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BR112012011315A2 - cepa de bifidobactéria probiótica - Google Patents

cepa de bifidobactéria probiótica Download PDF

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BR112012011315A2
BR112012011315A2 BR112012011315-1A BR112012011315A BR112012011315A2 BR 112012011315 A2 BR112012011315 A2 BR 112012011315A2 BR 112012011315 A BR112012011315 A BR 112012011315A BR 112012011315 A2 BR112012011315 A2 BR 112012011315A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
strain
formulation
disease
bifidobacterial
inflammatory
Prior art date
Application number
BR112012011315-1A
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English (en)
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BR112012011315B1 (pt
Inventor
Liam O'Mahony
Barry Kiely
John Francis Cryan
Timothy Dinan
Eileen Frances Murphy
Original Assignee
Alimentary Health Limited
The Procter & Gamble Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/616,752 external-priority patent/US9771624B2/en
Application filed by Alimentary Health Limited, The Procter & Gamble Company filed Critical Alimentary Health Limited
Publication of BR112012011315A2 publication Critical patent/BR112012011315A2/pt
Publication of BR112012011315B1 publication Critical patent/BR112012011315B1/pt

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Abstract

CEPA DE BIFIDOBACTÉRIA PROBIÓTICA. A presente invenção refere-se a uma cepa de bifidobactéria probiótica AH1714 que é significativamente imunomoduladora após o consumo via oral. A cepa é útil como um agente bioterapêutico imunomodulatório.

Description

' Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CEPA DE B/- - FIDOBACTÉRIA PROBIÓTICA".
INTRODUÇÃO 2 A presente invenção refere-se a uma cepa de bifidobactéria e seuusocomo uma bactéria probiótica, em particular como um agente biote- rapêutico imunomodulatório.
Os mecanismos de defesa para proteção do trato gastrointesti- nal humano contra a colonização por bactérias intestinais são altamente complexos e envolvem aspectos imunológicos e não imunológicos (1). Os mecanismos de defesa inatos incluem o baixo pH do estômago, sais biliares, peristaltismo, camadas de mucina e compostos anti-microbicianos, tais como ' lisozima (2). Os mecanismos imunológicos incluem agregados linfóides es- . pecializados, células M subjacentes, chamadas de placas de peyers, que são distribuídos ao longo do intestino delgado e cólon (3). Antígenos lumi- nais presentes nestes locais resultam na estimulação dos subconjuntos de células T e B adequados com estabelecimento de redes de citoquina e se- creção de anticorpos para o trato gastrointestinal (4). Além disso, a apresen- tação do antígeno pode ocorrer através das células epiteliais para os linfóci- tos epiteliais e para as células imunes de lâmina própria subjacentes (5).
Portanto, o hospedeiro investe substancialmente na defesa imunológica do trato gastrointestinal (TGI). Entretanto, devido a mucosa gastrointestinal ser a maior superfície na qua! o hospedeiro interage com o ambiente externo, devem existir mecanismos de controle específicos para regular a capacidade de resposta imune aos 90,718 kg (100 tons) de alimento que é gerido pelo trato gastrointestinal durante o tempo médio de vida. Além disso, o trato gas- trointestinal é colonizado por mais de 500 espécies de bactérias, alcançando 10" a 10'?/g no cólon. Assim, esses mecanismos de controle devem ser capazes de distinguir bactérias aderentes não-patogênicas de patógenos invasivos, os quais poderiam causar uma lesão significativa para o hospedei- ro. De fato, a flora intestinal contribui para a defesa do hospedeiro, compe- tindo com os micro-organismos potencialmente patogênicos recém- ingeridos.
' As bactérias presentes no trato gastrointestinal humano podem . causar inflamação. Respostas imunológicas aberrantes para a microflora ' nativa estiveram envolvidas em certos estados doentios, tal como o proces- - so inflamatório intestinal. Antigenos associados com a flora normal geral- —mentelevam à tolerância imunológica e a falha em alcançar essa tolerância é um importante mecanismo da inflamação mucosal (6). A evidência para essa falha na tolerância inclui um aumento nos níveis de anticorpos dirigidos contra a flora do trato gastrointestinal em pacientes com doença inflamatória intestinal (DIV). A presente invenção é encaminhada em direção a uma cepa de bifidobactéria que mostrou ter efeitos imunomodulatórios, ao modular os ní- ' veis de citoquina ou antagonizar e excluir micro-organismos pró- . inflamatórios do trato gastrointestinal.
DECLARAÇÕES DA INVENÇÃO A invenção apresenta uma cepa isolada de bifidobactéria NCIMB
41676.
A cepa de bifidobactéria pode estar sob a forma de células viá- veis. A cepa de bifidobactéria pode estar sob a forma de células não-viáveis. A bifidobactéria pode ser isolada do tecido para biópsia colônica de um indi- —víduo humano saudável. A cepa de bifidobactéria pode ser significativamen- te imunomodulatória após o consumo oral em seres humanos.
A invenção também fornece uma formulação que compreende uma cepa de bifidobactéria conforme descrita na presente invenção. A for- mulação pode compreender ainda um material probiótico. A formulação pode compreender ainda um material prebiótico. A formulação pode compreender ainda um veículo ingerível. O veículo ingerível pode ser um veículo farma- ceuticamente aceitável, como uma cápsula, tablete, ou pó. O veículo ingerí- vel pode ser um produto alimentício tal como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, requeijão, molhos ou bebidas.
A formulação pode compreender ainda uma proteina e/ou peptídeo, em par- ticular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutamina/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou microelemento. A cepa
' de bifidobactéria pode estar presente em uma quantidade de mais de 10º ufc . por grama da fórmula. A formulação pode compreender ainda um adjuvante. ' A formulação pode compreender ainda um componente bacteriano. A formu- - lação pode compreender ainda uma entidade de fármaco. A formulação po- de compreender ainda um composto biológico. A formulação pode ser usada para protocolos de imunização e vacinação.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso em produtos alimentícios.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso como um medicamento.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma Í formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento . de atividade inflamatória indesejável.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória gastrointestinal indesejável, como doença inflama- tória intestinal, por exemplo: doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável; bursite; ou colite pós-infecciosa.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer gastrointestinal.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica, como artrite reumatoide.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de transtornos autoimunes devido a atividade inflamatória indesejável.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncerdevido a atividade inflamatória indesejável.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia de câncer.
' A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma ' formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento ] de doença diarreica devido a atividade inflamatória indesejável, como diar- - reia associada a Clostridium diffícile, diarreia associada a rotavírus ou diar- reia pós-infecciosa, ou doença diarreica devido a um agente infeccioso, co- mo E. coli.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na preparação de agentes bio- terapêuticos anti-inflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável. As cepas de bifidobactéria, conforme descrito aqui, podem ser Ú utilizadas na preparação de um painel de agentes bioterapêuticos para modi- . ficação dos níveis de IL-10.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na prevenção e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente dos sistemas gastro- intestinal e imune), doença diarreica, diarreia associada ao uso de antibióti- Co, diarreia pediátrica, apendicite, distúrbios autoimunes, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatoide, doença celíaca, diabetes mellitus, transplante de órgão, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fún- gicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmis- sível, infecção por HIV, replicação de HIV, diarreia associada a HIV, trauma associado a cirurgia, doença metastásica induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função de barreira do intestino, alergia, asma, distúrbios respirató- rios, distúrbios circulatórios, doenças coronárias, anemia, distúrbios do sis- tema de coagulação de sangue, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, dis- túrbios endócrinos, distúrbios epidermais, psoríase, acne vulgar, transtorno do pânico, distúrbio comportamental e/ou distúrbio de stress pós-traumático.
A cepa de bifidobactéria, conforme descrito aqui, atua por anta-
i gonismo e exclusão de micro-organismos pró-inflamatórios do trato gastroin- - testinal. : A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma - formulação, conforme descrito aqui, para uso na preparação de agentes bio- terapêuticos anti-inflamatórios para reduzir os níveis de citoquinas pró- inflamatórias.
À cepa de bifidobactéria, conforme descrito aqui, pode ser usada como uma cepa probiótica anti-infectante.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de transtorno bipolar, depressão, transtornos de humor e/ou transtornos de : ansiedade. BR A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, que pode ser usada como intensificador cognitivo para a profilaxia e/ou para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, como doença de Alzheimer, esquizofrenia e/ou distúrbio cognitivo leve.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou no tratamen- tode inflamação relacionada à obesidade.
A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou no tratamen- to de desregulagem metabólica relacionada à obesidade.
Descrevemos a cepa de bifidobactéria AH1714 (NCIMB 41676) oumutantes ou variantes da mesma. O mutante pode ser um mutante gene- ticamente modificado. A variante pode ser uma variação de ocorrência natu- ral da bifidobactéria. Também há a descrição de uma variante resistente à rifampicina da cepa AH1714. A cepa pode ser um probiótico. Pode estar sob a forma de uma cultura biologicamente pura.
Também descrevemos uma cepa isolada de bifidobactéria NCIMB 41676. As cepas de bifidobactéria podem estar sob a forma de célu- las viáveis. Alternativamente, as cepas de bifidobactéria estão sob a forma de células não-viáveis. O uso geral de bactérias probióticas se dá sob a for- . ma de células viáveis. Entretanto, pode também ser estendido a células não- viáveis como culturas mortas ou composições contendo fatores benéficos - expressados pela bactéria probiótica. Isso pode incluir micro-organismos mortos termicamente ou micro-organismos mortos mediante a exposição a pH alterado ou submissão a pressão ou irradiação gama. Com células não- viáveis, a preparação do produto é simplificada, as células podem ser incor- poradas facilmente em fármacos e os requisitos de armazenamento são mui- to menos limitados do que com células viáveis. O Lactobacilos casei YIT 9018 oferece um exemplo da eficácia do uso de células mortas pelo calor como um método de tratamento e/ou prevenção de crescimento tumoral, conforme descrito na patente US nº 4347240. . As cepas de bifidobactéria podem ser isoladas do tecido de bi- ópsia colônica de indivíduos humanos saudáveis, sendo as cepas de bifido- bactéria significativamente imunomodulatórias seguindo o consumo oral em seres humanos.
