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WO2014007549A2 - 에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 의약제제 - Google Patents

에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 의약제제 Download PDF

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WO2014007549A2
WO2014007549A2 PCT/KR2013/005922 KR2013005922W WO2014007549A2 WO 2014007549 A2 WO2014007549 A2 WO 2014007549A2 KR 2013005922 W KR2013005922 W KR 2013005922W WO 2014007549 A2 WO2014007549 A2 WO 2014007549A2
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WO
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colitis
preventing
composition
cysteine
allyl
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PCT/KR2013/005922
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WO2014007549A3 (ko
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김순배
김광순
김완배
곽의종
전선덕
윤형영
함기백
김은희
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주식회사파마킹
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Publication date
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating colitis. More specifically, the present invention relates to a composition comprising S-allyl-L-cysteine as an active ingredient and useful for preventing or treating colitis and a method of using the same.
  • Colitis is largely classified into two types: infectious colitis such as amoeba dysentery, flagellosis, intestinal tuberculosis and mycosis, and nonspecific colitis such as Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • ulcerative colitis crocer's disease
  • crohn's disease ulcerative colitis
  • the ulcerative colitis crohn's disease
  • the majority of chronic colitis was colonic tuberculosis, but as the living environment becomes westernized, ulcerative colitis and Crohn's disease are gradually increasing.
  • ulcerative colitis is characterized by inflammation only in the mucosa and submucosa, and there is no inflammation in the muscle layer and the membrane layer, which are tissues below this. It usually affects the anus and rectum. Symptoms include squeezing abdominal pain, anal bleeding, and discharge of pus or abnormal mucus in the stool. If this lasts for a long time, it can lead to colorectal cancer.
  • the current medical treatment method is to calm the inflammatory response, to heal tissue damage, and to relieve symptoms such as diarrhea, bloody stool and abdominal pain. To this end, it is necessary first to accurately evaluate the area and extent of ulcerative colitis and the extent of inflammation before starting treatment, and the effectiveness of the treatment is determined based on the condition before treatment.
  • ulcerative colitis The cause of the ulcerative colitis has not been identified yet, but some knowledge about the development process has been accumulated and various drugs have been developed and used.
  • Treatment agents for ulcerative colitis that are widely used can be classified into anti-inflammatory agents, corticosteroids, immunosuppressants, and antibiotics.
  • anti-inflammatory agents such as sulfasalazine and mesalazine, such as corticosteroids, prednisone, prednisolone, hydrocortisone and entocort, budesonide, etc.
  • antibiotics include imuran, 6-MP, cyclosporine and methotrexate, and antibiotics such as metronidazole and ciprobay, and short-chain fatty acids and glutamine.
  • Local anesthetics such as allopurinol and dimethyl sulfoxide, such as lidocaine, and other agents, such as nicotine, heparin, ketotifen, thalidomide, colony stimulating factor, and epidermal growth factor epidermal growth factors).
  • Crohn's disease can occur in any part of the digestive organs, but it is an inflammatory growth disease that occurs mainly in the distal end of the large intestine connected to the intestinal tract, and causes intestinal symptoms such as diarrhea, weight loss, lower abdominal pain, fever and rectal bleeding.
  • Complications include anemia, malnutrition, musculoskeletal and renal dysfunction, and ophthalmic symptoms.
  • Complications can include intestinal stenosis, intestinal abscesses, and fistulas, and rarely cause intestinal cancer. Inflammation of the intestines is chronic, has a high recurrence rate, and deep granules invade the granuloma. Many young people in their 20s and 30s, the exact cause is still unknown.
  • Treatment should be distinguished from other infectious bowel disease, ischemic bowel disease, ulcerative colitis, and tuberculosis bowel disease. After conclusive diagnosis with endoscopic biopsy and radiographic imaging, conservative treatment such as fluid therapy and drug therapy Use together to heal. In principle, medication is given. In severe cases, steroids are administered. If symptoms are relieved, sulfasalazine or mesalazine is administered. To reduce complications and recurrences, medicines should be taken for nearly a lifetime. If complications occur that are not controlled by drugs, surgery may be possible but not cured and may return after surgery.
  • Sulfasalazine which is used as an anti-inflammatory agent for the treatment of ulcerative colitis and Crohn's disease, is a drug in which sulfapyridine molecules, sulfa-based antibiotics, and 5-aminosalicylic acid (5-ASA) molecules similar to aspirin are combined. By separating the bond between these two molecules, 5-ASA, which exhibits anti-inflammatory action, is released.
