CN115948296B - 用于改善肌骨健康和/或提高运动能力的植物乳杆菌及其组合物与应用 - Google Patents

Abstract

用于改善肌骨健康和/或提高运动能力的植物乳杆菌及其组合物与应用，其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP550，于2021年4月23日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021437。组合物包括植物乳杆菌LP550后生元，或者，组合物还包括植物乳杆菌LP550活菌株及其灭活菌株、菌株代谢产物、维生素D₂、维生素D₃、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌中的一种或多种的混合物。本发明还公开了含植物乳杆菌及其后生元的组合物用于改善肌骨健康和/或提高运动能力的应用。本发明的植物乳杆菌LP550对维生素D₂和维生素D₃有极强的代谢能力，能显著提高骨骼肌质量指数、四肢骨骼质量指数、全身骨密度、腰椎骨密度、前肢抓力和运动能力，通过多种途径来改善肌骨健康和提高运动能力。

Description

用于改善肌骨健康和/或提高运动能力的植物乳杆菌及其组 合物与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种用于改善肌骨健康和提高运动能力的植物乳杆菌及其组合物与应用。

背景技术

维生素D是一种脂溶性维生素，在自然界中存在两种形式，即维生素D₂(麦角化醇)和维生素D₃(胆钙化醇)。植物源性的维生素D₂和维生素D₃不能在人体内合成，只能从膳食中补充，比如海产品、酵母、植物提取物等。随着对维生素D领域的不懈研究，迄今为止，发现维生素D代谢产物在人体中发挥重要作用，维生素D的主要功能是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收。Nature Communications上发表的一项横断面研究，对567名老年男性的血清维生素D代谢产物进行深入分析后发现，8种特定肠道细菌分类群与维生素D活性形式——1，25-双羟维生素D的水平相关，而更高的1，25-双羟维生素D水平与肠道微生物多样性相关，表明，肠道菌群会改变肠道维生素D的代谢(Kado D,et al.Vitamin D Metabolites and theGut Microbiome in Older Men[J].Innovation in Aging,2020.)。

2009年，Binkley等基于肌少症和骨质疏松症相似的病理生理基础以及密切的相关性，提出了肌骨共减综合症(osteosarcopenia,OS)的概念，主要指符合骨质疏松症的诊断标准并同时存在肌量/功能下降的患者。OS患者表现为骨密度(BMD)下降，骨脆性增加，肌量、肌力和肌肉功能的进行性和全身性下降，导致患者虚弱、跌倒、骨折、住院、致残和致死风险增加。

根据肌骨共减综合症不同的诊断标准，肌骨共减综合症在60岁以上人群中的发病率范围在5％～37％，甚至有年轻化趋势。目前，尚无防治肌骨共减综合症的靶向药物，目前有效的防治手段包括健脾补肾为主的中医治疗，如CN202110982828.1公开了一种用于防治肌少骨质疏松症的中药组合物，组合物包括盐杜仲等中药或提取物，另外抗阻和平衡训练、营养摄入(补充维生素D和钙)等早期干预措施也能有效预防和缓解肌骨共减症症状。US15385786公开了植物乳杆菌组合物能够提高肌肉质量和耐力，降低血乳酸，提高运动能力。

现有技术中，维生素D通过直接与益生菌进行复配进行相关疾病的干预,如陈丹发表的维生素D₃联合鼠李糖乳杆菌及P40对结肠炎的保护作用及其机制研究，但未见特定菌株与维生素D及其代谢产物相互作用对肌骨共减综合症及提高运动能力的研究报道，因此，开发新的菌株及其组合物，用于制备一种便捷、高效的对改善肌骨健康和提高机体运动能力，具有重要的社会意义和市场价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种生物活性高、碳源利用广、可高效代谢维生素D₂或和维生素D₃且具有改善肌骨健康和运动能力的植物乳杆菌，本发明还提供了由植物乳杆菌及其后生元组成的组合物，并提出了将植物乳杆菌及由其组成的组合物用于改善肌骨健康和运动能力的新应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP550，于2021年4月23日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2021437。

生物保藏说明：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP550，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏机构简称：CCTCC，保藏日期：2021年4月23日(2021年4月23日接收登记入册，4月30日检测为存活，并保藏)，生物保藏编号为CCTCCNO：M 2021437，菌株编号：植物乳杆菌LP550。

其中，所述植物乳杆菌LP550分离自植物源，具体地，植物乳杆菌LP550从四川成都农家郫县豆瓣中筛选分离得到。

本发明的植物乳杆菌LP550的生物学性质如下：

1)形态学特征：在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落呈圆形、大小中等、乳白色、向上凸起光泽、菌落边缘较为整齐、易挑取，显微镜下呈杆状，革兰氏染色后呈阳性。

2)生物学鉴定：植物乳杆菌LP550送至中国典型培养物菌种保藏中心进行16SrRNA鉴定，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，植物乳杆菌LP550的16SrRNA序列进行NCBIBLAST比对，基于16S rRNA基因序列比对结果以Holzapfelia floricola Ryu1-2(AB523780)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，如图2所示，与Genebank中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)相似度大于99％，鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP550。

