CN109200064A

CN109200064A - 动物双歧杆菌a6在制备药物中的用途

Info

Publication number: CN109200064A
Application number: CN201710553064.8A
Authority: CN
Inventors: 任发政; 吴双; 张明; 赵亮; 张昊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2019-01-15

Abstract

本发明提出了动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防抗生素相关性腹泻。发明人通过实验发现，动物双歧杆菌A6能通过改善小鼠肠道功能，有效达到缓解抗生素相关性腹泻的作用。

Description

动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途，更具体地，本发明涉及动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途、筛选药物的方法以及用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物组合物。

背景技术

随着抗生素的广泛使用，抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated Diarrhea，AAD)在临床上日益受到重视，它给患者生活和健康带来的负担不容小觑。AAD是抗生素治疗过程中最为常见的不良反应之一，一种无法用其他原因解释的腹泻(McFarland LV，1998)。使用抗生素的患者约有5％～25％出现AAD(孙乐，2012)，其中有10％～20％的案例是由艰难梭状芽孢杆菌引起的，称作艰难梭状芽孢杆菌相关性腹泻(Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD)(Christy AV，2013；Katz DA，1996)。AAD的发病率因抗生素种类和人群差异而有所不同(John GB，2002)。抗生素方面，几乎所有的抗生素都能引起腹泻，如氨苄青霉素中为5％～10％，阿莫西林克拉维酸中为15％～20％，头孢曲松钠中为10％～40％(Gilbert DN，1994)；宿主方面，包括年龄和饮食方式等因素(Mettler J，2007)。

AAD可能发生在使用抗生素当天或者是几周之后，症状包括轻微的腹痛、呕吐、发热、腹泻等，严重情况下可能导致水电解质紊乱、脱水甚至死亡(Shelby RH，2016)。治疗AAD需要有复杂的诊断流程，同时也增加了患者住院的时间以及花费，有调查显示，接受外科手术的AAD患者或CDAD患者为此付出的医疗费用大概为3500美元到77483美元(Lawrence SJ，2007；Dubberke ER，2008；Zerey M，2007)。此外医院中的AAD患者发展成其它医院感染病的机率上升，有着更高的死亡率(McFarland，2008)。抗生素的不当使用将直接危害机体的健康，而服用治疗剂量的抗生素也会增加临床患者二重感染的风险(唐欢，2007)。

然而，抗生素相关性腹泻的治疗仍有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防抗生素相关性腹泻。发明人通过实验发现，动物双歧杆菌A6能通过改善小鼠肠道功能，有效达到缓解抗生素相关性腹泻的作用。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物用于下列的至少之一：增加肠道微生物的多样性、提高肠道专性厌氧菌的占比、提高双歧杆菌的比例、增加结肠黏液层厚度、提高黏蛋白MUC1的mRNA表达量、增加回肠绒毛高度、增加回肠隐窝深度、增加绒毛高/隐窝深比值、缓解肠道组织的炎症反应、增强肠道对肠腔水分的重吸收能力、提高粪便中乙酸、丁酸、丙酸浓度以及提高结肠上皮细胞水通道蛋白4的基因表达。发明人通过实验发现，动物双歧杆菌A6可有效提高或改善肠道的上述微环境或结构，进而能够有效改善和缓解抗生素相关性腹泻。

根据本发明的实施例，所述肠道专性厌氧菌包括选自毛螺杆菌、拟杆菌的至少之一。发明人发现，动物双歧杆菌A6可有效提高抗生素相关性腹泻模型小鼠肠道中的专性厌氧菌，其中对提高包括选自毛螺杆菌、拟杆菌的至少之一的专性厌氧菌的效率更加显著。

根据本发明的实施例，所述抗生素包括选自氨苄青霉素、氯林可霉素、庆大霉素以及头孢菌素的至少之一，优选地，所述抗生素为头孢菌素。根据本发明的实施例，动物双歧杆菌A6治疗上述抗生素，尤其是头孢菌素所引起的腹泻效果更加显著。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防抗生素相关性腹泻。根据本发明的实施例，所述方法包括为动物模型给予候选药物，所述动物模型为抗生素相关性腹泻模型，检测给药后所述模型的下列的至少之一的变化，肠道微生物的多样性、肠道专性厌氧菌的占比、双歧杆菌的比例、结肠黏液层厚度、黏蛋白MUC1的mRNA表达量、回肠绒毛高度、回肠隐窝深度、绒毛高/隐窝深比值、肠道对肠腔水分的重吸收能力、粪便中乙酸、丁酸、丙酸浓度以及结肠上皮细胞水通道蛋白4的基因表达，其中，给药后所述模型的上述的至少之一提高，是所述候选药物为目标药物的指示。利用根据本发明实施例的上述方法筛选的药物，可有效用于抗生素相关性腹泻疾病的治疗或预防。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述目标药物包含动物双歧杆菌A6。包含动物双歧杆菌A6的候选药物在给抗生素相关性腹泻模型给药后，可使上述指标的至少之一得到显著提高，发明人发现，上述指标的至少之一的显著提高可有效缓解或改善抗生素相关性腹泻，进而包含动物双歧杆菌A6的候选药物可作为有效用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物。

根据本发明的实施例，所述抗生素相关性腹泻模型是通过如下方法获得的：给BALB/c小鼠给药头孢曲松钠，其中，所述头孢曲松钠是以水溶液的形式提供的，所述头孢曲松钠的浓度为250mg/mL，给药剂量为0.2ml/天，给药时间为5天。利用上述方法获得的抗生素相关性腹泻模型的小鼠肠道菌群出现重度失衡，厌氧菌总数急剧下降，盲肠明显肿大，结肠上皮缺乏完整性，粪便含水量较正常组显著增加，稀软膨大，抗生素相关性腹泻的病理指征清晰。用上述方法获得的动物模型用于药物的筛选，筛选的药物的药用和治疗价值高、可信度高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括动物双歧杆菌A6。根据本发明实施例的包含动物双歧杆菌A6的药物组合物可有效用于治疗或预防抗生素相关性腹泻。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合包括动物双歧杆菌A6和其它可用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物，所述其它可用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物包括：甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特或利福平。动物双歧杆菌A6联合甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特或利福平，并分时使用，其对抗生素相关性腹泻的治疗效果更加显著。

