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Verfahren zur Gewinnung von Butylalkohol, Aceton und Isopropylalkohol
auf gärtechnischem Wege Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Gärungserzeugnissen,
die in der Hauptsache aus Butvlalkohol bestehen und außerdem Aceton und Isopropylalkohol
enthalten, aus Zucker enthaltenden Kohlehvdratmaischen. Es ist bekannt, daß es eine
Gruppe von Bakterien gibt, die durch Vergärung stärkefreier Kohlehydratmaischen
Butylalkohol, Aceton und Isopropylalkohol ergeben. Ein Vertreter dieser Gruppe ist
bekannt als C. Americanum (P r i n g s h e i m ), der hauptsächlich Butylalkohol
mit einer geringen Menge Isopropylalkohol und einer noch geringeren Menge Aceton
liefert. Das Verhältnis dieser Gärprodukte ist annähernd konstant, unabhängig von
den Bedingungen, unter denen die Gärung bewirkt wird. Ein anderer Vertreter dieser
Bakteriengruppe ist bekannt als C. Saccharobutylicumgamma. Er liefert in der Hauptsache
Butylalkohol mit einer kleineren Menge Aceton und einer noch kleineren Menge Isopropylalkohol.
Das Verhältnis ist hier ebenfalls annähernd konstant, unabhängig von den eingehaltenen
Gärungsbedingungen.
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Diese Bakteriengruppe - einschließlich der beiden im vorstehenden
erwähnten Vertreter zeigt durchgehend die folgenden allgemeinen Kennzeichen: Sie
erzeugen derartige Gärprodukte aus Maischen der genannten Art, sie verflüssigen
Gelatine nicht, sie vergären nicht nennenswert eine Maische, die lediglich aus Körnerstärke
und Wasser besteht. Die bakteriologische Gärprüfung fällt bei Glycerinlösung und
Saccharose positiv aus.
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Gemäß der Erfindung werden die Gärungserzeugnisse durch Benutzung
eines zu dieser Gruppe gehörigen Bakterienvertreters erhalten, der jedoch dadurch
gekennzeichnet ist, daß das Verhältnis von Aceton und Isopropylalkohol in der durch
ihn aus einer zuckerhaltigen Kohlehydratmaische erzeugten Gärprodukte weitgehend
entsprechend den eingehaltenen Gärbedingungen schwanken kann. Diese Bakterienspezies
soll Clostridium Saccharobutylisopropylacetonicum genannt werden. Sie kann durch
bekannte bakteriologische Verfahren gewonnen werden, welche bis zum` gewissen Grade
denen ähnlich sind, die zur Gewinnung von C. Saccharobutylacetonicum beschrieben
wurden, jedoch darüber hinaus unter elektiv er Züchtung im Glycerinmedium durchgeführt
werden. Die Sporen sind widerstandsfähig gegen Erhitzen, so daß sie eine etwa 15
Minuten lange Aussetzung auf eine Temperatur von 85° C überleben.
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Die Erzeugung von Isopropylalkohol und Aceton in weitgehend schwankenden
Verhältnissen, die durch die eingehaltenen Bedingungen und auch durch die vorherrschende
Menge Butylalkohol bestimmt werden, ist kennzeichnend für die vorliegende Erfindung.
Sie kann leicht durch Einstellung der anfänglichen Wasserstoff ionenkonzentration
der
gärenden Maische erreicht werden. In verhältnismäßig stark sauren
Medien ist die gebildete Acetonmenge hoch, die Isopropyl-@ alkoholmenge dagegen
niedrig. Wenn di@_ Reaktion der Maische annähernd neutral so werden höhere Ausbeuten
an Isopropyl-' alkohol und niedrigere Ausbeuten an Aceton erhalten.
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Die für die Gärung beste Temperatur liegt zwischen 30 und d.o°
C, beispielsweise bei 36' C. Nach der Impfung mit einer aktiven Kultur und unter
günstigen Wachstumsbedingungen entwickelt der Organismus kräftig seine eigene Anaerobiose.
