 제 2 결합물질과 제 1 결합물질은 다른 것이라도, 동일한 것이라도 사용할 수 있다. 피검물질에 대한 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질이란 피검물질 그 자체여도 좋고, 제 1 결합물질이 인식하는 부위를 갖는 화합물이어도 좋으며, 예를 들면 피검물질의 유도체와 단백질(예를 들면 BSA 등)을 결합시킨 것 같은 화합물 등이 그것에 해당한다.
본 발명에 있어서는, 바람직하게는 제 1 결합물질 및 제 2 결합물질 중 어느 하나가 항체이다. 본 발명의 면역크로마토그래프 방법에 있어서는 피검물질에 대하여 특이성을 갖는 항체로서 그 피검물질에 의해 면역된 동물의 혈청으로부터 조제하는 항혈청, 항혈청으로부터 정제된 면역글로블린 획분, 그 분석 대상물에 의해 면역된 동물의 비장 세포를 사용하는 세포융합에 의해 얻어지는 단일클론 항체, 또는 그것들의 단편[예를 들면 F(ab')2, Fab, Fab', 또는 Fv]을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 항체의 조제는 상법에 의해 행할 수 있다.
4-3. 크로마토그래프 담체(항체 고정화 멤브레인)
크로마토그래프 담체로서는 불용성 담체를 사용할 수 있고, 그 중에서도 다공성 담체가 바람직하다. 특히, 니트로셀룰로오스막, 셀룰로오스막, 아세틸셀룰로오스막, 폴리술폰막, 폴리에테르술폰막, 나일론막, 유리섬유, 부직포, 천, 또는 실 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
통상, 크로마토그래프 담체의 일부에 고정화 시약을 고정화시켜서 검출 부위를 제작한다. 고정화 시약은 크로마토그래프 담체의 일부에 물리적 또는 화학적 결합에 의해 직접 고정화시켜도 좋고, 고정화 시약을 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합시키고, 이 미립자를 크로마토그래프 담체의 일부에 트랩시켜서 고정화시켜도 좋다. 또한, 크로마토그래프 담체는 고정화 시약을 고정화 후 불활성 단백에 의한 처리 등에 의해 비특이적 흡착 방지 처리를 해서 사용하는 것이 바람직하다.
4-4. 시료 첨가 패드
시료 첨가 패드의 재질은 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 폴리우레탄, 폴리 아세테이트, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 및 면포 등의 균일한 특성을 갖는 것을 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다. 시료 첨가부는 첨가된 피검물질을 포함하는 피검시료를 받아들릴 뿐만 아니라 시료 중의 불용물 입자 등을 여과하는 기능도 겸한다. 또한, 분석시 시료 중의 피검물질이 피검시료 첨가부의 재질에 비특이적으로 흡착하여 분석의 정밀도를 저하시키는 것을 방지하기 위해서, 시료 첨가부를 구성하는 재질은 미리 비특이적 흡착 방지 처리해서 사용하는 경우도 있다.
4-5. 표식물질 유지 패드
표식물질 유지 패드의 소재로서는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 및 부직포 등을 들 수 있고, 상술한 바와 같이 조제한 표식물질을 일정량 함침하여 건조시켜서 제작한다.
4-6. 흡수 패드
흡수 패드는 첨가된 시료가 크로마토그래프 이동에 의해 물리적으로 흡수됨과 아울러 크로마토그래프 담체의 검출부에 불용화되지 않는 미반응 표식물질 등을 흡수 제거하는 부위이며, 셀룰로오스 여과지, 부직포, 천, 셀룰로오스아세테이트 등 흡수성 재료가 사용된다. 첨가된 시료의 크로마토그래프 선단부가 흡수부에 도달하고나서의 크로마토그래프의 속도는 흡수재의 재질, 크기 등에 따라 다르기 때문에 그 선정에 의해 피검물질의 측정에 맞은 속도를 설정할 수 있다.
5. 면역검사의 방법
이하, 본 발명의 크로마토그래프 방법에 대해서 그 구체적인 실시형태인 샌드위치법에 대하여 설명한다.