根据本发明的一些实施例，本发明的用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的另一些实施例，本发明的药物组合物中还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。

根据本发明的实施例，本发明的药物组合物能够用于增加肠道微生物的多样性、提高肠道专性厌氧菌的占比、提高双歧杆菌的比例、增加结肠黏液层厚度、提高黏蛋白MUC1的mRNA表达量、增加回肠绒毛高度、增加回肠隐窝深度、增加绒毛高/隐窝深比值、缓解肠道组织的炎症反应、增强肠道对肠腔水分的重吸收能力、提高粪便中乙酸、丁酸、丙酸浓度以及提高结肠上皮细胞水通道蛋白4的基因表达，因而，本发明的药物组合物可以在治疗或预防抗生素相关性腹泻时被给药。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物可以通过常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。本发明的药物组合物最恰当的使用方式是口服，A6具有耐酸耐胆盐的特征，能存活到到肠道发挥作用。不能使用注射方式。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在抗生素相关性腹泻的减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指抗生素相关性腹泻)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防抗生素相关性腹泻)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述动物双歧杆菌A6的药物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的药物或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的动物双歧杆菌A6、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

附图说明

图1是根据本发明实施例的造模期间各组小鼠腹泻指标变化的结果图；

图2是根据本发明实施例的恢复期不同处理组小鼠腹泻率变化的结果图；

图3是根据本发明实施例的恢复期不同处理组小鼠粪便干湿重比值的结果图；

图4是根据本发明实施例的恢复期不同处理组小鼠盲肠大小变化的结果图；

图5是根据本发明实施例的不同处理组小鼠肠道菌群UniFrac PCoA分析的结果图；

图6是根据本发明实施例的不同处理组中相对含量大于1％的微生物的结果图；

图7是根据本发明实施例的不同处理小鼠肠道菌群群落组成Heatmap图；

图8是根据本发明实施例的不同处理组中的差异微生物的结果图；

图9是根据本发明实施例的不同处理对小鼠近端结肠黏液层厚度的影响的结果图；

图10是根据本发明实施例的不同处理组小鼠近端结肠组织AB-PAS染色的结果图；

图11是根据本发明实施例的不同处理组小鼠近端结肠黏蛋白基因表达的结果图；

图12是根据本发明实施例的恢复期不同处理组小鼠回肠组织形态的结果图；

图13是根据本发明实施例的不同处理对小鼠结肠隐窝深度的影响的结果图；

图14是根据本发明实施例的恢复期不同处理组小鼠结肠组织形态的结果图；

图15是根据本发明实施例的不同处理组小鼠粪便中乙酸含量的结果图；

图16是根据本发明实施例的不同处理组小鼠粪便中丙酸含量的结果图；

图17是根据本发明实施例的不同处理组小鼠粪便中丁酸含量的结果图；

图18是根据本发明实施例的不同处理组小鼠近端结肠AQP4基因的表达量的结果图；

图19是根据本发明实施例的不同处理组小鼠近端结肠NHE3基因的表达量的结果图；以及

图20是根据本发明实施例的不同处理组小鼠近端结肠SLC26A3基因的表达量的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

以下实施例中所用的实验材料与方法如下所述：

1实验材料

1.1试剂

头孢曲松钠(罗氏芬)，上海罗氏药业。

1.2仪器

3K3O型Sigma低温高速离心机，德国Satorious；5418R小型台式高速离心机，芬兰Eppendorf；XSZ-G生物显微镜，重庆光学仪器厂；TP-214电子天平，美国Denver；SW-CJ医用型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；ZDX35BI高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DNP9082恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；ASP200S组织自动脱水机，德国Leica公司；EG1150C组织包埋机，德国Leica公司；RM2245半自动轮转式切片机，德国Leica公司；DM4M光学显微镜，德国Leica公司；PTC-200普通PCR仪，美国BIO-RAD公司；LightCycler96实时定量PCR仪，瑞士Roche公司；5418R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；LX-200迷你离心机，其林贝尔公司；MS3漩涡震荡仪，德国IKA公司；7890A气相色谱仪，美国Agilent公司；Illumina Miseq测序仪，美国Illumina公司。

1.3培养基与试剂配制

抗生素溶液：使用前用无菌水溶解头孢曲松钠，制成250mg/mL的抗生素溶液，配置后于4℃冰箱至多保存24小时。

过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色液，北京雷根生物；卡诺固定液(乙醇6：醋酸1：氯仿3，v/v/v)，现配现用；TRIzol试剂，Ambion；PrimeScript^TM RT reagent Kit，TaKaRa；SYBRPremix Ex Taq荧光定量PCR试剂，TaKaRa；引物由英潍捷基上海贸易有限公司代为合成；DEPC水，北京碧云天；无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、乙醚，北京化工厂。

1.4实验菌株及处理

受试菌株：动物双歧杆菌A6(Bifidobacterium animalis A6)，由教育部功能乳品实验室分离自正常人体肠道，菌种保藏号：CGMCC 9273。鼠李糖乳杆菌GG株(Lactobacillusrhamnosus GG，LGG)，来自于教育部功能乳品实验室。

菌株处理：将动物双歧杆菌A6接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，使菌浓度达到10⁹cfu/mL，菌液在室温下以4000rpm离心15min，收集菌体。收获的菌体以生理盐水洗涤两次后重悬于生理盐水，使用时将菌悬液倍比稀释成10¹⁰、10⁸、10⁶cfu/mL浓度。将鼠李糖乳杆菌LGG接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h，使菌浓度达到10⁹cfu/mL，菌液在室温下以4000rpm离心15min，收集菌体。收获的菌体以生理盐水洗涤两次后重悬于生理盐水，并将菌体浓度稀释为10⁸cfu/mL。

1.5实验动物

SPF级BALB/c小鼠72只，雄性，7周龄，体重18～22g，购自北京维通利华公司技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于中国农业大学转基因生物食用安全监督检验测试中心SPF动物房中，室温22±2℃，12h光照/黑暗循环，自由饮水和摄食。

