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Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung.
Es ist bekannt, dass bestimmte Schimmelpilze aus den Gruppen Aspergillus, Citromyces, Mucor, Penicillium u. a. imstande sind, aus einer nährstoffhaltigen Zuckerlösung grössere Mengen Zitronensäure
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zitronensäuregärende Wirkung von Sterigmatocystis nigra, einer Aspergillusart, die er sich im Am. Pat.-- Nr. 1066358 vom 1. Juli 1913 schützen liess. Spätere Untersuchungen zeigen, dass die Eigenschaft, Zitronensäure aus Zucker unter bestimmten Bedingungen zu bilden, den schwarzen Aspergillusarten, dem Aspergillus niger allgemein zukommt, u. zw. übertreffen diese Pilze die andern früher genannten bei günstigen Bedingungen um ein Mehrfaches.
In der letzten Zeit ist Diese ,,Zitronensäuregärung" Gegenstand vieler wissenschaftlicher Arbeiten geworden, von welchen hier auf die neuesten Arbeiten, welche auch die Ergebnisse der alten Arbeiten erwähnen bzw. kritisch besprechen, hingewiesen sei.
[J. N. Curie :"The eitric acid fennentation of Aspergillus niger."The Journal of the Biological Chemistry, Bd. XXXI (1917), S. 15-37. K. Bernhauer :"Über die Säure bildung durch Aspergillus niger I-III."Biochemische Zeitschrift, Bd. 172 (1926), S. 296-349. H. Amelung :"Beiträge zur Säurebildung durch Aspergillus niger."Hoppe-Syelers Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. 116 (1927), S. 161-209.]
Aus dieser Literatur ergibt sich etwa das folgende Bild über den derzeitigen Stand unserer Kenntnisse über die Zitronensäuregärung :
Als Gärsubstrat eignet sich Rohrzucker, aber auch Maltose, Invertzucker, Glucose und andere Zuekerarten und Zuckeralkohole mit 3'5 und 6 C-Atomen.
Dazu kommen Nährsalze, u. zw. anorganische Stickstoffverbindungen (Ammonsalze oder Nitrate), ferner Kalisalze, Phosphorsäure, Schwefel, Magnesiumsalze und Kalksalze neben fallweise Spuren von stimulierend wirkenden Schwermetallsalzen.
Eine ziemlich hohe Bedeutung wird dem Stickstoffgehalt der Gärflüssigkeit beigemessen, obzwar die Ergebnisse der verschiedenen Arbeiten nicht übereinstimmend sind. Im allgemeinen folgert man aber, dass relativ hohe Stickstoffmengen im Gännedium starkes Myeelwachstum geben und daher hohen Zuckeraufwand für Mycelaufbau und schlechte Zitronensäureausbeute zur Folge haben. Manche Autoren machen überhaupt Stiekstoffhunger für gute Zitronensäureausbeute verantwortlich.
Curie hält die nachstehendeZusammensetzungderLösungfürdieVornahmederZitronensäuregärungmitAspergillusniger in 1000 cm3 für die günstigste :
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<tb>
<tb> Saccharose <SEP> .....................................125 <SEP> bis <SEP> 150 <SEP> g
<tb> NH4NO3 <SEP> ......................................... <SEP> 2#0 <SEP> ,, <SEP> 2#5 <SEP> ,,
<tb> KH2PO4 <SEP> ......................................... <SEP> 0#75 <SEP> ,, <SEP> 1#0 <SEP> ,,
<tb> KH2PO4 <SEP> ......................................... <SEP> 0#75 <SEP> ,, <SEP> 1#0 <SEP> ,,
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> ..................................... <SEP> 0#20 <SEP> ,, <SEP> 0#25 <SEP> ,,
<tb>
angesäuert mit Salzsäure (5-4 Gm3 n/5 HCI) bis zu einer anfänglichen Azidität von Ph 3'4 bis 3-5.
Die Temperatur, bei der die Gärung vor sich geht, liegt je nach den angewendeten Schimmelpilzen zwischen 100 und 400 C.