Deshalb ist ein vollständiger Ausschluß der Luft aus oder oberhalb der Maische überflüssig,
obgleich der Organismus besser arbeitet, wenn die Maische frei von gelöstem Sauerstoff
ist.
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Der Organismus kann von Kartoffeln, Körnern und anderen Erzeugnissen
abgenommen werden. Reine Kulturen werden erhalten durch submerse Züchtung in Medien,
die Stoffe enthalten, welche für das Wachstum des Organismus, wie erwähnt, günstig
sind, und durch Isolierungs- und subkulturelle Methoden, wie sie dem Fachmann bekannt
sind. Als zweckmäßiges Beispiel für die submerse Züchtung, die bei der Darstellung
der Impfkultur angewandt wird, sei die folgende Arbeitsweise mitgeteilt. Es kann
jedoch auch in anderer Weise gearbeitet werden. Ungefähr 0,5 ccm einer reinen,
freie Sporen enthaltenden Kultur wurden in etwa i o ccm §terile Kartoffelmaische,
die aus 7 bis io o% o Kartoffeln und i bis 4% Maiszucker in sei bestand, übertragen.
Das geimpfte @.l ir wurde unter Einsetzen in ein Bechergläs mit Wasser auf etwa
85° erhitzt, wobei der Spiegel der Masse in dem Rohr unterhalb des Wasserspiegels
in dein Becherglas lag. Das Rohr blieb 15 Minuten darin. Dann wurde es unmittelbar
durch Eintauchen in kaltes Wasser gekühlt. Das Rohr wurde bei etwa 35 bis 37° 15
bis 24 Stunden lang bebrütet. Innerhalb dieser Zeit trat eine lebhafte Gärung auf.
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Diese io ccm Subkultur würden dann als Impfmittel für einen Glaskolben
benutzt, der etwa Zoo bis 500 ccm einer ähnlichen sterilen Kartoffelmaische
enthielt. Nach der Impfung wurde diese bei etwa 35 bis 37° 6 bis 2o Stunden lang
bebrütet. Auf diese Weise wurde eine geeignete Menge Impfmittel für das zu vergärende
Maischv olumen dargestellt. Eine Impfkultur von etwa 2 bis 5 % des Maischvolurnens
zeigte gute Ergebnisse. Es können jedoch auch größere oder kleinere Impfmittelmengen
benutzt werden.
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Um die Identifizierung dieses Organismus zu erleichtern, sei er mit
Hilfe der Bestimmungstafel der Society of American Bacteriologists beschrieben.
| II. Einzelheiten der Kultur |
| i. Nährboden Agar Stich. |
| Alter ........................ 5 Tage |
| Temperatur .................. 36"C |
| Wachstum.................... kein aerobisches |
| Wachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . anaerobisch,
rein am besten am |
| Boden |
| Farbe........................ Kremfarbe |
| Geruch..............'......... nicht beobachtet |
| III. Physiologie |
| i. Besttemperatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . 3o bis
q0° C |
| 2. Günstigstes pH von Rohrmelasse- |
| nährflüssigkeit................... ungefähr q.,o bis 6,o |
| 3. Gelatinestich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . keine
Verflüssigung in q.o Tagen |
| q.. Anaerobischer Organismus |
| Entwickeltes Gas................ C02 und H, |
Das Hauptmerkmal reiner Kulturen dieses Vertreters anaerober, sporenbildender Bakterien
ist die weite Schwankung des Verhältnisses von Aceton zu Isopropylalkohol in den
Gärprodukten, die durch Vergärung zuckerhaltiger Kohlehydratmaischen in Abhängigkeit
von den eingehaltenen Gärungsbedingungen hervorgerufen wird. Außerdem haben die
Bakterien folgende drei bestimmenden Merkmale, die auch auf die anderen Vertreter
der vorher erwähnten Gruppe zutreffen, nämlich das Unvermögen, Gelatine zu verflüssigen,
das Unvermögen, ohne Hilfsmittel beträchtliche Mengen Gärprodukte aus Körnerstärkmaischen
zu entwickeln, und die Fähigkeit, eine positive bakteriologische Gärprobe für Glycerinlösung
und Saccharose zu liefern.