Também descrevemos uma formulação que compreende a cepa de bifidobactéria conforme descrito aqui. A formulação pode incluir outro ma- terial probiótico. A formulação pode incluir um material prebiótico. De prefe- rência, a formulação inclui um veículo ingerível. O veículo ingerível pode ser um veículo farmaceuticamente aceitável como uma cápsula, tablete ou pó. De preferência o veículo ingerível é um produto alimentício como leite acidi- ficado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, requei- jão, molhos ou bebidas. A formulação pode compreender ainda uma proteí- na e/ou peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutamina/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou microelemento. A cepa de bifidobactéria pode estar presente na formulação em mais de 10º ufc por grama do sistema de liberação. De preferência, a formulação inclui um ou mais de um adjuvante, um componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.
Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma for- mulação para uso como produtos alimentícios, como um medicamento, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável, - para uso no tratamento de atividade inflamatória respiratória indesejável co- mo asma, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória - gastrointestinal indesejável como doença inflamatória intestinal, por exem- plo: doençade Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, bur- site ou colite pós-infecciosa, para uso na profilaxia e/ou tratamento de cân- cer gastrointestinal, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistê- mica como artrite reumatóide, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de transtornos auto-imunes devido a atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido a atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia de câncer, para uso na profilaxia e/ou tra- tamento de doença diarreica devido a atividade inflamatória indesejável, co- . mo diarreia associada a Clostridium difficile, diarreia associada a rotavírus ou diarreia pós-infectante, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarreica devido a um agente infeccioso, como E. coli.
Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma for- mulação da invenção para uso na preparação de um agente bioterapêutico anti-inflamatório para a profilaxia e/ou para o tratamento de atividade infla- matória indesejada ou para uso na preparação de agentes bioterapêuticos antiinflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável. A cepa pode agir por antagonismo e exclusão dos micro- organismos pró-inflamatórios do trato gastrointestinal.
Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma for- mulação para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti- inflamatórios para redução dos níveis de citoquinas pró-inflamatórias.
A cepa de bifidobactéria pode ser usada na preparação de agen- tes bioterapêuticos anti-inflamatórios para modificar os níveis de 11-10.
A cepa de bifidobactéria pode ser usada como um probiótico an- ti-infectante devido à sua habilidade de antagonizar o crescimento de espé- ciespatogênicas.
Descobrimos que cepas particulares de bifidobactéria obtêm e- feitos imunomodulatórios jin vitro.
A invenção é portanto de grande valor terapêutico potencial na - profilaxia ou tratamento de respostas imunológicas desreguladas, como rea- ções inflamatórias indesejadas, por exemplo, asma. - As bifidobactérias são micro-organismos comensais. Elas foram isoladas da flora microbiana dentro do trato gastrointestinal humano. O sis- tema imunológico no trato gastrointestinal não pode ter uma reação pronun- ciada em relação aos membros desta flora, uma vez que a atividade inflama- tória resultante também destruiria as células hospedeiras e a função do teci- do. Portanto, existem alguns mecanismos para que o sistema imunológico possa reconhecer membros comensais não patogênicos da flora gastrointes- tinal como sendo diferentes dos organismos patogênicos. Isso garante que Ú as lesões ao tecido hospedeiro sejam restritas e que uma barreira defensiva . ainda seja mantida. Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi fei- tono National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucksburn, cidade de Aber- deen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 5 de novembro de 2009 e le- vou o número de registro NCIMB 41676.
A Bifidobacterium longum pode ser um mutante geneticamente modificado ou pode ser uma variante de ocorrência natural da mesma.
De preferência, a Bifidobacterium longum pode se apresentar na forma de células viáveis.
Alternativamente, a Bifidobacterium longum pode estar na forma de células não viáveis.
Será entendido que a cepa de bifidobactéria específica da in- venção pode ser administrada a animais (incluindo seres humanos) em uma forma oralmente ingerível em uma preparação convencional como cápsulas, microcápsulas, tabletes, grânulos, pó, pastilhas, pílulas, supositórios, sus- pensões e xaropes. Formulações adequadas podem ser preparadas por mé- todos comumente empregados usando aditivos orgânicos e inorgânicos con- vencionais. À quantidade de ingrediente ativo na composição médica pode estar em um nível que irá exercer o efeito terapêutico desejado.
A formulação pode também incluir um componente bacteriano, . uma entidade farmacológica ou um composto biológico. Além disso, uma vacina que compreende as cepas da invenção - pode ser preparada com o uso de qualquer método conhecido adequado e pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável ou adjuvante.
Ao longo do relatório descritivo, os termos mutante, variante e mutante geneticamente modificado incluem uma cepa de bifidobactérias cu- jas propriedades genéticas e/ou fenotípicas são alteradas em comparação com a cepa progenitora. Variantes de ocorrência natural de Bifidobacterium fongum incluem as alterações espontâneas de propriedades alvo seletiva- mente isoladas. A alteração deliberada das propriedades da cepa progenito- ra é alcançada por tecnologias de manipulação genética (in vitro) convencio- ' nais, como perturbação genética, transferência conjugativa, etc. A modifica- ção genética inclui a introdução de sequências de DNA exógenas e/ou en- dógenas dentro do genoma de uma cepa de bifidobactéria, por exemplo por inserção dentro do genoma da cepa bacteriana por vetores, incluindo DNA plasmídeo ou bacteriófagos.
As mutações naturais ou induzidas incluem pelo menos altera- ções de uma única base como supressão, inserção, transversão ou outras modificações de DNA que podem resultar em alteração da sequência de a- minoácidos codificada pela sequência de DNA.
Os termos mutante, variante e mutante geneticamente modifíca- do também incluem uma cepa de bifidobactéria que sofreu alterações gené- ticas que acumulam em um genoma em uma taxa que é consistente em na- tureza com todos os micro-organismos e/ou alterações genéticas que ocor- rem através de mutação espontânea e/ou captura de genes e/ou perda de genes que não é alcançada por manipulação deliberada (in vitro) do geno- ma, mas é alcançada através da seleção natural de variantes e/ou mutantes que fornecem uma vantagem seletiva para suportar a sobrevivência da bac- téria quando exposta a pressões ambientais, como antibióticos. Um mutante pode ser criado pela inserção deliberada (in vitro) de genes específicos den- tro do genoma que não alteram fundamentalmente a funcionalidade bioquíi-
mica do organismo, mas cujos produtos podem ser usados para identifica- . ção ou seleção da bactéria, por exemplo, resistência antibiótica. i Uma pessoa versada na técnica iria reconhecer que cepas de bi- - fidobactérias mutantes ou variantes podem ser identificadas por análise de homologia de sequências de DNA com a cepa progenitora. As cepas de bifi- dobactérias que têm uma identidade de sequência próxima a da cepa pro- genitora são consideradas cepas mutantes ou variantes. Uma cepa de bifi- dobactéria com uma identidade de sequência (homologia) de 968% ou mais, como 97% ou mais, ou 98% ou mais, ou 99% ou mais com a sequência de DNA da progenitora pode ser considerada uma mutante ou variante. A ho- mologia da sequência pode ser determinada usando-se o algoritmo do pro- Ú grama online "BLAST" (um algoritmo para busca de homologia), publicamen- ' te disponível em http:/Mwww.ncbi.nIlm.nih.gov/BLAST/. Mutantes da cepa progenitora também incluem cepas de bifido- bactéria tendo pelo menos 85% de homologia de sequência, como pelo me- nos 90% de homologia de sequência, ou pelo menos 95% de homologia de sequência para a sequência de polinucleotídeo do espaçador intergênico de 16s — 23s da cepa progenitora. Esses mutantes podem compreender ainda mutações de DNA em outras sequências de DNA no genoma bacteriano.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção será mais claramente compreendida através da des- crição a seguir fornecida somente a título de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, em que: a Figura 1 é um gráfico ilustrando o trânsito da B. longum AH1714 através do trato gastrointestinal. A Figura 2 é uma foto da B. longum AH1714 cultivada em uma placa de ágar vermelho congo; a Figura 3 é um gráfico de barra ilustrando a razão I11L-10:1L- 12p70 de células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) estimuladas coma cepa Bifidobacterium longum 1714 (bifidobactéria 1714); a Figura 4 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do I1L-10 em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714
' e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissacarídeo LPS de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A), ou são estimuladas com lipopolissacarideo LPS (B) ou estimuladas com anticCD3/CD28 (C). Os dados - são mostrados como a média & EPM; a Figura 5 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do TNF-a em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissacarídeo LPS in vivo de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A) ou são estimu- ladas com antiCD3/CD28 (B). Os dados são mostrados como a média & EPM; a Figura 6 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução ] do IFN-y em esplenócitos isolados de camundongos administrados com . 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissacarídeo LPS de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A) ou estimuladas com an- ticD3/CD28 (B). Os dado são mostrados como a média & EPM.
a Figura 7 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do I11L-12p70 em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo com lipopolissacarídeo (LPS) de 1 mg/Kg. As células in vitro são não-estimuladas (A) ou estimuladas com an- ticCD3/CD28(B). Os dados são mostrados como a média & EPM; a Figura 8 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do TNF-a (A) e 11-10 (B) em amostras de soro de camundongos administra- dos com 1714 e com STF após 2 h do desafio in vivo com lipopolissacarídeo (LPS) de 1 mg/kg. Os dados são mostrados como a média & EPM; a Figura 9 é um gráfico de barra mostrando a atividade NFKB (fótons/segundo) do baço isolado 3 horas após o desafio com dose única de 0,5 mg/kg de lipopolissacarideo (LPS), de animais alimentados com placebo € 1714 (** indica p<0,01); a Figura 10 é um gráfico de barra (A) mostrando a atividade —NFKkB (fótons/segundo) de imagens do corpo total 1 h30 m após o desafio com uma dose única de 0,5 mg/kg de lipopolissacarideo LPS, de animais alimentados com placebo e com 1714 ((B) e (C) são imagens representati-
vas do corpo total em preto e branco e em cores; . a Figura 11 é um gráfico de barra representando o tempo de i- mobilidade exibido pelo camundongo durante um teste de 6 minutos; - a Figura 12 é um gráfico de linha representando a porcentagem de congelamento em resposta ao estímulo temido (contexto) para o dia 1 (captura), dia 2 (memória/extinção) e dia 3 (extinção); a Figura 13 é um gráfico de linha representando a porcentagem de congelamento em resposta ao estímulo temido (pista) para o dia 1 (captu- ra), dia 2 (memória/extinção) e dia 3 (extinção); a Figura 14 é um gráfico de barra representando o número de esferas escondidas pelo camundongo durante uma sessão de 30 minutos; i a Figura 15 é um gráfico de barra representando a variação de . temperatura corporal (AT) que os camundongos exibiram após o tratamento; e a Figura 16 é um gráfico de barra mostrando as mudanças nos níveis de citoquina em esplenócitos estimulados do modelo de ratos induzi- dos por dieta.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi fei- tono National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucksburn, cidade de Aber- deen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 5 de novembro de 2009 e le- vou o número de registro NCIMB 41676. Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum UCC35624 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucksbum, cidade de Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 13 de janeiro de 1999 e levou o número de registro NCIMB 41003. Exemplos Os exemplos a seguir descrevem e demonstram com mais deta- lhes as modalidades no âmbito da presente invenção. Os exemplos são for- necidos somente para fins ilustrativos e não devem ser considerados como limitações à presente invenção, uma vez que muitas variações da mesma o são possíveis, sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Exemplo 1 - Isolamento da Bifidobacterium longum AH1714 . A cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi isolada do tecido de biópsia colônica de individuos humanos saudáveis.