植物乳杆菌LP550发酵用培养基为MRS、维生素D₂+MRS培养基或维生素D₃+MRS培养基，所述维生素D₂+MRS培养基包括蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0g/L，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸二氨2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.038g/L，1000～4000IU维生素D₂(加琼脂粉15g/L为固体培养基)；所述维生素D₃+MRS培养基包括蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0g/L，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸二氨2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.038g/L，1000～4000IU维生素D₃(加琼脂粉15g/L为固体培养基)，优选，维生素D₃+MRS培养基中的维生素D₃显著促进植物乳杆菌LP550的生长，且其产酸水平与常规MRS培养基中的相当，同时还可以促进短链脂肪酸的增加，特别是显著提高在肠肌轴，肠骨轴起重要作用的丁酸含量；此外，维生素D₃能促进提高植物乳杆菌LP550对病原微生物抑菌能力大幅提高，对幽门螺杆菌ATCC 26695，变异链球菌CGMCC 1.2499，金黄色葡萄球菌CMCC 26003，产气荚膜梭菌ATCC 13124，白色念珠菌ATCC 10231的抑菌效果。

本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：

一种组合物，包括植物乳杆菌LP550后生元，所述植物乳杆菌LP550后生元为以MRS培养基或维生素D₂+MRS培养基或维生素D₃+MRS培养基发酵培养植物乳杆菌得到的发酵液进行浓缩、喷雾干燥含有菌体及其代谢产物的固体粉末，可选地，所述固体粉末还含有维生素D₂/维生素D₃。

进一步，所述组合物还包括上述植物乳杆菌LP550活菌株、植物乳杆菌LP550的灭活菌株、菌株代谢产物、维生素D₂、维生素D₃、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌中的一种或多种的混合物，其中鼠李糖乳杆菌优选申请人筛选的鼠李糖乳杆菌S24，发酵乳杆菌优选申请人筛选的发酵乳杆菌GF1800。

所述组合物包括但不限于生物菌剂、功能性食品、保健品或药物。

所述功能性食品为酵素、泡菜、固体饮料、丸剂、片剂或微胶囊晶球中的任意一种。

所述药物还含有药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或润滑剂中的一种或多种。

所示药物为用于改善肌骨健康和提高运动能力的药物，优选为口服药。

所述填充剂为岩藻多糖、海藻糖、乳糖、壳聚糖、淀粉或糊精中的一种或多种；所述粘合剂为液状葡萄糖、淀粉糊或糖浆的一种或多种；所述润湿剂为甘油或乙醇中的一种或多种；所述崩解剂为交联聚维酮、羧甲基淀粉钠或交联羧甲基淀粉钠的一种或多种；所述润滑剂为二氧化硅硬脂酸镁或硬脂酸富马酸钠的一种或多种。

本发明的植物乳杆菌LP550及其LP550后生元可以明显提高OS大鼠的全身骨密度和腰椎骨密度，进而改善肌骨健康或预防肌骨共减症(OS)的形成。

本发明的植物乳杆菌LP550及其LP550后生元能显著提高OS大鼠的前肢抓力、全身骨骼肌量和四肢骨骼肌量，实现改善肌骨健康或对肌肉减少症(SP)的进行有效防治。

植物乳杆菌LP550还可以明显延长大鼠跑步时间与跑步距离，进而提高机体运动能力，进一步防治肌骨共减症OS。

植物乳杆菌LP550还能促进增加OS大鼠粪便中丁酸含量，进而达到防治肌骨共减症OS。

基于本发明的植物乳杆菌LP550的上述特性，本发明植物乳杆菌及其后生元的应用之一：

植物乳杆菌LP550后生元在制备用于改善肌骨健康和提高运动能力的功能性食品或药物中的应用；或者，植物乳杆菌LP550后生元、与植物乳杆菌LP550、植物乳杆菌LP550灭活菌株和菌株代谢产物中的一种或多种形成的组合物在制备用于改善肌骨健康和提高运动能力的功能性食品或药物中的应用。

在某一示范实施例中，植物乳杆菌LP550的用量≥6×10⁸CFU/per mouse/day，植物乳杆菌LP550的灭活菌株的用量为3～8×10¹⁰CFU/day，植物乳杆菌LP550后生元的用量为≥6×10⁸个/per mouse/day，游离氨基酸＞1mg/g。

其次，抑菌实验表明：植物乳杆菌LP550对致病菌具有广泛的抑菌性。具体表现为对幽门螺杆菌ATCC 26695、变异链球菌CGMCC1.2499、金黄色葡萄球菌CMCC26003、产气荚膜梭菌ATCC13124、白色念珠菌ATCC10231都具有较好的抑制效果，其中对变异链球菌CGMCC1.2499抑制作用最强，且采用维生素D₂-MRS和维生素D₃-MRS培养基培养的植物乳杆菌LP550对致病菌的抑菌性能比采用常规MRS培养基培养的植物乳杆菌LP550强。

基于植物乳杆菌LP550的上述特性，本发明植物乳杆菌及其后生元的另一应用：

植物乳杆菌LP550及其后生元在制备抑制致病菌的功能性食品或药物中的应用。

本发明的植物乳杆菌LP550对胃酸、胆盐具有非常好的耐受性，适于口服。

植物乳杆菌LP550具有广谱的碳源利用能力，且对维生素D₂和维生素D₃有极强的代谢能力，其产酸能力强，发酵初期产酸迅速，产酸量大，随着发酵时间的增加，其产酸量趋于平稳。尤其，植物乳杆菌LP550在维生素D₂+MRS培养基的生长性能和产酸能力均相对在常规的MRS培养基上有大幅度的提高，而维生素D₃+MRS培养基仅对植物乳杆菌LP550的生长有促进作用，对其产酸能力与在MRS培养基上的相当，基于上述特性，本发明植物乳杆菌及其后生元的另一应用：