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Mit dem Ausdruck >>ein Organismus der Gattung Clostridium Saccharobutylisopropylacetonicum«
ist ein anaerobes, sporenbildendes Bakterium mit diesen vier wesentlichen Bestimmungsmerkmalen
gemeint.
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Die folgenden Stoffe wirkten sämtlich bei einer balcteriologischen
Gärprüfung positiv, was durch Gasentwicklung bewiesen wurde: Arabinose, Dextrin,
Galactose, Lactose, Lävulose, Maltose, Mannose, Saccharose, Xylose, Glucose, Glycerinlösung,
Glykogen, Inulin, Mannit, Melizitose, a-Methylglucosid, Raffinose, Salacin, Trehalose,
lösliche Stärke, stärkehaltige Rohstoffe, wie Mais, Roggen, "reizen, Reis, Gerste.
Bei Cellulose, Ouerzit, Ervthrit und Rhamnose fiel der Gärversuch negativ aus.
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Diese bakteriologischen Gärungsversuche wurden bei einer Temperatur
von etwa 37° C 85 Tage lang durchgeführt. Die Gasentwicklung wurde durch das Anheben
steriler Vaselinpfropfen in den Reagensgläsern gemessen, von denen jedes io ccm
sterile Flüssigkeit von il/, Kohlehydratgehalt enthielt. Die bei diesen Gärversuchen
benutzte Nährflüssigkeit war eine synthetische, Pepton und verschiedene anorganische
Salze über i ccm gewaschenen Sand enthaltende Flüssigkeit. Zum Impfen wurden aus
Pasteurpipetten 8 Tropfen einer ,4 Tage alten Kultur gegeben, die in einer Kalbfleischaufgußbrühe
über Hirn entwickelt worden war, die vorher aus gut vergärten Stammkulturen mit
niedrigem Zuckergehalt geimpft worden war.
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Selbstverständlich können geringe Abweichungen in der Gasbildung bei
solchen Versuchen mit verschiedenen Spielarten oder mit der gleichen Spielart eines
Organismus dieser Gattung auftreten, u. a. je nach dem Alter der Kultur und -den
Züchtungsbedingungen, denen der Organismus unterworfen worden ist. Während, wie
oben erwähnt, eine d. Tage alte Kultur, z. B. Glvcerinlösung und lösliche Stärke,
mit einiger Verzögerung vergärte, wurde mit einer aktiven, i Tag alten Kultur Glvcerinlösung
und lösliche Stärke glatt vergoren. Die grundlegenden Bestimmungsmerkmale, wie sie
im vorstehenden angegeben worden sind, schwankten jedoch nicht.
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Die Prüfungen sind selbstverständlich bakteriologische Gärprüfungen
an Maischen mit il/" Kohlehydratgehalt und dürfen nicht mit gewerblichen Gärungen
von Maischen mit einem Kohlehydratgehalt von etwa 5 bis 7"/, verwechselt werden.
Z. B. zeigte sich, daß eine Spielart der Spezies Clostridium Saccharobutylisopropylacetonicum
sehr gute Ausbeuten beim Vergären nicht invertierter Melassemaischen mit 5 bis 7
°/o Zuckergehalt ergibt. Es wurde jedoch eine andere
Spielart gefunden,
die verhältnismäßig niedrige Ausbeuten bei solchen uninvertierten Melassemaischen,
dagegen sehr gute Ausbeuten bei invertierten Melassemaischen von gleicher Zuckerkonzentration
liefert. Die Erklärung hierfür ist die, daß zwar alle Spielarten der Spezies eine
positive bakteriologische Prüfung bei Saccharosegärung ergeben, einige Spielarten
jedoch Saccharose vollständiger vergären als die anderen. Solche Schwankungen in
der Vergärung von Saccharose gibt es bei verschiedenen Spielarten aller Spezies
der Butylalkohol erzeugenden Bakterien.