Seções do TGI grosso, obtidas durante sondagem colo-retal, fo- ram analisadas em busca de cepas bacterianas probióticas. Tecido mucoso do trato gastrointestinal humano foi transferido para um tubo de coleta con- tendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), suplementada com 0,05 de cisteina-HCl. Foi adicionado Triton X-100 (0,05%) para liberar os micro- organismos aderentes da amostra de tecido. Amostras de tecido foram então B incubadas por 10 min. As amostras foram agitadas vigorosamente e lactoba- - cilos e bifidobactérias foram isolados do tecido gastrointestinal por placas em ágares seletivos (ágares De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) + vancomicina e ágar Wilkins-Chalgren + mupirocina, respectivamente). Colônias isoladas foram então retiradas das placas e reaplicadas por esfregaço três vezes pa- ra garantir a pureza. Foram usadas avaliações por examinação microscópi- ca, manchas de Gram, testes de catalase, frutose-6-fosfato fosfoquetolase para determinar espécies de bifidobactérias prováveis e os isolados foram colocados em solução-tampão com 40% de glicerol e armazenados em -20 o e -BO0ºC. Foi usado o sequenciamento da região do espaçador intergênico 168 para confirmar a identidade das cepas recém-isoladas.
Seguindo o isolamento de uma cepa de bifidobactéria pura e a- pós atribuída a designação AH1714, as características microbiológicas foram —avaliadase estão resumidas na Tabela 1 abaixo. A AH1714 é uma bactéria gram-positiva de forma pleomórfica de catalase negativa, que é frutose-6- fosfato fosfoquetolase positiva, confirmando sua identidade como uma bifi- dobactéria.
Tabela 1 - Características físico-químicas da B. /ongum AH1714 | [LL eae | [mare == Sequenciamento do espaçador intergênico (IGS) de 168-23s foi realizado para identificar as espécies de bifidobactérias isoladas.
Brevemen- te, o DNA foi isolado da AH1714 usando-se 100 ul de solução para extração e25uldesolução para preparação de tecidos (Sigma, kit XNAT2). As amos- tras foram incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente seguido de 2 horas em 95ºC e depois 100 ui de solução para neutralização (Sigma, kit XNAT2) foram adicionados.
A solução de DNA genômico foi quantificada Ú usando-se um espectrofotômetro de nanogotas e armazenado em 4ºC.
À PCR (reação em cadeia de polimerase) foi realizada com o uso do iniciador de IGS (espaçador intergênico). Os pares de iniciadores usados foram IGS R S-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ |D nº 4) e IGS L 5- GCTGGATCACCTCCTTTCT-3' (SEQ ID nº 3). As condições de ciclo foram 94ºC durante 4 minutos (1 ciclo), 94ºC durante 45 segundos, 53ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 45 segundos (28 ciclos). A reação PCR continha 2 ul (100 ng) de DNA, mistura de PCR (Sigma, Red Taq), 0,025 nM de inici- ador IGS L e R (MWG Biotech, Alemanha). As reações PCR foram realiza- das em um termociclo Biotherma.
Os produtos de PCR (10 ul) foram passa- dos, juntamente com um marcador de peso molecular (100 bp Ladder, Ro- che) por um gel de agarose 2% corado com brometo de etídio (EtBr) em TAE (tris-acetato EDTA), para determinar seu perfil de IGS.
Os produtos de PCR da bifidobactéria (banda única) foram purificados com o uso do kit de purificação Promega Wizard PCR.
Os produtos de PCR purificados foram sequenciados com o uso de sequências iniciadoras (acima) para a região de — espaçador intergênico (IGS). Os dados de sequência foram então pesquisa- dos em relação à base de dados de nucleotideos do NCB!I para determinar a identidade da cepa por homologia de nucleotídeos.
Os dados da sequência resultante de DNA foram submetidos à ferramenta de busca BLAST de ho-
mologia de nucleotídeo-a-nucleotídeo padrão NCBI - (http://www. ncbi.nlm.nih.govwBLASTY/). A correspondência mais próxima para a sequência foi identificada e então as sequências foram alinhadas para - comparação usando o software DNASTAR MegAlign.
As sequências (SEQ IDnº1[IGS sequência direta] e SEQ ID nº 2 [IGS sequência reversa]) obti- das podem ser vistas na listagem de sequência.
A procura na base de dados da NCIMB revelou que a AH1714 tem uma sequência de IGS (SEQ ID nº 1 [Sequência direta] e SEQ ID nº 2 [sequência reversa]) única com sua homo- logia de sequência mais próxima a uma Bifidobacterium longum.
Para poder desenvolver um perfil PCR de código de barra para AH1714, o PCR foi realizado com o uso de iniciadores BOX (8). As condi- : ções de ciclo foram 94ºC durante 7 min. (1 ciclo); 94ºC durante 1 minuto, . 53ºC durante 45 segundos, 65ºC durante 8 minutos, (30 ciclos) e 65ºC du- rante 16 minutos.
A reação PCR continha 50 ng de DNA, mistura PCR (Sig- ma, Red Taq) e 0,038 nM de iniciador BOXAIR (5 CTACGGCAAGGC- GACGCTGACG-3') (SEQ ID nº 5) (MWG Biotech, Alemanha). As reações PCR foram realizadas em um termociclo Biotherma.
Os produtos PCR foram passados por um gel de agarose a 3% juntamente com um marcador de pe- so molecular (Roche, 100 bp ladder) e fotografados.
Perfisde sensibilidade antibiótica.
Os perfis de sensibilidade antibiótica para a B. longum AH1714 foram determinados usando o ensaio de 'disco de suscetibilidade". As cultu- ras foram cultivadas no meio de caldo adequado por 48 h e espalhadas (100 ul) pela placa sobre o meio ágar.
Discos contendo concentrações conheci- das dos antibióticos foram colocados sobre o ágar.
As cepas foram exami- nadas em busca de sensibilidade antibiótica depois de 1 a 2 dias de incuba- ção em 37ºC sob condições anaeróbicas.
Tabela 2 - Resistência antibiótica [Menina | Antiiófica flatama Mo
| | Genmamíena — | Antbiôtico aminagicasideo [mM | | Acidonaidiico | Armbiômco qumoloma sintético | Ro | | sutametorazol | Anfbiótica sufonamida É Ro | suramanaia | |" Sulfametoxazol metapra QI [Cetera [O Ts - Merda | Antbióticonitoimidazo — | mM [| Mmupraena OO RA ' R= Resistente (Tamanho de zona < 14 mm) M= Moderadamente sensível (Tamanho de zona 15 a 19 mm) S = Sensível (Tamanho de zona 2 20 mm) Trânsito intestinal Para determinar se a Bifidobacterium longum AH1714 pode so- breviver em baixos valores de pH, equivalentes a estes encontrados no es- tômago, as células bacterianas foram colhidas de culturas frescas de um dia para o outro, lavadas duas vezes em tampão de fosfato (pH 6,5) e re- suspensas em caldo TPY ajustado em pH 2,5 (com 1 M HCI). As células fo- ram incubadas em 37ºC e a sobrevivência foi medida em intervalos de 5, 30, 60 e 120 minutos usando o método de contagem em placas.
A AH1714 so- breviveu bem durante 5 minutos em pH 2,5 enquanto nenhuma célula viável foi recuperada depois de 30 minutos.
Ao sair do estômago, probióticos putativos são expostos aos sais biliares no intestino delgado.
Para poder determinar a habilidade da B. longum AH1714 para sobreviver à exposição à bílis, as culturas foram apli- cadas por esfregaço em placas de ágar TPY suplementadas com 0,3% (pe- so por volume), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% ou 10% de bílis de porco.
O cres- cimento da B. longum AH1714 foi observado nas placas que continham até 0,5% de bílis.
i Tabela 3 - Crescimento da AH1714 na presença de bílis de porco (resulta- o dos duplicados) : [ema [00 [os os 1020 [so 75 [100] [arizia | [ar [Da +++ = crescimento muito bom - 100% ++ = crescimento bom -66% +=crescimento insatisfatório -33% - = sem crescimento-0% Em um modelo murino livre de germes, a habilidade da B. fon- gum AH1714 para se mover no trato gastrointestinal foi avaliada.
Os camun- ' dongos consumiram 1x1 0º AH1714 diariamente e foi examinada a presença 210 de pelotas fecais do micro-organismo ingerido.
À detecção da AH1714 foi facilitada ao isolar-se uma variante resistente à rifampicina espontânea da bifidobactéria — a incorporação da rifampicina nas placas de RCA + cisteina usadas para avaliar o movimento (trânsito) garantem que foi cultivada so- mente a bifidobactéria resistente à rifampicina administrada.
As amostras fecais foram coletadas diariamente e o trânsito da B. longum AH1714 atra- vês do trato gastrointestinal foi confirmado (veja a Figura 1) Atividade antimicrobiana Para avaliar as atividades antimicrobianas da B. longum AH1714 em relação a culturas indicadoras e para determinar se a atividade antimi- crobiana foi devida à produção de ácido, a AH1714 foi cultivada de um dia para o outro na MRS (suplementada com 0,05% de cisteina-HCI). 2 ul de cultura AH1714 foi notada sobre o ágar e incubada por 24 h.