샌드위치법에서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하의 순서에 의해 피검물질의 분석을 실시할 수 있다. 우선, 피검물질(항원)에 대하여 특이성을 갖는 제 1 항체 및 제 2 항체를, 앞에 4-2에 있어서 서술한 방법에 의해 미리 조제해 둔다. 또한, 제 1 항체를 4-1, 또는 4-2에서 서술한 방법을 이용하여 미리 표식화해 둔다. 제 2 항체를 적당한 제 1 불용성 담체(예를 들면, 니트로셀룰로오스막, 유리섬유막, 나일론막, 또는 셀룰로오스막 등) 상에 고정하고, 피검물질(항원)을 포함할 가능성이 있는 피검시료(또는 그 추출액)와 접촉시키면 그 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에는 항원항체반응이 일어난다. 이 항원항체반응은 통상의 항원항체반응과 마찬가지로 행할 수 있다. 항원항체반응과 동시 또는 반응 후에 과잉량의 표식화 제 1 항체를 더 접촉시키면, 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에는 고정화 제 2 항체와 피검물질(항원)과 표식화 제 1 항체로 이루어지는 면역 복합체가 형성된다.
샌드위치법에서는 고정화 제 2 항체와 피검물질(항원)과 제 1 항체의 반응이 종료한 후 면역 복합체를 형성하지 않은 표식화 제 1 항체를 제거하고, 계속해서 제 1 불용성 담체에 있어서의 고정화 제 2 항체를 고정한 영역에 대해서 제 1의 광학농도 측정을 행함으로써 표식물을 정량하여 피검시료 중의 피검물질의 양을 측정할 수 있다. 이어서, 금속 이온 및 환원제를 공급함으로써 면역 복합체를 형성한 표식화 제 1 항체의 표식으로부터의 신호를 증폭한 후에 제 2의 광학농도 측정을 행함으로써 증폭 후의 표식물질을 정량하여 피검시료 중의 피검물질의 양을 측정할 수 있다.
6. 세정
본 발명에 있어서는 피검물질과, 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 있어서 전개한 후에 세정액을 불용성 담체 상에 전개하고, 그 후에 포착한 표식물질을 증폭시켜도 좋다.
(세정액)
면역 복합체를 형성하지 않은 표식물질을 제거하기 위한 세정액은 세정의 기능이 있으면 어떤 것이라도 좋다.
세정액은 특이적인 결합 반응 이외에 크로마토그래프 담체 내에 잔존하고 있는, 즉 비특이적으로 잔존하고 있는 표식물질을 세정하기 위한 액체이면 특별하게 한정되는 것은 아니고, 단순한 물이나 에탄올 등의 용제 단독이어도 좋고, 예를 들면 1질량% BSA가 들어간 PBS 버퍼나 계면활성제 등의 용액 등을 사용할 수 있다. 또한, 세정액으로서 후술하는 은이온을 포함하는 액체, 은이온의 환원제를 포함하는 액체를 사용할 수도 있다. 또한, 세정액은 전개 도중에 비특이적으로 잔존한 표식물질을 세정하면서 전개하므로 표식물질을 포함하면서 전개되게 되지만, 전개되기 전의 세정액은 세정 효과를 높이기 위해서 표식물질을 포함하고 있지 않은 액을 사용한다. 또한, 세정 효과를 높이기 위해서 그 pH를 조정하거나, 계면활성제 성분이나 BSA 등의 단백질, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 화합물을 첨가하거나 한 세정액을 사용해도 좋다.
(세정액의 전개, 그 방향)
세정액은 검체액을 전개한 후에 크로마토그래프용 스트립에 첨가해 크로마토그래프용 스트립에 잔존하는 항원항체반응에 의해 결합한 것 이외의 표식물질을 세정한다. 세정액의 송액방법으로서는 검체액을 전개한 후에 그대로 시료 적하부에 첨가하는 방법이나, 미리 스트립에 세정액 송액을 위한 세정액 첨가 패드, 흡수 패드를 부착시켜 두고, 그 세정액 첨가 패드에 첨가해 흡수 패드 방향으로 송액하는 방법, 미리 스트립에 세정액의 첨가 부위를 구비해 두고, 검체액의 전개 후에 그 세정액의 첨가 부위에 세정액을 첨가하는 방법 등이 있지만, 보다 바람직하게는 검체액을 스트립에 전개한 후에 세정액 송액을 위한 세정액 첨가 패드, 흡수 패드를 스트립에 부착시켜 세정액 첨가 패드에 세정액을 공급하고, 세정액을 전개시키는 방법이다. 세정액 첨가 패드에 세정액을 공급하는 방법으로서는 세정액이 들어간 포트에 세정액 첨가 패드를 삽입해도 좋고, 세정액 첨가 패드에 세정액을 적하해도 좋다.