  • Sulfasalazine is effective for ulcerative colitis and Crohn's and Behcet's disease invading the large intestine, and for ulcerative colitis, this drug is prescribed to prevent relapse (replay) in remission (without symptoms). The disease has not been proven to be effective in preventing replay. Side effects of sulfasalazine can cause skin rashes, nausea, abdominal pain, liver failure, and rarely decreased bone marrow function.
  • mesalazine or mesalamine
  • Suppositories and enemas are effective when the rectum or left intestine is inflamed, respectively, and may be used to maintain remission.
  • Oral mesalamine has recently been shown to be effective in maintaining remission of these diseases as well as being effective in active ulcerative colitis, Crohn's and Behcet's disease.
  • olisalazine which combines two molecules of 5-ASA, and other non-toxic molecules instead of sulfypyridine Collagen and ipsalazide, pentasa and azaran adsorbed on cellulose or resin so that 5-ASA is gradually released, and acidity (pH) in the intestine is alkaline
  • examples include asacol, rowasa and salalofalk, claversal and mesasal, which are packaged to free 5-ASA.
  • Sulphasalazine and dipentatum are effective for inflammation of the large intestine, while asacol, salopalk and pentasa are also effective for inflammation of the small intestine.
  • the mesalin preparations are widely used for the treatment of inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis or Crohn's disease, but they are still allergic reactions such as allergic skin rash, abnormal hyperthermia caused by drugs, bronchospasm and lupus erythematosus syndrome. In addition, there is a problem that can cause side effects such as nausea, vomiting, headache.
  • Non-Patent Document 1 describes that sulfasalazine and steroids are effective in carrageenan-induced inflammation models, and that steroids and immunosuppressants inhibit the production of cytokines in immune cells such as T cells. .
  • sulfasalazine and steroid preparations there are side effects as described above, and in the case of steroid preparations, there is a problem in that the use range is largely limited due to the side effect of rapidly increasing weight.
  • Non-Patent Document 1 Cronstein BN, Montesinos MC and Weissman G, Salitylate and sulfasalazine, but not glucocorticoid, inhibit leukocyte accumulation by an adenosinedependent mechanism that is independent of inhibition of prostaglandin synthesis and p105 NF- ⁇ B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, May 25, 1999, 96 (11): 6377-6381
  • Another object of the present invention is to provide a method of using the pharmaceutical composition for preventing or treating colitis.
  • the composition for preventing or treating colitis is S-allyl-L-cysteine, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a It contains solvates or hydrates as an active ingredient, and exhibits anti-inflammation activity against colitis.
  • composition for preventing or treating colitis comprises S-allyl-L-cysteine, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate or hydrate thereof as an active ingredient, and anti-inflammation activity and antioxidant activity against colitis. It may represent (Anti-Oxidant) activity.
  • composition for preventing or treating colitis may include 5 wt% to 99.9 wt% of the es-allyl-L-cysteine.
  • composition for preventing or treating colitis is any one selected from the group consisting of the purified S-allyl-L-cysteine from Allium genus plants, synthesized, prepared by fermentation, and mixtures thereof. It may be.
  • composition for preventing or treating colitis may further include an anti-inflammatory agent or an antioxidant for the composition for preventing or treating colitis.
  • the composition for preventing or treating colitis is the anti-inflammatory agent ibuprofen (ibuprofen), ketoprofen (ketoprofen), flurbiprofen (flurbiprofen), fenofene (feno-profen), naproxen (naproxen), phyroxicam (piroxicam), tenoxicam, isoxiccam, melo-xicam, indomethacin, aceclofenac, diclofenac and combinations thereof
  • the antioxidant is selected from the group consisting of vitamin A, vitamin C, vitamin E, carotenoids, zinc, copper, iron, manganese, lutein, zeaxanthin, selenium, glutathione (GHS), lycopene and combinations thereof It may be either one.
  • the pharmaceutical preparation ( ⁇ ) may be selected from the group consisting of oral administration preparations, mucosal application preparations, injections, inhalants and external preparations comprising the composition for preventing or treating colitis.
  • a composition for preventing or treating colitis is an active ingredient of S-allyl-L-cysteine, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate or hydrate thereof. It includes, and anti-inflammation (Anti-inflammation) activity in colitis.