Os organismos indicadores foram cultivados na TSB (E. coli e Salmonella typhimurium), cal- do Brucella (Campylobacter jejuni) e meio reforçado de Clostrídio (RCM, Clostridium difficile). À grama indicadora foi preparada inoculando uma ca- mada derretida com 2% (v/v) da cultura indicadora de um dia para o outro, que foi então derramada sobre a superfície das culturas probióticas pintadas, seguido de crescimento de um dia para o outro nas placas de ágar.
As pla- cas foram incubadas em 37ºC sob condições adequadas para a cepa indi-
cadora e o crescimento registrado após 24-48 h.
Zonas de abertura maior do o que 1 mm de diâmetro foram consideradas sensíveis à cepa probiótica.
Esse ensaio também foi realizado em meio suplementado com 2% B-glicerofosfato . e como agente tampão para limitar a atividade antagonista devido à produ- çãodeácido.
Tabela 4 — Atividade antimicrobiana da AH1714 o voadembiçãoimm | sampylobacterigamt | a O QU | Cstidiumperííngens | 20 [0 | Geração de rifampicina (Rif”) cepas resistentes do 1714 ' Para ser possível rastrear o movimento (trânsito) da AH1714 em amostras fecais, uma variante (rif+) resistente à rifampicina espontânea foi isolada da seguinte forma: uma cultura de caldo fresca de AH1714 foi espa- lhada pela placa (100 ul) sobre a MRS + rifampicina + cisteina com a menor concentração de rifampicina (na faixa de 0,1%, 0,08%, 0,06%, 0,04%, 0,02% € 0,002%). O meio de placa sem rifampicina foi incluído como controle posi- tivo.
Ambos os conjuntos de placas foram incubados anaerobicamente em 37ºC (48 horas). À pureza das placas removidas foi então avaliada antes de escolher uma colônia da placa de ágar suplementada com rifampicina e ser aplicada por esfregaço sobre a placa suplementada de rifampicina próxima de maior concentração.
Além disso, uma colônia foi retirada por esfregaço da placa de ágar MRS, aplicada sobre uma nova placa de ágar MRS e am- bosos conjuntos de placas incubados anaerobicamente em 37ºC (48 horas). Esse processo foi repetido por toda faixa de placas suplementadas com ri- fampicina.
Uma única colônia de uma cultura totalmente madura em uma placa de ágar MRS suplementada com rifampicina de 50 pg/mL foi usada para inocular o caldo MRS de 20 ml e a cultura resultante usada para arma- zenamento subsequente.
A identidade da variante foi confirmada por avalia- ção microscópica, análise de sequências IGS e por análise PCR específica.
Exemplo 2 - Tela de ágar com vermelho congo
Uma tela de ágar com vermelho congo foi usada para avaliar fe- o notipicamente cepas de bactérias que expressam polissacarídeo extracelular (EPS - extracellular polysaccharide). Um meio de caldo Rogosa de 10 ml - modificado (+ 0,05% cisteina) foi brevemente inoculado assepticamente com uma colônia recém-cultivada da cepa bacteriana e incubada anaeróbicamen- te em 37ºC até a turbidez (cerca de 16 até 24 horas). As culturas de caldo foram assepticamente espalhadas por esfregaço nas placas de ágar com vermelho congo e incubadas anaeróbicamente em 37ºC por 48 horas.
Acre- dita-se que o polissacarídeo extracelular (EPS) produzido como um subpro- —dutodo crescimento e/ou metabolismo de certas cepas evita a absorção do corante vermelho congo, resultando em uma morfologia de colônias com i coloração creme/branca.
Corantes que produzem menos EPS absorvem : facilmente o corante vermelho congo, resultando em uma morfologia de co- lônias com coloração rosa/vermelha.
Cepas que não produzem uma colora- ção vermelha de EPS parecem quase transparentes em fundo de ágar ver- melho.
Com referência à Figura 2, a morfologia da colônia da B. longum AH1714 é de colônias convexas, mucóides e brancas brilhantes.
Exemplo 3 - Bifidobactéria 1714 induz uma razão 11-10:11-12 significativa- mente elevada.
Células mononucleares de sangue periférico (CMSP's) foram iso- ladas a partir de sangue humano periférico saudável com o uso de tubos CPT, BD Vacutainer (BD catálogo 362761), conforme instruções do fabrican- te.
As CMSPs foram lavadas e ressuspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco- Glutamax'"” (Glutamax (substituto da glutamina) + piruvato + 4,5 g/l glicose (catálogo Gibco 10569-010), 10% de soro fetal bovino (catálo- go Sigma F4135) e 1% penicilina/estreptomicina (catálogo Sigma PO781). As CMSPs foram incubadas (2 x 10º células por poço) em placas de fundo cha- to com 96 poços e 20 ul de uma suspensão bacteriana (em uma concentra- ção de1x10' ufeuml) foram adicionados.
As CMSPs foram coincubadas com bactérias por 48 horas em 37ºC / 5% CO, em um incubador.
Depois do período de 2 dias de incubação, as placas foram centrifugadas em 300 x ge i os sobrenadantes foram removidos e armazenados congelados em -80ºC o até análise. Os níveis de interleucina-10 (IL-10) e interleucina-12p70 (IL- 12p70) nas culturas sobrenadantes foram quantificados com o uso de um kit . de ensaio de 96 poços disponível junto à Meso Scale Discovery (Gaithers- burg, MD, EUA; catálogo K15008B-1). As bactérias foram preparadas para experimentos de cocultura em dois formatos: (a) Bactérias recém-cultivadas foram cultivadas em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacionária, Todas as células foram cultivadas sob condições anaeróbicas em 37ºC. (b) Bactérias foram cultivadas sob condições anaeróbicas em 37ºC em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacionária. Pós secados por conge- lamento foram gerados para cada uma dessas bactérias e armazenados em - -80ºC em frascos de pré-alíquota de 100 mg. Imediatamente antes do uso, uma alíquota de cada cepa foi removida do congelador e deixada ao ar livre até atingir a temperatura ambiente. Cada cepa foi lavada 3 vezes em 10 mi de solução de Ringer seguido de centrifugação. Um frasco novo foi usado em cada ocasião. Curvas de crescimento (DO vs. número de células vivas) foram criadas para cada condição de crescimento e as células lavadas foram normalizadas pelo número de células antes da adição às CMSPs. Um con- trolesem bactérias foi também incluído em todos os experimentos. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Os resultados são apresentados na Figura 3.
O controle de doenças inflamatórias é exercido em vários níveis. Os fatores de controle incluem hormônios, prostaglandinas, oxigênio reativo e intermediários de nitrogênio, leucotrienos e citoquinas, As citoquinas são proteinas biológicamente ativas de baixo peso molecular que estão envolvi das na geração e controle de respostas imunológicas e inflamatórias. Várias células produzem essas citoquinas, sendo os neutrófilos, monócitos, e linfó- citos as maiores fontes durante as reações inflamatórias devido a seu gran- de número no |ocal lesionado. Múltiplos mecanismos existem, pelos quais as citoquinas gera- das em locais inflamatórios influenciam a resposta inflamatória. A quimiota-
i xia estimula o fluxo de células inflamatórias ao local da lesão, enquanto cer- o tas citoquinas promovem a infiltração das células nos tecidos.
As citoquinas liberadas no local do tecido lesionado resultam na ativação do infiltrado in- . flamatório.
Grande parte das citoquinas são pleiotrópicas e exprimem múlti- plas atividades biologicamente sobrepostas.
Visto que respostas inflamató- rias não controladas podem resultar em doenças, tais como SII, é razoável imaginar que a produção de citoquina tomou um rumo incerto em indivíduos afetados com essas doenças.
A interleucina-10 (IL-10) é uma citoquina anti-infltamatória que é produzida por muitos tipos de células, incluindo monócitos, macrófagos, cé- lulas dendríticas, mastócitos e linfócitos (em particular células reguladoras : T). A 11-10 regula negativamente a expressão de citoquinas Th1i pró- . inflamatórias, antigenos MHC classe |! e moléculas coestimuladoras em cé- lulas apresentando antígenos.
Ela também melhora a sobrevivência da célu- laB, proliferação e produção de anticorpos.
Essa citoquina pode bloquear a atividade NF-xB e está envolvida na regulação da via de sinalização JAK- STAT.
Estudos de knockout em murinos demonstraram o papel essencial da 11-10 na imunoregulação quando camundongos com IL-10KO desenvolve- ram colite severa.
Além disso, bactérias que são potentes indutores de 11-10 têm se provado capazes de promover diferenciação celular regulatória T in vivo, assim contribuindo para a homeostase imunológica (7; 8). A interleucina-12 (11-12) é uma citoquina pró-inflamatória asso- ciada à polarização de respostas de células T com efetor Th1 e estimulam a produção de outras citoquinas Th1 pró-inflamatórias, tais como interferon- gama (IFN-y) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), de células T e exter- minadoras naturais (NK). Altos níveis de expressão 11-12 são associados com auto-imunidade.
A administração de IL-12 a pessoas sofrendo de doen- ças auto-imunes agravou os sintomas da doença.
Em contraste, camundon- gos com knockout de 1L-12 ou tratamento de camundongos com anticorpos — neutralizadores de |l-12 amenizou a doença.
Cascatas de citoquina e redes controlam a resposta inflamatória, ao invés da ação de uma citoquina em particular em um tipo de célula em i particular. Os níveis relativos de expressão ou balanço de duas citoquinas o (tais como 1L-10 and IL-12) são mais informativos do que a expressão de uma única citoquina. Nestes estudos, estimulamos as CMSPs humano com ” uma faixa de cepas bacterianas diferentes. Todas as cepas induziram I1L-10 etodasascepasinduziram IL-12. Entretanto, a examinação da razão entre a indução de IL-10 e IL-12 revelou que algumas cepas de bactéria induziram uma razão maior (exemplo, mais I1L-10 com menos |L-12) comparada a ou- tras cepas. Essa é uma observação importante, já que é o balanço entre ca- da um desses sinais opostos que por fim determina o resultado imunológico.