Neben den bereits einleitend erwähnten Patentschriften beschäftigen sich mit der Durchführung der Zitronensäuregärung noch die nachstehenden Patentschriften : Österr. P. Nr. 101009 (vom 28. Februar 1925, Dr. Josef Szücs), laut welchem besonders ausgewählte Stämme der tauglichen Schimmelpilze Melasse als Nährlösung vergären ; D. R. P. Nr. 426926 (vom 29. März 1926, Dr. Richard Falck), welches als Gärsubstrat stärkeenthaltende feste Substrate verwendet, und Engl. P. Nr. 266414 und Nr. 266415 (vom 28. Februar 1927, Auguste Fernbach, John Lewis Yuil and Bowntree & Co. Ltd.), nach welchen Lösungen von Saccharose oder Zuekerarten mit anfänglicher hoher Azidität, die durch Zusatz von starken Säuren herbeigeführt wird, vergoren werden.
Wie man sieht, streben die Patentnehmer an, den Vorgang der Zitronensäuregärung zu einem gesicherten, wirtschaftlichen, technischen Verfahren auszugestalten. Dies ist auch der Zweck der vorliegenden Erfindung.
Um die gewerbsmässige Darstellung der Zitronensäure wirtschaftlich zu gestalten, ist es notwendig, neben der zweckmässigen Auswahl eines billigen Rohstoffes den Vorgang so zu gestalten, dass der Zucker in möglichst hoher Ausbeute zu Zitronensäure umgesetzt wird, dass die gebildete Zitronensäure nicht
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also in hoher Zeitausbeute und dass die Herstellung der Zitronensäure in derartigen technischen Einrichtungen vor sich geht, dass für die Einheit des aufgewendeten Investitionskapitals die Ausbeute an Zitronensäure eine möglichst hohe wird. Diesen wirtschaftlichen Momenten muss vorangestellt werden die Forderung der dauernden Sicherheit und Gleichmässigkeit der Betriebsausbeuten.
Hier spielt die Auswahl und die Dauerhaltung des Pilzes mit gärgünstigcn Eigenschaften die wichtigste Rolle.
Die Auswahl und die Zucht des Pilzes hat mit Hilfe der bekannten Methoden der mykologisehen Analyse bzw. mykologisehen Züchtung stets so zu erfolgen, dass der Pilz unter den Bedingungen der späteren Arbeitsweise die Höchstleistung erlangt. Es wurde gefunden, dass am geeignetsten für die Durch-
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der Aufzüchtung bzw.
Dauerzüchtung des Pilzes wurde erkannt, dass es notwendig ist, in zweckmässiger Weise in die Züchtung auf Gelatine oder Agar-Agar oder festen Nährboden, von denen das Ernten der Sporen für die Aussaat bei der technischen Gärung vorgenommen wird, zeitweise Kleingärungen unter den gewerbsmässig günstigen Bedingungen vorzunehmen und ferner Wachstumszyklen einzuschalten, bei denen als Nährboden bestimmte organische Säuren enthaltende Früchte oder Teile von Pflanzen, die gleichzeitig vitaminreich sind, angewendet werden. Als solche eignen sich z. B. Zitronen, Orangen, Tomaten und ähnliches. Es hat sich gezeigt, dass gerade bei dieser Art Um züchtung die erhaltenen Sporen äusserst rein säuern.
Auch wird bei dieser Art der Züchtung die Gärkraft des Stammes dauernd erhalten.
Bei der gewerbsmässigen Zitronensäuregärung wird man als Zuckerlösungen technische Gärmaischen verwenden, etwa von gleicher Art, wie sie zur Spirituserzeugung als Rohstoff der alkoholischen Gärung dienen. Sofern man von Rohstoffen ausgeht, welche polymere Kohlehydrate (Stärke, höhere Zuckerarten usw.) enthalten, ist es für den wirtschaftlichen Verlauf der Zitronensäuregärung nicht unwichtig, in richtiger Art und Weise den Abbau dieser polymeren Kohlehydrate zu Zuckern vorzunehmen. Man bedient sich dabei zweckmässigerweise der Abbauwirkung des für die Zitronensäuregärung verwendeten Pilzes selbst, u. zw. allein oder in Kombination mit anderen bekannten Verzuckerungsverfahren.