본 명세서 중에서는, 상기 피검물질의 액의 전개방향이란 시료 첨가 패드와 흡수 패드를 연결하는 방향으로 정의하고, 세정액의 전개 방향이란 세정액 송액을 위한 세정액 첨가 패드와 흡수 패드를 연결하는 방향으로 정의한다.
피검물질의 액의 전개 방향과 세정액의 전개 방향이 이루는 각이 45도∼170도인 경우 세정 효과가 커진다. 또한, 상기 피검물질의 액의 전개 방향과 세정액의 전개 방향이 이루는 각은, 바람직하게는 60도∼170도, 더욱 바람직하게는 60도∼150도이다.
세정액 첨가 패드(제 2 불용성 담체라고도 표기함)는, 본 발명에 있어서는 유리섬유 패드나 셀룰로오스 멤브레인, 니트로셀룰로오스 멤브레인 등을 사용할 수 있다.
흡수 패드(제 3 불용성 담체라고도 표기함)는, 본 발명에 있어서는 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 그것들의 혼합체 등을 사용할 수 있다.
7. 증폭액
증폭액은 포함되는 약제가 표식물질이나 피검물질의 작용에 의해 촉매적으로 반응함으로써 착색된 화합물이나 발광 등을 발생시키고, 시그널의 증폭을 일으킬 수 있는 용액이다. 예를 들면, 금속 표식 상에서 물리현상에 의해 금속은의 석출을 일으키는 은이온 용액이나, 퍼옥시다아제 표식과 과산화 수소의 작용에 의해 색소가 되는 페닐렌디아민 화합물과 나프톨 화합물의 용액 등을 들 수 있다.
상세하게는, 사진 화학의 분야에서의 일반 서적[예를 들면 「개정 사진공학의 기초-은염 사진편-」 (일본 사진학회편, 코로나사), 「사진의 화학」(사사이 아키라, 샤신고교 출판사), 「최신 처방 핸드북」 (키쿠치 신이치 외, 아미코 출판사)]에 기재되어 있는 것 같은 소위 현상액을 사용할 수 있고, 액중에 은이온을 포함하고, 액중의 은이온이 현상의 핵이 되도록 금속 콜로이드 등을 중심으로 환원되는, 소위 물리 현상액이면 특별하게 한정되지 않고 증폭액으로서 사용할 수 있다.
증폭액의 구체예로서는 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 포함하는 증폭액을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 증폭액의 조제는 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 모두 함유하는 하나의 증폭액으로서 조제해서 사용할 수 있지만, 본 발명의 바람직한 형태로서 은을 포함하는 화합물을 포함하는 증폭액과, 은이온을 위한 환원제를 포함하는 증폭액을 각각 조제해서 사용하는 것이 바람직하다. 이하, 은을 포함하는 화합물과 은이온을 위한 환원제 등에 대하여 설명한다.
(은(이온)을 포함하는 화합물)
은이온 함유 화합물로서는 유기은염, 무기은염, 또는 은 착체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 물 등의 용매에 대하여 용해도가 높은 은이온 함유 화합물이며, 질산은, 아세트산은, 락트산은, 부티르산은, 티오황산은 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 질산은이다. 은 착체로서는 수산기나 술폰기 등 수용성기를 갖는 배위자에 배위된 은 착체가 바람직하고, 히드록시티오에테르은 등을 들 수 있다.
유기은염, 무기은염, 또는 은 착체는 은으로서 일반적으로 0.001몰/㎡∼0.2몰/㎡, 바람직하게는 0.01몰/㎡∼0.05몰/㎡ 함유되는 것이 바람직하다.
(은이온을 위한 환원제)
은이온을 위한 환원제는 은이온을 은으로 환원할 수 있으면 무기·유기의 어떠한 재료, 또는 그 혼합물이어도 사용할 수 있다.
무기 환원제로서는 Fe2+, V2+, Ti3+ 등의 금속 이온에 의해 원자가가 변화될 수 있는 환원성 금속염, 환원성 금속 착염을 바람직하게 들 수 있다. 무기 환원제를 사용할 때에는 산화된 이온을 착형성하거나 환원해서 제거하거나 무해화할 필요가 있다. 예를 들면, Fe2+를 환원제로서 사용하는 계에서는 시트르산이나 EDTA를 이용하여 산화물인 Fe3+의 착체를 형성하여 무해화할 수 있다. 본 계에서는 이러한 무기 환원제를 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Fe2+의 금속염이 바람직하다.