É esperado que uma razão alta de IL-10:1L-12 promoverá uma resposta anti- inflamatória associada com atividade imunoregulatória adequada enquanto uma baixa razão de [1L-10:11-12 vai contribuir para a polarização de Th1i da - resposta imunológica. Assim, a razão de CMSP IL-10:11-12 é um importante critério de seleção para identificação de cepas bacterianas com proprieda- desimunoregulatórias.
Exemplo 4 - A alimentação prolongada de camundongos com Bif. AH1714 está associada com o aumento da citoquina anti-inflamatória IL-10 e com a diminuição de citoquinas Th1 e pró-inflamatórias TNF -a IFN-y e 11-12 em animais saudáveis e em um modelo de sepse/inflamação.
Materiais & Métodos: Camundongos fêmeas com 6 a 8 semanas de idade são adquiri- dos junto à Harlan UK (Reino Unido) e alojados em gaiolas individualmente ventiladas e com acesso ad libitum a alimento e água estéril para camun- dongos.
Camundongos de pesos similares são distribuídos aleatoriamen- te em 2 grupos e administrados STF (veículo de controle n=9), cepa de Bifi- dobacterium longum AH1714 (n=17) via sonda esofágica diariamente por 115 dias, Seguindo o período de administração, o sangue é coletado de 10 camundongos AH1714 e 6 veículos de controle são desafiados com 1 mg/kg delipopolissacarídeo LPS (Sigma, L4391) via injeção intraperitoneal.
Seguindo o período de administração, o sangue é coletado de 6 camundongos AH1714 e 4 veículos de controle, o soro é extraído e preser-
i vado para medição de citoquina.
O baço é também removido e suspensões o de células únicas são cultivadas in vitro, As citoquinas são medidas em célu- las supernatantes seguindo as 48 horas de cultivo. . Adicionalmente, mais 10 camundongos AH1714 e 6 camundon- gos de controle são administrados com uma dose única de lipopolissacari- deo LPS em 1 mg/kg via injeção intraperitoneal.
Depois de 2 horas o sangue é coletado e os camundongos abatidos.
O soro e as células esplenócitas foram tratadas e analisadas conforme anteriormente descrito.
Ensaio de citoquina esplenócita Os esplenócitos são isolados do baço e incubados por 48 horas em 37ºC (na presença de penicilina e estreptomicina) com meio de controle, lipopolissacarídeo LPS ou anticD3/CD28. As citoquinas nos sobrenadantes . das culturas são testadas com o uso de um kit de ensaio de 96 poços dispo- níveis juntos à Meso Scale Discovery (Gaithersbura, MD, EUA; catálogo K15008B-1). A interleucina 1 beta (Il-1b), interleucina 6 (I-6), interleucina 8 (1-8) interleucina 10 (11-10), interleucina 12p70 (1112p70), Interferon-gama (IFN-y) e fator de necrose tumoral alfa (TNFa) são quantificados e relatados como picogramas por mililitro (pg/mL). Ensaio de soro de citoquina O soro é analisado usando camundongo IL-10 da Meso Scale Discovery e o kit ultrasensível de TNF-a.
Resultados A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com Bif.
AH1714 é associada com um aumento na citoquina anti-inflamatória I1- 10deCMSPs ex vivo estimuladas, comparada com o grupo placebo (alimen- tados com STF) para camundongos saudáveis (veja a Figura 4 (B)) ou em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figura 4 (C)). A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com Bif AH1I714 é associada com uma diminuição nas citoquinas Th1 e pró- inflamatórias TNF-a IFN-y e IL-12 (sub unidade p70) de CMSPs ex vivo es- timuladas, comparada com o grupo placebo (alimentados com STF) em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figu- o ra 5 (B), a Figura 6 (B) e a Figura 7 (B)). A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com . Bif.
AH1714 é associada com um aumento nos níveis séricos da citoquina antiinflamatória 11-10 e uma diminuição nas citoquinas Thi e pró- inflamatórias TNF-a comparada com o grupo placebo (alimentados com STF) em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figura 8 (A & B)). Tomados juntos, esses resultados demonstram que a cepa 1714 de Bifidobacterium longum tem atividade imunomodulatória sistêmica in-vivo e atividade anti-inflamatória e protege contra LPS ou respostas inflamatórias mediadas por TLR-A4. - Exemplo 5 - A Bif 1714 tem atividade imunomodulatória quando coincubada com células do sistema imune humano, diferente da Bif.
AH35624. Materiais & Métodos A cepa de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 (B624), dois lotes de cultura independentes (1 & 2) e a cepa de Bifidobacterium lon- gum 1714 são testadas utilizando-se um ensaio de indução de citoquina em CMSP.
As bactérias são preparadas para experimentos de cocultura nos formatos a seguir.
A bacteria é cultivada sob condições anaeróbicas em 37ºC em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacioná- ria.
Pós secados por congelamento são gerados para cada uma dessas bac- térias e armazenados em -80ºC em frascos de pré-alíquota de 100 mg.
Ime- diatamente antes do uso, uma alíquota de cada cepa é removida do conge- ladore deixada ao ar livre até atingir a temperatura ambiente Cada cepa é lavada 3 vezes em 10 ml de solução de Ringer seguido de centrifugação.
Um frasco novo é usado em cada ocasião.
Contagens microscópicas diretas são realizadas com o uso de uma câmara de contagem Petroff-Hausser, de acordo com as instruções do fabricante, e as células lavadas são normalizadas pelo número de células antes da adição ao ensaio de CMSP.
As bactérias (20 ul em solução salina tamponada com fosfato (PBS - phosphate buffered saline)) são acrescenta-
das em cada poço de CMSPs para resultar no número total de bactérias, o conforme indicado para cada experimento.
Ensaio de indução de citoquinas em CMSP (células mononucleares do san- - que periférico)
Células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) são isola- das de sangue periférico humano saudável com o uso de tubos CPT (tubo preparador de células) da BD Vacutainer (BD catálogo 362761), de acordo com as instruções do fabricante.
As CMSPs são lavadas e ressuspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco - Glutamax TM (Glutamax (substitu-
to glutamina) + piruvato + 4,5 g/L glicose (Gibco catálogo 10569-010), 10% soro fetal bovino (Sigma catálogo F4135), e 1% penicilina/estreptomicina (Sigma catálogo PO781). As CMSPs são incubadas (2 x 10º células por po- . ço) em placas de fundo chato com 96 poços com e 20 ul. de uma suspensão bacteriana.
Também é feito um controle sem bactérias.
Todos os ensaios são realizados em triplicata.
Depois de uma incubação de 2 dias em 37ºC, as placas foram agitadas em 300 x q e os sobrenadantes foram removidos e armazenados congelados em -80ºC até análise.
As CMSPs são coincubadas com a bactéria por 48 horas em 37ºC / 5% CO? em um incubador.
Depois do período de 2 dias de incubação, as placas são centrifugadas em 300 x 9, e ossupernadantes removidos e armazenados congelados em -80ºC até aná- lise.
As citoquinas nos sobrenadantes das culturas são testadas com o uso de um kit de ensaio de 96 poços disponíveis juntos à Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA; catálogo K15008B-1). A interleucina humana 1 be- ta (11-1b), interleucina humana 86 (II-6), interleucina humana 8 (11-8) interleuci- nahumana 10 (II-10), interleucina humana 12p70 (I112p70), Interferon-gama humano (IFN-y) e fator de necrose tumoral alfa (TNFa) são quantificados e relatados como picogramas por mililitro (pg/mL). Cada amostra é testada em duplicata, Resultados A cepa de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 (B624), dois lotes de cultura independentes (1 & 2) e cepa de Bifidobacterium lon- gum 1714 são testados para imunomodulação usando-se um ensaio de in-
i dução de citoquina em CMSP com 1,0E+07 bactérias.
Os sobrenadantes oO são testados para uma faixa de citoquinas incluindo IL-18, -6, -8, -10 e -12, TNF-a e IFN-y. . Por comparação com 35624 (ambas culturas que apresentaram um padrão similar para todas as citoquinas testadas), a cepa 1714 exibiu um padrão muito similar para muitas das citoquinas testadas.
Surpreendente- mente, entretanto, a 1714 apresentou um padrão bem diferente para I1L-12, IFNy e IL-6. 11-6: Incubação com 1714 induz a um nível significativamente menor de IL-6 comparado a 35624 em 1,0 x 10” bactérias por poço (veja a Tabela 5) Tabela 11-12: A incubação com 1714 induz um nível significativamente menor de IL-12 comparado ao 35624 em 1,0 x 10º bactérias por poço (veja a Tabela6) A incubação de INF-y com 1714 induz um nível significativamen- te menor de INF-y comparado ao 35624 em 1,0 x 10º bacterias por poço (ve- ja a Tabela 6) Tabela 6 bacteria) (pg/ml) (-pgiml) (pg/ml) (pg/ml) [essas | 500 | so so iso [me | 2 Te TB a Foligne et al”? demonstraram que cepas de bactérias formadoras de ácido lático exibindo uma capacidade de induzir níveis maiores da cito- quina anti-inflamatória I1L-10 e níveis menores da citoquina inflamatória 11-12 ofereceram a melhor proteção no modelo de colite in vivo enquanto que, em contraste, cepas levando a uma baixa razão de citoquina IL-10/I1L-12 não puderam aliviar significativamente os sintomas da colite.
A proteção in vivo i observada era específica da cepa. O perfil da citoquina obtida para a Bif. o AH1714 poderia sugerir que essa cepa tem o potencial para eficácia aprimo- rada no modelo de colite ulcerativa in vivo. : A IL-6 é uma citoquina fortemente ligada na patologia da DIL À L-6é relevante para muitos processos doentios como diabetes, ateroescle- rose, depressão, doença de Alzheimer, lupus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Sendo assim, há um interesse em desenvolver agentes antí-lL-6 como terapia contra muitas destas doenças. Exemplo 6 - A Bif. AH1714 reduz a atividade NFKB induzida por LPS em um modelo de sepse/inflamação de murina in vivo Materiais & Métodos Camundongos transgênicos NFKkBlux em um antecedente - CS7BL/6J-CBA/J são obtidos do Charles River Laboratories (Wilmington, EUA) e criados internamente. Os camundongos são alojados sob condições de barreira mantida.
As fêmeas são administradas com Bif. AH1714, como um pó se- co e congelado reconstituído na água em aproximadamente 1x10º unidades de formação de colônia, ou por dia, ou por animal, ou um controle de place- bo. Os camundongos consomem micro-organismos em sua água ad libitum por20dias anteriores ao desafio com LPS.
