CN107574131A - 益生菌双歧杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

益生菌双歧杆菌菌株AH1714在口服后具有显著的免疫调节功能。所述菌株用作免疫调节生物治疗剂。

Description

益生菌双歧杆菌菌株

本申请是申请日为2010年11月11日、发明名称为“益生菌双歧杆菌 菌株”的中国专利申请No.201080051187.8的分案申请。

发明背景

本发明涉及双歧杆菌菌株及其作为益生菌的用途，具体地讲作为免疫 调节生物治疗剂的应用。

保护人的胃肠道不被肠细菌定植的防御机制是高度复杂的并且涉及免 疫和非免疫的方面(1)。先天的防御机制包括胃的低pH、胆汁盐、蠕动、粘 蛋白层和抗微生物化合物例如溶菌酶(2)。免疫学机制包括在M细胞下面的 特定淋巴聚集体，称为派伊尔氏淋巴集结(peyers patches)，其遍布在小肠 和结肠(3)。存在于这些位置的内腔抗原对合适的T细胞和B细胞亚群产生 刺激，建立细胞因子网络并分泌抗体到胃肠道中(4)。此外，可经由上皮细 胞将抗原递呈到上皮内的淋巴细胞和下面的固有层免疫细胞(5)。因此，宿 主在胃肠道的免疫防御上投入巨大。然而，因为胃肠粘膜是宿主与外部环境 相互作用的最大表面，其中必须有特定的控制机制以调控对100吨食物的免 疫应答，这是胃肠道经平均寿命处理的食物数量。此外，超过500种菌种定 植在肠内，它们在结肠上的数量为10¹¹-10¹²/g。因此，这些控制机制必须能 够分辨非病原的粘附细菌与侵入的病原菌，所述病原菌将引起对宿主的显著 伤害。事实上，肠内菌群通过与新摄取的潜在病原微生物竞争，有助于宿主 防御它们。

人体胃肠道内存在的细菌可促发炎症。在某些疾病例如炎性肠病的状 态下，对正常菌群的异常免疫反应使得病情变得复杂。与正常菌群相关的抗 原一般会导致免疫耐受性，而不能获得该耐受性是粘膜炎症的主要机理 (6)。免疫耐受性失效的依据包括炎性肠病(IBD)患者胃肠菌群的抗体 水平提高。

本发明涉及表现出免疫调控效应的双歧杆菌菌株，其通过调节细胞因 子水平或者竞争和排斥作用从胃肠道中排除促炎微生物。

发明概述

本发明提供分离的双歧杆菌菌株NCIMB 41676。

所述双歧杆菌菌株可按活体细胞的形式存在。所述双歧杆菌菌株可按 非活体细胞的形式存在。所述双歧杆菌可从健康人受试者的结肠活检组织中 分离得到。所述双歧杆菌菌株口服后在人体中可具有明显的免疫调控作用。

如本文所述，本发明也提供包含双歧杆菌菌株的制剂。所述制剂还可 包含益生菌材料。所述制剂还可包含益生元材料。所述制剂还可包含可摄取 的载体。可摄取的载体可为药用载体，例如胶囊、片剂或者粉剂。可摄取的 载体可为食物产品，例如发酵乳、酸乳酪、冷冻酸乳酪、奶粉、浓缩乳、涂 抹干酪、调味品或饮料。所述制剂还可包含蛋白质和/或肽，尤其是富含谷 氨酰胺/谷氨酸、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或痕量元素的蛋白质和/或肽。所述双歧杆菌菌株可按大于10⁶cfu每克制剂的量存在。所述制 剂还可包含辅料。所述制剂还可包含细菌组分。所述制剂还可包含药物实 体。所述制剂还可包含生物化合物。所述制剂可用于免疫和疫苗接种方案。

本发明还提供如本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于食品。

本发明还提供如本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用作药物。

本发明还提供如本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或 治疗不良炎症活性。

本发明还提供如本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或 治疗不良胃肠道炎症活性，例如炎性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、 肠易激综合征；囊炎；感染后结肠炎。

本发明还提供如本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或 治疗胃肠道癌。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗系统性疾病如类风湿性关节炎。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或制剂，其用于预防和/或治疗 由不良炎症活性诱发的自身免疫性疾病。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗不良炎症活性诱发的癌症。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防癌症。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗由不良炎症活性诱发的腹泻病，例如艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)相关性腹泻、轮状病毒相关性腹泻、或感染后腹泻或者由病原体 (例如大肠杆菌(E.coli))诱发的腹泻病。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于制备可预防 和/或治疗不良炎症活性的抗炎生物治疗剂。

本文所述双歧杆菌菌株可用于制备调节IL-10水平的一系列生物治疗 剂。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗以下疾病：炎性疾病，免疫缺陷，炎性肠病，肠易激综合征，癌症(特别 是胃肠道和免疫系统的癌症)，腹泻病，抗生素相关性腹泻，小儿腹泻，阑 尾炎，自身免疫性疾病，多发性硬化症，阿尔茨海默病，类风湿性关节炎， 腹腔疾病，器官移植，糖尿病，细菌感染，病毒感染，真菌感染，牙周病， 泌尿生殖系统疾病，性传播疾病，HIV感染，HIV复制，HIV相关性腹泻， 手术相关的创伤，手术引起的转移性疾病，败血症，体重减轻、厌食，恶病 质，发烧控制，伤口愈合，溃疡，肠屏障功能，过敏，哮喘，呼吸系统疾 病，循环系统疾病，冠状动脉心脏疾病，贫血，凝血系统的疾病，肾脏疾 病，中枢神经系统病症，肝脏疾病，缺血，营养障碍，骨质疏松症，内分泌 失调，表皮疾病，牛皮癣，寻常痤疮，惊恐症，行为障碍和/或创伤后应激 障碍。

本文所述的双歧杆菌菌株可通过拮抗促炎微生物和从胃肠道内排除促 炎微生物来发挥作用。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于制备降低促 炎细胞因子水平的抗炎生物治疗剂。

本文所述双歧杆菌菌株可用作抗感染益生菌。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗双相型疾病、抑郁症、情绪障碍和/或焦虑症。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂用作认知增强剂以预 防和/或治疗中枢神经系统病症，例如阿尔茨海默病，精神分裂症和/或轻度 认知功能障碍的疾病。

本发明还提供本文所述的双歧杆菌菌株或者制剂，其用于预防和/或治 疗肥胖相关炎症。

本发明还提供用于预防和/或治疗肥胖相关的代谢失调的双歧杆菌菌株 或者制剂。

我们描述了双歧杆菌菌株AH1714(NCIMB 41676)或者其突变体或者其 变种。所述突变体可为经基因修饰的突变体。该变种可为自然发生的双歧杆 菌菌株变体。另外还描述了一种利福平抗性的菌株变种AH1714。所述菌株 可为益生菌。它可为生物学纯培养物形式。

我们还描述了一种分离的双歧杆菌菌株NCIMB 41676。所述双歧杆菌 菌株可按活体细胞形式存在。作为另外一种选择，双歧杆菌菌株也可按非活 体细胞形式存在。益生菌的一般使用形式为活体细胞。然而，可将它扩展到 非活体细胞例如杀灭过的培养物或包含益生菌表达的有益因子的组合物。这 可包括高温灭活微生物或者由于暴露于改变的pH或承受压强或者gamma射 线导致的灭活。非活体细胞产品制备相对容易。相比于活体细胞，非活体细 胞在整合进药品和储存要求方面限制更少。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YIT 9018提供一个加热灭活细胞的有效利用样品，这作为治疗和/或 防止肿瘤生长的方法在美国专利US4347240中进行了描述。