Neben dem Zucker sind für die Durchführung der Zitronensäuregärung die schon eingangs erwähnten Nährstoffe wichtig, deren Menge so gewählt wird, dass das Wachsen der Pilzkörper unter Berücksichtigung der durch die Art der Durchführung des Verfahrens bedingten Strömung der Bestandteile der Gärmaische an und in die Zelle auf ein notwendiges Minimum herabgesetzt wird. Dadurch werden Bedingungen geschaffen, um eine optimale Verarbeitung des Zuckers auf Zitronensäure zu erzielen. Die günstigste Menge der Nährstoffe, die diesen optimalen Verlauf der Gärung zur Folge hat, hängt von dem verwendeten Pilz (etwa Beschaffenheit der Zellwand usw. ) sowie auch von der Art der Gärung (ruhende
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systematische Versuche ermittelt werden.
Die bisherigen Angaben in der Literatur und die patentierten Verfahren nehmen auf die qualitative Art der Nährstoffe keine besondere Rücksicht. Es hat sich gezeigt, dass unter sonst gleichen Bedingungen die Art der Stickstoffbindungsform, der als Nährstickstoff fungiert, von sehr grosser Bedeutung ist. Es hat sich gezeigt, dass bestimmte organisehe Bindungsformen des Stickstoffes am günstigsten sind, da sie allem Anschein nach in einem bestimmten günstigen Verhältnis mit dem Zucker in die Zelle einwandern, dort ohne wesentlichen Energieaufwand zum Protoplasma aufgebaut werden und dabei auch zu Stoffen (Fennenten), welche auf die Bildung der Zitronensäure günstig wirken.
Derartige Stickstoffnährstoffe sind vor allem Aminosäuren und andere Spaltung-und Abbauprodukte von Eiweissstoffen.
Sie können in bestimmten technischen Zuckerlösungen von vornherein vorkommen oder werden zu denselben in Form von Eiweissspaltungslaugen, die nach bekannten Verfahren gewonnen werden (z. B.
Hydrolysate von Leim u. dgl. ), oder in Form von Ablaugen von vorhergehenden Gärungen zugesetzt. Man kann auch zu den Lösungen, die organisch gebundenen Stickstoff enthalten, mehr oder weniger kleine Mengen anorganisch gebundenen Stickstoffs in Form von Ammonsalzen oder Nitraten oder beiden zusammen zusetzen. Die Menge und die Art des Stickstoffzusatzes richtet sich nach den Gärbedingungen selbst, vor allem nach der Art, in welcher der zu verarbeitende Zucker der Zelle zugeführt wird.
Ferner hat es sieh gezeigt, dass es für die Anhäufung der Zitronensäure, um dieselbe in wirtschaftlichen Konzentrationen zu erhalten, d. h. den Zucker möglichst vollständig zu Zitronensäure zu verarbeiten, ohne dabei die letztere weiter anzugreifen, zweckmässig ist, der gärenden Lösung Stoffe zuzusetzen, welche, ohne den Gärverlauf sonst nachteilig zu beeinflussen, das Vermögen besitzen, die Zitronensäure komplett zu binden oder sie in ihrer Säureeigenschaft abzupuffern. Wehmer und andere haben bereits vorgeschlagen, bei der Gärung zur Neutralisation der Säure Kreide zuzusetzen, was jedoch mit einer Reihe von Nachteilen verbunden war (Entwicklung der Kohlensäure, alkalische Wirkung des hydro- lysierten Kalziumkarbonates, welche zur Ammoniakentwicklung führt usw. ).
Diese Nachteile entfallen vollständig, wenn man für den oben angegebenen Zweck organische Stoffe, die stickstoffhaltig oder stickstoffrei sein können, verwendet, so dass es zur Ausbildung von Niederschlägen nicht kommt. Solche Stoffe können gelöst oder kolloidgelöst von vornherein in technischen Zuckerlösungen enthalten sein oder sie können künstlich zugesetzt werden. Hieher gehören z. B. Eiweissstoffe oder deren Spaltungsprodukte, ferner hochmolekulare Kohlehydrate, die an und für sich nicht gärfähig sind, Pektinstoffe, Ligninsubstanzen oder deren Abbauprodukte und ähnliche Verbindungen.