2实验方法

2.1抗生素相关性腹泻模型的建立

用苦味酸标记小鼠后进行适应性喂养1周，按体重随机分为两组，分别是正常组(12只)和造模组(60只)。实验周期为12天，造模5天，恢复天数为7天。正常组小鼠在整个实验期间灌服生理盐水，模型组小鼠在造模阶段灌服250mg/mL的头孢曲松液0.2mL，每天一次，连续五天，然后检测动物模型是否建立成功。每天观察小鼠精神状态，记录体重和摄食量，并进行腹泻指标的评定。

造模成功的标准：模型组小鼠均发生腹泻，且粪便干湿重比值与正常组相比具有统计学差异(张文娣，2015)。

2.2实验分组和剂量设置

将造模成功的小鼠按照体重随机分成5组，每组12只，3只一笼饲养。其中低剂量组(低A6)每天灌胃10⁶cfu/mL浓度的动物双歧杆菌A6菌液0.2mL，每天一次，连续7天；中剂量组(中A6)灌第体积10⁸cfu/mL浓度A6菌液；高剂量组(高A6)灌胃等体积10¹⁰cfu/mL浓度A6菌液；LGG组(LGG)灌胃等体积10⁸cfu/mL浓度LGG菌液；自然恢复组(自恢)灌胃等体积生理盐水。此外，正常组小鼠每天也灌胃0.2mL生理盐水，每天一次，连续7天。

2.3样本收集

在实验第12天，以颈椎脱臼法处死小鼠，由于每只小鼠结肠长度较短，每组12只小鼠随机均分为2部分留存肠道样品。每组前六只小鼠摘下盲肠，称取重量(包含内容物)，并用相机记录盲肠形态。

在恢复期第7天，以颈椎脱臼法处死小鼠，由于每只小鼠结肠长度较短，每组12只小鼠随机均分为2部分留存肠道样品。每组前六只小鼠摘下盲肠，称取重量，并用相机记录盲肠形态；距回盲部1cm取回肠2cm，靠近盲肠下端1cm处取近端结肠2cm，分别浸泡在4％福尔马林液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片厚度5μm，用于后期HE染色；收集小鼠的盲肠内容物，装于无菌离心管后转移至-80℃，用于后期菌群DNA提取及高通量检测。

每组后六只小鼠距回盲部1cm取回肠2cm，靠近盲肠下端1cm处取近端结肠2cm，浸泡于预冷的卡诺固定液，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片厚度5μm，用于后期AB-PAS染色检测黏液层厚度；距回盲部3cm取回肠2cm，靠近盲肠下端3cm处取结肠2cm，用生理盐水洗净后立即投入液氮，转移至-80℃冻存，用于后期RT-PCR。

在恢复期最后一天收集每只小鼠的新鲜粪便，装于无菌离心管中迅速转移至-80℃保存，用于后期粪便中短链脂肪酸含量的测定。

2.4腹泻情况

每天观测各组小鼠的临床表现，包括精神状态、粪便形态、肛门红肿等现象，为了减少对小鼠的伤害又能观测不同处理后小鼠腹泻指标的变化，在造模第五天(恢复期第0天)、恢复期第4天及第7天收集小鼠新鲜粪便并检测粪便干湿重比值。

粪便评分(Akinobu K，2000)：大便正常或没有，0分；轻度腹泻，大便可见轻徵湿软，1分；中度腹泻，大便较湿且不成形并且有轻度肛周着色，2分；重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色，3分。0分表示正常粪便，1分、2分、3分则视为腹泻。

腹泻率(％)＝组内腹泻小鼠只数/组内小鼠总只数(％)。

粪便干湿重比值：将小鼠单独放置于干净鼠笼中，断食1小时，收集1小时内小鼠所有新鲜粪便于干净离心管中，称湿重，然后105℃烘干2小时，直至重量变化小于1％，再称量干重，计算干湿重比值。

2.5肠道菌群DNA的提取及高通量测序

将小鼠盲肠内容物按照以往文献方法提取细菌DNA(王然，2016)。

测序由北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成，使用Illumina MiSeq平台进行，选择细菌的16S rRNA基因序列中V3-V4可变区进行测序，扩增片段大小在400-450bp。

2.6肠组织HE染色观测黏膜形态

取回肠、结肠组织切片，厚度为5μm，常规苏木精伊红(HE)染色：

(1)65℃烤片，1小时；

(2)二甲苯脱蜡，15min并重复一次；

(3)乙醇水化，梯度为100％、100％、95％、80％、70％，每个浸泡5min；

(4)蒸馏水水封，5min；

(5)纯苏木精染色，5min；

(6)自来水返蓝，5min；

(7)95％乙醇浸泡，1min并重复一次；

(8)伊红染细胞质，5s；

(9)95％乙醇浸泡，1min并重复一次；

(10)100％乙醇脱水，5min并重复一次；

(11)二甲苯透明，5min并重复一次；

(12)中性树胶封片，晾干一天后完成制片。

绒毛高度隐窝深度统计：用光镜观察染色的组织切片，并用软件分析图像，每个标本随机观察5个视野，测量每个视野中10根连续排列的绒毛长度或10个连续排列的隐窝深度。这50个值的平均数作为每只老鼠的肠组织绒毛高度或者隐窝深度(结肠只有隐窝深度)。

在光镜下观察肠黏膜病理变化，观察正常黏膜结构是否破坏、是否出现细胞浸润等现象，该过程由同一名病理科医生在单盲状态下完成。

2.7肠组织AB-PAS染色观测黏液层

将浸泡在卡诺固定液的结肠组织脱水、包埋、切片，接着进行阿尔新蓝-过碘酸雪夫(Alcian Blue-Periodie Acid Schiff，AB-PAS)特殊染色：

