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CN110964656B - 一种可预防骨质疏松的乳双歧杆菌bl-99及其应用 - Google Patents

一种可预防骨质疏松的乳双歧杆菌bl-99及其应用 Download PDF

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CN110964656B CN201811161107.9A CN201811161107A CN110964656B CN 110964656 B CN110964656 B CN 110964656B CN 201811161107 A CN201811161107 A CN 201811161107A CN 110964656 B CN110964656 B CN 110964656B
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Abstract

本发明提供了一种可预防骨质疏松的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的乳双歧杆菌具有耐胃酸和耐肠液性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在pH6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。该菌能显著降低雌激素缺乏引起的骨量的丢失；提升血钙和血磷；抑制体内破骨细胞的数量，抑制其对骨的吸收作用；并能通过促进骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白，提高蛋白的水平从而来促进新骨的形成。本发明的菌株可以用于制备食品等，具有广泛的应用前景。

Description

一种可预防骨质疏松的乳双歧杆菌BL-99及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株具有预防骨质疏松、提高血液的钙离子和/或磷离子等功效的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
背景技术
骨质疏松症是以骨量减少，骨的微细结构破坏为特征的一种全身性代谢性的骨骼疾病。其表现为骨脆性增加，易诱发骨折。目前全球约2亿人口患有骨质疏松。由于骨质疏松症引起的髋部骨折的发病率在全世界都在增加，老年人群大部分受到骨折风险的影响。在世界范围内统计每年残疾总数为580万。这一数字中有51％是因骨折而引起的，主要发生在欧洲和美洲。因此，在发达国家，骨质疏松性骨折被认为是死亡率和发病率的重要原因。最常见的骨质疏松症类型是与50岁及以上的女性的绝经后有关。50岁以上的老人中，1/3的女性和1/5的男性会受到骨质疏松的威胁。中国卫生部2002年至2005年的调查结果显示，骨质疏松症患病率为8.8％，名列中国居民慢性病患病率的第三位。
骨质疏松的治疗药物一般通过注射激素、补充钙制剂、抗骨吸收药等药物。长期服用药物或激素，会对机体产生明显的副作用。
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)已经有报道有各种健康功效如免疫调节和肠道健康等。然而，经查，鲜有关于乳双歧杆菌用于治疗和/或预防骨质疏松的技术报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的乳双歧杆菌及其用途。
一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，本发明的乳双歧杆菌单菌即能用于治疗或预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子等功效。
不抗酸、不耐受胃肠液是双歧杆菌属的普遍性能，这将导致双歧杆菌很难通过胃液到达肠道并在肠道中定殖。而本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，其具有耐胃酸和耐肠液性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在pH6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。
本发明中将所提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)命名为BL-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
本发明的研究发现，本发明的乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)可以用于治疗或预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子浓度，具体包括：(1)显著降低雌激素缺乏引起的骨量的丢失；(2)提升血钙和血磷浓度；(3)通过调节OPG/RANKL的比例，来抑制体内破骨细胞的数量，抑制其对骨的吸收作用；(4)通过促进骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白，如碱性磷酸酶和骨钙素的表达，提高其蛋白的水平从而来促进新骨的形成。