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Der Gelatineverflüssigungsversuch wurde mit einer ro,8°/oigen Lösung
von Bactonährgelatine gemacht, die 0,25 g Glucose je z oo ccm Lösung enthielt.
B:acton;ährgela@tine ist eine Nährlösung, die 3 Teile Rindfleischextrakt, 5 Teile
Pepton und zoo Teile Gelatine enthält. Die Versuche wurden mit aktiven 2o-Stunden-Kulturen
durchgeführt. Die Rohre entwickelten gut Gas, jedoch wurde keine Verflüssigung selbst
nach 40tägiger Bebrütung bei ungefähr 35° beobachtet.
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Im folgenden werden einige besondere Durchführungsformen der Erfindung
als Beispiel für die Arbeitsweise nach der Erfindung beschrieben. Der Ausdruck Butylalkoholacetonisopropylorganismus
in der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich auf den hier beschriebenen
Organismus Clostridium Saccharobutylisopropylacetonicum. Beispiel r Eine 5 °/oige
Zuckerlösung wird durch Zugeben von 15 kg Schwarzschnur- (blackstrap-) Rohrzuckermelasse
zu ungefähr 149 1 Wasser hergestellt. Ein Nährmittel, bestehend aus 3009
Malzkeimen und Schwefelsäure, wird zugegeben, um die titrierbare Säure der Maische
nach der Sterilisierung auf ungefähr 2, r ccm 1/1ö normal titrierbarer S äure j
e z o ccm Maische und den pH-Wert auf ungefähr 4,5 zu bringen. Die Maische wurde
durch 2o Minuten langes Sieden und 40 Minuten langes Kochen mit Dampf unter einem
Druck von 1,4 kg/qcm sterilisiert. Dann wird auf 36° gekühlt. Die sterile Maische
wird mit einer aktiven Kultur des beschriebenen Organismus geimpft. Das Volumen
der Kultur betrug etwa 21/,1/, des Maischevolumens. Eine normale Gärung trat ein
und war in etwa 48 Stunden beendet. Die Gärprodukte wurden von der Maische entfernt
und durch Destillation abgetrennt. Der Zuckerverbrauch war 851/" die Ausbeute betrug
29 °/o des Gewichtes des eingemaischten Zuckers und 34.°/o des verbrauchten Zuckers.
Die Gärprodukte setzen sich aus etwa 64°% Butylalkohol, 341/, Aceton und 2°/oIsopropylalkohol
zusammen. Beispiel 2 Eine ähnliche Melassemaische mit einem pH von etwa 4,5 und
einem Gehalt von 7°/a Zucker wurde gleichfalls sterilisiert, geimpft und vergoren.
Die Gärung erforderte ungefähr die gleiche Zeit, die Ausbeute war annähernd dieselbe
wie in Beispiel z und betrug etwa 22'/, des eingemaischten und etwa 37'/, des verbrauchten
Zuckers. Der Zuckerverbrauch betrug ungefähr 65 °/p des eingemaischten Zuckers.
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Beispiel 3 Eine Lösung von 5 % Zuckergehalt wurde durch Zusatz
von Melasse zu Wasser hergestellt. Nährmittel wurden wie im Beispiel r zugesetzt.
Die titrierbare Säure und das PH der Maische wurden so eingestellt, daß eine titrierbare
Säure von etwa 1,5 ccm und ein PH-Wert von etwa 5;5 nach der Sterilisierung und
Abkühlung auf 36° erhalten wurde. Die Gärung war nach etwa 72 Stunden vollendet,
und der Zuckerverbrauch betrug etwa 70'A.
Die Gärprodukte bestanden aus 751/,
Butylalkohol, 2o % Isopropylalkohol und 5 %
Aceton. Die Ausbeute
betrug :250/, des gesamten eingemaischten und 33 °/Q des verbrauchten Zuckers. Eine
im übrigen ähnliche Maische mit einem Gehalt von 7% Zucker gab ungefähr dieselbe
Menge an Gärprodukten, jedoch einen geringeren Zuckerverbrauch.