植物乳杆菌LP550及其后生元作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品或膳食补充剂中的应用。

本发明一种植物乳杆菌的有益效果：

该植物乳杆菌LP550在MRS琼脂培养、维生素D₂+MRS培养基和维生素D₃+MRS培养基上生长良好，其生物活性高，具有广泛的碳源利用能力，产酸特性好，对人工胃液、肠液、胆盐具有良好的耐受性。

所述植物乳杆菌LP550能够代谢并利用维生素D_2、维生素D₃进而提高生长性能和抑菌作用，维生素D₂还能促进植物乳杆菌LP550产酸。

本发明的植物乳杆菌LP550及后生元组能显著提高骨骼肌质量指数、四肢骨骼质量指数、全身骨密度、腰椎骨密度、前肢抓力和运动能力，并增加粪便中丁酸含量，通过多种途径来改善肌骨健康和提高运动能力，进而延缓或改善肌骨共减综合症。

本发明植物乳杆菌LP550具有良好的安全性，植物乳杆菌LP550的应用广泛，可用于制备用于改善肌骨健康和提高运动能力的功能性食品或药物，或抑制致病菌的功能性食品或药物，或作为发酵剂用于制备发酵食品、保健食品。

附图说明

图1为植物乳杆菌LP550在MRS琼脂培养基上的菌落形态，其中，(A)平板菌落形态图，(B)显微镜下菌株形态图；

图2为植物乳杆菌LP550系统发育树；

图3为植物乳杆菌LP550及其他菌株对维生素D₂、维生素D₃的代谢能力的对比分析图；

图4为维生素D₂、维生素D₃对植物乳杆菌LP550生长性能的影响；

图5为维生素D₂、维生素D₃对植物乳杆菌LP550产酸性能的影响；

图6为不同实验组的大鼠全身骨密度和腰椎骨密度对比分析图；其中，(A)大鼠全身骨密度，(B)大鼠腰椎骨密度；

图7为不同实验组的大鼠前肢抓力的对比分析图；

图8为不同实验组的大鼠的SMI(A)和RSMI(B)对比分析图；

图9为不同实验组的大鼠跑步时间(A)、距离(B)的对比分析图；

图10为不同实验组的大鼠粪便中丁酸含量对比图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

本发明各实施例中所涉及的培养基配方：

MRS培养基(植物乳杆菌LP550)：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0g/L，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸二氨2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.038g/L，(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。

维生素D₂+MRS培养基(植物乳杆菌LP550)(简称：VD₂+MRS)：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0g/L，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸二氨2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.038g/L，4000IU维生素D₂(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。

维生素D₃+MRS培养基(植物乳杆菌LP550)(简称：VD₃+MRS)：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0g/L，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸二氨2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.038g/L，4000IU维生素D₃(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。

实施例1

本发明的一种植物乳杆菌LP550(Lactobacillus plantarumLP550)，于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2021437。

1)植物乳杆菌LP550的分离、筛选及耐胃酸胆盐测定

从四川成都农家郫县豆瓣中采集微生物筛选样品，将采集的样品剪碎后称取1g，放入9mL无菌生理盐水中，充分震荡混匀后，10倍梯度稀释涂布于MRS固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，反复划线纯化培养；再通过革兰氏染色和溶钙法初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株用45％甘油保存于-80℃冰箱备用。

a)形态观察

将纯化的植物乳杆菌LP550划线于MRS琼脂培养基上，37℃倒置培养48h后，对菌株的菌落形态进行及电镜观察，结果如附图1所示：所述菌株在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落呈圆形、大小中等、乳白色、向上凸起光泽、菌落边缘较为整齐、易挑取，显微镜下呈杆状，革兰氏染色后呈阳性。

b)菌株分子生物学鉴定

将纯化的菌株送至中国典型培养物菌种保藏中心进行16S rRNA鉴定，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的植物乳杆菌相似度大于99％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQID NO:1所示，命名为植物乳杆菌LP550(Lactobacillus plantarumLP550)，植物乳杆菌LP550基于16S rRNA基因序列比对结果以Holzapfelia floricola Ryu1-2(AB523780)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，如图2所示。

2)菌株代谢维生素D的对比试验

将候选菌株植物乳杆菌LP550、植物乳杆菌360、植物乳杆菌220、植物乳杆菌M71、M72、发酵乳杆菌GF1800、副干酪乳杆菌S6菌株在MRS培养基活化两次后，将活化好的植物乳杆菌LP550及其他菌株的菌液按5％的接种量接种到维生素D₂+MRS培养基、维生素D₃+MRS培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180mm)；将分装好的候选菌株菌液放置37℃恒温培养箱中静置培养24后HPLC测定维生素D₂与维生素D₃含量(计为M₁)，培养基中添加维生素D₂与维生素D₃含量作为初始含量(计为M₀)，其中培养基不接种作为对照，菌株代谢维生素D计算公式(％)＝(M₀-M₁)/M₀*100％。

实验结果见图3，候选菌株中植物乳杆菌LP550对维生素D₂与维生素D₃的代谢能力分别为32.15％、42.57％，且植物乳杆菌LP550对维生素D₂与维生素D₃的代谢能力显著强于其他候选菌株。