A atividade NFKB é medida após a administração do substrato de luciferina e retratada usando a Xenogen IVIS 100. A linha de base da ati- vidade NFKB é medida anteriormente ao desafio com uma dose única de 0,5 mb/kg de LPS. Depois de 3 horas, todos os animais são então retratados. À atividade de NFKB do corpo total é avaliada subtraindo as leituras de linha de base.
Todos animais são então abatidos e o baço, fígado, intestino delgado e cólon são removidos e colocados em um prato de cultura para imagens individuais.
Resultados A Bif. AH1714 reduz a atividade sistêmica NFKB induzida por LPS em um modelo de sepse/inflamação de murino in-vivo, como demons-
i trado por uma diminuição de atividade NFKB em baços isolados 3 horas a- CS pós o desafio (veja a Figura 9) e de imagens do animal total 1 h30 m após o desafio (veja a Figura 10) de animais alimentados com 1714 comparado com . os animais alimentados com placebo.
Esses resultados demonstram que a alimentação com Bif. 1714 está associada com um nível reduzido de infla- mação sistêmica associado ao fator de transcrição NFKB.
Exemplo 7 - A 1714 exibe benefícios positivos em modelos de animais de depressão e ansiedade, A depressão e ansiedade são os transtornos psiquiátricos mais comuns com uma alta taxa de prevalência na comunidade.
Transtornos de ansiedade são geralmente subdivididos em transtorno do pânico, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno pós-traumático e transtorno obsessi- . vo compulsivo, Antidepressivos modernos, como os inibidores de retomada de serotonina seletiva (por exemplo, fluoxetina) e inibidores de retomada nora- drenérgicos e serotoninérgicos seletivos (por exemplo venlafaxina) são am- plamente usados para tratar esses transtornos.
Entretanto, os tratamentos não são sempre eficazes e não são aceitáveis aos pacientes.
Há uma ne- cessidade de desenvolver estratégias alternativas.
A possibilidade de que —probióticos possam ser eficazes em tais condições é sugerida pelos dados anteriores indicando que a Bifidobacterium Infantis probiótica reduz o hor- mônio do stress corticosterona em roedoeres (9). Aqui examinamos os efeitos comportamentais da Bifidobacteri- um AH1714 em modelos de stress em camundongos e comparamos com um SSRI amplamente usado, especificamente, escitalopram, que é usado para tratar ambas, a ansiedade e depressão.
Os animais são tratados com escitalopram, ou AH1714 por três semanas.
Material & Métodos Teste de suspensão da cauda Um teste bem caracterizado para avaliar a atividade de depres- são ou atividade de anti-lepressão.
Os camundongos são individualmente suspensos pela cauda em uma barra anelar em um suporte horizontal (dis-
tância do chão = 30 cm) usando fita adesiva (distância da ponta da cauda = O 2 cm). Tipicamente, os camundongos demonstram vários comportamentos orientados ao escape intercalados com aumento temporário de luta contra a ' imobilidade. Uma sessão de testes de 6 minutos é empregada e é gravada emvídeo. Os vídeos são subsequentemente pontuados por um observador altamente treinado que desconhece o tratamento. O parâmetro gravado é o número de segundos gastos imobilizado.
Teste de condicionamento do medo Amplamente usado para avaliar os componentes cognitivos de transtornos de ansiedade. Usamos um protocolo de três dias que permite a : observação do aprendizado de medo contextual e associado à pista. Após 3 minutos de exploração do seu ambiente contextual, os camundongos rece- - bem 6 pares de 20 segundos de uma pista específica (tom de 10 KHz, 70dB combinado com o acendimento da luz do aparelho), combinado no final com um choque leve (0,4 mA) de 2 segundos, seguido de 1 minuto de exposição somente ao contexto. O procedimento é repetido nos dois dias seguintes, entretanto, sem aplicação de choque e o comportamento de congelamento ao contexto ou pista é observado. O primeiro dia permite avaliar a habilidade da intervenção para alterar a força do contexto e o condicionamento de me- do induzido por pistas, enquanto que o terceiro dia permite a observação da extinção de aprendizado do medo. A extinção é a formação de novas memó- rias, e drogas que facilitem a extinção podem ter um papel! no tratamento do transtorno de stress pós-traumático.
O teste de esconder esferas.
Proposto como modelo de transtorno obsessivo-compulsivo. A- nimais que são mais ansiosos precisam entrar em comportamento ativo (es- conder as esferas defensivamente) para evitar estimulo ansiogênico na cai- xa clara-escura e labirintos elevados. Os camundongos são colocados indi- vidualmente em pequenas gaiolas, na qual 20 esferas foram igualmente dis- tribuidas na superfície de 5 cm de profundidade de serragem, e uma tampa de arame é colocada no topo da gaiola. Os camundongos são deixados sem perturbação por 30 min e a seguir as esferras escondidas são contadas (por exemplo, aquelas que estão mais de e menos de três quartos cobertas por oO serragem). Resultados - No teste de suspensão da cauda, a AH1714 dá um resultado positivo sugerindo possível atividade antidepressão. Com referência à Figura 11, a AH1714 induziu tempo de imobilidade menor do que o veículo (Veh) que sugere comportamentos atenuados de depressão em animais alimenta- dos com 1714. Isso é similar ao impacto de antidepressivos convencionais, como Lexapro€O. Em termos de cognição, no teste de condicionamento do medo, animais de teste tratados com AH1714 mostraram um efeito de aprendizado positivo. Com referência à Figura 12, no contexto de testes de condiciona- - mento de medo (principalmente memórias dependentes do hipocampo e a- mígdala), o 1714 induziu um congelamento maior ao contexto (Cxt) do que o veículo (Veh) no dia 1 e dia 2, com a mesma porcentagem de congelamento que o veículo no dia 3, isso sugere que a 1714 promove aprendizado de medo contextual e memória sem prejudicar a extinção, sugerindo um papel positivo na memória contextual de eventos de medo. Com referência à Figu- ra 13, em testes de condicionamento de medo por pistas (dependente da amígdala), o 1714 induziu um maior congelamento à pista de medo (estímu- lo) do que o veículo (Veh) no dia 1, com a mesma porcentagem de congela- mento do que o veículo nos dias 2 e 3. Isso sugere que o 1714 promoveu aprendizado de medo dependente da amígdala (pista) e memória, sem pre- judicar a memória e extinção, sugerindo um papel positivo na memória de estimulos de medo independente do contexto.
Evidência de um efeito positivo no transtorno obsessivo- compulsivo surge de estudos com o teste de esconder as esferas. Animais tratados com AH1714 esconderam menos esferas na tarefa de esconder esferas, que é indicativo de uma menor ansiedade em animais alimentados com 1714e sugere um possível efeito no transtorno obsessivo-compulsivo (Figura 14). Como no caso de escitalopram, a AH1714 induziu um menor aumento de temperatura corporal causado pelo estresse de ser manuseado
(diminuição de hipotermia induzida por stress), isso sugere uma menor ansi- oC edade em animais alimentados com 1714 (Figura 24). Não existem diferen- ças entre os resultados com qualquer intervenção. - Conclusão A AH1714 em modelos animais de depressão e ansiedade se comporta de maneira similar a antidepressivos convencionais.
O impacto observado é similar ao relatado na literatura para antidepressivos como SSIRs (inibidores seletivos de retomada da serotonina). Como um todo, os dados indicam que a AH1714 pode ser bené- ficanotratamento de síndromes psiquiátricas de depressão e ansiedade.
Exemplo 8: A 1714 exibe benefícios positivos em marcadores inflamatórios em obesidade induzida por dieta. . Nos anos recentes, foi bem estabelecido que a obesidade está associada a uma inflamação de baixo grau que contribui para o desenvolvi- mento das patologias associadas com a obesidade, que incluem diabetes mellitus do tipo 2 (T2D), doença cardiovascular (CVD), hipertensão, hiperco- lesterolemia, hipertrigliceridemia e doença de fígado gordo não-alcóolica.
À gordura visceral produz um número de citoquinas inflamatórias e quimioci- nas (como leptina, fator de necrose tumoral-a (TNF-a), proteína-1 químio- atrativa de macrófago e interleucina-6, entre outros), nas quais a produção pode ser patologicamente desregulada no estado de obesidade (analisado por Shoelson et al., 2007). De fato, enquanto se pensa que macrófagos con- tribuem de uma maneira importante à resistência de insulina, outros estudos sugeriram que o controle das propriedades anti-inflamatórias das células com um fenótipo potencialmente regulatório pode ter potencial terapêutico.
Um estudo recente sugere que as células Tre reduzem o estado inflamatório do tecido adiposo e, assim, a resistência a insulina em camundongos (Feu- rer et al., 2009). Além disso, um corpo seminal de trabalho implicou em a- normalidades da microbiota do trato gastrointestinal como uma força aciona- dora de desregutagem metabólica relacionada à obesidade, sugerindo que as intervenções que visam a saúde do trato gastrointestinal terão efeitos be- neficiais de saúde em distúrbios metabólicos relacionados à obesidade.