또한, 습식의 할로겐화은 사진 감광재료에 사용되는 현상 주약(예를 들면, 메틸갈릭산염, 히드로퀴논, 치환 히드로퀴논, 3-피라졸리돈류, p-아미노페놀류, p-페닐렌디아민류, 힌다드페놀류, 아미드옥심류, 아진류, 카테콜류, 피로갈롤류, 아스코르브산(또는 그 유도체), 및 류코 색소류), 및 본 분야에서의 기술에 숙련되어 있는 것에 있어서 명확한 그 밖의 재료, 예를 들면 미국 특허 제6,020,117호에 기재되어 있는 재료도 사용할 수 있다.
환원제로서는 아스코르브산 환원제도 바람직하다. 유용한 아스코르브산 환원제는 아스코르브산과 유사물, 이성체와 그 유도체를 포함하고, 예를 들면 D- 또는 L-아스코르브산과 그 당유도체(예를 들면, γ-락토아스코르브산, 글루코아스코르브산, 후코아스크로브산, 글루코헵토아스코르브산, 말토아스코르브산), 아스코르브산의 나트륨염, 아스코르브산의 칼륨염, 이소아스코르브산(또는 L-에리스로아스코르브산), 그 염(예를 들면, 알칼리 금속염, 암모늄염 또는 당 기술분야에 있어서 알려져 있는 염), 엔디올 타입의 아스코르브산, 엔아미놀 타입의 아스코르브산, 티오에놀 타입의 아스코르브산 등을 바람직하게 들 수 있고, 특히 D, L 또는 D,L-아스코르브산(그리고, 그 알칼리 금속염) 또는 이소아스코르브산(또는 그 알칼리 금속염)이 바람직하고, 나트륨염이 바람직한 염이다. 필요에 따라서 이것들의 환원제의 혼합물을 사용할 수 있다.
8. 기타의 조제
증폭액의 그 밖의 조제로서는 완충제, 방부제, 예를 들면 산화방지제 또는 유기안정제, 속도 조절제를 포함할 경우가 있다. 완충제로서는, 예를 들면 아세트산, 시트르산, 수산화나트륨 또는 이것들 중 어느 하나의 염, 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 사용한 완충제, 기타 일반적 화학실험에 사용되는 완충제를 사용할 수 있다. 이들 완충제를 적당하게 사용하여 그 증폭액에 최적인 pH로 조정할 수 있다. 또한, 흐림 방지제로서 알킬아민을 첨가제로서 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 도데실아민이다. 또한 이들 첨가제의 용해성 향상을 위해서 계면활성제를 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H이다.
9. 검출시의 평균 입자 사이즈의 산출 방법
검출시(증폭 후), 테스트 라인부를 잘라내고 시료 이면을 카본 페이스트로 시료대에 부착한 후 단면을 잘라 카본 증착하고, 주사형 전자현미경으로 형상과 크기를 관찰한다. 예를 들면, 히타치 하이테크놀러지즈 제 FE-STEM S-5500으로, 가속 전압 10KV에서 반사 전자에 의한 시료 표면의 관찰을 SEM으로 행할 수 있다. 그 후에 시그널 입자를 100입자 선정, 입자의 투영면적의 원상당 지름을 측정하고, 평균치를 산출하여 검출시의 평균 입자 사이즈로 한다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
(1) 인플루엔자 A형 검출 면역크로마토그래프 키트의 제작
(1-1) 항인플루엔자 A형 항체 수식 금 콜로이드의 제작
(1-1-1) F(ab')2 단편화 항인플루엔자 A형 바이러스 항체의 제작
항인플루엔자 A형 바이러스 항체(품번 7307, 메딕스바이오케미카사)를 사용하고, ImmunoPureIgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit(품번 44880, 피아스사)를 이용하여 제작했다.