所述双歧杆菌菌株可从健康人受试者的结肠活检组织中分离，所述菌 株口服后在人体可起到显著的免疫调控作用。

我们还描述了一种包含本发明双歧杆菌菌株的制剂。所述制剂可包括 其它益生菌材料。所述制剂可包括益生元材料。优选地，所述制剂包括可摄 入的载体。可摄入的载体可为药用载体例如胶囊、片剂或粉末。优选地，可 摄取载体为食物产品，例如发酵乳、酸乳酪、冷冻酸乳酪、奶粉、浓缩奶、 涂抹干酪、调料或者饮料。该制剂还可包含蛋白质和/或肽，尤其是富含谷 氨酰胺/谷氨酸、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或痕量元素的蛋白质和/或肽。双歧杆菌菌株可在制剂中以大于10⁶cfu每克递送系统存在。优 选地，所述制剂含有辅料，细菌组分，药物实体或者生物化合物中的任意一 种或者多种。

本文还提供用作食品或药剂的双歧杆菌菌株或者制剂，其可用于预防 和/或治疗不良炎症活性、不良呼吸道炎症活性(例如哮喘)、不良胃肠道 炎症活性(如炎性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征)、 囊炎、感染后结肠炎、胃肠道癌、全身性疾病(如类风湿性关节炎)、不良 炎症活性诱发的自身免疫病、不良炎症活性诱发的癌症、不良炎症活性诱发 的腹泻病(例如艰难梭状芽孢杆菌相关性腹泻、轮状病毒相关性腹泻、或感染后腹泻或者由病原体(如大肠杆菌)诱发的腹泻病)。

我们还描述了双歧杆菌菌株或者制剂，其用于制备预防和/或治疗不良 炎症活性的抗炎生物治疗剂，或用于制备预防和/或治疗不良炎症活性的抗 炎生物治疗剂。该菌株可通过竞争排斥作用将促炎微生物排除出胃肠道。

我们还描述了双歧杆菌菌株或者制剂，其用于制备降低促炎细胞因子 水平的抗炎生物治疗剂。

该双歧杆菌菌株可用作调控IL-10水平的抗炎生物治疗剂的制备。

该双歧杆菌菌株由于其能够抑制致病微生物的生长从而可用作抗感染 的益生菌。

我们发现具体的双歧杆菌菌株在体外展示其免疫调控作用。

因此，该发明在预防和/或治疗免疫失调如不良炎症活性反应(例如哮 喘)方面具有潜在的治疗价值。

双歧杆菌是共生微生物。它们已经从人的胃肠道内的微生物区系中分 离出来。由于所引起的炎活性也将破坏宿主细胞和组织功能，因此胃肠道内 的免疫系统不可能对这种区系有显著的反应。因此，存在一些机制使得免疫 系统能够识别与病原生物不同的共生的非病原胃肠微生物区系。这确保对宿 主组织的伤害受到限制并且仍旧保持防御屏障。

将长双歧杆菌菌株AH1714于2009年11月5日保存在National Collections ofIndustrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building，CraibstoneEstate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA，Scotland， UK，并且授予保藏号NCIMB 41676。

长双歧杆菌可为经基因修饰的突变体或它可为其天然存在的变体。

优选地，长双歧杆菌菌株可为活菌的形式。

作为另外一种选择，长双歧杆菌可为非活体细胞的形式。

应当理解，本发明中的具体双歧杆菌菌株能以常规制备的口服形式用 于动物(包括人)，例如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、片剂、丸 剂、栓剂、悬浮物或者糖浆等。合适的制剂可利用常规的有机和无机添加剂 通过本领域常用方法制备。药物组合物中的活性组分的量可为达到治疗效果 的水平。

该制剂还包括细菌组分、药物实体或者生物化合物。

此外，包含本发明中菌株的疫苗可采用合适的已知方法准备，并且可 能含有药用载体或者辅料。

在整个说明书中术语突变体、变体和经基因修饰的突变体包括双歧杆 菌菌株，其基因特性和/或表型特性与亲本菌株相比发生改变。天然存在的 长双歧杆菌变体包括选择性分离的靶向特性的自发改变。通过常规(体外) 基因操纵技术如基因分裂、接合转移等完成亲本菌株特性的有意改变。基因 修饰包括将外来和/或内源DNA序列导入双歧杆菌菌株基因组，例如通过载 体插入细菌菌株基因组，所述载体包括质粒DNA或噬菌体。

天然或诱导的突变包括至少单个碱基的改变例如缺失、插入、颠换或 可引起所述DNA序列编码的氨基酸序列改变的其它DNA修饰。

术语突变体、变体和经基因修饰的突变体也包括已经发生基因改变的 双歧杆菌菌株，所述基因改变在基因组中积聚的速率与所有微生物的天然改 变一致，和/或通过自发突变和/或基因获取和/或基因丢失发生的基因改变， 其不是通过有意(体外)操纵基因组完成，而是通过变体和/或突变体的天 然选择完成，所述天然选择提供当暴露于环境压力如抗生素时在保持细菌存 活率方面的选择性优势。可通过有意地(体外)将特定基因插入到基因组中 制备突变体，其不会根本改变生物体的生物化学功能，但是其产物可用于细菌的鉴定或选择，例如抗生素抗性。

本领域的技术人员将认识到双歧杆菌菌株的突变体或变体能够通过与 亲本菌株的DNA序列同源性分析进行鉴定。双歧杆菌菌株具有与亲本菌株 相近的序列同一性，认为它们是突变体或变体菌株。可认为与亲本DNA序 列具有96％或更高的序列同一性(同源性)，例如97％或更高，或98％或 更高，或99％或更高的序列同一性的双歧杆菌菌株是突变体或变体。序列 同源性可使用在线同源性算法“BLAST”程序进行测定，其在 http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/上公开可用。

本专利亲本菌株的突变体也包括衍生的双歧杆菌菌株，其具有与亲本 菌株的16s-23s基因间隔区多核苷酸序列至少85％的序列同源性，例如至少 90％的序列同源性，或至少95％的序列同源性。这些突变体还可包含在细菌 基因组的其它DNA序列中的DNA突变。

附图简述

由以下描述将会更清楚地理解本发明，其仅参考附图以举例的方式给 出，其中：

图1为显示长双歧杆菌菌株AH1714通过胃肠道的转运的图。

图2为在刚果红琼脂平板上生长的长双歧杆菌菌株AH1714的照片。

图3为柱形图，其示出用长双歧杆菌菌株AH1714(Bifidobacterium 1714) 刺激后PBMC中的IL-10：IL-12p70比率。

图4为柱形图，其显示分离自AH1714和PBS饲喂小鼠的脾细胞的IL- 10诱导谱，其中所述小鼠在体内用1mg/kg LPS激发或未激发。体外细胞为 无刺激(A)，用LPS刺激(B)或用抗CD3/CD28刺激(C)。数据以平均值& SEM的形式呈现。

图5为柱形图，其显示分离自AH1714和PBS饲喂小鼠的脾细胞的 TNF-α诱导谱，其中所述小鼠在体内用1mg/kg LPS激发或未激发。体外细 胞为无刺激(A)或用抗CD3/CD28刺激(B)。数据以平均值&SEM的形式呈 现。

图6为柱形图，其显示分离自AH1714和PBS饲喂小鼠的脾细胞的 IFN-γ诱导谱，其中所述小鼠在体内用1mg/kg LPS激发或未激发。体外细胞 为无刺激(A)或用抗CD3/CD28刺激(B)。数据以平均值&SEM的形式呈现。

图7为柱形图，其显示分离自AH1714和PBS饲喂小鼠的脾细胞的IL- 12p70诱导谱，其中所述小鼠在体内用1mg/kg LPS激发或未激发。体外细 胞为无刺激(A)或用抗CD3/CD28刺激(B)。数据以平均值&SEM的形式呈 现；

图8为柱形图，其显示用1mg/kgLPS体内激发AH1714和PBS饲喂小 鼠2小时后的血清样品中的TNF-α(A)和IL-10(B)诱导谱。数据以&SEM的 形式呈现；