发明人基于植物乳杆菌LP550对维生素D的强代谢能力，进一步分析维生素D对植物乳杆菌LP550的生长及代谢的影响，并进一步探索其新的应用。

3)维生素D对植物乳杆菌LP550生理生化特性

①植物乳杆菌LP550生长性能

将植物乳杆菌LP550菌株菌种按5％的接种量接种到MRS培养基培养24h，连续活化两次。将活化好的植物乳杆菌LP550菌液按5％的接种量接种到MRS、维生素D₂+MRS、维生素D₃+MRS液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180mm)；将分装好的植物乳杆菌LP550菌液放置37℃恒温培养箱中静置培养24h后，取3支试管测定15h与24h菌液吸光度值OD₆₀₀，计算平均值；以时间为横坐标，吸光度值OD₆₀₀为纵坐标，绘制生长曲线图。

植物乳杆菌LP550生长实验结果如图4所示，植物乳杆菌LP550在维生素D₂+MRS、维生素D₃+MRS液体培养基中生长分别提高22.99％与33.70％，生长显著优于MRS培养基，表明维生素D₂与维生素D₃及其代谢产物不仅不会影响植物乳杆菌LP550生长，还能促进植物乳杆菌LP550的生长。

②植物乳杆菌LP550产酸性能试验

将植物乳杆菌LP550菌株菌种按5％的接种量接种到MRS培养基培养24h，连续活化两次。将活化好的植物乳杆菌LP550菌液按5％的接种量接种到MRS、维生素D₂+MRS、维生素D₃+MRS液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180mm)。将分装好的植物乳杆菌LP550菌液放置在37℃恒温培养箱中静置培养，并取3支试管测定菌液总酸，计算平均值；每隔一定时间，取3支试管测定菌液总酸，并以时间为横坐标，以产酸量为纵坐标，绘制产酸曲线，如图5所示。

参见图5，植物乳杆菌LP550在维生素D₂+MRS与维生素D₃+MRS液体培养基中总酸水平相对在MRS培养基中的产酸水平没有显著性差异，通过HPLC进一步分析表明，短链脂肪酸得到显著提高，特别是丁酸含量显著增加(表1)，以上结果表明：维生素D₂或维生素D₃对植物乳杆菌LP550总酸的产生影响极小，但可以提高短链脂肪酸的含量，维生素D₂+MRS较MRS提高16.4％，维生素D₃+MRS较MRS提高27％，特别是显著提高在肠肌轴，肠骨轴起重要作用的丁酸含量，维生素D₂+MRS、维生素D₃+MRS较MRS分别提高了4.7倍与7.4倍。

表1短链脂肪酸检测结果

注释：短链脂肪酸定量单位为μg/ml。

③植物乳杆菌LP550对致病菌的抑菌能力试验

对致病菌抑菌实验：在无菌平板中倾倒10mL的水琼脂培养基，待冷却凝固后放上牛津杯，将指示菌菌悬液(幽门螺杆菌ATCC 26695，变异链球菌CGMCC1.2499，金黄色葡萄球菌CMCC26003，产气荚膜梭菌ATCC13124，白色念珠菌ATCC10231)分别加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中，使指示菌浓度为10⁶CFU/mL，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，待其凝固后，用镊子取出牛津杯，即形成孔洞，向每个孔中加入200μL的待测样品(MRS培养基，维生素D₂+MRS培养基,维生素D₃+MRS培养基)发酵液，扩散30min，37℃培养15-24h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径，记录抑菌圈直径，最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。

表2不同培养基培养得到的植物乳杆菌LP550发酵液的抑菌能力分析

变异链球菌CGMCC1.2499 16.17±0.68 23.32±0.67 22.08±0.63

金黄色葡萄球菌CMCC26003 14.81±0.75 21.18±0.63 20.75±0.42

产气荚膜梭菌ATCC 13124 18.72±0.44 22.57±0.88 20.98±0.45

结果如表2所示，相对于MRS培养基发酵获得的植物乳杆菌LP550，MRS培养基中加入维生素D₂或维生素D₃后发酵获得的植物乳杆菌LP550对幽门螺杆菌ATCC 26695，变异链球菌CGMCC 1.2499，金黄色葡萄球菌CMCC 26003，产气荚膜梭菌ATCC 13124，白色念珠菌ATCC10231抑菌圈都达到20mm以上，说明：维生素D₂和维生素D₃协同促进了植物乳杆菌LP550对病原微生物抑菌能力，且植物乳杆菌LP550的抑菌能力在常规MRS培养基的基础上均提高了11％以上，尤其是维生素D₂协同促进植物乳杆菌LP550对白色念珠菌ATCC 10231的抑菌能力提高幅度高达49％，维生素D₃协同促进植物乳杆菌LP550对幽门螺杆菌ATCC26695的抑菌能力提高幅度高达42％；结合植物乳杆菌在维生素D₂+MRS培养基、维生素D₃+MRS培养基中菌数增加，但总酸变化不明显，说明植物乳杆菌LP550在维生素D₂+MRS培养基、维生素D₃+MRS培养基中抗菌肽等抗菌物质含量得到提高，使得植物乳杆菌LP550抑菌性能得到显著提高。