(1-1-2) 항인플루엔자 A형 단편화 항체 수식 금 콜로이드의 제작
직경 50㎚ 금 콜로이드 용액(EM.GC50, BBI사) 9mL에 50mM KH2PO4 버퍼(pH7.5) 1mL를 첨가하여 pH를 조정한 금 콜로이드 용액에, 농도가 160㎍/mL인 (1-1-1)에서 작성한 F(ab')2 단편화 항인플루엔자 A형 바이러스 항체 용액 1mL를 첨가하여 교반했다. 10분간 정치한 후 1질량% 폴리에틸렌글리콜(PEG Mw.20000, 품번 168-11285, 와코쥰야쿠) 수용액을 550μL 첨가하여 교반하고, 계속해서 10질량% 소혈청 알부민(BSA FractionV, 품번 A-7906, SIGMA) 수용액을 1.1mL 첨가하여 교반했다. 이 용액을 8000×g, 4℃의 조건에서 30분간 원심(himacCF16RX, 히타치)한 후, 1mL정도를 남겨서 상청을 제거하고 초음파 세정기에 의해 금 콜로이드를 재분산시켰다. 이 후, 20mL의 금 콜로이드 보존액[20mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.2), 0.05질량% PEG(Mw.20000), 150mM NaCl, 1질량% BSA, 0.1질량% NaN3]에 분산하고, 다시 8000×g, 4℃의 조건에서 30분간 원심한 후 1mL정도를 남겨서 상청을 제거하고, 초음파 세정기에 의해 금 콜로이드를 재분산하여 항체 수식 금 콜로이드(50㎚) 용액을 얻었다.
(1-2) 금 콜로이드 항체 유지 패드(표식물질 유지 패드)의 제작
(1-1)에서 작성한 인플루엔자 A형 항체 수식 금 콜로이드를, 금 콜로이드 도포액[20mM Tris-HCl 버퍼(pH8.2), 0.05질량% PEG(Mw.20000), 5질량% 수크로오스] 및 물에 의해 희석하고, 520㎚의 광학농도(OD)가 3.0이 되도록 희석했다. 이 용액을 8㎜×150㎜로 자른 유리섬유 패드(Glass Fiber Conjugate Pad, 밀리포어사)에 대하여 1장당 0.8mL씩 균일하게 도포하고, 12시간 감압 건조하여 금 콜로이드 항체유지 패드를 얻었다.
(1-3) 항체 고정화 멤브레인(크로마토그래프 담체)의 제작
25㎜×200㎜로 절단한 니트로셀룰로오스 멤브레인(플라스틱의 보강 있음, HiFlow Plus HF120, 밀리포어사)에 관해 이하와 같은 방법에 의해 항체를 고정해 항체 고정화 멤브레인을 작성했다. 멤브레인을 횡길이로 설치하고, 200㎜의 긴변으로부터 10㎜의 위치에 1.5mg/mL이 되도록 조제한 항인플루엔자 A형 바이러스 항체(품번 7307, 메딕스바이오케미카사) 용액을 잉크젯 방식의 도포기(BioDot사)를 이용하여 폭 0.7㎜정도의 라인 형상으로 도포하여 검출 부위로 했다. 또한, 마찬가지로 200㎜의 긴변으로부터 16㎜의 위치(검출 부위로부터 6㎜의 위치)에 0.5mg/mL가 되도록 조제한 컨트롤용 항마우스 IgG 항체[항마우스 IgG(H+L), 토끼 F(ab')2, 품번 566-70621, 와코쥰야쿠) 용액을 라인 형상으로 도포하여 컨트롤 부위로 했다. 도포한 멤브레인은 온풍식 건조기에서 50℃, 30분간 건조했다. 블록킹액[0.5질량% 카제인(젖 유래, 품번 030-01505, 와코쥰야쿠) 함유 50mM 붕산 버퍼(pH8.5)] 500mL를 배트에 넣고, 건조가 종료된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 담근 상태에서 그대로 30분간 정치했다. 그 후에 같은 배트에 넣은 세정·안정화액[0.5질량% 수크로오스 및 0.05질량% 콜산 나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 버퍼] 500mL에 멤브레인을 옮겨서 담그고, 그대로 30분간 정치했다. 그 후에 멤브레인을 액으로부터 인출하여 실온에서 12시간 건조하여 항체 고정화 멤브레인을 제작했다.
(1-4) 면역크로마토그래프용 스트립의 제작
백 점착 시트(ARcare9020, 닙픈 테크노클러스터사)에 (1-3)에서 작성한 항체 고정화 멤브레인을 붙이고, 25㎜×200㎜의 멤브레인이 횡길이가 되도록 설치했다. 설치한 멤브레인의 컨트롤 부위에 대하여 검출 부위측에 상당하는 멤브레인의 긴변의 끝의 부분과 약 2㎜ 겹치도록 1-2에서 작성한 금 콜로이드 항체 유지 패드(표식물질 유지 패드)를 횡길이로 붙였다. 또한, 금 콜로이드 항체 유지 패드와 약 4㎜ 겹치도록 해서 멤브레인과는 반대측의 멀어지는 위치에 시료 첨가 패드[18㎜×250㎜로 자른 유리섬유 패드(GlassFiber Conjugate Pad, 밀리포어사)]를 횡길이로 겹쳐서 붙였다. 이어서, 금 콜로이드 항체 유지 패드와는 반대측의 항체 고정화 멤브레인의 끝에 멤브레인과 약 5㎜ 겹치도록 흡수 패드[20㎜×250㎜로 자른 셀룰로오스·유리막(CF6, 왓트만사)]를 횡길이로 겹쳐서 붙였다.