Foi i sugerido que a microbiota do trato gastrointestinal pode estar envolvido no o desenvolvimento da obesidade na regulagem da homeostase da energia, na resistência à insulina, doenças do fígado gordo não-alcóolicas e no metabo- : lismo da energia, lipídio e aminoácido (analisado por Ley ef a/., 2009) A obesidade induzida por dieta (DIO - diet-induced obesity) no modelo do camundongo foi escolhida como o modelo de camundongo mais adequado para avaliar o impacto dos candidatos probióticos selecionados na obesidade e saúde metabólica e para observar a relação entre a obesidade e marcas inflamatórias. O modelo de camundongo DIO se refere a camun- —dongos saudáveis alimentados em uma dieta de alta gordura para induzir a obesidade ao longo do tempo.
| Desenvolvimento experimental - Camundongos machos C57BL/J6 de sete semanas foram ali- mentados com uma dieta de baixa gordura (10% de calorias da gordura; Re- search Diets, New Jersey, EUA; %D12450B), uma dieta de alta gordura (DIO; 45% de calorias da gordura; Research Diets, New Jersey, EUA; fD12451) ou uma dieta de alta gordura com AH1714 (1 x 10º ufc/dia) na água potável por 14 semanas. Todos os camundongos foram alojados em grupos de 5 e alíquotas de probióticos frescos foram administrados diariamente. O peso corporale o consumo alimentar foram avaliados semanalmente. No fim das 14 semanas, os camundongos foram sacrificados e os órgãos internos foram removidos, pesados e armazenados em -80ºC. Os baços foram removidos e ensaios de citoquina do esplenócito foram efetuadas como no Exemplo 4. Resultados Como esperado, os camundongos DIO ganharam significante- mente mais massa de gordura (p<0,001) comparado aos controles leves durante as 14 semanas do período de alimentação. Em concordância com os estudos anteriores, os camundongos DIO consumiram significantemente mais calorias do que os controles leves, como medidos pela ingestão calóri- ca cumulativa durante o período de 14 semanas do estudo (p<0,001). Em esplenócitos estimulados por LPS (estímulo de imunidade inata) de camun- dongos DIO, a AH1714 teve o efeito de reduzir a TNFa e resposta de cito-
i quina 11-12 ao LPS (Figura16). Em esplenócitos estimulados por CD3/CD28 CO (estímulo de imunidade adaptativo), o tratamento com AH1714 teve o efeito de reduzir a resposta da citoquina IL6. Esses resultados indicam um efeito " anti-inflamatório sistêmico no modelo de camundongo DIO consistente com osdadosCMSP e dados do modelo de camundongo in vivo ilustrados em outros exemplos.
Imunomodulação O sistema imunológico humano tem um papel significativo na e- tiologia e patologia de uma grande variedade de doenças humanas. As res- postas hiper e hipo-imunes resultam em, ou são um componente da maioria : dos estados doentios. Uma família de entidades biológicas, denominadas citoquinas, é particularmente importante no controle do processo imunológi- 7 co. Perturbações dessas redes delicadas de citoquinas são cada vez mais associadas com muitas doenças. Essas doenças incluem, mas não se limi- tama, distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença infiamatória intesti- nal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente esses dos siste- mas gastrointestinal e imune), doença diarreica, diarreia associada ao uso de antibióticos, diarreia pediátrica, apendicite, transtornos auto-imunes, es- clerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatóide, doença celíaca, diabetes mellitus, transplante de órgão, infecções bacterianas, infecções vi- rais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença se- xualmente transmitida, infecção por HIV, replicação de HIV, diarreia associ- ada ao HIV, trauma associado a cirurgia, doença metastásica induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatri- zação de ferimentos, úlceras, função de barreira do intestino, alergia, asma, distúrbios respiratórios, distúrbios circulatórios, doenças coronárias, anemia, distúrbios do sistema de coagulação do sangue, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epidermais, psoríase e acne vulgar Os efeitos na produção de citoquina são específicos para cada uma das cepas probióticas examinadas. Desse modo, cepas probióticas es-
pecíficas podem ser selecionadas para normalizar um imbalanço exclusivo, CO em particular de citoquina, para um tipo de doença específico.
A personali- zação de terapias específicas para doenças pode ser alcançada usando-se " uma única cepa AH1714 ou mutantes e variantes da mesma ou uma seleção dessas cepas.
Educação imune A flora entérica é importante para o desenvolvimento e função adequada do sistema imune intestinal.
Na ausência de uma flora entérica, o sistema imune intestinal é subdesenvolvido, como demonstrado nos mode- losde animais livres de germes, e certos parâmetros funcionais são diminui- : dos, como a habilidade fagocítica macrófaga e produção de imunoglobulina (10). A importância da flora do trato gastrointestinal em estimular respostas . imunes não danosas está se tornando mais evidente.
O aumento na incidên- cia e severidade de alergias no mundo ocidental foi ligado com um aumento na higiene e sanitização, concomitante com uma diminuição no número e alcance de desafios infecciosos encontrados pelo hospedeiro.
Essa falta de estímulo imune pode permitir a reação do hospedeiro a agentes não- patogênicos, mas antigênicos, resultando em uma alergia ou auto- imunidade.
O consumo deliberado de uma série de bactérias imunomodula- tórias não-patogênicas fornecerá ao hospedeiro o estímulo educacional ade- quado e necessário para o desenvolvimento correto e controle da função imune.
Inflamação A inflamação é o termo usado para descrever a acumulação lo- calde fluido, proteinas de plasma e glóbulos brancos em um local que so- freu lesão física, infecção ou onde há uma resposta imune em andamento.
O controle da resposta inflamatória é exercido em um número de níveis (11). Os fatores de controle incluem citoquinas, hormônios (por ex. hidrocortiso- na), prostaglandinas, intermediários reativos e leucotrienos.
As citoquinas são proteinas biologicamente ativas de baixo peso molecular que estão en- volvidas na geração e controle das respostas imunológicas e inflamatórias, enquanto também regulam o desenvolvimento, reparo de tecido e hemato-
poiese.
Elas fornecem um meio de comunicação entre os leucócitos e tam- CO bém com outros tipos de células.
A maioria das citoquinas são pleiotrópicas e expressam múltiplas atividades biologicamente sobrepostas.
Cascatas e " redes de citoquina controlam a resposta inflamatória ao invés da ação de uma citoquina em particular em um tipo de célula em particular (12). O en- fraquecimento da resposta inflamatória resulta em baixas concentrações dos sinais de ativação adequados e outros mediadores inflamatórios levando à cessação da resposta inflamatória.
A TNFa é uma citoquina pró-inflamatória pivô porque inicia uma cascata de citoquinas e efeitos biológicos resultando no estado inflamatório.
Portanto, agentes que inibem a TNFa estão atual- : mente sendo usados para o tratamento de doenças inflamatórias, por ex. infliximab. . Pensa-se que as citoquinas pró-inflamatórias têm um grande papel na patogênese de muitas doenças inflamatórias, incluindo a doença inflamatória intestinal (DII). As terapias atuais para tratar a DI têm como alvo a redução dos níveis dessas citoquinas pró-inflamatórias, incluindo a IL-8 e TNFa.
Tais terapias podem também ter um papel significativo no tratamento de doenças inflamatórias sistêmicas como artrite reumatóide.
As cepas da presente invenção podem ter potencial de aplicação no tratamento de uma gama de doenças inflamatórias, particularmente se usadas em combinação com outras terapias anti-inflamatórias, como fárma- cos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAIDs) ou Infliximab.
Citoquinas e câncer A produção de citoquinas multifuncionais por um grande espec- trode tipos de tumores sugere que respostas inflamatórias significativas es- tejam em andamento em pacientes com câncer.
É atualmente incerto que efeito de proteção essa resposta tem em relação ao crescimento e desen- volvimento de células de tumor in vivo.
Entretanto, essas respostas inflama- tórias podem afetar adversamente o paciente com tumor.
Interações com- plexas de citoquinas estão envolvidas na regulação de produção de citoqui- na e proliferação celular dentro do tumor e tecidos normais (13, 14). Já é reconhecido há muito tempo que a perda de peso (caquexia) é a única cau-
i sa mais comum de morte em pacientes com câncer e a desnutrição inicial O indica um mau prognóstico. Para um tumor crescer e espalhar, ele deve in- duzir a formação de novos vasos sanguíneos e degradar a matriz extracelu- . lar. A resposta inflamatória pode ter um papel significativo nos mecanismos acima, assim contribuíndo para o declínio do hospedeiro e progressão do tumor. Devido às propriedades anti-inflamatórias da Bifidobacterium longum infantis, essas cepas bacterianas podem reduzir a taxa de transformação celular maligna. Adicionalmente, as bactérias intestinais podem produzir, a partir de compostos dietéticos, substâncias com atividade genotóxica, carci- —nogênica e promotora de tumor e as bactérias do trato gastrointestinal po- dem ativar os agentes reativos pró-carcinogênicos para o DNA (15). No ge- ral, as espécies de Bifidobacterium têm baixas atividades de enzimas meta- “ bolizantes de xenobiótico comparadas a outras populações dentro do trato gastrointestinal como bacteroides, eubactérias e clostrídia. Portanto, aumen- taronúmero de Bifidobacterium bacteria no trato gastrointestinal pode modi- ficar beneficialmente os níveis essas enzimas.
Vacina/Aplicação de medicamento A maioria dos organismos patogênicos ganha entrada via super- fícies mucosas. A vacinação eficaz desses locais protege contra invasão de um agente infeccioso em particular. Estratégias de vacinação oral foram concentradas, até hoje, no uso de organismos patogênicos vivos atenuados ou antígenos encapsulados purificados (16). As bactérias probióticas, de- senvolvidas para produzir antígenos de um agente infeccioso, in vivo, podem proporcionar uma alternativa atraente porque essas bactérias são conside- radas seguras para o consumo humano (estado GRAS).
Estudos em murinos demonstraram que o consumo de bactérias probióticas que expressam antígenos estranhos pode provocar respostas imunológicas de proteção. O gene que codifica o fragmento C da toxina te- tânica (TTFC - tetanus toxin fragment OC) foi expresso no Lacfococceus lactis e os camundongos foram imunizados via oral. O sistema foi capaz de induzir anticorpos em concentrações significativamente altas para proteger os ca- mundongos de um desafio de toxina letal. Em adição à apresentação de an-
tígeno, os vetores de bactérias vivas podem produzir compostos bioativos, CO como citoquinas imunoestimulatórias, in vivo.
A secreção de IL-2 ou IL-6 humana bioativa e TTFC por L. factis induziu concentrações séricas de IgG - de 10 a 15 vezes maiores em camundongos imunizados intranasalmente (17). Entretanto, com essa cepa bacteriana em particular, o nível total de IgA não foi aumentado pela coexpressão com essas citoquinas.
Outras cepas bacterianas, como a Streptococcus gordonii, estão também sendo examina- das por sua utilidade como vacinas mucosais.
A colonização das cavidades vaginais e orais de murino por S. gordonii recombinante induziu tanto res- postas de anticorpos mucosais como sistêmicos aos antígenos expressos por essa bactéria (18). Sendo assim, a imunização oral usando bactérias probióticas como vetores não somente iria proteger o hospedeiro de infec- . ção, mas também pode substituir o estímulo imunológico que o patógeno normalmente usaria, assim contribuindo para a educação imunológica do hospedeiro.
Prebióticos A introdução de organismos probióticos é realizada pela inges- tão dos micro-organismos em um veículo adequado.