(1)65℃烤片，1小时；

(2)二甲苯脱蜡，15min并重复一次；

(4)蒸馏水水封，5min；

(5)阿尔新蓝染色，5min；

(6)蒸馏水浸泡，5min并重复一次；

(7)过碘酸(A液)染色，5min；

(8)蒸馏水浸泡，5min并重复一次；

(9)Schiff(B液)染色，5min；

(10)蒸馏水浸泡，5min并重复一次；

(11)乙醇脱水，梯度为70％、80％、95％、100％、100％，每个浸泡5min；

(12)二甲苯透明，5min并重复一次；

(13)中性树胶封片，晾干一天后完成制片。

光镜下观察染色完成的切片，用软件分析组织图像，每个标本随机观察10个视野，每个视野取5个点测量粘附的黏液层厚度，这50个值的平均数作为每只老鼠的黏液层厚度。

2.8肠道组织RNA提取及cDNA合成

动物组织RNA的提取：

(1)冰盒中倒入液氮，将冻存于-80℃冰箱的结肠组织取出放入液氮中。

(2)舀取一些液氮预冷研钵，取50mg左右动物组织放入研钵，在液氮中磨碎。

(3)在无RNA酶的1.5ml离心管中加入1ml TRNzol试剂，加入研磨后的组织粉末，剧烈震荡，4℃，12，000rpm离心10-15min，离心后西区上清液到新的1.5mL离心管。

(4)在上清液中加入200μl氯仿，4℃，12，000rpm离心10-15min，平缓取出离心管并尽快转移上清液到新的EP管。

(5)新EP管中加入200μl异丙醇，上下颠倒混匀，4℃，12，000rpm离心10min。弃上清，得到微黄的RNA沉淀。

(6)加入1ml 75％乙醇清洗沉淀，轻摇混匀后离心，4℃，5，000rpm离心3min，离心结束后倒去液体留下沉淀。

(7)用掌上离心机短暂离心，枪头吸出剩余少量的液体，将离心管打开自然晾干，然后根据沉淀的体积加入20-50ul DEPC水，溶解RNA。

RNA质量检验：

(1)制备1.2％琼脂糖凝胶，电泳槽需使用新的TAE溶液。

(2)将5μlRNA样品与1μl loading buffer混匀点胶，开始电泳(电压150V，7-8min)。

(3)凝胶成像仪观察电泳条带并照相。可见28s，18s，5s从上至下依次三条条，若28s亮度约为18s的两倍且条带清晰无弥散，则说明提取的RNA质量较好。

反转录步骤：使用TaKaRa的反转录试剂盒，按照说明书的要求进行试剂的混合及上机实验，反转录后得到肠道组织cDNA，冻存于-20℃用于后期RT-PCR.

2.9定量PCR检测黏蛋白及水电解质通道基因表达

将提取及反转录得到的肠组织cDNA进行RT-PCR，检测黏蛋白Mucin1、Mucin2、Mucin3、Mucin4及水电解质通道AQP4、NHE3和SLC26A3的基因表达水平。上述基因的引物设计见表1。

表1：基因引物序列和产物大小

表1：

3.0气相法测定小鼠粪便中短链脂肪酸含量

小鼠粪便中短链脂肪酸的提取和气相检测参考Goossens等的方法(Goossens D，2003)。用自动进样器吸取预处理后的样品2μL，使用毛细管柱FFAP跑样，用火焰离子检测器进行检测。气相程序如下：

检测器：230℃，进样口：230℃，AUX：230℃，柱箱：50℃2.5min，50-140℃5℃/min，140℃1min，140-240℃30℃/min，240℃2min。

用倍比稀释法配制5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mmol/L的乙酸、丙酸、丁酸及庚酸标准溶液，然后在气相色谱仪上跑样，作出标准曲线。

3数据的统计分析

实验数据使用SPSS 20统计软件分析，结果采用表示，并进行t-检验，P<0.05视为差异显著，P<0.01视为差异极显著，具有统计学意义。

实施例及实验结果与分析

实施例1抗生素相关性腹泻小鼠模型的建立

1.1造模期间小鼠腹泻率变化

正常小鼠毛发有光泽，活动正常，粪便质硬粒小，水分含量低。造模组小鼠精神萎靡，毛发无光泽，粪便性状发生改变。灌胃头孢曲松钠溶液，每天灌胃BALB/c小鼠250mg/mL的头孢曲松钠溶液0.2mL，连续5天后小鼠粪便蓬松湿软，便粒变长，逐渐出现轻度腹泻，在给药5天后达到高峰，所有小鼠均产生腹泻(结果见图1A)。

1.2造模期间小鼠粪便干湿重比值变化

给药五天后模型组小鼠全部产生轻微腹泻，发明人进一步用粪便干湿重比值来反映粪便的软硬程度，以判别造模是否成功。收集造模第五天每只小鼠的新鲜粪便进行干湿重比值的检测，结果显示，第五天抗生素模型组动物的粪便干湿重比值极显著低于正常组(P<0.01)，由正常组的45.9±13.7％下降到24.7±2.4％(结果参见图1B)，说明粪便中水分含量显著上升，与腹泻评分结果一致。

1.3造模成功率

抗生素相关性腹泻动物模型成功的标准是模型动物发生腹泻，且模型组动物粪便干湿重比值与正常组相比具有统计学差异，根据此标准，模型组60只小鼠均造模成功，此模型造模成功率为100％，模型组的60只小鼠可以继续接下来的实验用于评价双歧杆菌A6对小鼠抗生素相关性腹泻的效果。

实施例2双歧杆菌A6对AAD小鼠腹泻指标的影响

2.1恢复期不同处理组小鼠腹泻率变化

从图2可以看出，自然恢复组的小鼠腹泻情况改善缓慢，到第七天还有30％的小鼠存在轻度腹泻。灌胃双歧杆菌A6后，腹泻小鼠加快恢复，高剂量A6组效果最佳，第四天只有30％的小鼠仍存在轻度腹泻的症状，第七天腹泻全部恢复。灌胃LGG的小鼠腹泻率变化情况与灌胃低剂量A6的小鼠相似，实验第四天腹泻小鼠只数减少约一半，第七天还有部分小鼠存在腹泻。