4)植物乳杆菌LP550对人体胃酸、胆盐的耐受性试验

①菌株耐胃酸测定

配制模拟胃液：NaCl 2.0g/L，用HCl将pH值分别调至2.0、2.5、3.0和4.0，进行高压灭菌，胃蛋白酶3.2g/L，胃蛋白酶在实验时现加现用；配制模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g/L，用NaOH将pH值调至7.5，进行高压灭菌，胰蛋白酶10.0g/L，胰蛋白酶在实验时现加现用；取甘油管保存的LP550菌种以10％的接种量接种至MRS培养基中37℃活化24h；将等量的LP550菌液加入到体系50mL模拟胃液中，记录初始活菌，37℃恒温培养3h后测定活菌数。对检测的乳酸菌活菌进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组×100％。

当食物进入胃中时，胃酸即开始分泌。人体正常的胃分泌的胃酸浓度pH值约为0.5-1.5。胃在排空时pH值约在7.0 -7.2间，当食物进入胃中时，pH值迅速下降到2-3。饭后胃液稀释，pH上升至3.5左右。实验结果表明，pH2.0时，LP550存活率为49.52％；pH2.50时，LP550存活率为74.37％；在pH3.0时，LP550存活率为95.43％,说明LP550菌株有很好的耐受胃酸能力。

②菌株耐胆盐测定

将LP550菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的LP550菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养15h。将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。

按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L和0.0g/L(初始菌液)的MRS培养基中，以胆盐浓度为0.0g/L为对照组。然后于37℃恒温培养箱中孵育3h。将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水，拍打混匀后检测乳酸菌数；对检测的乳酸菌活菌进行统计，并计算存活率，计算公式如下：

菌株存活率(％)＝试验组/对照组×100％。

LP550胆盐耐受性数据表明：当胆盐浓度为1.0g/L和2.0g/L时，菌株的存活率分别为100％和98.13％，但当胆盐浓度达到3.0g/L时，菌株存活率仍达到95.76％。肠道内的胆盐浓度不超过3.0g/L，说明LP550菌株具有较好的胆盐耐受性。

综上所述，植物乳杆菌LP550不仅能代谢利用培养基中的维生素D₂或维生素D₃，同时，维生素D₂和维生素D₃还能促进植物乳杆菌LP550的生长及抑菌肽等代谢产物的形成，以及促进植物乳杆菌LP550生长过程中形成短链脂肪酸等代谢产物，植物乳杆菌LP550对胃液、肠液、胆盐具有良好的耐受性，基于维生素D的主要功用是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收，提高血钙、血磷浓度，有利于新骨生成和钙化，为植物乳杆菌LP550的新应用的开发研究提供了新方向。

实施例2

一种组合物，包括植物乳杆菌LP550后生元，所述后生元中含实施例1中的植物乳杆菌菌体数100亿个/g，维生素D₃含量400IU/g，游离氨基酸＞1mg/g，所述后生元的制备方法为：将实施例1中的植物乳杆菌LP550在维生素D₃+MRS液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷干含有菌体、维生素D₃及代谢产物的固体粉末。

实施例3

植物乳杆菌LP550及其后生元在制备用于改善肌骨健康和提高运动能力的功能性食品或药物中的应用。

受试样品：①后生元植物乳杆菌LP550(简称：后生元LP550)：实施例2中的植物乳杆菌LP550后生元(菌体数100亿个/g，D₃含量400IU/g，游离氨基酸＞1mg/g)，其制备方法为：将植物乳杆菌LP550在维生素D₃+MRS液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷雾干燥含有菌体、维生素D₃及代谢产物的固体粉末。②复配维生素D₃及后生元LP550(简称：复配VD₃)：实施例1中在MRS培养基中发酵培养得到植物乳杆菌LP550发酵液进行浓缩、喷雾干燥含有菌体及代谢产物的固体粉末，然后再与维生素D₃成品混合，复配后的产品中维生素D₃含量为400，植物乳杆菌LP550菌体数100亿个/g。

植物乳杆菌LP550对改善肌骨健康和提高运动能力的研究试验

试验分组：购自成都达硕公司的30只SPF级SD大鼠按体质量随机分为5组，即正常组(CON组)、假手术组(SHM组)、OS组、复配维生素D₃及后生元LP550组(OS+复配VD₃组)和OS后生元植物乳杆菌LP550(OS+后生元LP550组)。其中OS组、OS+复配VD₃组和OS+后生元LP550组大鼠采用去势法造模，SHM组采用假手术造模，除CON组外，其余各组大鼠术后均每日肌内注射青霉素钠8万单位/只，连续3d。术后恢复7d，7d后开始对OS组、OS+复配VD₃组和OS+后生元LP550组大鼠腹腔注释地塞米松磷酸钠注射液(DXM)1mg(/kg·d)，连续2周。造模结束后，开始进行药物干预：CON组、SHM组和OS组大鼠每天灌胃10mL/kg生理盐水，OS+复配VD₃组连续12周灌胃复配维生素D₃及后生元LP550(1×10⁸个/per mouse/day)，OS+后生元LP550组连续12周灌胃实施例2中后生元植物乳杆菌LP550(1×10⁸个/per mouse/day)，实验结果完成后对数据进行分析，与CON组相比，^aP<0.05；与SHM组相比，^bP<0.05；与OS组相比，^cP<0.05；与OS+复配VD₃组相比，^dP<0.05。