本发明的乳双歧杆菌BL-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如TPY培养基、BBL培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。本发明同时提供了一种乳双歧杆菌BL-99菌制剂的制作方法，其是将所述的菌株在液态发酵培养基中厌氧培养，获得包含菌体的发酵液。发酵液可直接或进一步浓缩后作为液态菌制剂，也可将发酵液干燥后制备菌粉，或是从发酵液中分离出菌体制备菌粉。本发明的液态菌制剂也可以是将菌体重悬于培养液、缓冲液或去离子水等溶剂后的液态制剂。本发明的BL-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)在保藏期具有较好的稳定性。所述的菌制剂可以用于食品、饲料或药品的生产。由于本发明的乳双歧杆菌BL-99具有良好的耐受胃肠液性能，其将能够通过胃液到达肠道并在肠道中定殖。
从而，另一方面，本发明还提供了一种乳双歧杆菌菌制剂，该菌制剂中含有本发明所述的乳双歧杆菌，为固态或液态菌制剂。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于防治骨质疏松的组合物中的应用，所述组合物包括饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于降低雌激素缺乏引起的骨量的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于提升血钙和/或血磷的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于抑制体内破骨细胞数量的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于促进骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。具体地，所述骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白包括碱性磷酸酶和/或骨钙素等。
本发明的组合物可使用于动物或是人类。所述组合物还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药物组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产，所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊、液体制剂等。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了一种食品，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂；优选地，所述食品为发酵乳制品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、乳酪、含乳饮料、固体饮料或乳粉。食品的具体配方和生产方法可参照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行。
在本发明的另一些具体实施方案中，本发明还提供了一种药物，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂。药物的具体配方和生产方法可参照现有技术中含乳双歧杆菌的药物进行。
在本发明的另一些具体实施方案中，本发明还提供了一种饲料，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂。饲料的具体配方和生产方法可参照现有技术中含益生菌的饲料进行，本发明的乳双歧杆菌或菌制剂作为益生菌补充剂添加即可。
优选地，在所述食品、药物或饲料中，乳双歧杆菌BL-99供动物或人类使用的建议剂量可为1.0×103CFU～1.0×1010CFU/kg体重/天。本发明的药物或饲料，因包含所述的乳双歧杆菌BL-99而具有相应的防治骨质疏松的功效。
综上所述，本发明提供了一种乳双歧杆菌BL-99，其保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌，该乳双歧杆菌具有耐胃酸和耐肠液性能，该菌可用于食品、饲料或医药用途，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1A显示实施例2中乳双歧杆菌BL-99干预前后动物的体重变化。
图1B显示实施例2中乳双歧杆菌BL-99干预前后动物子宫重量变化。
图2A显示实施例3中HE染色结果。
图2B显示实施例3中乳双歧杆菌BL-99干预前后骨小梁面积百分率的变化。
图3A显示实施例3中胫骨TRAP染色结果。
图3B显示实施例3中乳双歧杆菌BL-99干预前后破骨细胞占骨表面百分比(OcS/BS)的变化。
图4A-图4D分别显示乳双歧杆菌BL-99干预后血钙、血磷、血清骨钙素、I-型胶原C端肽变化。
图5A-图5E显示乳双歧杆菌BL-99干预对调节骨代谢相关基因的影响。
图6为本发明一具体实施例中的发酵工艺流程示意图。
专利程序的微生物保存：
本发明的乳双歧杆菌BL-99：
保藏日期：2018年04月26日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏编号：CGMCC No.15650；
分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。
本发明的各实施例中，实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-way ANOVA跟随Tukery’smultiple comparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。
实施例1：乳双歧杆菌BL-99及其性能测定
本发明的乳双歧杆菌BL-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
1.乳双歧杆菌BL-99的分类学特征
理化试验结果：
Figure GDA0003022332100000051