2.2恢复期不同处理组小鼠粪便干湿重比值变化

粪便干湿重比值能更直观地反映小鼠粪便的湿软程度，从图3可以看出，造模后小鼠粪便干湿重比值显著低于正常组小鼠(P<0.05)，且这种变化7天后仍不能自然恢复，仍然显著低于正常小鼠(P<0.05)，而双歧杆菌A6或LGG的补充能明显改善这种差异，在恢复实验的中期小鼠粪便的干湿重比值与正常组的差异就缩小为不显著，且中剂量和高剂量A6的效果优于LGG。结果说明，AAD小鼠在恢复阶段补充双歧杆菌A6能显著降低粪便中的水分含量，减少与正常小鼠的差异，并且中剂量和高剂量A6效果最佳。

实施例3双歧杆菌A6对AAD小鼠盲肠大小的影响

在解剖过程中发现抗生素处理过后的小鼠盲肠明显增大，颜色呈土黄色，与正常组的深褐色相比变浅，于是检测了小鼠盲肠的重量。如图4所示(其中，图4A为小鼠盲肠重量，图4B为小鼠盲肠形态照片)，正常组小鼠盲肠重0.25g左右，抗生素处理后盲肠及内容物重量增至1g左右，尽管补充高剂量的A6能减少盲肠重量，与自然恢复组相比显著降低(P<0.05)，但是这种与正常小鼠的差异仍然存在(P<0.05)。

实施例4双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道菌群的影响

4.1双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道菌群Alpha多样性的影响

综合考虑检测成本及第二章实验结果，选择AAD缓解效果最佳的高剂量A6组小鼠、正常组小鼠及自然恢复组小鼠共18个样品进行高通量测序分析，肠道菌群Alpha多样性的结果见表2。

表2：高通量测序基本信息

利用Illumina Miseq平台进行高通量测序，测序后18个样品的基本信息如表2所示。Miseq平台通过对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，优化数据后得到661909条有效序列，平均长度约442.19bp。接着通过聚类操作，将每一个样品中相似度为97％的序列聚类成一个小组，即一个OTU(Operational Taxonomic Unit)，然后对OTUs进行物种注释及生物信息统计分析。

Alpha多样性(Ace、Chao、Shannon、Simpson、Coverage)可以反映样品内微生物群落的物种丰度和多样性。Ace指数和Chao指数是两种不同的计算方法，存在细微的差异，都能用来估计OTU的数量从而反映菌群的丰度。在本研究中，单样品的Ace和Chao指数要高于该样品的OUT数目，说明随着测序的加深，仍能检出新的微生物种类，而所有样品中覆盖率(coverage)都大于99.98％，表明该测序结果较好地反映了样品中微生物的真实情况。通过比较不同样本OTU的数目发现，抗生素使用后小鼠肠道菌群的丰度明显下降，自然恢复组小鼠菌群丰度(OTUs:53)略高于高剂量A6组小鼠(OTUs:41)，可能是双歧杆菌A6抑制了一些条件致病菌的增长，但这需要通过后面的检测结果验证。Shannon指数和Simpson指数用来反映微生物群落的多样性，Shannon值越大表明群落多样性越高，而Simpson值越大则表明群落多样性越低。结果如表2所示，正常组、自然恢复组和高剂量A6组小鼠肠道菌群的Shannon指数分别为4.33、1.53和1.54，Simpson指数分别为0.0290、0.3226和0.3057，表明头孢曲松钠造模后小鼠肠道菌群多样性大幅度降低，而补充高剂量双歧杆菌A6一周后可以提高肠道中微生物的多样性。

4.2双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道菌群组成的影响

利用Alpha多样性分析初步证明了双歧杆菌A6能提高抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的多样性，本实验接着进行Beta多样性分析，利用基于UniFrac的PCoA分析来比较不同处理组小鼠肠道微生物群落组成的差异，结果如图5所示。

4.3双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道菌群相对丰度的影响

群落Bar图可以直观地反映不同样本在特定分类学水平上的群落组成情况。本实验利用Bar图分析了属水平上三个不同处理组小鼠肠道菌群的组成，包括微生物种类及其相对丰度，见图6。

如图6所示，在属的水平上，三个不同处理组小鼠肠道菌群中相对丰度大于1％的微生物有25种，分别为unclassified_f_Enterococcaceae，norank_f_Bacteroidales_S24-7_group，Bacteroides，Lachnospiraceae_NK4A136_group，unclassified_f_Lachnospiraceae，Roseburia，uncultured_f_Lachnospiraceae，Alloprevotella，uncultured_f_Ruminococcaceae，Akkermansia，Enterococcus，Lachnospiraceae_UCG-001，unclassified_o_Bacteroidales，Mycoplasma，Staphylococcus，norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group，Bifidobacterium，Lachnospiraceae_UCG-006，Alistipes，Helicobacter，Ruminiclostridium_9，Lachnoclostridium，Mucispirillum，Anaerotruncus和Oscillibacter。

正常组小鼠肠道中，毛螺菌是优势菌，包括Lachnospiraceae_NK4A136_group(相对丰度22.0％)、unclassified_f_Lachnospiraceae(相对丰度11.1％)和uncultured_f_Lachnospiraceae(相对丰度9.6％)，罗斯菌属Roseburia占到11％左右，这些菌是哺乳动物胃肠道中常见的厌氧菌，罗斯菌还能代谢碳水化合物产丁酸，头孢曲松钠使用后这些菌全部消失，自然恢复一周后仍未产生，而补充双歧杆菌A6一周后少量毛螺菌uncultured_f_Lachnospiraceae(占0.7％)出现。Bar图显示专性厌氧的拟杆菌也是正常小鼠肠道菌群中的优势菌，占比约14％(norank_f_Bacteroidales_S24-7_group 9.2％，Bacteroides2.2％，unclassified_o_Bacteroidales2.6％)，灌胃抗生素后拟杆菌数量上升，自然恢复组中含有39％左右，双歧杆菌中含有44％左右。