图9为柱形图，其显示分别用单剂量LPS 0.5mg/kg、安慰剂和1714-饲 喂刺激动物3小时后其分离的脾中的NFkB活性(光子/秒)(**指定p<0.01)；

图10为柱形图，(A)展示来自分别用单剂量LPS 0.5mg/kg、安慰剂和 1714-饲喂诱导刺激动物1.5小时后的整体成像NFkB活性(光子/秒)， ((B)和(C)为黑和白以及彩色的整体成像图片)；

图11为示意小鼠在6分钟测试后表现的不动状态时间的柱形图；

图12为第一天(获得)、第二天(记忆/消退)和第三天(消退)响应 恐惧刺激(背景)后的不动率的线状图；

图13为第一天(获得)、第二天(记忆/消退)和第三天(消退)响应 恐惧刺激9(信号)后的不动率的线状图；

图14为小鼠30分钟内埋珠数量的柱形图；

图15显示处理后小鼠的体温变化(ΔT)的柱形图；并且

图16为显示饮食诱导小鼠模型中受刺激的脾细胞的细胞因子水平变化 的柱形图。

发明详述

保藏长双歧杆菌菌株AH1714于2009年11月5日提交至National Collections ofIndustrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building，CraibstoneEstate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA，Scotland， UK，其被授予的保藏号为NCIMB41676。

保藏长双歧杆菌菌株UCC35624于1999年1月13号提交至National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland,UK， 其被授予的保藏号为NCIMB41003。

实施例

以下实施例进一步描述和证明了本发明范围内的实施方案。给出的这 些实施例仅仅是说明性的，不可理解为是对本发明的限制，因为在不脱离本 发明实质和范围的条件下可作出许多变型。

实施例1：长双歧杆菌AH1714的分离

长双歧杆菌菌株AH1714分离自健康人受试者的活检组织。

益生菌的筛选采用从结直肠癌检查中得到的大量人体胃肠道组织部 分。将人体胃肠道粘膜组织转移到装有磷酸盐缓冲液(PBS)(添加0.05％半胱 氨酸盐酸盐)的试管中。添加Triton X-100(0.05％)以释放组织样品中的 粘附微生物。然后培养组织样品10分钟。将样品漩涡振荡，然后通过选择 性琼脂(分别为De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)琼脂+万古霉素和Wilkins- Chalgren琼脂+莫匹罗星)平板接种分离自胃肠道组织的粘附乳酸杆菌和双 歧杆菌。从平板上分离克隆并重复划线三次以保证克隆的纯度。采用显微镜 检查、革兰氏染色、过氧化氢酶实验、果糖-6-磷酸磷酸转酮酶实验来检测 可能的双歧杆菌菌种，分离得到的菌株保存在40％甘油中放置于-20℃和- 80℃中。16S间隔区序列用于确定新分离的菌株身份。

分离到纯化的双歧杆菌菌株后(定为命名AH1714)检测相关微生物特 性，概括于下面表1。AH1714为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的多形态细 菌，且为果糖-6-磷酸磷酸转酮酶阳性，从而确定其为双歧杆菌属的身份。

表1：长双歧杆菌菌株AH1714的生理理化特征

菌株特征	长双歧杆菌菌株AH1714
		革兰氏染色	+
过氧化氢酶	-
		运动性	-
F6PPK*	+

进行16s-23s基因间隔区(IGS)测序以鉴定分离的双歧杆菌菌种。简 而言之，使用100μL提取液和25μL组织制备溶液(Sigma，XNAT2试剂 盒)从AH1714中分离DNA。样品在室温培养5分钟，随后95℃2小时， 然后加入100μl中和液(Sigma，XNAT2试剂盒)。基因组DNA溶液通过 Nanadrop分光光度计定量，然后保存于4℃。使用IGS引物进行PCR。所 用的引物对为：IGS R 5’-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3’(SEQ ID NO.4)和 IGS L 5’-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3’(SEQ ID NO.3)。PCR条件为94℃ 4分钟(1循环)，94℃45秒，53℃45秒，72℃45秒(28个循环)。PCR 反应体系为2μl(100ng)DNA，PCR mix(Sigma,Red Taq)，0.025nM IGS L和R引物(MWG Biotech，德国)。PCR使用Biotherma热循环仪。PCR 产物(10μl)与分子量标记(100bpLadder,Roche)一起在TAE中进行2％琼 脂糖EtBr染色凝胶电泳以测定IGS谱。使用PromegaWizard PCR纯化试剂 盒纯化双歧杆菌的PCR产物(单条带)。使用基因间隔区的引物序列(如 上所述)为纯化的PCR产物测序。然后用序列数据搜索NCBI核苷酸数据 库以通过核苷酸同源性确定菌株的同一性。所得DNA序列数据经NCBI标 准核苷酸-核苷酸同源性BLAST搜索引擎 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行处理。鉴定与序列最接近的匹 配，然后使用DNASTAR MegAlign软件进行序列比对。获得的序列(SEQ ID NO.1[IGS正向序列]和SEQ ID NO.2[IGS反向序列])在序列表中可见。 NCIMB数据库的搜索结果表明，AH1714具有与长双歧杆菌序列同源性最 接近的唯一IGS(SEQ ID NO.1[正向序列]和SEQ ID NO.2[反向序列])序 列。

为了获取AH1714的PCR条形编码，使用BOX引物进行PCR(8)。循 环条件为94℃7分钟(1循环)；94℃1分钟，53℃45秒，65℃8分 钟，(30个循环)和65℃16分钟。PCR反应体系含有50ng DNA、PCR mix(Sigma,Red Taq)和0.03nM BOXA1R引物(5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’)(SEQ ID NO.5)(MWG Biotech，德国)。PCR反应使用Biotherma热循环仪。PCR产物与分子量标 记(Roche,100bp ladder)一起在3％琼脂糖凝胶上电泳分离并照相。

抗生素敏感谱

长双歧杆菌菌株AH1714的抗生素敏感谱是通过药敏盘片实验测定的。 将培养物放在合适的培养基肉汤培养基中培养48小时，然后在琼脂平板上 涂板(100μl)。将含有一定已知浓度抗生素的盘片置于琼脂平板上。37℃厌氧 培养培养1-2天后，测菌株的抗生素敏感性。

表2：抗生素抗性

R＝抗性(区域直径≤14mm)

M＝中度敏感(区域直径15-19mm)

S＝敏感(区域直径≥20mm)

小肠转运

为了检测长双歧杆菌菌株AH1714是否可在相当于胃部环境的低pH值 下存活，从新鲜培养过夜的培养液中收集细菌菌体，用磷酸缓冲液(pH 6.5)洗涤两遍并重悬于pH调至2.5(用1M盐酸溶液)的TPY肉汤。在37℃ 下培养细胞，使用平板计数法检测5、30、60和120分钟时的存活情况。 AH1714在pH 2.5环境中5分钟内存活良好，然而在30分钟后无活细胞回收。

离开胃部后，推定这些益生菌暴露于小肠的胆汁盐之中。I为了检测长 双歧杆菌菌株AH1714是否能在胆汁中存活，将培养物在添加有0.3％ (w/v)，0.5％，1％，2％，5％，7.5％或者10％猪胆汁的TPY琼脂平板上 划线接种。在含有至多0.5％胆汁的平板上可观察到长双歧杆菌菌株AH1714 的生长。

表3：在猪胆汁存在下的AH1714的生长情况(重复结果)