16S rRNA基因序列测序结果(SEQ ID No.1)：
GCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACT
2.乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性
双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌
Figure GDA0003022332100000061
作为对比。
测试方法：将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。
将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。
菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率检测结果如表1所示，BB-12在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。
表1、菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率
Figure GDA0003022332100000071
菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，BB-12在人工小肠液(pH6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。
表2、菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率
Figure GDA0003022332100000072
3.乳双歧杆菌BL-99的的毒力实验及安全性检测
将本发明的乳双歧杆菌BL-99接种于BBL液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌BL-99活菌数为3.7×108cfu/mL，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0mL/kg BW给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌BL-99的BBL培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
采用SN/T 1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌BL-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌BL-99对氨苄西林Ampicillin、青霉素G PenicillinG、红霉素Erythromycin、氯霉素Chloramphenicol、克林霉素Clindamycin、万古霉素Vancomycin和四环素Tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(EuropeanFood Safety Authority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌BL-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。
实施例2：去卵巢大鼠动物模型和益生菌干预
将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后冷冻干燥，-18℃以下保存。用于本发明实施例2-实施例5的实验研究。
17周龄雌性成年SD大鼠85只，体重200-300g。大鼠随机分成3组，每组10只。20只大鼠进行去卵巢手术，剩余10只大鼠进行假手术。大鼠每天12h光照/黑暗，室温在25℃左右，自由饮水。术干预12周后，处死模型考察组动物，收集子宫、股骨、胫骨等样品，并测定子宫系数、骨微观结构形态、骨结构模型参数等骨质疏松相关指标。
术后动物休息两周后开始灌胃给予受试物，疗程为每天给药一次，连续12周。去卵巢大鼠喂食BL-99益生菌，假手术组和去卵巢空白对照组喂食蒸馏水；动物具体给药情况如下：
动物具体分组情况如下：
编号 组别 动物数(只) 益生菌剂量
1 假手术空白对照组(假手术) 10 空白溶剂
2 去卵巢空白对照组(OVX) 10 空白溶剂
3 去卵巢+益生菌BL-99 10 10<sup>9</sup>CFU/mL
动物在干预前后的体重变化见图1A。模型建立成功后，假手术假手术组的体重明显低于其他各去卵巢组，这与绝经后女性的体重明显增加相一致。各干预组在12周干预期间体重都有了一定程度的增加。去卵巢空白组与去卵巢+益生菌BL-99干预组比较体重在干预前后无显著差异。
12周干预后，处死动物，收集、称量并记录子宫的重量，计算子宫系数(即子宫重量与体重的比值)。实验结果(图1B)显示，去卵巢OVX组与假手术假手术组的子宫系数有极其显著的差异(P<0.001vs.假手术)，说明去卵巢后，随着体内雌激素的减少，子宫显著的萎缩。而去卵巢空白组和去卵巢+益生菌BL-99干预组对子宫的重量均无影响，说明其无雌激素样副作用。
实施例3：骨组织形态计量学测定
取左侧胫骨近端1/3处，沿矢状面纵向切开，取材约1×0.5×0.5cm3，在脱钙液10％EDTA/PBS(pH7.4)中浸泡至完全脱钙，约1周左右，每3天换液一次，然后常规脱水，石蜡包埋，沿矢状面(厚度4μm)，HE染色，用病理图像分析仪可测定总组织面积、骨小梁面积、骨小梁总周长，再用计算公式换算出骨小梁面积百分率、骨小梁数目、骨小梁厚度和骨小梁分离度。骨组织切片还观察骨小梁外观、排列及形态结构完整性等情况.