이들 겹쳐 붙인 부재(면역크로마토그래프 본체 부재)를 검출 부위, 및 컨트롤 부위와 직교하는 방향으로 7㎜ 폭이 되도록 짧은변에 평행하게 길로틴식 커터(CM4000, 닙픈 테크노클러스터사)로 절단해 감으로써 복수의 7㎜×60㎜의 면역크로마토그래프용 스트립을, 도 1, 및 도 2에 모식적으로 나타내는 바와 같이 제작했다. 이것들을 시험용 면역크로마토그래프 키트라고 했다.
(1-5) 세정액
이하 (1-6)에 서술하는 증폭액 A-1을 사용했다.
(1-6) 은 증폭액의 제작
(1-6-1) 증폭액 A-1(은이온을 위한 환원제 성분을 포함하는 용액)의 제작
물 325g에 질산철(III) 9수화물(와코쥰야쿠, 095-00995)을 물에 용해해서 작성한 1mol/L의 질산철 수용액 40mL, 시트르산(와코쥰야쿠, 038-06925) 10.5g, 도데실아민(와코쥰야쿠, 123-00246) 0.1g, 계면활성제 C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.44g을 용해시킨다. 모두 용해되면 스터러로 교반하면서 질산(10질량%)을 40mL 첨가한다. 이 용액 80mL를 칭량하여 황산암모늄철(II) 6수화물(와코쥰야쿠, 091-00855)을 11.76g 첨가하고 이것을 증폭액 A-1로 했다.
(1-6-2) 증폭액 A-2(은(이온)을 포함하는 화합물을 포함하는 용액)의 제작
질산은 용액 10mL(10g의 질산은을 포함함)에 물을 첨가해서 전체량이 100g이 되도록 하고, 증폭액 A-2(10질량% 질산은 수용액)를 제작했다.
(1-7) 카제인 분해물
(1-7-1) 카제인 분해물의 제작
5질량% 카제인 용액(αS1 카제인, αS2 카제인, β 카제인, κ 카제인 중 1종 이상을 포함함) 1L를 스터러로 교반해 두고, 순수 84.2mL를 첨가한다. 거기에, 리실엔도펩티다아제(R)(와코쥰야쿠, 생화학용, 125-02543)를 용해 버퍼(0.1M 인산Na, 2mM EDTA·2Na, pH7.8)로 0.05AU/mL이 되도록 용해시킨 것을 10mL 첨가한다. 이것을 37℃의 항온조에서 10일간 정치하여 카제인 분해물로서 사용했다.
카제인 분해물 30uL에 대하여 NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4×)(Life Technologies사)를 10uL 넣었다. 70℃, 10분간 가열 처리해 이것을 NuPAGE Bis-Tris 겔(Life Technologies사)에 인젝트했다. NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(20×)(Life Technologies사)를 20배로 순수로 희석한 것을 러닝 버퍼로 해서 XCell SureLock Mini-Cell(Life Technologies사) 및 파워 서플라이(Life Technologies사)를 이용하여 200V, 40분 전기영동을 행하였다. 겔 염색액으로서 InstantBlue(Former Novexin Ltd)를 사용하고, 실온에서 1시간 염색하여 백그라운드의 색이 탈색될 때까지 순수를 교환해서 세정을 반복했다. 그 후 LAS-4000(후지 필름 가부시키가이샤)으로 촬상하고, 해석 소프트 Multi Gauge로 그 밴드 농도를 적분하여 단백질량의 분자량 및 그 함유율을 정량했다. 그 결과, 총 단백질량 중 50% 이상이 1kD 이상 15kD 이하의 분자량 범위이며, 1kD 이상 15kD 이하가 메인의 분자량 범위이었다.