+++＝生长极好～100％

++＝生长良好～66％

+＝生长不良～33％

-＝不生长～0％

在无菌小鼠模型中，评估长双歧杆菌菌株AH1714穿透胃肠道的能力。 小鼠每天摄入1×10⁹AH1714，并对粪粒中存在的摄入微生物进行检测。 AH1714的检测通过分离一个具有自发性利福平抗性的双歧杆菌菌株变种进 行(利用含利福平的RCA+半胱氨酸平板的方法进行评估，以确保只有饲喂 利福平抗性的双歧杆菌菌株被培养)。每天收集排泄物并确定穿透胃肠道的 长双歧杆菌菌株AH1714菌量(见图1)。

抗微生物活性

为了评估长双歧杆菌菌株AH1714的排斥指示培养物的抗微生物能力并 确定该抗微生物能力是否是由于其酸性产物，在MRS培养基(添加0.05％ 半胱氨酸盐酸盐)上培养AH1714生长过夜。取2μl AH1714培养物在琼脂 平板上点斑，培养24小时。指示微生物在TSB(大肠杆菌和沙门氏菌)、 布氏肉汤(空肠弯曲杆菌)和增强型梭菌培养基(RCM，艰难梭状芽胞杆 菌)分别培养。指示菌苔通过将过夜培养的指示培养物覆盖接种到过夜培养 的点斑益生菌琼脂平板上来制备(接种比例2％)。平板在37℃和指示菌株 合适的培养条件下培养，24-48小时后进行生长记录。大于1mm直径的区域 判断为对益生菌敏感。该检测实验同时在补充2％β-甘油磷酸作为缓冲剂培 养基上进行，该缓冲剂可以限制酸的产生带来的拮抗活性。

表4：AH1714的抗微生物活性

制备利福平(Rif^R)抗性的AH1714菌株

为了跟踪排泄物样品中的AH1714转运，分离了一个具有自发性利福平 抗性(rif+)的变种，方法如下：将新鲜的AH1714肉汤培养物(100μl每 板)涂到MRS+利福平+半胱氨酸平板上，其中利福平浓度最低，范围分别 为0.1％，0.08％，0.06％，0.04％，0.02％和0.002％。不含利福平的平板作为 阳性参照。两套平板均在37℃厌氧环境下培养48小时。在从利福平琼脂平 板上挑取一个克隆并划线接种到高一等级浓度的利福平平板上之前，评估分 析所移出的平板的纯度。此外，从一个MRS琼脂平板挑一个克隆到新的 MRS琼脂平板，两套平板都在厌氧、37℃培养48小时。所有浓度的利福平 平板都重复进行该操作。在生长好的含有50μg/ml利福平MRA琼脂平板上 挑一个单克隆，接种到20ml MRS肉汤中，该肉汤培养后用于保菌。变种的 识别通过微观显微观察、IGS序列分析和特异性PCR分析进行确定。

实施例2：刚果红琼脂筛选

使用刚果红琼脂筛选用于EPS表达细菌菌株的表型筛选。简而言之， 用细菌菌株的新生菌落无菌接种到10ml改良Rogosa肉汤培养基(+0.05％ 半胱氨酸)，并且在37℃厌氧培养至浑浊(约16至约24小时)。将肉汤 培养物无菌划线接种到刚果红琼脂平板上，并且在37℃厌氧培养48小时。 据信EPS作为某些菌株生长和/或代谢副产物而被生产出来，EPS阻止刚果 红染料的摄取，导致奶油状/白色的菌落形态。产生较少EPS的菌株容易吸 收刚果红染料，产生粉红色/红色的菌落形态。不生产EPS的菌株染上红 色，在红色琼脂背景中看上去几乎是透明的。

参考图2，长双歧杆菌菌株AH1714的菌落形态为凸的、粘液样、亮白 菌落。

实施例3：双歧杆菌菌株1714诱导显著升高的IL-10:IL-12比率。

使用BD Vacutainer CPT管(BD目录362761)，按照制造商的说明 书，从健康人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC并将其 重悬在Dulbecco's Modified EagleMedium-Glutamax^TM(Glutamax(谷氨酰胺 替代品)+丙酮酸+4.5g/l葡萄糖(Gibco目录号10569-010)10％胎牛血清 (Sigma目录号F4135)，和1％青霉素/链霉素(Sigma目录号P0781)中。 PBMC在(2×10⁵个细胞/孔)平底96孔板中培养，并且加入20μL细菌悬 浮液(浓度为1×10⁷CFU/mL)。PBMC和细菌在37℃/5％CO₂培养箱中共 培养48小时。培养2天后，300×g离心平板，将上清移出并冷冻保存于- 80℃以备分析。使用96孔测定试剂盒测定培养上清液中的白介素-10(IL- 10)和白介素-12p70(IL-12p70)水平，该试剂盒来自Meso ScaleDiscovery (Gaithersburg，MD；目录K15008B-1)

制备两种形式的细菌用于共培养实验。(a)新生细菌在Difco MRS培 养基中生长，在进入稳定期后收获。所有细胞在37℃在厌氧条件下生长。 (b)细菌在37℃厌氧条件下，在Difco MRS培养基中生长，并且在进入稳 定期后收获。这些细菌中的每一个生成冻干粉，并且在预等分的100mg小 瓶中储存在-80℃。在使用它们前，从冷冻机中取出每个菌株的一个等分试 样并恢复至室温。离心后，每一菌株用林格氏液洗涤三遍。每次试验都是用 新的小瓶。构建每一生长条件下的生长曲线(OD相对于活细胞数)，并且 在加入PBMC之前根据细胞数目归一化洗涤的细胞。所有实验也包括无细 菌对照。所有测定重复三次。结果如图3所示。

炎性疾病的调控在多个水平上进行。控制因子包括激素、前列腺素、 反应氧和氮中间体、白三烯和细胞因子。细胞因子是低分子量生物活性蛋 白，它们涉及免疫和炎性响应的产生和控制。许多类型的细胞产生这些细胞 因子，中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞是炎性反应中的主要来源，这是因 为它们在受伤位置大量存在。

在炎性位置生成的细胞因子存在多个机制影响炎性响应。趋化性刺激 炎性细胞聚集到受伤位置，而某些细胞因子促进细胞进入组织。在受伤组织 中释放的细胞因子导致炎性渗入的活化。大多数细胞因子是多效性的，表达 多个生物重叠活性。因为不受控制的炎性响应能够导致疾病如IBD，有合理 理由认为在个体中错误的细胞因子生产影响这些疾病。

白介素-10(IL-10)是一种抗炎细胞因子，它由多种类型的细胞生产， 包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨细胞和淋巴细胞(尤其是T调 节细胞)。IL-10下调抗原递呈细胞上的促炎Th1细胞因子、MHC II类抗 原、和共刺激分子的表达。它也促进B细胞的存活、增殖、和抗体生产。 这个细胞因子能够阻碍NF-κB活性，并且涉及JAK-STAT信号途径的调 控。小鼠基因敲除研究已经证明IL-10在免疫调节中的主要作用是作为IL- 10KO小鼠发育严重结肠炎。另外，作为IL-10的潜在诱导物的细菌显示会 促进体内调节性T细胞分化，从而对免疫稳态(7；8)产生影响。

白介素-12(IL-12)是与极化Th1效应子相关联的促炎细胞因子，T细 胞响应并刺激从T和天然杀伤(NK)细胞中生产其它促炎Th1细胞因子， 例如干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。高水平的IL-12表达 与自身免疫相关联。给药IL-12于患自身免疫疾病的病人证明恶化疾病症 状。与之相反，IL-12敲除小鼠或用IL-12中和抗体治疗小鼠可减轻疾病。