益生菌BL-99干预12周以后，HE染色结果(图2A)，假手术组骨小梁排列紧密,结构完整；而OVX空白组骨小梁排列松散稀疏，结构不完整，与假手术组比，骨小梁面积百分比显著减低(P<0.001vs.假手术)。而与OVX空白组相比较，益生菌BL-99组能增加骨小梁面积百分比约12.5％(OVX：16.8±2.5％，OVX+BL-99:18.9±1.8)(P<0.05vs.OVX)(图2B)，提示益生菌BL-99能抑制由雌激素缺乏导致的骨丢失，对骨有一定的保护作用。
破骨细胞是体内负责骨吸收的主要细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用。破骨细胞来源于单核－巨噬细胞系统，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过细胞融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞与成骨细胞在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase，TRAP)是破骨细胞主要标志之一。胫骨TRAP染色结果如图3A所示，染色阳性结果为定位于破骨细胞胞浆被染成酒红色。OVX空白组的大鼠胫骨表面TRAP染色的破骨细胞数目显著高于假手术组大鼠。与OVX空白组大鼠相比较，益生菌BL-99组TRAP染色破骨细胞的数量出现显著降低约17.9％(OVX：22.3±1.1％，OVX+BL-99:18.3±0.6)(P<0.05vs.OVX)。在体内雌激素能抑制破骨细胞的活性，同时诱导破骨细胞的凋亡进而发挥抗骨吸收作。在OVX的动物中，由于雌激素的水平明显低下，导致其对破骨细胞的抑制作用缺失，破骨细胞的数量和骨吸收的能力明显增加(图3B)，最终的后果就是松质骨骨量的明显减少。而从图2A、图2B和图3A、图3B的结果提示BL-99干预能抑制OVX引起的骨量的丢失，可能是通过减少破骨细胞的数量。
实施例4：生化指标的测定
测定的生化指标包括血钙、血磷、血清骨钙素(Osteocalcin,OCN)、I-型胶原C端肽(C-terminal telopeptides of type I collagen,CTX-I)。采用原子吸收分光光度法测定血钙、血磷，血清样品直接测定。检测所用试剂盒包括：Calcium
Figure GDA0003022332100000101
Test(REF0155-225)，Phosphorus
Figure GDA0003022332100000102
Test(REF 0830-125)，生产商均为Stanbio Laboratory(NorthMainBoerne,FX,USA)如图4A-图4D所示，与假手术组对比，OVX空白组的血钙和血磷水平降低，虽然血钙的降低没有统计学意义。但与OVX空白组相比较，益生菌BL-99干预组能显著提升高血清钙离子(OVX：2.28±0.02mg/dl，OVX+BL-99:2.49±0.03mg/dl)，升高约10％，和磷离子(OVX：1.02±0.08mg/dl，OVX+BL-99:1.41±0.11mg/dl)，升高约40％。
血清骨钙素是由成骨细胞分泌的一种活性多肽，在调节骨代谢中起重要的作用，其水平反映成骨细胞活性。I型胶原C端肽是I型胶原降解后的小片段，其含量和变化可评价骨吸收状态。血清骨钙素和I型胶原C末端肽采用ELASA试剂盒测定，测定方法按照试剂盒中说明书进行。检测所用试剂盒如下：Rat Osteocalcin ELISA Kit，Rat C-telopeptide ofCollagen alpha-1(I)chain ELISA Kit，生产商均为SAB(SABiosciences,USA)。
如图4A-图4D所示与OVX空白组相比较，益生菌BL-99干预组能显著提升血清骨钙素的水平约44.6％(OVX：68.6±16.4pg/dl，OVX+BL-99:92.6±24.3pg/dl)，降低血清I-型胶原C端肽约14.6％，但没有统计学的意义。
实施例5：骨标本PCR的检测
本实施例继续研究和检测骨标本中与破骨细胞形成和成骨细胞形成相关的基因表达。益生菌BL-99干预方式同实施例2。
骨组织利用Trizol提取总RNA后，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，之后用不同基因引物(如下表)进行PCR扩增。
Figure GDA0003022332100000111
与OVX空白对照组相比，益生菌BL-99干预组能显著提升骨保护素(OPG)的基因表达，而对RANKL的基因表达没有显著的影响，从而挺高了OPG/RANKL的比值。RANKL与破骨细胞表面上的RANK受体结合，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制其凋亡；骨保护素OPG阻止RANKL与RANK的结合，从而阻止破骨细胞的激活，抑制破骨细胞的功能，减少骨吸收，起负调节作用。OPG/RANKL的比值提示体内调控破骨细胞的水平。本研究发现BL-99干预后OPG/RANKL基因表达比值升高，从去卵巢空白组的1到1.75，提升比值约75％，此结果提示BL-99有明显的抑制破骨细胞形成的作用。另外，如图5A-图5E所示：与OVX空白组比较，BL-99干预组可以提高骨钙素约1.1倍(OVX：0.908±0.107，OVX+BL-99：2.075±0.643)和碱性磷酸酶约37.8％(OVX：0.990±0.217，OVX+BL-99：1.364±0.513)的基因表达水平，这两个基因的表达水品与骨形成的能力密切相关，因此BL-99干预可通过促进成骨的相关基因的表达，来促进新骨的形成而拮抗OVX引起的骨量的丢失。
以上研究结果证实：本发明的乳双歧杆菌BL-99能显著抑制去卵巢或雌激素低下导致的骨量的丢失，提升血钙和血磷。
实施例6：BL-99菌粉的制备及其用于食品的生产
参照图6所示的发酵工艺流程，将本发明提供的乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)在TPY液体培养基中进行厌氧培养。TPY液体培养基(g/L)：水解酪蛋白10.0，大豆胨5.0，酵母粉2.0，葡萄糖5.0，L-半胱氨酸0.5，磷酸氢二钾2.0，氯化镁0.5，硫酸锌0.25，氯化钙0.15，氯化铁0.0001，吐温80 1.0，pH值6.5±0.1。经一级、二级并扩大培养后的发酵液，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，冷冻干燥，得到BL-99菌粉，-18℃以下保存。