(1-7-2) 산 불용물을 제거한 카제인 분해물의 제작
(1-7-1)에서 작성한 효소분해 카제인 4mL에 대하여 2mol/L 염산을 이용하여 pH를 3.0으로 조정해서 현탁한다. 4℃에서 5분간 정치한 후 9,000×g, 4℃에서 10분간 원심했다. 침전을 무너뜨리지 않도록 상청을 채취하여 산 불용물을 제거한 카제인 분해물을 제작했다.
(2) 평가
(디바이스의 세팅)
도 3에 나타낸 면역크로마토그래프 키트를 이용하여 실험을 행하였다. 도 3의 제 1 디바이스 부품(55)에 (1-4)에서 제작한 면역크로마토그래프용 스트립(51)을 부착하고, 제 2 디바이스 부품(56)에 세정액 첨가 패드로서 제 2 불용성 담체(53)[15㎜×12㎜로 자른 유리섬유 패드(GF/F, GEhealth kea사)], 및 흡수 패드로서 제 3 불용성 담체(54)[15㎜×12㎜로 자른 유리섬유 패드(GF/F, GEhealth kea사)]를 각각 설치했다.
(항원액의 점착·전개)
피검시료(검체액)로서 1질량% BSA를 포함하는 PBS 버퍼에 BD Flu 이그제이먼 컨트롤 A+B-(벡톤 딕킨손사)를 용해한 항원 희석 용액을 제작했다.
시판 면역크로마토그래프 검출 키트 「캬피리아 FluA·B」(알프레사 파마)에 의한 BD Flu 이그제이먼 컨트롤 A+B-의 검출한계는 1/40이었지만, 여기에서는 1질량% BSA를 포함하는 PBS 버퍼로, 이 양성 컨트롤액을 1/3200로 희석하고, 이것을 모의 양성 검체액 1/3200로서 사용했다. (1-4)에서 제작한 면역크로마토그래프용 스트립의 시료 첨가 패드에 검체액 65μl를 균일해지도록 적하하고, 2분간 정치했다.
(세정)
상기와 같이 검체액을 적하해서 2분간 정치해 전개시킨 후, 도 1에 나타낸 제 3 디바이스 부품(55)의 액체 저장 포드(52)에 (1-6-1)에서 제작한 환원제 성분을 포함하는 증폭액(A-1) 150μl를 넣었다. 제 2 디바이스 부품(56)을 제 1 디바이스 부품(55)에 마주보게 해서 닫고, 제 2 불용성 담체(53)(세정액 첨가 패드)의 끝을 액체 저장 포드(52)의 환원제 성분을 포함하는 증폭액(A-1)에 침지함과 아울러 제 2 불용성 담체(53)(세정액 첨가 패드) 및 제 3 불용성 담체(54)(흡수 패드)를 제 1 불용성 담체(51)인 (1-4)에서 제작한 면역크로마토그래프용 스트립에 길이 방향 옆으로부터 장착했다. 이렇게 해서 환원제 성분을 포함하는 증폭액(A-1)을 면역크로마토그래프용 스트립에 전개시켜 2분간 송액했다. 이 공정에 의해 면역크로마토그래프용 스트립이 환원제 성분을 포함하는 증폭액(A-1)에 침지되고, 특이적으로 흡착되어 있지 않은 재료가 더 세정되었다.
(증폭액에 의한 시그널 증폭)
제 2 디바이스 부품(56)에 형성된 점착 구멍(57)으로부터 (1-6-2)에서 제작한 은이온을 포함하는 증폭액(A-2)을 적하하고, 검출 부위에 흡착된 금 콜로이드 표식을 1분간 증폭시켰다. 증폭 후 제 1 불용성 담체(51)인 면역크로마토그래프용 스트립을 인출하여 1분간 수세했다.
(라인의 농도 측정)
이 면역크로마토그래프용 스트립을 면역크로마토그래프용 농도 측정기 ICA-1000(하마마쓰 호토닉스)을 이용하여 측정하고, 백그라운드와 검출 부위의 흡광도의 차(ΔOD, 단위 mABS)를 구해 평가했다.
(검체액)
Blank 검체 용액으로서는 1질량% BSA를 포함하는 PBS 버퍼를, ×1/3200 모의 양성 검체로서는 1질량% BSA를 포함하는 PBS 버퍼에 BD Flu 이그제이먼 컨트롤 A+B-(벡톤 딕킨손사)를 용해해 제작했다.
<비교예 1> 카제인 없음
상기 Blank 검체 및 모의 양성 검체를 그대로 검체액으로서 사용했다.