与正常小鼠相比，AAD小鼠肠道菌群组成变化最显著的就是肠球菌数量的急剧上升，自然恢复组小鼠肠道中unclassified_f_Enterococcaceae和肠球菌属Enterococcus的相对丰度分别达到50.9％和2.0％，灌胃双歧杆菌A6后下降至45.7％和1.2％。肠球菌兼性厌氧，是引起医院感染性肠道病的重要病原体，对多种抗菌药物具有耐药性，包括头孢曲松钠(李庚锋，2014)。Guo Y等人灌胃小鼠头孢曲松钠溶液连续150天，实验第8天肠球菌就成为小鼠肠道中主要的细菌，这种优势地位维持了整个实验阶段(Guo Y，2017)。此外，正常肠道中微量存在的葡萄球菌Staphylococcus也在AAD小鼠肠道中出现，自然恢复组达到2.2％，双歧杆菌A6则使葡萄球菌的相对丰度下降至0.2％，葡萄球菌也为兼性厌氧菌，部分具有致病性。

灌胃双歧杆菌A6除了促进肠道专性厌氧菌毛螺杆菌数量的恢复，抑制兼性厌氧的肠球菌及葡萄球菌的增殖，还提高了AAD小鼠肠道中双歧杆菌的数量(0％上升至2.1％)，增加严格厌氧菌在肠道中的优势地位，促进肠道菌群平衡的重建。

Heatmap图是以颜色梯度来呈现菌群中的物种组成信息，颜色的变化和相似程度体现了不同样品中菌群组成的差异性和相似性(李欣蔚，2017)。通过Bar图分析了不同处理组小鼠肠道菌群的组成(见图6)，接着利用群落Heatmap图(见图7)来观察三组小鼠菌群结构的变化和差异性，并在属分类水平上运用Students’T检验分析不同处理组间的差异物种，如图8。

Heatmap图中，自然恢复组绿色色块占比较正常组增多，且深度较大，说明抗生素的处理使许多细菌的数量发生急剧下降，尤其是厌氧菌，以毛螺菌Lachnospiraceae(P<0.001)、罗斯菌Roseburia(P＝0.002<0.01)、瘤胃菌uncultured_f_Ruminococcaceae(P<0.001)和棍杆菌Alistipes(P＝0.0013<0.01)为代表(见图8A)。自然恢复组中以肠球菌为代表的红色色块颜色加深，Students’T检验结果显示(见图8A)，肠球菌unclassified_f_Enterococcaceae(P<0.001)和Enterococcus(P＝0.006<0.01)相对丰度极显著上升，未分类拟杆菌Bacteroidales_S24-7(P<0.001)极显著增加，拟杆菌属Bacteroides(P＝0.013<0.05)占比显著提高。

Heatmap图通过颜色梯度变化直观地显示了自然恢复组与正常组小鼠菌群结构的极大差异，高剂量A6组的颜色变化较自然恢复组更接近于正常组，说明灌胃双歧杆菌A6促进AAD小鼠肠道菌群结构的恢复。从图8B可以看出，与自然恢复的AAD小鼠相比，补充A6(1010CFU/d)一周后，小鼠肠道中肠球菌unclassified_f_Enterococcaceae(P＝0.05)相对丰度显著下降，肠球菌属Enterococcus比例下降(2.0％下降至1.2％)，未分类拟杆菌Bacteroidales_S24-7(P＝0.04<0.05)比例显著降低，拟普雷沃菌Alloprevotella比例下降(P＝0.054)，葡萄球菌Staphylococcus比例下降(2.16％下降至0.03％)。此外，有三种菌的相对丰度显著上升，包括拟杆菌Bacteroides(P＝0.02<0.05)、双歧杆菌Bifidobacterium(P＝0.003<0.01)和拟杆菌科norank_f_ratAN060301C(P＝0.005<0.01)，同时乳杆菌Lactobacillus的相对丰度也又自然恢复组的0％提高至0.34％，接近正常组的0.55％。

上述关于肠道菌群结构的分析结果显示，头孢曲松钠处理后小鼠肠道菌群发生剧烈变化，毛螺菌等厌氧菌数量急剧下降，几乎消失，自然恢复7天后仍未出现，兼性厌氧菌，尤其是对头孢曲松耐药的肠球菌数量爆发，相对丰度超过二分之一，成为肠道中最主要的细菌，小鼠肠道的厌氧环境被打破，致病菌成为优势菌，肠道微生态平衡完全被破坏。双歧杆菌A6的补充则缓解了这种菌群失衡现象，专性厌氧的拟杆菌和毛螺菌数量增加，乳杆菌出现，双歧杆菌相对丰度极显著上升，肠球菌和葡萄球菌比例下调，肠腔中厌氧菌数量提高，对肠道健康具有积极作用的双歧杆菌和乳杆菌重现并增殖，致病菌肠球菌的生长受到抑制，数量减少，A6促进紊乱的肠道微生态系统向着平衡稳固的正常结构恢复。

实施例5双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道黏液屏障的影响

5.1不同处理组小鼠近端结肠黏液层厚度变化

抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群结构发生巨大改变，厌氧菌相对丰度下降，以肠球菌为主的机会致病菌比例大幅度上升。发明人继而研究与肠道菌群紧密接触的黏液层，看其在不同处理中是否发生变化。

如图9和10所示，正常小鼠覆盖于近端结肠上皮表面的黏液层厚度约为60μm，头孢曲松钠造模后，连续灌胃生理盐水7天的自然恢复组小鼠黏液层严重削减(P<0.05)，厚度仅为正常组的二分之一，并且从图像上看来结构松散，薄薄的一层覆盖于结肠隐窝表面。补充高中低三组剂量A6后，小鼠结肠黏液层结构稳固，厚度随剂量逐渐增加，接近正常小鼠(P>0.05)并显著高于自然恢复组(P<0.05)。补充LGG后小鼠黏液层厚度增加，高于正常组小鼠(P<0.05)。

5.2肠道组织黏蛋白基因表达水平

覆盖于肠道上皮组织表面的黏液层主要成分是黏蛋白，主要由MUC1、MUC2等组成。通过实验发现AAD小鼠近端结肠黏液层厚度削减，补充A6或者LGG后黏液层厚度显著增加，这种变化可能与黏蛋白组成成分的变化有关，于是检测了主要的四种黏蛋白在结肠组织的基因表达情况。