细胞因子级联和网络、而不是特定细胞因子对特定细胞类型的作用控 制炎性响应。两种细胞因子(如IL-10和IL-12)的表达相对水平、或平衡 比单个细胞因子的表达提供更多信息。在这些研究中，用不同细菌菌株刺激 人PBMC。所有菌株都诱导IL-10和IL-12的表达。然而，检测IL-10和IL- 12诱导的比例表明某些菌株诱导产生高比率(即，更多的IL-10和更少的 IL-12)，而其它的菌株则不能。这一观察结果是有意义的，因为它是这些 最终决定免疫结果的相反信号间的平衡。预期高IL-10:IL-12比率将促进与 合适的免疫调节活性相关联的抗炎响应，而低IL-10:IL-12比率将有助于免 疫响应的Th1极化。因此，PBMCIL-10:IL-12比率是鉴定具有免疫调节特性 的细菌菌株的重要选择标准。

实施例4在健康动物和败血症/炎症模型动物中长期喂食小鼠双歧杆菌菌株 AH1714可提高抗炎细胞因子IL-10水平，减少促炎Th1细胞因子TNF-α IFN-γ和IL-12。

材料和方法：

6-8周大Balb/c雌性小鼠来源于Harlan UK，并且分别饲养于独立的通 风笼中，并提供可自由采食的无菌标准鼠食和水。

相近体重的小鼠随机划分到2个小组中并通过每日口服填喂法给药 PBS(载体参照n＝9)和长双歧杆菌菌株AH1714(n＝17)，进行115天。 给药结束后，对10只AH1714小鼠和6只参照小鼠腹膜腔内注射1mg/kg LPS(Sigma,L4391)，然后采血取样。

给药结束后，分别对6只AH1714小鼠和4只参照小鼠采血取样，分离 出血清保存以备细胞因子检测。移出脾脏并在体外单细胞重悬培养。培养 48小时后检测细胞上清液中的细胞因子水平。

另外10只AH1714小鼠和6只参照小鼠通过腹膜腔内注射LPS(单次 剂量为1mg/kg)给药。2小时后采血取样并杀掉小鼠。血清和脾细胞如前所 述处理和分析。

脾细胞细胞因子检测实验

从脾脏分离脾细胞后，用分别含有参照培养基、LPS、或CD3/CD28抗 体的培养基在37℃培养48小时(培养基中含有青霉素和链霉素)。在培养 上清液中的细胞因子使用96孔测定试剂盒进行测定，所述试剂盒得自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD；目录K15008B-1)。对白细胞介素1β (IL-1b)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素8(IL-8)，白细胞介素10 (IL-10)，白细胞介素12p70(Il12p70)，γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死 因子α(TNFα)进行定量，报道单位为皮克每毫升(皮克/毫升)。

血清细胞因子测定实验

使用Meso Scale Discovery小鼠IL-10和TNF-α超敏试剂盒分析血清。

结果

在健康小鼠或者败血症/炎症模型小鼠(用LPS激发小鼠；参见图4(C)) 中，相对于安慰剂组(喂食PBS)，长期(115天)喂食双歧杆菌菌株AH1714 与小鼠体外PBMC刺激后的抗炎细胞因子IL-10水平提高相关。

在败血症/炎症模型(用LPS激发小鼠；参见图5(B)，图6(B)和图7 (B))中，相对于安慰剂组(喂食PBS)，长期(115天)用双歧杆菌菌株 AH1714饲喂小鼠会降低小鼠体外PBMC刺激后促炎的Th1因子TNF-αIFN- γ和IL-12(p70亚基)。

在败血症/炎症模型(用LPS激发小鼠；参见图8)中，相对于安慰剂 组(喂食PBS)，长期(115天)用双歧杆菌菌株AH1714饲喂小鼠与小鼠 血清中抗炎细胞因子IL-10水平提高以及促炎Th1因子TNF-α水平降低相关 (参见图8A&B))。

综上，这些结果表明长双歧杆菌菌株AH1714具有体内系统免疫调控和 抗炎活性，并防止LPS或者TLR-4介导的炎症应答反应。

实施例5：与双歧杆菌菌株AH35624不同，双歧杆菌AH1714在与人体免疫细胞体外 共孵培养后有免疫调控活性

材料和方法

采用PBMC细胞因子诱导测定实验检测长双歧杆菌婴儿菌株 UCC35624(B624)，两个独立的培养批次(1&2)和长双歧杆菌菌株AH1714。 制备以下形式的细菌用于共培养实验。细菌在厌氧条件、37℃、Difco MRS 培养基中培养，待其进入平台期立即收集。将收集的每种细菌分别冷冻干 燥，保存于-80℃，每管100mg分装。在使用它们前，从冷冻机中取出每个 菌株的一个等分试样并恢复至室温。每个菌株在10ml的ringer中洗涤3 次，然后进行离心。每次使用新的小瓶。

使用Petroff-Hausser计数室，按照制造商的说明书进行直接显微镜计 数，并且在将细胞加入PBMC测定之前，通过细胞数目进行洗涤细胞的归 一化。将细菌(20μl的磷酸盐缓冲液(PBS))加到PBMC的每个孔中以提 供每个实验指示的细菌总数。

PBMC(外周血单核细胞)细胞因子诱导测定

使用BD Vacutainer CPT管(BD目录362761)，按照制造商的说明 书，从健康人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC并将其 重悬在Dulbecco's Modified EagleMedium-Glutamax TM(Glutamax(谷氨酰 胺替代品)+丙酮酸+4.5g/L葡萄糖(Gibco目录10569-010)10％胎牛血清 (Sigma目录F4135)，以及1％青霉素/链霉素(Sigma目录P0781)中。PBMC在平底96孔板上培养(2×10⁵细胞/孔)并加入20μl细菌重悬液。还进 行无细菌对照。所有测定重复三次。在37℃培养2天后，将平板以300×g 旋转，并且移除上清液并冷藏在-80℃直至分析。PBMCs和细菌在37℃ /5％CO²培养箱中共培养48小时。培养2天后，300×g离心平板，移除上清 并保存于-80℃以备分析。在培养上清液中的细胞因子使用96孔测定试剂盒 进行测定，所述试剂盒得自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD；目录K15008B-1)。对人白细胞介素1β(IL-1b)，人白细胞介素6(IL-6)，人 白细胞介素8(IL-8)，人白细胞介素10(IL-10)，人类白细胞介素12p70 (Il12p70)，人干扰素-γ(IFN-γ)和人肿瘤坏死因子-α(TNFα)进行定量并 以皮克/毫升(pg/mL)报告。每个样品重复测两次。

结果

1.0E+07菌量下采用PBMC细胞因子诱导实验检测长双歧杆菌婴儿菌株 UCC35624(B624)，两个独立的培养批次(1&2)和AH1714的免疫调控活性。 检测上清一系列细胞因子，包括IL-1β,-6,-8,-10和-12,TNF-α和IFN-γ。

与35624相比(以及表现出一个相似模式的所有检测细胞因子的培养 物)，菌株1714在多数检测的细胞因子上表现为一个相似的模式。然而， 1714对IL-12、IFNγ和IL-6分别表现出不同的模式。

相比于35624，IL-6与1714在1.0×10⁷细菌/孔下共孵诱导了显著低水 平的IL(见表5)。

表5

菌株(1x10E7细菌)	IL-6(～pg/ml)
		35624	28,000
1714	16,000

相比于35624，IL-12与1714在1.0×10⁷细菌/孔下共孵诱导了显著低 水平的IL-12(见表6)。

与35624相比，INF-γ与1714在1.0×10⁷细菌/孔时共孵诱导了显著低 水平的INF-γ(见表6)。

表6

Foligne等人¹⁹，已经报道乳酸菌菌株可以在体外诱导提高抗炎细胞因 子IL-10水平并降低促炎细胞因子IL-12水平从而为体内结肠炎模型提供保 护机制；反之，菌株如果导致低IL-10/IL-12细胞因子比值则不能显著地减 轻结肠炎症状。体内保护的观察结果因不同菌株而异。双歧杆菌菌株 AH1714的细胞因子谱表明该菌株在体内溃疡性结肠炎模型中具有改善溃疡 性结肠炎的潜在功效。