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Die nach obigen neuen Erkenntnissen gewonnenen Gärsubstrate werden in dem bekannten Verfahren auf Zitronensäure vergoren, worauf aus den Laugen die Zitronensäure in bekannter Weise gewonnen wird. Die Ablaugen können wieder in an sich bekannter Weise weiter verarbeitet werden.
Ausführungsbeispiele :
Der Einfluss der Züchtungsart und der Gärmaische soll durch folgende Ausführungsbeispiele wiedergegeben werden :
Versuch 1 : Verwendet wurde als Gärmaische ein Presssaft aus Zuckerrüben, der entsprechend geklärt wurde durch Kalken und nachherige Saturation mit Kohlensäure, so dass eine Zuckerlösung analog einem Dünnsaft der Zuckerfabriken entstand.
Die Maische enthielt in 1000 cm 150 g Zucker,
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von 15 Tagen bei einer Temperatur von 250 C wurde der Gärversuch abgebrochen und die gebildete Zitronensäure in der Hitze als zitronensaurer Kali : gefällt. Gewonnen wurden aus den ursprünglichen vorhandenen 150 g Zucker 42 g zitronensaurer Kalk, entsprechend 28% des vorgelegten Zuckers. Bei
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boden, der mit der obigen Maische angesetzt war ; die geernteten Sporen machen dann eine Gärung wie im Beispiel 1 beschrieben, durch. Die Sporen nach dieser beendeten Gärung wurden auf den Agarnähr- boden umgeimpft und diese Züchtung fünfmal wiederholt. Nach der zweiten und vierten Umzüchtung wurde eine Züchtung auf sterilisierten Zitronenscheiben eingeschaltet.
Mit so gezüchtete Pilz wurde unter ganz gleichen Bedingungen wie im Versuch 1 eine Ausbeute von 70 g zitronensaurem Kalk entsprechend einer Ausbeute von 46'6% erreicht, wobei noch 12 g Restzucker verbleiben. Der zitronensaure Kalk enthielt neben 67% Zitronensäure noch 2% Oxalsäure.
Versuch 3 : Es wurde als Gärmaische der Rübenzuekersaft wie im Versuch 1 angewendet. Von
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sterilisiert und in das Gärgefäss eingefüllt. Nach dem Abkühlen wurde sie mit Sporen von Aspergillus niger, welcher ähnlich wie im Versuch 2 gezüchtet wurde, beimpft. Die Züchtung bestand hier aus fünf Zyklen, wobei nacheinander die Sporen auf stark zitronensaurer Agar-Agar-Nährlösung, der Gärmaische selbst und Orangenscheiben gezüchtet wurden. Die unter gleichen Bedingungen wie früher durchgeführte
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beute von 693% Kalziumzitrat auf vorgelegtem Zucker. Das gewonnene Kalziumzitrat enthielt 68% Zitronensäure neben 0'5% Oxalsäure, war also weitestgehend rein.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung von Lösungen von Zucker oder andern Kohlehydraten oder gärfähigen Kohlenstoffverbindungen mit Hilfe von Schimmelpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die ausgewählten Schimmelpilze in der Weise züchtet, dass man bei der Züchtung der Pilzstämme auf Gelatine, Agar-Agar oder festem Nährboden, von dem man die Aberntung der aussaatfähigen Sporen vornimmt, Arbeitszyklen einschaltet, bei denen man den Pilz auf flüssigem Nährmedium wachsen lässt, welches dem der gewerbsmässigen Gärung entspricht und ferner Wachstumszyklen auf derartigen natürlichen festen Nährböden, wie z. B. Früchten, welche organische Säuren (z. B. Zitronensäure oder Gerbsäure) enthalten und gleichzeitig vitaminreich sind, wie z.
B. Zitronen, Orangen u. dgl.
2. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung von Zucker oder andere Kohlehydrate oder andere gärfähige Kohlenstoffverbindungen enthaltenden technischen Gäl1naischen mit