从图11可以看到不同处理组小鼠结肠组织转录黏蛋白基因MUC1、MUC2、MUC3和MUC4的情况。MUC2和MUC3的基因表达量在各组中的变化不大，不存在显著性差异(P>0.05)，其中自然恢复组和高剂量A6组的MUC2基因与其他组相比表达增加(P>0.05)。由图11A可知，各组小鼠MUC1基因的表达差异较大，自然恢复组小鼠结肠组织表达的MUC1基因仅为正常组的一半(P<0.05)，低中剂量A6及LGG并未起到太大的效果，表达量与自然恢复组相似。灌胃高剂量的A6与自然恢复组相比显著提高了黏蛋白MUC1的基因表达(P<0.05)，与正常小鼠接近(P>0.05)。MUC4的表达情况见图11D，造模后灌胃生理盐水一周的小鼠MUC4的基因表达量仍低于正常小鼠，尽管低中剂量A6未能提高MUC4的基因表达，灌胃高剂量A6后小鼠结肠组织MUC4基因表达增加，高于造模后的其他几组(P>0.05)，接近正常小鼠，阳性对照LGG组的MUC4基因表达量与自然恢复组相似。

综合这四个黏蛋白基因的表达情况，可以看出抗生素相关性腹泻小鼠的黏蛋白MUC1基因表达下降(P<0.05)，而补充高剂量A6(10¹⁰cfu/d)可以显著提高该黏蛋白的mRNA表达量(P>0.05)。

实施例6双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道黏膜形态的影响

6.1恢复期不同处理对小鼠回肠绒毛形态的影响

黏液屏障的削弱会降低肠道对致病菌的抵御能力，病原菌有机会侵袭组织并引起炎症反应，造成损伤。本实验接着检测双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道黏膜形态的影响。

用光镜观察小鼠回肠组织切片，分析绒毛长度及隐窝深度，并计算肠组织绒毛长度/隐窝深度(v/c)。

表3：不同处理对小鼠回肠绒毛隐窝结构的影响(x±s)

注：表中每列数值含有不同字母则表示具有显著性差异(P<0.05)

由表3可见，和正常小鼠相比，抗生素处理后自然恢复组小鼠回肠绒毛高度显著降低，下降幅度为11.47％(P<0.05)。补充低剂量A6或补充LGG能抵消这种下降趋势，绒毛高度与正常组接近(P>0.05)。补充中剂量A6或高剂量A6能显著改善抗生素处理后回肠绒毛缩短的现象，并且绒毛高度和正常小鼠相比提高了2.6％和9.07％。

抗生素处理后小鼠回肠的隐窝结构深度显著变浅，补充A6和LGG都能改善这种变化，而高剂量的A6效果最为明显，从自然恢复组降低15.45％减弱为降低8.13％，与正常小鼠差异不显著(P>0.05)。

用绒毛长度/隐窝深度(v/c)来综合反映回肠绒毛形态的变化，可以看到，抗生素处理后自然恢复组小鼠v/c较正常组增大(P>0.05)，尽管该组小鼠绒毛变短隐窝变浅。低剂量A6和LGG的干预效果相似，v/c达到3.00左右，与正常组差异不显著(P>0.05)，而补充中高剂量A6的小鼠v/c变化相似，比自然恢复组高出12.37％(P>0.05)，比正常组高出18.66％(P<0.05)。

光学显微镜下观察小鼠回肠组织，如图12，正常小鼠回肠绒毛表面完整，固有层、肌层和浆膜层层次清晰。与正常组相比，自然恢复组小鼠绒毛上端有局部断裂，排列不规则，变稀疏，固有层有炎症细胞浸润，并且隐窝空洞变浅，形态不规则。补充A6或者LGG后，小鼠回肠结构恢复至与正常组无异，绒毛排列规则，上皮细胞完整，组织无炎症现象，并且高剂量A6组小鼠回肠绒毛紧密细长，说明双歧杆菌A6有助于AAD小鼠小肠绒毛隐窝精微结构形态的恢复。

6.2恢复期不同处理组小鼠结肠组织形态的变化

由图13可以看出，自然恢复组小鼠的近端结肠隐窝深度明显低于正常小鼠(P<0.05)，而补充A6或LGG使能这种差异降低，使得隐窝深度与正常小鼠隐窝深度相近(P>0.05)。其中LGG组小鼠近端结肠隐窝深度最大，紧接着依次为高中低剂量A6组。

由图14可以看出，光学显微镜下观察小鼠近端结肠组织，正常小鼠隐窝完整，排列整齐。自然恢复组小鼠近端结肠黏膜表面细胞缺失，隐窝大小不一致，隐窝高度变低，局部中性粒细胞浸润，有轻微炎症。补充A6或者LGG后，小鼠结肠组织无炎症，隐窝加深，结构完整，其中高剂量A6组与LGG组小鼠隐窝与正常小鼠相比更深，排列规则紧密。

实施例7双歧杆菌A6对AAD小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响

7.1短链脂肪酸标准曲线的建立及线性相关方程

前期实验结果显示双歧杆菌A6对抗生素相关性腹泻小鼠的肠道菌群组成起到一定的调节作用，增加了双歧杆菌等厌氧菌的占比，于是接着探究A6对肠腔中菌群重要代谢产物短链脂肪酸的影响，检测了粪便中乙酸、丙酸和丁酸这三种主要短链脂肪酸的含量。

发明人使用气相色谱方法来测量乙酸、丙酸和丁酸的标准曲线，得到的线性相关方程和相关系数(R²)分别为:

乙酸/庚酸y＝0.000532x R²＝0.999045

丙酸/庚酸y＝0.000717x R²＝0.999313

丁酸/庚酸y＝0.001156x R²＝0.999317

表明得到的标准曲线相关性强，分析结果具有参考价值。

7.2灌胃双歧杆菌A6对小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响

乙酸的浓度变化可以从图15中看出，抗生素造模后，各组小鼠粪便中乙酸浓度均发生大幅度下降，仅为正常组的二分之一不到。自然恢复组、低中剂量A6组含量相近，LGG组含量稍低，高剂量A6组乙酸的含量最高，为507.75±35.69mg/g。