IL-6是与IBS病理强烈相关的细胞因子。IL-6与很多疾病相关，例如糖 尿病、动脉粥样硬化、抑郁症、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮和类风湿性 关节炎。因此，研发治疗抗IL-6药剂作为上述多种疾病的治疗剂备受关 注。

实施例6在体内鼠败血症/炎症模型中，双歧杆菌菌株AH1714降低LPS-诱导的NFκB 活性。

材料和方法

C57BL/6J-CBA/J背景的NfkBlux转基因小鼠获赠于Charles River实验 室(Wilmington,USA)并于室内繁殖。小鼠在屏障隔离条件下饲养。

将双歧杆菌AH1714冷冻干燥粉末溶于水饲喂雌性动物，饲喂量大约为 1×10⁹cfu/天/动物，或者喂食相应的安慰剂。小鼠通过饮用水自由喂食共生 微生物20天后，进行LPS刺激。

在底物荧光素给药和用Xenogen IVSIS 100成像之后测NFκB活性。在 0.5mg/kgLPS单次剂量刺激前，测基准NFκB活性。3小时后，所有动物再 次成像。扣除基线读数后评估整体NFκB活性。

然后杀掉所有动物，移出脾脏、肝脏、小肠和结肠并放到培养皿中以 分别成像。

结果

在体内小鼠败血症/炎症模型中，相对于安慰剂饲喂组动物，1714饲喂 的实验组动物显示在LPS注射3小时后的脾脏NFκB活性降低(参见图9)，并且全身成像显示在LPS注射1.5小时后动物全身NFκB活性开始降 低(参见图10)，表明双歧杆菌菌株AH1714降低系统性LPS诱导的NFκB 活性。这些结果表明饲喂双歧杆菌菌株AH1714与降低的转录因子NFκB相关的系统性炎症水平相关。

实施例7：1714在抑郁和焦虑动物模型中显示积极效应

抑郁和焦虑是最常见的精神疾病，在社会上具有高发病率。焦虑症通 常分为惊恐症、广泛性焦虑症、创伤后障碍和强迫症。

现代抗抑郁药，如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(如氟西汀)和选择 性去甲肾上腺素和羟色胺再摄取抑制剂(如文拉法辛)被广泛用于治疗这些 疾病。然而，这些治疗不总是有效，也不受患者欢迎。因此，需要研发替代 方案。前面的实验数据表明益生菌婴儿双歧杆菌在啮齿动物中降低应激激素 肾上腺酮水平，这表明益生菌可能在上述病情中有效(9)。

本文在小鼠压力模型中观察双歧杆菌AH1714的行为效应，并与广泛使 用的抗焦虑和抑郁药SSRI，名称为依地普仑，进行对比。动物使用依地普 仑或者AH1714处理三周。

材料和方法

悬尾实验

悬尾实验是评估抑郁样和抗抑郁样的经典实验。用胶带将小鼠尾巴 (距离尾巴尖端2cm)粘到水平环架上(距离地面30cm)，使小鼠个体倒 悬。通常情况下，小鼠会有多种逃跑倾向的行为并伴随有越来越多的不动时 间。每组实验进行6分钟，并录像记录。录像由不知实验处理的受训人员进 行评分。记录的数据为小鼠不动时间(秒数)。

条件恐惧实验

条件恐惧实验广泛应用于评估焦虑症的认知成分。我们采用了一个三 天的实验方案，以观察环境相关恐惧和信号相关恐惧学习。将小鼠放置于环 境背景中3分钟后，然后给予6组20秒钟的特定信号(音调10KHz，70dB 声音结合仪器灯光)，同时在最后给予2秒钟的轻度电击(0.4mA)，然后 放置于环境背景1分钟。这过程在后续两天内分别重复，但不给予电击，然 后观察背景或者信号下的不动行为。第一天评估不同背景强度或信号诱导条件恐惧下的干预能力，而第三天则可以观察检测恐惧学习的记忆消退。记忆 消退是指形成新的记忆，促进记忆消退的药物可用于创伤后精神障碍的治 疗。

埋珠实验(The marble-buryingtest)

这是检测强迫症的一个实验模型。越是焦虑的小鼠越有积极性行为 (防御性埋大理石珠)以避免光暗盒和高架迷宫中的焦虑性刺激。小鼠分别 放置在小笼中，笼内铺有5cm深的锯屑，其上均等地分布着20颗大理石珠 子，笼顶为丝盖。将小鼠不受干扰地放置于笼中30分钟，然后统计被埋的 大理石珠数目(其中有大概四分之三埋到锯屑下)。

结果

在悬尾实验中AH1714给出的正面结果表明它可能具有抗抑郁活性。参 考图11，相对于对照(Veh)组，AH1714诱导降低不动时间表明1714-喂食动 物的类抑郁行为减少。这与传统抗抑郁药如效果类似。

在条件恐惧实验中，认知组数据表明用AH1714处理的实验动物具有积 极的学习效果。参考图12，在背景(主要是海马和杏仁核依赖的记忆)恐 惧实验中，1714诱导组相对于Veh组提高了第1天和第2天的静止时间， 在第三天相对于对照组仍有相同的静止时间比例，这暗示1714提高了背景 依赖的恐惧学习和记忆且对记忆消退没影响，表明1714在恐惧事件的背景 记忆中有正面效果。参考图13，在信号(杏仁核依赖记忆)恐惧实验中， 相对于对照组，对于恐惧信号(刺激)1714诱导组在第一天提高了静止时间， 在第二、三天时相对对照组仍具有相同的静止比例。这表明1714提高了杏 仁核依赖(信号)恐惧学习和记忆，且对记忆和记忆消退没影响，这表明在 不依赖于背景的恐惧刺激记忆中有正面效果。

埋珠实验则显示它在强迫症中可能有正面效果。埋珠实验中，1714处 理小鼠所埋的珠子更少，这表明1714饲喂小鼠较不焦虑并且表明在强迫症 中可能有正面效果(图14)。跟依地普仑类似，AH1714降低了处理中的压 力诱导的体温升高值(降低压力诱导体温下降)，这表明在1714饲喂小鼠 中更低的焦虑。是否干预下的实验结果则是没有区别。

结论

在抑郁及焦虑动物模型中，AH1714与传统抗抑郁药物表现方式类似。 观察到的效果与文献上报道的抗抑郁药如SSRIs类似。

总而言之，这些数据表明AH1714可对治疗精神抑郁和焦虑综合症中具 有有益效果。

实施例8:1714在饮食诱导性肥胖症中对炎症标记物显示正面效果

近几年，已经证明肥胖与低度炎症相关联，低度炎症导致促进肥胖相 关的疾病，其包括2型糖尿病(T2D)、心血管疾病(CVD)、高血压、高 胆固醇血症、高甘油三脂血症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。内脏脂肪 会产生一系列的炎症因子和趋化因子(如瘦素、肿瘤坏死因子(TNF-α)、巨 噬细胞化学诱导蛋白1和白介素6等等)，其产生可在肥胖状态下导致病理性失调(Shoelson等人综述，2007)。事实上，一般认为巨噬细胞在胰岛素 抗性上有重要作用，其它研究表明利用细胞的抗炎特征与潜在的调控型细胞 可具有潜在的医疗价值。最近的研究表明T_reg细胞可降低脂肪组织中的炎症 状态和小鼠中的胰岛素抗性(Feurer等人，2009)。此外，一个开创性工作 证明胃肠道微生物异常作为肥胖症相关代谢失调的推动力，这表明对目标肠 道健康的干扰对于肥胖相关的代谢失调具有有益健康效果。这表明肠道微生 物可能参与到肥胖相关的能量平衡调控、胰岛素抗性、非酒精性脂肪肝疾病 和能量、脂肪和氨基酸的代谢(综述Ley等人，2009)。