①大鼠一般情况观察及体重变化分析

灌胃期间每天观察并记录各组大鼠的摄食活动、精神状态及异常行为等。干预结束后，每周定时用电子秤测量各组大鼠体重(bodyweight，BW)。

实验过程中，各组无老鼠死亡。OS组大鼠较其他组皮毛光干燥，毛发乱，光泽度下降。OS+复配VD₃组，OS+后生元LP550组大鼠较OS组皮毛光泽，毛发柔和，精神与活动度正常。

不同试验组的大鼠体重变化如表3所示。各剂量组与对照组、SHM组之间无显著性差异(P>0.05)；OS组相对CON组、SHM组，其体重上升幅度偏小，这与肌骨共减患者在临床上的表现之一——体重减轻一致；OS+复配VD₃组、OS+后生元LP550组与OS组相比，其体重有上升趋势，但上升幅度不显著，说明植物乳杆菌LP550与LP550后生元有缓解OS大鼠体重下降的趋势，且，长期口服维生素D₃、植物乳杆菌LP550活菌株或其后生元能有效预防动物肌骨共减症，且生长安全性良好。

表3各实验组大鼠体重变化

注释：与CON组相比，^aP<0.05；与SHM组相比，^bP<0.05；与OS组相比，^cP<0.05；与OS+复配VD₃组相比，^dP<0.05。

②各组大鼠骨密度变化分析

试验方法：干预结束后、取材前，将上述各组大鼠麻醉，用双能X线骨密度仪测量各组大鼠全身骨密度(Bone mineral density，BMD)、腰椎BMD。

参见图6，试验结果表明：与CON组和SHM组相比，OS组大鼠全身BMD和腰椎BMD明显下降(P<0.05)，说明造模成功，OS对大鼠的肌骨健康有显著影响；与OS组相比，OS+复配VD₃组、OS+后生元LP550组大鼠全身BMD和腰椎BMD显著增加(P<0.05)，表明：利用MRS培养基和维生素D₃+MRS培养基获得的植物乳杆菌LP550后生元均可明显改善肌骨共减症大鼠(OS组)的骨密度，进而有效改善OS大鼠的肌骨健康。

与OS+复配VD₃组比较，OS+后生元LP550组全身BMD和腰椎BMD明显增加(P<0.05)，说明：相对常规MRS培养基发酵培养得到的植物乳杆菌LP550发酵液形成的后生元与维生素D₃复配形成的组合物，代谢维生素D₃的植物乳杆菌LP550的后生元对OS大鼠的骨密度改善效果更好，可能与植物乳杆菌LP550在利用维生素D₃的生长代谢过程中合成了除利用常规MRS培养基生长代谢产物以外且能促进OS大鼠骨密度提高的代谢物，进而使其对OS大鼠骨密度的提高促进作用更显著。

③各组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比较分析

试验方法：干预结束后，使用抓力仪每周固定时间测量大鼠前肢抓力(Forelimbgrip strength)。测试前让大鼠在抓力仪上适应5分钟，然后抓住大鼠尾巴水平缓慢向后拉，直到大鼠前肢无法抓住横杆，记录仪器上的最大抓力读数。测定三次并记录，用三次抓力的平均值作为反映前肢肌肉力量的指标。双能X线骨密度仪测量各组大鼠全身骨骼肌量(Lean mass，LM)和四肢骨骼肌量(appendicular lean mass，ALM)。并计算大鼠骨骼肌质量指数(SMI＝LM/BW)和四肢骨骼肌质量指数(RSMI＝ALM/BW)。

参见图7和图8，与CON组和SHM组比较，OS组大鼠前肢抓力显著下降(P<0.05)，SMI和RSMI也明显下降(P<0.05)；与OS组比较，OS+复配VD₃组和OS+后生元LP550组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI显著增加(P<0.05)，且OS+后生元LP550组明显优于OS+复配VD₃，表明OS+复配VD₃组和OS+后生元LP550组可明显改善OS大鼠前肢抓力和骨骼肌量，从而改善肌骨健康。

与CON组比较，OS+后生元LP550组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI显著增加(P<0.05)，说明：后生元LP550不仅能促进OS大鼠的前肢抓力、SMI和RSMI的恢复，还能促进大鼠前肢抓力和骨骼肌量的进一步提升，即，后生元LP550对OS大鼠或健康的大鼠都有改善肌骨健康和提升运动能力的作用，可有效防止防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合征。

④各组大鼠跑步实验

试验方法：连续喂食大鼠12周后测试大鼠的耐力表现，自测试前1周每次喂食后30分钟让大鼠适应跑步机训练。将大鼠放置于跑步机小室中，设置转速为20r/min，电刺激区电流强度为1.2A，记录大鼠到力竭跑步的时间和运动距离，力竭判定标准为大鼠在电击区静止10S以上。

试验结果如图9所示，与对照组比较，OS组大鼠跑步时间与跑步距离明显缩短(P<0.05)，说明OS对大鼠的跑步能力有显著影响；与OS组大鼠跑步时间与跑步距离比较，OS+复配VD₃组与OS+后生元LP550组均可使大鼠跑步时间及跑步距离明显延长(P<0.05)，且，OS+后生元LP550组的大鼠跑步时间及跑步距离也显著优于OS+复配VD₃组，说明，后生元LP550有助于提高大鼠的机体运动能力。

