CN106970219A - 一种基于胶体金法检测尿液中hiv（1+2）抗体试剂 - Google Patents
一种基于胶体金法检测尿液中hiv（1+2）抗体试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种体外诊断试剂及其使用方法，特别涉及一种检测人尿液中HIV(1+2)抗体的检测方法。一种基于胶体金法检测尿液中HIV(1+2)抗体试剂的制备方法，包括以下步骤：以胶体金标记的SPA偶联抗人IgG抗体制备胶体金结合物垫，作为显色探针，在硝酸纤维素膜上混合包被gp41抗原和gp36抗原，作为检测HIV1型抗体和HIV2型抗体的检测线。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外诊断试剂及其使用方法，特别涉及一种检测人尿液中HIV(1+2)抗体的检测方法。
背景技术
现有HIV尿液抗体检测试剂，用的是酶联免疫法，该方法仅限于检测HIV-1抗体，且需要专用的仪器设备，检测时间长，必须由专业人员操作。
研发一种快速的并能用于自检的HIV(1+2)尿液抗体检测试剂是有必要的。
发明内容
本发明提供一种基于胶体金法检测尿液中HIV(1+2)抗体试剂的制备方法，以胶体金标记的SPA偶联抗人IgG抗体制备胶体金结合物垫，作为显色探针，在硝酸纤维素膜上混合包被gp41抗原和gp36抗原，作为检测HIV 1型抗体和HIV 2型抗体的检测线。
其中的胶体金结合物垫的制备方法如下：
1)标记SPA，以0.2M碳酸钾调节胶体金PH在8.2左右，10～30μg/ml 金的比例加入SPA,反应30～60分钟后，以BSA或PEG进行封闭，封闭液的终浓度1～10mg/ml，10000rpm离心10～60分钟，弃上清，沉淀用含有2mg/ml BSA的10mM Tris-Hcl(pH8.2)缓冲液的复溶至原体积。
2)金标SPA偶联抗人IgG抗体，在上述复溶后的金标SPA溶液中，每毫升溶液中加入抗人IgG抗体0.1～10μg，反应60min，10000rpm 离心10～60分钟，弃上清，沉淀用含0.5％BSA、5％蔗糖、0.1％Triton X-100、0.03％proclin-300的10mM Tris-Hcl(pH8.2)的缓冲液复溶至原体积。
3)冷冻干燥，将上述金标溶液铺金后，-50℃预冻2小时后，抽真空进行升华冻干，制备胶体金结合物垫。
其中的胶体金结合物垫，通过金标SPA偶联抗人IgG抗体，使抗人 IgG抗体的有序性增强，即Fab端一致向外，增加有效抗体的数量，增强其结合尿液中游离蛋白的能力，同时，通过金标SPA偶联抗人 IgG，延长金标探针的手臂，增强其反应能力，提升产品的灵敏度。其中，在硝酸纤维素膜上混合包被的gp41抗原浓度为0.5～2.5mg/ml, gp36抗原浓度为0.1～0.5mg/ml。
本发明进一步提供一种检测体系，所述检测体系主要包括，SPA，胶体金，BSA，PEG，Tris-Hcl缓冲液，抗人IgG，蔗糖，Triton X-100， proclin-300等成分。
本发明所述检测体系即实施例中所述检测卡，检测卡包括硝酸纤维素膜、金标垫，吸水纸、胶板和塑料卡壳等，检测卡设有检测线显示部分和样本加样孔，其中的金标垫按照本发明方法制备。
其他所需物品如铝箔袋、塑瓶、干燥剂、说明书也属于本发明的范畴。本发明的优点在于：
1、通过金标SPA并偶联抗人IgG抗体，使抗体的有序性增强，即 Fab端一致向外，增加有效抗体的数量，增强其结合尿液中游离蛋白的能力。通过金标SPA偶联抗人IgG抗体，延长金标探针的手臂，增强其反应能力，提升产品的灵敏度。
2、检测效率提高，与酶免尿检试剂相比，检测时间显著缩短，结果 15min判读；
以下为本发明技术方案和现有技术方案实施效果比较表：
附图
图1生产工艺流程图
图2检测结果的判定
图3阳性尿20例检测结果：
图4阴性尿20例检测结果：
图5均一性试验结果：