选择饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠模型作为评估所选择的益生菌在肥胖和 代谢健康中的作用，并观察肥胖与炎症标记物之间的关系。DIO小鼠模型是 指喂食高脂肪食物以使其肥胖的健康小鼠。

实验设计

对7周大C57BL/J6公鼠分别喂食低脂肪食物(10％卡路里来自脂肪； ResearchDiets,New Jersey；#D12450B)，高热量食物(DIO；45％卡路里来 自脂肪；Research Diets,New Jersey；#D12451)或者高热量食物，并在饮水 中加入AH1714(1×10⁹cfu/天)，养14周。所有小鼠以5只每组安置并每日 饲喂新鲜的定量益生菌。每周评估一次体重和食物摄入。在第14周末期， 杀掉小鼠移出内脏，称重并保存于-80℃。取出脾脏，并按例子4检测脾细胞的细胞因子。

结果

如预期一致，与体重减轻参照组相比，DIO小鼠在14周饲喂时期内获 取了显著更多的脂肪量(p<0.001)。在14周的累积性卡路里摄入测量中，相 对于体重减轻参照组小鼠，DIO小鼠消耗了显著更多的能量(p<0.001)，这与 以前的研究一致。在DIO小鼠的LPS刺激脾细胞实验(先天免疫刺激) 中，AH1714具有降低TNFα和IL-12细胞因子对LPS应答的效应(图16)。在CD3/CD28刺激脾细胞实验(后天免疫刺激)中，AH1714处理具 有降低IL6细胞因子响应的效果。这些结果表明在DIO小鼠模型中具有系 统性抗炎效应，这与其它实施例的PBMS数据或者活体小鼠模型结果一 致。

免疫调控

人体免疫系统在众多人类疾病的病因和病理中有非常重要的作用。超 免疫或者低免疫应答效应导致或作为其中一部分因素导致大部分疾病。一个 生物物质家族(称为细胞因子)在免疫过程的调控中起到重要的作用。对这 些精细的细胞因子细网络的干扰越来越多地与许多疾病相关。这疾病包括但 不限于：炎症性疾病，免疫缺陷，炎性肠病，肠易激综合征，癌症(尤其是 胃肠道和免疫系统的癌症)，腹泻病，抗生素相关性腹泻，小儿腹泻，阑尾 炎，自身免疫性疾病，多发性硬化症，阿尔茨海默病，类风湿性关节炎，腹 腔疾病，糖尿病，器官移植，细菌感染，病毒感染，真菌感染，牙周病，泌 尿生殖系统疾病，性传播疾病，HIV感染，HIV复制，HIV相关性腹泻，手 术相关的创伤，手术引起的转移性疾病，败血症，体重下降，厌食，发烧控 制，恶病质，伤口愈合，溃疡，肠屏障功能，过敏，哮喘，呼吸系统疾病，循环系统疾病，冠状动脉心脏疾病，贫血，凝血系统的疾病，肾脏疾病，中 枢神经系统病症，肝脏疾病，缺血，营养失调，骨质疏松症，内分泌失调， 表皮疾病，牛皮癣，寻常痤疮。

对每种益生菌株对细胞因子产生的特异性影响进行检测。因此可筛选 到特定的益生菌菌株以恢复特定疾病类型导致的细胞因子失衡。利用单一的 AH1714菌株或其突变体或它们的变种或者它们的组合可完成疾病特定治疗 的个性化治疗方案。

免疫教育

肠道菌群对于小肠免疫系统的发育与正常功能非常重要。正如无菌动 物模型所显示的，缺失肠道菌群后小肠的免疫系统不能发育，并且某些功能 指标丧失，例如巨噬细胞的吞噬功能和免疫球蛋白的产生(10)。肠道菌群 在刺激非致病免疫应答反应中的重要性越来越明显。西方国家过敏疾病的发 病率和严重程度的增长与卫生和环境卫生的增长相关，同时伴随着降低宿主 所能遇到的病原挑战的种类与数量。缺失免疫刺激可能导致宿主对非致病抗 原产生反应，从而导致过敏以及自身免疫病。适当的有意摄入一系列非致病免疫调控细菌能够提供给宿主以必要的和合适的学习性刺激以促进免疫功能 的正常发育与调控。

炎症

炎症一词用于描述经受物理伤害、感染或其部位存在持续免疫应答时 相应局部部位发生体液、血浆蛋白和白细胞聚集的现象。炎性应答的调控在 多个水平上进行(11)。调控因子包括细胞因子、激素(氢化可的松)、前列 腺素、活性中间体和白三烯。细胞因子是低分子量生物活性蛋白，其参与免 疫和炎性应答的产生与调控，并且还参与调控发育、组织修复和造血。它们 提供了白细胞自身以及与其它细胞类型间的通讯手段。大多数细胞因子是多 效性的并且表达多个生物重叠活性。细胞因子级联及其网络调控炎症应答， 而不是由特定细胞类型上的特定细胞因子来调控(12)。减弱炎症应答水平 会导致低浓度的相应激活信号和其它炎症介质，从而导致炎症应答停止。 TNFα是一个关键的促炎细胞因子，原因在于它激活细胞因子的级联反应以 及导致炎症状态的生物学效应。因此，抑制TNFα的药剂例如英夫利昔 (infliximab)现在通常被用来治疗炎症。

一般认为促炎细胞因子在包括炎性肠病(IBD)在内的众多炎性疾病致 病病理中具有重要作用。目前治疗IBD的方案旨在降低这些促炎细胞因子 的水平，所述促炎细胞因子包括IL-8和TNFα。这些治疗方案也可在系统性 炎性疾病如类风湿性关节炎的治疗中具有重要作用。

本发明中的菌株在治疗一系列的炎性疾病中可能有潜在的应用，尤其 是与其它抗炎治疗方法如非甾体化合物消炎药(NSAIDs)或者英夫利昔 (Infliximab)结合。

在体内

细胞因子和癌症在一系列的肿瘤类型中都伴随着多功能细胞因子的产 生，表明在癌症患者体内持续发生着显著的炎症应答反应。现在还不清楚体 内这些炎症反应的何种保护效应抑制肿瘤细胞生长和发育。然而，这些炎症 应答反应可能严重影响携瘤宿主。肿瘤或者正常组织的细胞因子产生以及细 胞增殖涉及到复杂的细胞因子间的相互作用(13,14)。长期以来，人们认 为体重减低(恶病质)是癌症患者的主要常见死因，而初始的营养不良则预 示病情的恶化。肿瘤的生长和扩散会诱导新血管的形成并降解细胞外基质。炎症应答反应可能在上述机制中起到重要作用，从而导致宿主的衰弱以及肿 瘤的发展。由于婴儿长双歧杆菌菌株的抗炎特征，这些菌株可降低恶性细胞 的转移率。此外，肠道细菌可从食物中生产具有基因毒性、致癌性和促肿瘤 活性物质，并且肠道细菌能够将促致癌物质激活为DNA反应活性物质 (15)。一般来说，与肠道内其它菌种例如类杆菌属、真细菌和梭菌属相 比，双歧杆菌具有较低的外源性代谢酶活性。因此，提高肠道内的双歧杆菌 数目可有益于调控这些酶的水平。

疫苗和药物递送

大多数致病生物都是从粘膜表面进入体内。在这些部位进行有效的疫 苗接种能够防止某些传染原的入侵。到目前为止，口服疫苗方案主要集中在 减活病原生物或者纯化后的胶囊封装抗原(16)。工程改造的益生菌在体内 产生某些传染原的抗原可提供很有吸引力的替代方案，因为这些菌在人体内 服用通常被认为是安全的(GRAS状态)。