<비교예 2> 카제인 첨가
상기 Blank 검체 및, 모의 양성 검체에 마지막 농도 1질량%가 되도록 카제인을 첨가했다.
<실시예 1> 카제인 분해물 첨가
상기 Blank 검체 및, 모의 양성 검체에 마지막 농도 1질량%가 되도록 카제인 분해물을 첨가했다.
<실시예 2>
상기 Blank 검체 및, 모의 양성 검체에 마지막 농도 1질량%가 되도록 카제인 분해물 산 불용물 제거를 첨가했다.
Blank 검체에 있어서의 위양성은 편차로 측정 불능인 경우를 「-」로 하고, 위양성에 대해서 1mABS∼50mABS인 경우를 「A」로 하며, 위양성에 대해서 51∼100mABS인 경우를 「B」로 함으로써 평가했다. 또한, Blank 검체에 있어서의 증폭면 상의 편차는 편차 없음의 경우를 「A」로 하고, 약한 편차가 발생할 경우를 「B」로 하며, 편차가 있을 경우를 「C」로 함으로써 평가했다. 또한, 모의 양성 검체의 라인의 농도는 1mABS∼50mABS인 경우를 「A」로 하고, 위양성 있음 평가 불능인 경우나 편차로 측정 불능인 경우를 「-」로 함으로써 평가했다.
결과를 하기의 표 1에 나타낸다.
비교예 1에서는 강한 위양성이 발생했다.
비교예 2에서는 증폭 편차가 발생해 버려 라인의 농도를 측정할 수 없었다.
실시예 1에서는 위양성이 크게 저감되고, 또한 모의 양성 검체 1/3200에서 Blank에 대하여 유의하게 검출할 수 있는 라인 농도가 되었다. 그러나 약한 증폭 편차가 발생했다.
실시예 2에서는 위양성이 크게 저감되고, 또한 모의 양성 검체 1/3200에서 Blank에 대하여 유의하게 검출할 수 있는 라인 농도가 되었다.
또한 이들 실시예 1에서 검출했을 때의 검출시의 평균 입자 사이즈를 「9. 검출시의 평균 입자 사이즈의 산출 방법」에 따라 산출한 결과 6∼8㎛이었다.
Figure 112012042726200-pat00001

Claims (11)

  1. 피검물질과,
    상기 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서 상기 복합체를 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개하고,
    상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 상기 피검물질에 대한 상기 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 포함한 불용성 담체 상의 검출 부위에 있어서 상기 피검물질과 상기 표식물질을 포착하며,
    포착한 상기 표식물질을 증폭시켜서 상기 피검물질을 검출하는 것을 포함하는 면역크로마트그래프 방법으로서,
    상기 단백질의 프로테아제 분해물은 산성 조건 하에서 불용 성분으로서의 석출물이 존재하지 않는 분해물인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질의 프로테아제 분해물의 분자량의 범위는 0.1kD∼15kD인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 단백질의 프로테아제 분해물은 상기 단백질의 프로테아제 분해물에 산을 첨가해서 pH를 4 이하로 하고, 석출된 석출물을 제거함으로써 얻어지는 단백질 분해물인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 단백질의 프로테아제 분해물은 카제인의 프로테아제 분해물인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 카제인은 αS1 카제인, αS2 카제인, β 카제인, 또는 κ 카제인으로부터 선택되는 1개 이상의 카제인인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 결합물질 및 제 2 결합물질 중 적어도 어느 한쪽이 항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 포착한 표식물질을 증폭시키는 공정을, 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 포함하는 증폭액을 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 피검물질과, 상기 피검물질에 대한 상기 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 상기 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태에서,
    상기 복합체를 상기 단백질의 프로테아제 분해물의 존재 하에서 불용성 담체 상에 전개한 후에 세정액을 불용성 담체 상에 전개하고,
    그 후에 상기 포착한 표식물질을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프 방법.
  10. 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 금속을 포함하는 표식물질과,
    상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 상기 피검물질에 대한 상기 제 1 결합물질로의 결합성을 갖는 물질을 포함한 불용성 담체와,
    단백질의 프로테아제 분해물을 구비하고,
    상기 단백질의 프로테아제 분해물은 산성 조건 하에서 불용 성분으로서의 석출물이 존재하지 않는 분해물인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프용 키트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1 결합물질 및 제 2 결합물질 중 적어도 어느 한쪽이 항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래프용 키트.
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