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Die raschesten Gärungen und die besten Ausbeuten werden im allgemeinen
mit diesem Organismus bei zuckerhaltigen Maischen erzielt, die auf niedrige pH-Werte
eingestellt sind. Bei diesen Gärungen mit niedrigem pFI sind Butylalkohol und Aceton
die Haupterzeugnisse, während Isopropylalkohol in :Mengen von Spuren bis zu zo°/o
vorhanden ist. Ungefähr 6o bis 70"/, Butylalkohol und 3o bis 38 °1o Aceton werden
aus Melassemaischen mit PH-Werten zwischen etwa ,4 und 5,3 gewonnen, vorausgesetzt,
daß reichlich Nährboden vorhanden ist; sei es als zugesetzte Proteinsubstanz, sei
es als von Natur vorhandener Bestandteil der Maische. Mit diesen Maischen von niedrigem
PH-Wert werden höherer Zuckerverbrauch und größere Ausbeuten erzielt als mit Maischen
von hohem PH, wenn die anderen Gärungsverhältnisse ähnlich sind. Melassemaischen
mit PH-Werten bis zu etwa 8 können benutzt werden; bei niedrigerem pH werden jedoch
raschere Gärungen erreicht als bei den höheren PH-Werten. Bei niedrigen pH-Werten
liegt die Gärungsdauer zwischen etwa q:8 und 72 Stunden, während Zeiträume von 65
bis roo Stunden zur Vollendung der Gärungen bei ähnlichen Maischen mit höheren p11
-Werten erforderlich sind.
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Die in Maischen mit höherem p,1 hergestellten Gärungsprodukte enthalten
etwa 65 bis
So% Butylalkohol, io bis 30°/o Isopropylalkohol und
einige Prozente bis etwa 2o1/0 Aceton. Die geringsten Acetonmengen werden mit den
Maischen von höchstem pH gewonnen. Nach einer allgemeinen Regel kann mit steigenden
PH-Werten der relative Anteil an Isopropy lalkohol erhöht und -der relative Anteil
an Aceton erniedrigt werden.
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Die Änderung des pH-Wertes der Maischen bietet ein Mittel, um in weitem
Maße die Ausbeuten an Aceton und Isopropylalkohol unter Beibehaltung hoher Ausbeuten
an Butylalkohol zu verändern. Man kann also den Bedürfnissen anderer Verfahren entgegenkommen,
und der Handelswert der vereinigten Gärprodukte, die durch den Organismus gebildet
werden, kann beliebig geändert werden. Im Vergleich zu einer Gewinnungsanlage, bei
der bisher zwei Organismen benutzt wurden, um große Ausbeuten an Isopropylalkohol,
Aceton und Butylalkohol zu gewinnen, bietet das Verfahren nach der Erfindung den
praktischen Vorteil, daß Kulturen von nur einem Organismus in einer einzigen Gäranlage
benutzt werden und daß die Bildung von Aceton und Isopropylalkohol durch Einstellungen
der Maische geändert werden kann, während ein hoher Zuckerverbrauch und ein hoher
allgemeiner Wirkungsgrad eingehalten wird.
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Die Bakterien arbeiten gut in Maischen, die 2 bis 7'1, Zuckerstoffe
oder sogar mehr enthalten. Melasselösung ist ein geeigneter Rohstoff, jedoch können
auch andere zuckerhaltige Stoffe, wie Maltose, Dextrose und Dextrin, oder Stoffe,
die diese Substanzen enthalten, benutzt werden. Der Ausdruck zuckerhaltig in der
Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich auf Stoffe, wie z. B. Saccharose,
Dextrose, L ävulose und hydrolysierte Kohlehydrate, die Zucker ähneln und als Zuckerarten
betrachtet werden können, wie z. B. Dextrin, Inulin und zuckerartige Stoffe enthaltende
Sirupe, die in wässeriger Lösung unter der Wirkung der beschriebenen Bakterien mit
günstigen Wachstumsbedingungen vergärbar sind. Der Ausdruck ist ge--i einen Unterschied
gegenüber Gew * lilt, un treidestärkestoffen, Körnern u. dgl. zu machen,
die durch die beschriebenen Bakterien nicht leicht verflüssigt werden und nicht
durch sie vergoren werden können, ohne in die Form zuckerartiger Kohlehydrate umgewandelt
zu sein. Die Stärke in Kornmaischen, die unter ,_f kg/C1,12 Dampfdruck i Stunde
lang sterilisiert ist, wird unter der Einwirkung der Bakterien nicht vergoren. Obgleich
eine geringe Gasbildung nach einer ausgedehnten Bebrütung solcher Stärkemaischen
beobachtet werden konnte, war doch keine wesentliche Menge von Gärprodukten gebildet
worden. Eine reichliche Zuführung von Nährstoff ist notwendig, um die Proteine für
das Wachstum der Bakterien zur Verfügung zu stellen und höchste Ausbeute zu erzielen.