小鼠研究表明摄入表达外源抗原的益生菌能引起保护性免疫应激。在 乳酸乳球菌中外源基因编码表达破伤风毒素片段(TTFC)并且小鼠通过口 服途径获得免疫。这套系统能够诱导显著足够量的抗体滴度从而保护小鼠能 够免死于致死毒素。除了抗原递呈，活菌载体能够在体内生产生物活性化合 物，例如免疫调控细胞因子。乳酸乳球菌分泌的生物活性的人IL-2或者IL- 6和TTFC，在小鼠滴鼻免疫实验中诱导血清IgG滴度提高10-15倍(17)。然而，对于这个菌株，IgA总量并不会随着这些细胞因子的共表达 而增加。其它菌株，如格氏链球菌(Streptococcus gordonii)，也检测类其作为 粘膜疫苗的可行性。重组格氏链球菌定植于小鼠口腔和阴道腔中，诱导两个 地方的粘膜与系统抗体对该菌表达的抗原产生抗体反应(18)。因此，利用 益生菌作为载体的口服免疫不仅能够保护宿主免于感染，也能置换经常致病 的病原体的免疫刺激，这些免疫应激对于宿主的免疫学习有用。

益生元

通过合适载体中的微生物摄取可引入益生微生物。这在提供介质以促 进大肠中益生菌株的生长方面是有利的。添加一种或者多种低聚糖、多糖或 者其它益生元可提高胃肠道内乳酸菌的生长速度。益生元是指可由结肠内任 何由有益内源细菌(例如双歧杆菌、乳酸杆菌)发酵的任何非活体食物组 分。益生元的类型可包括含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖 的那些。将益生菌菌株与一种或多种益生元化合物组合给药可提高体内服用 的益生菌的生长速度，从而获得更明显的健康效益，这称为合生素。

其它活性组分

应当理解，所述菌株可以预防性给药，或者作为可单独给药，也可与 如前所述的其它益生菌和/或益生元一起给药的治疗方法。另外，该菌株可 以作为使用其它活性物质的预防和/或治疗方法的一部分，所述活性物质是 例如用于治疗炎症以及其它疾病，尤其是免疫相关疾病的那些。这些组合可 以在单个制剂中给药或者在相同或者不同的时间作为独立的制剂给药，且可 利用相同或者不同的途径给药。

本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相 反，除非另外指明，每个这样的量纲是指所引用的数值和围绕该数值的功能 上等同的范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。

在发明详述中引用的所有文献都在相关部分中以引用方式并入本文 中；对任何文献的引用不应被解释为承认其是关于本发明的现有技术。当本 发明中的术语的任何含义或定义与引入以供参考的文件中术语的任何含义或 定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术 人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多 其它的改变和变型。因此，所附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有 这些改变和变型。

参考文献

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22.Ley RE.Obesity and the human microbiome.Curr Opin Gastroenterol.(2010)1,5-11。

序列表

<110> Alimentary Health Limited

<120> 益生菌双歧杆菌菌株

<130> ALIM45/C/WO

<150> US 12/616,752

<151> 2009-11-11

<150> US 61/344,030

<151> 2010-05-11

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.3

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n 为 a, c, g 或 t

<400> 1

ttctccgagg tgtgcgcccc gcgcgtcgca tggtgcgatg gcggcggngt tgctggtgtg 60

gaagacgtcg ttggctttgc cctgccggtc gtgcggtggg tgcggggtgg tatggatgcg 120

cttttgggct cccggatcgc caccccaggc tttttgcctg gcgcgattcg atgcccgtcg 180

tgcctggggg ccggccgtgt gccggcgcga tggcgtggcg gtgcgtggtg gcttgagaac 240

tggatagtgg acgcgagcaa aacaagagtt tttgaatctt tgttttgctg ttgatttcga 300

atcgaactct attgttcgtt tcgatcgttt tgtgatcatt tttagtgtga tgatttgtcg 360

tctgggaatt tgctagagga atcttgcggc catgcacttt cgtggtgtgt gttgcttgca 420

agggcgtatg gtggatgcct tgacaccaga 450

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n 为 a, c, g 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> n 为 a, c, g 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (454)..(454)

<223> n 为 a, c, g 或 t

<400> 2

cacacacacc cacgnaagtg tcatggcccg caagtatttc ctctagcaaa ttcccagnac 60

gacaaatcat cacactaaaa atgatcacaa aacgatcgaa acgaacaata gagttcgatt 120

cgaaatcaac agcaaaacaa agattcaaaa actcttgttt tgctcgcgtc cactatccag 180

ttctcaagcc accacgcacc gccacgccat cgcgccggca cacggccggc ccccaggcac 240

gacgggcatc gaatcgcgcc aggcaaaaag cctggggtgg cgatccggga gcccaaaagc 300

gcatccatac caccccgcac ccaccgcacg accggcaggg caaagccaac gacgtcttcc 360

acaccagcaa ccccgccgcc atcgcaccat gcgacgcgcg gggcgcacac cgtcggacga 420

acatccgact gaattctccg tagaaaggag gtgntcccag ca 462

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

gctggatcac ctcctttct 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

ctggtgccaa ggcatcca 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

ctacggcaag gcgacgctga eg 22

<210> 6

<211> 493

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<400> 6

tgctgggatc acctcctttc tacggagaat teagteggat gttegtcega cggtgtgcgc 60

cccgcgcgtc gcatggtgcg atggcggcgg ggttgctggt gtggaagacg tcgttggctt 120

tgccctgccg gtcgtgcggt gggtgcgggg tggtatggat gcgcttttgg gctcccggat 180

cgccacccca ggctttttgc ctggcgcgat tcgatgcccg tcgtgcctgg gggccggccg 240

tgtgccggcg cgatggcgtg gcggtgcgtg gtggcttgag aactggatag tggacgcgag 300

caaaacaaga gtttttgaat ctttgttttg ctgttgattt cgaatcgaac tctattgttc 360

gtttcgatcg ttttgtgatc atttttagtg tgatgatttg tcgtctggga atttgctaga 420

ggaatcttgc ggccatgcac tttcgtggtg tgtgttgctt gcaagggcgt atggtggatg 480

ccttgacacc aga 493

Claims (17)

1.一种分离的双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株NCIMB 41676。

2.如权利要求1所述的双歧杆菌菌株，所述双歧杆菌菌株以活体细胞的形式存在。

3.如权利要求1所述的双歧杆菌菌株，所述双歧杆菌菌株以非活体细胞的形式存在。

4.如权利要求1-3中的任一项所述的双歧杆菌菌株，其中所述双歧杆菌分离自健康人受试者的结肠活检组织。

5.如权利要求1-4中的任一项所述的双歧杆菌菌株，其中所述菌株口服后在人体中具有显著的免疫调节功能。

6.一种制剂，所述制剂包含如权利要求1-5中的任一项所述的双歧杆菌菌株。

7.如权利要求6所述的制剂，所述制剂还包含益生菌材料。

8.如权利要求6或7所述的制剂，所述制剂还包含益生元材料。

9.如权利要求6-8中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含可摄取的载体。

10.如权利要求9所述的制剂，其中所述可摄取的载体为药用载体，例如胶囊、片剂或者粉剂。

11.如权利要求9所述的制剂，其中所述可摄取的载体为食品，例如发酵乳、酸乳酪、冷冻酸乳酪、奶粉、浓缩奶、涂抹干酪、调料或者饮料。

12.如权利要求6-11中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含蛋白质和/或肽，尤其是富含谷氨酰胺/谷氨酸、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或痕量元素的蛋白质和/或肽。

13.如权利要求6-12中的任一项所述的制剂，其中所述双歧杆菌菌株以大于10⁶cfu/克所述制剂的量存在。

14.如权利要求6-13中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含辅剂。

15.如权利要求6-14中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含细菌组分。

16.如权利要求6-15中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含药物实体。

17.如权利要求6-16中的任一项所述的制剂，所述制剂还包含生物化合物。