图6本发明检测卡示意图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
具体实施的关键步骤如下：
步骤一：取100ml 40nm胶体金溶液，金浓度0.03％，加入1ml 0.2M 碳酸钾，搅拌中加入4ml SPA(5mg/ml)，反应60分钟后，加入1ml 20％BSA，反应60分钟，10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用含有2mg/ml BSA的10mM Tris-Hcl(pH8.2)缓冲液复溶至100ml。步骤二：在上述复溶后的金标SPA溶液中，加入抗人IgG抗体100μl (10mg/ml)，反应60min，10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用含0.5％BSA、5％蔗糖、0.1％Triton X-100、0.03％proclin-300的10mM Tris-Hcl(pH8.2)缓冲液复溶至100ml。
步骤三：冷冻干燥，将上述金标溶液按30ml/张玻璃纤维膜 (20cm×30cm)铺金，-50℃预冻2小时后，抽真空进行升华冻干，冻干时间18小时，制备胶体金结合物垫。
步骤四：在硝酸纤维素膜检测线位置上混合包被gp41抗原和GP36 抗原，其中gp41抗原浓度为1.5mg/ml,gp36抗原浓度为0.2mg/ml，质控线位置包被兔抗鼠IgG，包被浓度为1mg/ml。
其他详细流程按生产工艺流程图进行生产，见图1。
检测过程如下：
【样本要求】
本产品检测样本为尿液。尿液样本收集在干净、干燥的尿杯内，一天之内的尿液均可检测，妇女经期应留取中段尿。尿样不得有明显的血液污染(如妇女经期)和细菌污染。
采集样本后当日检测为宜，如不能当日检测，可在2-8℃保存一周；如需延长储存时间，需在-20℃以下冻存，冷冻标本检测前应充分融化并恢复室温，摇匀。
【检验方法】
将本发明的检测卡置于干净平坦的台面上，垂直滴加约80μL(约3 滴)样本于加样孔内。在15～20分钟时观察测试结果，20分钟后判定无效。
实施例2，本发明的使用说明
【产品功能】
本产品应用免疫层析法定性检测人尿液中的HIV-1和(或)HIV-2型抗体，适用于人类免疫缺陷病毒感染的辅助诊断。
人类免疫缺陷病毒(HIV)属逆转录病毒科慢性毒属，HIV主要经血液、性交、母婴三种途径传播，机体受感染会出现严重的免疫缺陷，即获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，AIDS)，是一种病死率极高的慢性传染病。HIV感染诊断的标准方法是抗体检测[1]，除血液标本外， HIV感染者的多种体液中(尿液、唾液、精液、泪液)均含有HIV抗体。为避免HIV在诊治过程中的传播、满足自我检测的需求和减少样本运输过程中可能存在的生物安全风险，近年来，研究人员开始研发非侵入性HIV抗体检测方法。有文献报道，与传统的血液方法比较，尿液抗体检测的敏感性与特异性分别达到97.28％和99.09％[2]。鉴于在安全便捷等方面更具优势，尿液检测已成为艾滋病(AIDS)检测的一种全新手段。
【检验原理及阴阳性判定方法】
本产品采用免疫层析技术原理，应用间接法检测人尿液样本中的 (HIV1+2)抗体。通过基因工程制备的针对不同结合位点的两组HIV 重组抗原(gp41、gp36)作为包被抗原。用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)、抗人IgG抗体标记胶体金，兔抗鼠IgG作为质控线。当被检测尿液通过层析作用在试纸条上迁移时，尿液中如果含有HIV-1或HIV-2抗体，则在检测线位置出现一条紫红色条带，判定为阳性；若尿液中不含有 HIV抗体，则检测线位置无条带出现判定为阴性。无论尿液中是否含有HIV抗体，在质控线位置都会出现一条紫红色条带。具体判定结果见附图2.