Der Nährstoff ist bisweilen in reichlichen Mengen in den zuckerhaltigen Stoffen,
z. B. in Rübenmelassen, enthalten. Verschiedene protein- oder stickstoffhaltige
'Nährstoffe, wie z. B. Proteine tierischer oder pflanzlicher Herkunft, die in Kartoffeln,
Maiskleber, Roggen, Gerste, Weizen, Reis, Rübenpülpe, Sojabohnenmehl, Kopramehl,
Baumwollsamenmehl, Casein, Leinsamenmehl, Malzkeimen, Schlachthausabfällen, Abwasserschlamm,
Knochenmehl, Äthylalkoholschlempe oder minderwertiger Hefe gefunden werden, können
gegebenenfalls noch Hydrolyse usw. zugesetzt werden. Auch kann Harnstoff benutzt
werden. In der Beschreibung sollen die Ausdrücke Proteinstoff, stickstoffhaltige
Stoffe und Nährmittel sich sowohl auf Harnstoff als auch auf andere Nährstoffe wie
die eben erwähnten beziehen. Ein großer Überschuß an Proteinstoff kann vorhanden
sein. Es ist jedoch überflüssig, mehr als eine reichliche Menge vorzusehen, um ein
gutes Wachstum des Organismus zu unterhalten.
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Durch Zusatz verhältnismäßig geringer Mengen von Salzen oder Stoffen,
die anorganische oder organische Ammoniumverbindungen enthalten, wie z. B. Sulfat,
Carbonat, Chlorid, Phosphat, Acetat, Lactat, Hydroxy d, Butyrat, kann die Gärung
beschleunigt und der Zuckerverbrauch gesteigert werden. Auch kann Harnstoff an Stelle
von oder in Verbindung mit anorganischen Ammoniumyerbindungen benutzt werden, um
die Gärung zu beschleunigen und die Abspaltung zu verändern. Durch Zusatz anorganischer
Ammoniumstoffe wird weniger Butvlalkohol und mehr an niedriger siedenden Gärprodukten
erhalten. Geringe Mengen wasserlöslicher anorganischer Ammoniumstoffe, wie etwa
0,0002 bis o,i °/o des 1-Iaischegewichts, sind ausreichend. Es kann jedoch auch
mehr benutzt werden. So kann Harnstoff verwendet werden, um die Proteine pflanzlichen
oder tierischen Herkommens zu ergänzen, und er kann zur Ergänzung oder als Zusatz
für die Ammoniumverbindungen dienen.
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Bei einem gegebenen pHWert kann die titrierbare Azidität von Maischen
verschiedener Konzentration oder von verschiedenen Maischstoffen etwas schwanken.
Werte zwischen etwa o,-2 und 2,5 ccm titrierbarer Säure je io ccm Maische entsprechen
pH-Werten von etwa 6 bis .4. Die titrierbare Säure kann jedoch auch mehr oder weniger
als die angegebenen Werte betragen, wenn die pH-Werte genau eingestellt sind. Der
p11-Wert und der
Titrationswert können in bekannter Weise eingestellt
werden, in melassehaltigenMaischen durch Änderung der Anteile von Rüben- und Rohrzuckermelasse.