本实施例所制得的BL-99菌粉，可以用于食品、饲料或医药用途。所述食品例如可以是发酵乳、乳酪、含乳饮料、固体饮料、乳粉等普通食品或保健食品。优选地，在所述食品中，乳双歧杆菌BL-99供人类使用的建议的剂量可为1.0×103CFU～1.0×1010CFU/kg体重/天，更优选为1.0×104CFU～1.0×109CFU/kg体重/天。
序列表
<110> 内蒙古伊利实业集团股份有限公司
<120> 一种可预防骨质疏松的乳双歧杆菌及其应用
<130> GAI18CN5164
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)
<400> 1
gctcccccac aagggtcggg ccaccggctt cgggtgctac ccactttcat gacttgacgg 60
gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt tgctgatccg cgattactag 120
cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagac cggttttcag 180
cgatccgccc cacgtcaccg tgtcgcaccg cgttgtaccg gccattgtag catgcgtgaa 240
gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc gagttgaccc 300
cggcggtccc acatgagttc ccggcatcac ccgctggcaa catgcggcga gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420
tgaaccggcc ccgaagggaa accgtgtctc cacggcgatc cggcacatgt caagcccagg 480
taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg 540
tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc ttaacgcgtt 600
ggctccgaca cgggacccgt ggaaagggcc ccacatccag catccaccgt ttacggcgtg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtgac 720
ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat tccaccgtta 780
caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tccagcccgc ccgtacccgg cgcagatcca 840
ccgttaggcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc ctttacgccc 900
aataaatccg gataacgctc gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cggtgcttat tcgaacaatc cactcaacac ggccgaaacc gtgccttgcc cttgaacaaa 1020
agcggtttac aacccgaagg cctccatccc gcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc 1080
ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc 1140
aatgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcaac gccttggtgg gccatcaccc 1200
cgccaacaag ctgataggac gcgaccccat cccatgccgc aaaagcattt cccaccccac 1260
catgcgatgg agcggagcat ccggtattac cacccgtttc caggagctat tccggtgcac 1320
agggcaggtt ggtcacgcat tactcacccg ttcgccactc tcaccccgac agcaagctgc 1380
cagggatccc gttcgact 1398
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>

Claims (5)

1.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或含有其的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于预防骨质疏松的组合物中的应用，所述组合物包括饲料组合物或药品组合物。
2.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或含有其的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于降低雌激素缺乏引起的骨量的丢失的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
3.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或含有其的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于提升血钙和/或血磷的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
4.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或含有其的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于抑制体内破骨细胞数量的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
5.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或含有其的乳双歧杆菌菌制剂在制备用于促进骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物；
其中，所述骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白包括碱性磷酸酶和/或骨钙素。
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