Seria vantajoso forne- cer um meio que pudesse promover o crescimento dessas cepas probióticas nointestino grosso.
A adição de um ou mais oligossacarídeos, polissacari- deos ou outros prebióticos acentua o crescimento de bactérias formadoras de ácido lático no trato gastrointestinal.
O termo prebiótico se refere a qual- quer componente alimentício não-viável que seja especificamente fermenta- do no cólon por bactérias indígenas que se pensam ser de valor positivo, por ex, bifidobactéria, lactobacilo.
Tipos de prebióticos podem incluir esses que contém frutose, xilose, soja, galactose, glicose e manose.
À administração combinada de uma cepa probiótica com um ou mais compostos prebióticos pode melhorar o crescimento do probiótico administrado in vivo, resultando em um benefício de saúde mais pronunciado, e é chamado de simbiótico.
Outros ingredientes ativos Será entendido o fato de que cepas probióticas podem ser ad- ministradas profilaticamente ou como um método de tratamento ou por si só,
ou com outros materiais probióticos e/ou prebióticos, como descrito acima. " Além disso, a bactéria pode ser usada como parte de um regime profilático ou de tratamento usando outros materiais ativos, como esses usados para 7 tratar inflamações ou outras desordens, especialmente essas com um envol- vimento imunológico. Tais combinações podem ser administradas em uma formulação simples ou em formulações separadas administradas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes e usando as mesmas rotas ou diferentes de administração.
As dimensões e valores apresentados na presente invenção não devem ser compreendidos como estando estritamente limitados aos exatos : valores numéricos mencionados. Em vez disso, exceto de outro modo espe- cificado, cada uma dessas dimensões se destina a significar tanto o valor . mencionado como uma faixa de valores funcionalmente equivalentes em torno daquele valor. Por exemplo, uma dimensão apresentada como "40 mm"destina-se a significar "cerca de 40 mm".
Todos os documentos citados na descrição detalhada da Inven- ção são, em sua parte relevante, aqui incorporados por referência, e a cita- ção de qualquer documento não deve ser interpretada como admissão de que este represente técnica anterior com respeito à presente invenção. Se — houver conflito entre qualquer significado ou definição de um termo mencio- nado neste documento e o significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado a título de referência, o significado ou definição atri- buído ao termo mencionado neste documento terá precedência.
Embora modalidades particulares da presente invenção tenham sidoilustradas e descritas, deve ficar evidente aos versados na técnica que várias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindica- ções anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram no escopo da presente invenção.
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TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO . INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA . EFEITOS DE PROCEDIMENTO EM MATÉRIA DE PATENTES Alimentary Health Ltd Building 2800 RECIBO DE DEPÓSITO . Cork Airport Business Park Kinaale Road INTERNACIONAL NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL Cork concedido de acordo com a Regra 7,1 pela anda AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fim dessa página
NOME E ENDEREÇO DO
DEPOSITANTE LL IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-CRGANISMO Referência de identificação dada pelo Número de acesso dado pela . DEPOSITANTE AUTORIDADE DEPOS!TÁRIA INTERNACIONAL Bifidobacterium fongums AHI714 NCIMB 41676
1. — DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA O micro-organismo identificado seb o item | acima foi acompanhado por: O uma descrição científica uma designação taxonômica proposta (Marque com uma cruz onde aplicável) Ul. — RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO Essa autoridade depositária internacional aceita o micro-organismo identificado no item | acima, que foi recebido pela mesma no dia 5 de novembro de 2009 (data do depósito original)" Nv. — RECEBIMENTO DE PEDIDO PARA CONVERSÃO O microorganismo identificado no item | acima foi recebido por essa autoridade depositária intemacional na (data do depósito original) e um pedido para converter o depósito original em um depósito sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela na (data do recebimento do pedido para conversão) V. — AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: — NCIMS Ltd Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com o poder de representar a F Boi autoridade depositária internacional ou de oficial(is) erguson Building autorizado(s): Craibstone Esnic furtnia Der Endereço: Buciksbum Data: 11 de novembro de 2009 Aberdeen ' ABZ19YA 1; Onde a Regra 6/4(d) se aplicar, tal data é a data onde o estado da autoridade depositária intemacional foi recebida. Formulário BP/4 (toda página)

Claims (38)

  1. REIVINDICAÇÕES - 1. Cepa isolada de bifidobactéria NCIMB 41676.
  2. 2. Cepa de bifidobactéria, de acordo com a reivindicação 1, que ' está sob a forma de células viáveis.
  3. 3. Cepa de bifidobactéria, de acordo com a reivindicação 1, que está sob a forma de células não viáveis.
  4. 4, Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, em que a bifidobactéria é isolada do tecido de biópsia co- lônica de um ser humano saudável.
  5. 5. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das rei- . vindicações | a 4, que é significativamente imunomodulatória após o con- . sumo oral. '
  6. 6. Formulação que compreende uma cepa de bifidobactéria co- : mo definida em qualquer uma das reivindicações 1a 5.
  7. 7. Formulação, de acordo com a reivindicação 6, que compreen- de adicionalmente um material probiótico.
  8. 8. Formulação, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, que com- preende adicionalmente um material probiótico.
  9. 9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6a8,compreendendo adicionalmente um veículo ingerível.
  10. 10. Formulação, de acordo com a reivindicação 9, na qual o vei- culo ingerível é um veículo farmaceuticamente aceitável, como uma cápsula, um tablete ou um pó.
  11. 11. Formulação, de acordo com a reivindicação 9, na qual o veíi- culoingerívelé um produto alimentício como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, leite concentrado, requeijão, molhos ou bebidas.
  12. 12. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 11, que compreende adicionalmente uma proteína e/ou um peptí- deo, em particular proteínas e/ou peptideos que são ricos em glutami- — na/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina um mineral e/ou um microelemento.
  13. 13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica-
    ções 8 a 12, na qual a cepa de bifidobactéria está presente em uma quanti- - dade de mais de 10º cfu por grama da formulação.
  14. 14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- " ções 6 a13, que compreende adicionalmente um adjuvante.
  15. 15. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 14, que compreende adicionalmente um componente bacteriano.
  16. 16. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 15, que compreende adicionalmente uma entidade de fármaco.
  17. 17. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções6al6, que compreende adicionalmente um composto biológico. .:
  18. 18. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- - ções 6 a 17, que é usada para protocolos de imunização e vacinação. '
  19. 19. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das 7 reivindicações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer uma das rei- —vindicações6a18, para uso em produtos alimentícios.
  20. 20. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer das reivindica- ções 6 a 18, para uso como medicamento.
  21. 21. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inftamatória indesejada.
  22. 22. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade in- flamatória gastrointestinal indesejada, como doença inflamatória intestinal, por exemplo: doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável; bursite; ou colite pós-infecciosa.
  23. 23. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer das reivindi- cações1ias5,ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de câncer gastrointes- tinal.
  24. 24. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das . reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com a qualquer uma das rei- vindicações 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de doenças ' sistêmicas como artrite reumatoide.
  25. 25. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de distúrbios au- toimunes devido a atividade inflamatória indesejada.
  26. 26. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer uma das rei- - vindicações 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de câncer de- - vido a atividade inflamatória indesejada. ,
  27. 27. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das Í reivindicações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações6 a 18, para uso na profilaxia do câncer.
  28. 28. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer das reivindi- cações 1 a 5, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 to 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de doenças diarrei- cas devido a atividade inflamatória indesejada, como diarreia associada a Clostridium difficile, diarreia associada a rotavírus, ou diarreia pós-infecciosa ou doença diarreica causada por um agente infeccioso como E. coli.
  29. 29. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 6 a 18, para uso na preparação de agentes bioterápicos anti- inflamatórios para a profilaxia e/ou o tratamento de atividade inflamatória indesejada.
  30. 30. Cepas de bifidobactéria, de acordo com a reivindicação 29, para uso na preparação de um painel de agentes bioterápicos para modificar os níveis de IL-10.
  31. 31. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 6 a 18, para uso na prevenção e/ou tratamento de distúrbios infla-
    matórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, sindrome do intes- . tino irritável, câncer (particularmente dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarreica, diarreia associada a antibiótico, diarreia pediátrica, apendi- ' cite, distúrbios auto-imunes, esclerose múltipla, doeça de Alzheimer, artrite reumatoide, doença celíaca, diabetes mellitus, transplante de órgão, infec- ções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmissível, infecção por HIV, re- plicação de HIV, diarreia associada a HIV, trauma associado a cirurgia, do- ença metastásica induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, con- trole da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função de bar- . reira do intestino, alergia, asma, distúrbios respiratórios, distúrbios circulató- - rios, doenças coronárias, anemia, distúrbios do sistema de coagulação de o sangue, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepáti- : ca, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinas, dis- túrbios epidermais, psoríase, acne vulgar, transtorno do pânico, transtorno comportamental e/ou transtorno de stress pós-traumático.
  32. 32. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a cepa atua por antagonismo e exclusão de Microorganismos pró inflamatórios do trato gastrointestinal.
  33. 33. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer com uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 18, para uso na preparação de agentes bioterápicos anti- inflamatórios para a redução dos níveis de citoquinas pró inflamatórias.
  34. 34. Uso de uma cepa de bifidobactéria, como definida em qual- —queruma das reivindicações 1 a 5, como cepa probiótica anti-infecciosa.
  35. 35. Cepa de bifidobactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 6 a 18, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de distúrbio de bipolaridade, depressão, distúrbios do humor e/ou distúrbios de ansiedade.
  36. 36. Uso de uma cepa de bifidobactéria, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 5 ou da formulação, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 18, como intensificador congnitivo para a profilaxia e/ou o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, como . doeça de Alzheimer, esquizofrenia e/ou distúrbio cognitivo leve.
  37. 37. Uso de uma cepa de bifidobactéria, como definida em qual- Í quer uma das reivindicações 1 a 5 ou da formulação, como definida em — qualquer uma das reivindicações 6 a 18, para a profilaxia e/ou o tratamento de inflamação relacionada à obesidade.
  38. 38. Uso de uma cepa de bifidobactéria, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 5 ou da formulação como definida em qual- quer das reivindicações 6 a 18 para a profilaxia e/ou o tratamento de desre- gulaçãometabólica relacionada à obesidade.
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