粪便中丙酸浓度在抗生素处理后也锐减，如图16所示，自然恢复组小鼠粪便中丙酸浓度仅为正常小鼠的六分之一，补充低中剂量双歧杆菌A6或鼠李糖乳杆菌LGG并没有提高丙酸的含量，而补充高剂量A6与自然恢复组小鼠相比显著提高了丙酸浓度，达到75.72±23.63mg/g(P<0.05)。

丁酸能为肠道上皮细胞提供碳源和能量，促进上皮细胞的完整性。从图17中可以看到，正常小鼠粪便中丁酸浓度达到272.49±42.14mg/g，抗生素处理后急剧下降，造模后的五个不同处理组丁酸浓度均不足15.00mg/g，尽管低中高剂量A6组的丁酸含量呈递增趋势，高剂量A6组的小鼠粪便中丁酸浓度仅为10.81±6.40mg/g，比自然恢复组高出约4mg/g(P>0.05)。

7.3双歧杆菌A6对AAD小鼠肠道上皮细胞水电解质转运的影响

短链脂肪酸会影响肠道上皮细胞对水分及电解质的转运功能，本实验选择了肠道上皮组织在钠水吸收方面起主导作用的三个通道蛋白并检测其基因表达水平，包括水通道蛋白4(AQP4)、Na⁺/H⁺交换体3(NHE3)及Cl^-/HCO₃ ^-交换体(SLC26A3)。

水通道蛋白AQP4负责肠道中水分的重吸收，主要在结肠上皮细胞刷状缘表达。由图18可知，自然恢复组与LGG组AQP4的基因表达与正常组相比无明显差异，而灌胃A6后AQP4的基因表达有所提高，尤其是高剂量A6组小鼠结肠组织AQP4的表达量与自然恢复组相比提高了一倍(P<0.05)。说明A6的补充增强了结肠上皮细胞对肠腔中水分的吸收，有助于缓解抗生素相关性腹泻小鼠肠腔内容物高水分含量的现象。

钠/氢交换体NHE3在肠道中介导肠腔Na⁺与上皮细胞内H⁺的交换，通过促进上皮细胞吸收Na⁺来形成渗透压梯度从而增加水的被动吸收。如图19所示，造模后不同处理组小鼠结肠组织表达的NHE3基因水平差异较大，自然恢复组与正常鼠接近，而补充高中低剂量A6和LGG都使NHE3的表达有所下降，高剂量A6组的下降幅度最小(P>0.05)。

SLC26A3离子交换泵位于结肠上皮细胞顶膜，调节Cl^-和HCO₃ ^-的交换，在下消化道与NHE3协同介导电中性NaCl的吸收，在肠道水分与电解质转运中起着重要作用。从图20中看到，造模后恢复阶段各组小鼠的SLC26A3基因表达均比正常小鼠高，自然恢复组和LGG组比正常组高出50％，低中高剂量A6组的表达量更高，其中中剂量A6组比自然恢复组要高出33.33％(P<0.05)，说明A6促进了结肠隐窝Cl^-和HCO₃ ^-的交换活性，有助于NaCl的吸收。

根据上述这三个水电解质通道的基因表达情况，再考虑到SLC26A3与NHE3对NaCl吸收的协同调节作用，发现抗生素相关性腹泻小鼠自然恢复一周后结肠上皮细胞对钠水的吸收能力与正常小鼠差异不大，而补充双歧杆菌A6可以增强上皮细胞对肠腔水分的重吸收能力。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途

<130> PIDC3172278

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<223> Mucin4的正向引物

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<400> 15

cacaaattca gaagacgaac atcgcagacc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SLC26A3的反向引物

<400> 16

gcatcagcat tccctttaag tttccgagtg 30

Claims

1.动物双歧杆菌A6在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防抗生素相关性腹泻。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于下列的至少之一：

增加肠道微生物的多样性、提高肠道专性厌氧菌的占比、提高双歧杆菌的比例、增加结肠黏液层厚度、提高黏蛋白MUC1的mRNA表达量、增加回肠绒毛高度、增加回肠隐窝深度、增加绒毛高/隐窝深比值、缓解肠道组织的炎症反应、增强肠道对肠腔水分的重吸收能力、提高粪便中乙酸、丁酸、丙酸浓度以及提高结肠上皮细胞水通道蛋白4的基因表达。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肠道专性厌氧菌包括选自毛螺杆菌、拟杆菌的至少之一。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗生素包括选自氨苄青霉素、氯林可霉素、庆大霉素以及头孢菌素的至少之一，

优选地，所述抗生素为头孢菌素。

5.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防抗生素相关性腹泻，其特征在于，为动物模型给予候选药物，所述动物模型为抗生素相关性腹泻模型，检测给药后所述模型的下列的至少之一的变化，

肠道微生物的多样性、肠道专性厌氧菌的占比、双歧杆菌的比例、粪便干湿重比值、结肠黏液层厚度、黏蛋白MUC1的mRNA表达量、回肠绒毛高度、回肠隐窝深度、绒毛高/隐窝深比值、肠道对肠腔水分的重吸收能力、粪便中乙酸、丁酸、丙酸浓度以及结肠上皮细胞水通道蛋白4的基因表达，

其中，给药后所述模型的上述的至少之一提高，是所述候选药物为目标药物的指示。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述目标药物包含动物双歧杆菌A6。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗生素相关性腹泻模型是通过如下方法获得的：

给BALB/c小鼠给药头孢曲松钠，其中，所述头孢曲松钠是以水溶液的形式提供的，所述头孢曲松钠的浓度为250mg/mL，给药剂量为0.2ml/天，给药时间为5天。

8.一种用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物组合物，其特征在于，包括动物双歧杆菌A6。

9.一种药物联合，其特征在于，包括动物双歧杆菌A6和其它可用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物，所述其它可用于治疗或预防抗生素相关性腹泻的药物包括：甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特或利福平。