与CON组比较，OS+后生元LP550组大鼠跑步时间与跑步距离显著延长(P<0.05)，说明：后生元LP550不仅能促进OS大鼠的运动能力的恢复，还能促进大鼠运动能力的进一步提升，即，后生元LP550对OS大鼠或健康的大鼠都有提升机体运动能力的作用，进而有效防止防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合征。

⑤各组大鼠粪便中丁酸的检测分析

连续喂食大鼠12周后收集各组大鼠新鲜粪便，按照HPLC上机要求制样并检测。试验结果如图10所示，与CON组比较，模型组大鼠丁酸含量显著降低(P<0.01)。经过12周的干预后，OS+复配VD₃组与OS+后生元LP550组的大鼠粪便中丁酸含量均显著升高，同时，OS+后生元LP550组显著优于OS+复配VD₃组(P<0.01)。表明植物乳杆菌LP550后生元能提高大鼠肠道内用于满足结肠黏膜上皮细胞的能量供给需要的丁酸含量，进而改善大鼠肠道菌群，进一步促进肠道对维生素D和植物乳杆菌LP550代谢产物的吸收，达到有效防治肌骨共减综合征(OS)。

综上所述，与CON组和SHM组相比，OS组大鼠全身BMD、腰椎BMD、SMI和RSMI明显降低，表明去势法联合DXM可导致大鼠发生肌骨共减综合症(简称OS)。与OS组相比，OS+复配VD₃和OS+后生元LP550组大鼠全身BMD、腰椎BMD、前肢抓力、SMI、RSMI、跑步时间和跑步距离明显增加，同时粪便中丁酸含量显著增加，且后生元LP550组的相应性能均优于复配VD₃组，表明：植物乳杆菌LP550及其后生元可明显改善OS大鼠骨骼健康，并提高运动能力，进而有效防治肌骨共减综合症。

实施例4

本实施例的一种组合物，包括植物乳杆菌LP550后生元，所述后生元中含实施例1中的植物乳杆菌菌体数100亿个/g，维生素D₂含量400IU/g，游离氨基酸＞1mg/g，所述后生元的制备方法为：将实施例1中的植物乳杆菌LP550在维生素D₂+MRS液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷雾干燥含有菌体、维生素D₂及代谢产物的固体粉末。

本实施例的组合物用于OS大鼠的治疗，其对OS大鼠的体重下降抑制作用、以及对OS大鼠的全身BMD、腰椎BMD、前肢抓力、SMI、RSMI、跑步时间和跑步距离的提升作用略优于实施例2中的组合物。

实施例5

本实施例的一种组合物，包括植物乳杆菌LP550活菌株和植物乳杆菌LP550的灭活菌株，其中，植物乳杆菌LP550活菌株为实施例1中在维生素D₂+MRS液体培养基中培养获得的植物乳杆菌LP550；植物乳杆菌LP550的灭活菌株为采用在维生素D₂+MRS液体培养基中37℃条件下培养48h后，得到植物乳杆菌LP550菌液，菌液在125℃，灭菌5分钟；将灭活后菌液经8000g离心5min，得到植物乳杆菌LP550的灭活菌株；植物乳杆菌LP550活菌株与植物乳杆菌LP550的灭活菌株的重量比为1:3。

本实施例的一种组合物，在制备改善肌骨健康和提升运动能力的药物中的应用，使用时，该组合物中植物乳杆菌LP550用量为1.0*10¹⁰CFU/day，灭活植物乳杆菌LP550用量为6.0*10¹⁰CFU/day。

实施例6

植物乳杆菌LP550在制备防治OS的功能性食品或药物中的应用，植物乳杆菌LP550用量为1.5×10¹⁰CFU/day。

其中，植物乳杆菌LP550如实施例1中所述采用MRS培养基培养获得。

实施例7

后生元植物乳杆菌LP550在改善肌骨健康和提高运动能力的功能性食品或药物中的应用，其中，植物乳杆菌LP550后生元用量为500mg/day。

所述后生元植物乳杆菌LP550的制备方法为：将实施例1中的植物乳杆菌LP550在MRS液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷雾干燥含有菌体及代谢产物的固体粉末。

实施例8

本实施例的一种组合物，包括质量比为1:1的植物乳杆菌LP550活菌株和植物乳杆菌LP550后生元。

由实施例1的3)-③植物乳杆菌LP550对致病菌的抑菌能力试验可知，植物乳杆菌LP550活菌株对常见的幽门螺杆菌ATCC 26695，变异链球菌CGMCC1.2499，金黄色葡萄球菌CMCC26003，产气荚膜梭菌ATCC13124，白色念珠菌ATCC10231等致病菌具有良好的抑制作用。

本实施例的组合物具有抑菌作用，在制备抑制致病菌的功能性食品或药物中的应用，致病性螺杆菌包括幽门螺杆菌ATCC 26695，变异链球菌CGMCC1.2499，金黄色葡萄球菌CMCC26003，产气荚膜梭菌ATCC13124，白色念珠菌ATCC10231。使用时，植物乳杆菌LP550活菌株的用量为1×10¹⁰CFU/day，植物乳杆菌LP550的灭活菌株为2×10¹⁰CFU/day，后生元的用量为100mg/day。