【主要组成成分】
检测卡由HIV基因重组抗原(gp41、gp36)、兔抗鼠IgG包被的硝酸纤维素膜、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)、抗人IgG抗体制备金标垫，玻璃纤维、吸水纸、胶板和塑料卡壳组成。
其他所需物品铝箔袋、塑瓶、干燥剂、说明书
【制备方法】
1、将样品垫、吸水纸裁切为1.8cm×30cm规格备用，金结合物垫裁切为6mm×30cm规格备用。
2、将胶板、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸、金结合物垫进行层压贴合，组装大板。
3、将组装好的大板进行切条，切条宽度4mm。
4、将切好的条与卡壳一起组装成卡，与一袋干燥剂一起装入铝箔袋中，封口。
【检验方法】
使用前将试剂卡和样本恢复至室温。
撕开铝箔包装袋，取出检测卡置于干净平坦的台面上，垂直滴加约 70μL(约3滴)样本于加样孔内。
3.在10～15分钟时观察测试结果，20分钟后判定无效。
【检测结果的判定】
见图2
实施例3
检测实例见附图3-5。
参考文献：
田宇,沈长新,蒋岩.尿液HIV-1抗体检测技术进展【J】.中国艾滋病性病,2016(7)：579-581.
冯霞,王继宝,田雨,等.尿液HIV-1抗体检测的临床应用评价【J】.中国艾滋病性病,2016(4)：241-243.
《全国艾滋病检测技术规范》(2015年修订版),中国疾病预防控制中心。
Claims (6)
1.一种基于胶体金法检测尿液中HIV(1+2)抗体试剂的制备方法，其特征在于，以胶体金标记的SPA偶联抗人IgG抗体制备胶体金结合物垫，作为显色探针，在硝酸纤维素膜上混合包被gp41抗原和gp36抗原，作为检测HIV 1型抗体和HIV 2型抗体的检测线。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，胶体金结合物垫的制备方法如下：
1)标记SPA，以0.2M碳酸钾调节胶体金PH在8.2左右，10～30μg/ml金的比例加入SPA,反应30～60分钟后，以BSA或PEG进行封闭，封闭液的终浓度1～10mg/ml，10000rpm离心10～60分钟，弃上清，沉淀用含有2mg/ml BSA的10mM Tris-Hcl(pH8.2)缓冲液的复溶至原体积。
2)金标SPA偶联抗人IgG抗体，在上述复溶后的金标SPA溶液中，每毫升溶液中加入抗人IgG抗体0.1～10μg，反应60min，10000rpm离心10～60分钟，弃上清，沉淀用含0.5％BSA、5％蔗糖、0.1％Triton X-100、0.03％proclin-300的10mM Tris-Hcl(pH8.2)的缓冲液复溶至原体积。
3)冷冻干燥，将上述金标溶液铺金后，-50℃预冻2小时后，抽真空进行升华冻干，制备胶体金结合物垫。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中的胶体金结合物垫，通过金标SPA偶联抗人IgG抗体，使抗人IgG抗体的有序性增强，即Fab端一致向外，增加有效抗体的数量，增强其结合尿液中游离蛋白的能力，同时，通过金标SPA偶联抗人IgG，延长金标探针的手臂，增强其反应能力，提升产品的灵敏度。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在硝酸纤维素膜上混合包被的gp41抗原浓度为0.5～2.5mg/ml,gp36抗原浓度为0.1～0.5mg/ml。
5.一种检测体系，包括SPA，胶体金，BSA，PEG，Tris-Hcl缓冲液，抗人IgG，蔗糖，TritonX-100，proclin-300。
6.权利要求5的检测体系，为检测卡，包括硝酸纤维素膜、金标垫，吸水纸、胶板和塑料卡壳，检测卡设有检测线显示部分和样本加样孔，其中的金标垫按照权利要求2的方法制备。
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