实施例9

本实施例的一种组合物，包括植物乳杆菌LP550活菌株和植物乳杆菌LP550后生元，植物乳杆菌LP550后生元的制备方法同实施例4。

根据实施例1可知，在维生素D₂+MRS培养基上培养的植物乳杆菌LP550活菌株具有较好的产酸与抑菌能力，本实施例的组合物作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品中的应用。

所述发酵食品为泡菜，本实施例的组合物作为发酵剂在制备泡菜中的应用方法具体如下：

选用新鲜蔬菜洗净后，加入到4-5倍重量份的饮用水中，再加入总体积1％的食用葡萄糖，总体积0.5-2.0％的食用氯化钠，再接入本发明实施例1制备的植物乳杆菌LP550，使其浓度达到10⁷CFU/mL以上，在室温下发酵5-24h后，得到添加了含植物乳杆菌LP550和植物乳杆菌LP550后生元的组合物的发酵泡菜。该发酵泡菜口味爽脆，风味独特，并含有植物乳杆菌LP550菌体及代谢产物，具有良好安全性和益生功能。

实施例10

植物乳杆菌LP550及后生元在改善骨骼健康的功能性食品或药物中的应用，其中，植物乳杆菌LP550用量为5*10¹⁰CFU/day，后生元植物乳杆菌LP550用量为5*10¹⁰个/day。

其中，植物乳杆菌LP550及其后生元分别如实施例1中维生素D₃+MRS培养基上培养、实施例2所述培养获得。

实施例11

本实施例的一种组合物，按重量份计，包括植物乳杆菌LP550菌粉(4.0×10¹⁰CFU/g)10重量份、鼠李糖乳杆菌S24(4.0×10¹⁰CFU/g)8重量份，植物乳杆菌LP550后生元(细胞数4.0×10¹⁰个/g)2重量份及辅料，所述辅料包括脱脂奶粉10重量份、抗性淀粉10重量份、麦芽糊精10重量份、透明质酸纳10重量份、樱桃提取物10重量份、猕猴桃提取物10重量份、苹果提取物10重量份、维生素C 5重量份、叶酸3重量份。

先称取脱脂奶粉10重量份、抗性淀粉10重量份、麦芽糊精10重量份、透明质酸纳10重量份、樱桃提取物10重量份、猕猴桃提取物10重量份、苹果提取物10重量份、维生素C 5重量份、叶酸3重量份，混合均匀，采用浓度为30％酒精湿法20目筛网制粒成湿颗粒，55℃烘干3.5小时，20目筛网整粒后，再添加植物乳杆菌LP550菌粉(4.0×10¹⁰CFU/g)10份、鼠李糖乳杆菌S24(4.0×10¹⁰CFU/g)8重量份、植物乳杆菌LP550后生元(细胞数4.0×10¹⁰个/g)2份、硬脂酸镁2份，均匀混合后旋转式压片机压片，得到具有植物乳杆菌LP550膳食补充剂的片剂。

本实施例的组合物用于制备改善骨骼健康和提升运动能力的功能性食品。

实施例12

本实施例的一种组合物，按重量份计，包括植物乳杆菌LP550(4.0×10¹⁰CFU/g)10重量份、植物乳杆菌LP550后生元(4.0×10¹⁰个/g)2重量份、发酵乳杆菌GF1800(4.0×10¹⁰CFU/g)8重量份、麦芽糊精10重量份、山梨糖醇10重量份、玉米肽10重量份、透明质酸纳10重量份、鹅肌肽10重量份、大豆肽10重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母2重量份、叶酸2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E 2重量份、维生素C 2重量份。

该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2-10g/袋具有改善肌骨健康和提高运动能力的固体饮料。

实施例13

植物乳杆菌LP550及其后生元在防治OS的药物中的应用，其中，植物乳杆菌LP550用量为5*10¹⁰CFU/day，植物乳杆菌LP550后生元用量为1.2*10¹¹个/day。所述植物乳杆菌LP550如实施例1所述在维生素D₃+MRS培养基培养获得，所述植物乳杆菌后生元如实施例2所述培养获得。

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)LP550，于2021年4月23日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021437。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括植物乳杆菌LP550后生元，所述植物乳杆菌LP550后生元为以MRS培养基或维生素D₂+MRS培养基或维生素D₃+MRS培养基发酵培养如权利要求1所述植物乳杆菌得到的发酵液进行浓缩、喷雾干燥进而得到含有灭活菌株及其代谢产物的固体粉末。

3.如权利要求2所述组合物，其特征在于，所述维生素D₂+MRS培养基、维生素D₃+MRS培养基分别为在MRS培养基上添加1000～4000IU维生素D₂、1000～4000IU维生素D₃。

4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如权利要求1所述植物乳杆菌LP550活菌株、植物乳杆菌LP550灭活菌株、植物乳杆菌LP550菌株代谢产物、维生素D₂、维生素D₃、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌中的一种或多种的混合物。

5.如权利要求1所述的植物乳杆菌LP550或如权利要求2～4任一项所述的组合物在制备用于改善肌骨健康和/或提高运动能力的功能性食品中的应用。

6.如权利要求1所述的植物乳杆菌LP550或如权利要求2～4任一项所述的组合物在制备用于防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合征的药物中的应用。

7.如权利要求1所述植物乳杆菌LP550或如权利要求2所述的组合物在制备抑制致病菌的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的植物乳杆菌LP550或如权利要求2～4任一项所述的组合物作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品或膳食补充剂中的应用。