  • the s-allyl-L-cysteine is one of the garlic active ingredients aged and has an anti-oxidant effect on atherosclerosis, and anti-cancer activity against some cancer cell lines (Proceedings of the American Association for Cancer Research, 30, p181, And various efficacy have been reported.
  • 8-oxo-deoxyguanosine is the active ingredient of the above es-allyl-L-cysteine in a mouse model induced colitis with dextran sodium sulfate (DSS).
  • DSS dextran sodium sulfate
  • solvates or hydrates thereof can be used as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • a pharmaceutically or food acceptable salt of es-allyl-L-cysteine may be used.
  • such salts include acid addition salts and quaternary ammonium salts.
  • the acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride salt, hydrobromide salt, iodide salt, sulfate salt, and phosphate salt, oxalate salt, maleic acid salt, fumaric acid salt, lactic acid salt, malic acid salt, succinic acid salt, tartaric acid salt, Organic acid salts, such as ancinh acid salt and methanesulfonic acid salt, are mentioned.
  • the present invention is not limited thereto.
  • quaternary ammonium salts for example, lower alkylhalogenides such as methyl iodide, methyl bromide, ethyl iodide, ethyl bromide and the like; Lower alkylsulfonates such as methylmethanesulfonate and ethylmethanesulfonate; And quaternary ammonium salts such as lower alkylarylsulfonate such as methyl-p-toluenesulfonate.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the composition for preventing or treating colitis includes S-allyl-L-cysteine as an active ingredient, and at least two drugs are mixed with anti-inflammation activity and anti-Oxidant activity against colitis. Although not used, it was confirmed that it has an excellent prophylactic and therapeutic effect against colitis.
  • sulfasalazine which is generally used for colitis, may have skin rashes, nausea, abdominal pain, abnormal liver function, rarely reduced bone marrow function as side effects, and difficulty in maintaining remission.
  • the composition for preventing or treating colitis includes S-allyl-L-cysteine as an active ingredient, and the S-allyl-L-cysteine does not have side effects such as sulfasalazine, and there is no problem of using steroid preparations at the same time. In the prevention and treatment of colitis, there is a wide range of applications.
  • composition for preventing or treating colitis may include 5 to 99.9% by weight of the es-allyl-L-cysteine.
  • the colitis includes infectious colitis and inflammatory bowel disease.
  • the inflammatory bowel disease refers to typical diseases, including idiopathic chronic persistent types of nonspecific enteritis, ie ulcerative colitis and Crohn's disease. However, it is not limited thereto.
  • the composition for preventing or treating colitis may be any one selected from the group consisting of purified, synthesized, and fermented S-allyl-L-cysteine from Allium genus plants.
  • the s-allyl-L-cysteine is a leek such as garlic (garlic), elephant garlic (elephant garlic), onion (onino), leek (scallion) and the like by the method described in European Patent Publication No. EP 0429080A1.
  • (Allium genus) may be prepared from plants, and may be prepared by various methods known in the art, such as synthesis and fermentation.
  • Es-allyl-L-cysteine, a pharmaceutically or food acceptable salt thereof, or a solvate or hydrate thereof, which is an active ingredient of the composition of the present invention may be administered to the patient itself, but generally their effective
  • a composition comprising one or two or more components may be formulated and administered or may be administered in combination with other useful anti-inflammatory or antioxidant agents to formulate in the form of a co-formulation.
  • the anti-inflammatory agent is ibuprofen (ibuprofen), ketoprofen (ketoprofen), flurbiprofen (flurbiprofen), feno-profen (nanoxen), pyroxicam (piroxicam), tenoxam ( tenoxicam, isoxicam, melo-xicam, indomethacin, indomethacin, aceclofenac, diclofenac, and any combination thereof, and the antioxidant
  • the agent may be any one selected from the group consisting of vitamin A, vitamin C, vitamin E, carotenoids, zinc, copper, iron, manganese, lutein, zeaxanthin, selenium, glutathione (GHS), lycopene and combinations thereof.
  • the pharmaceutical preparation according to another embodiment of the present invention may be selected from the group consisting of oral administration preparations, mucosal application preparations, injections, inhalants and external preparations comprising the composition for preventing or treating colitis.
  • Formulations for oral administration include hard and soft capsules, tablets, suspensions, syrups or powders, sustained-release preparations, enteric preparations, granules, lactose preparations, fine granules, pills, extracts, solutions, fragrances, emulsions, syrups, elixirs In practice, this includes, but is not limited to, flow excipients, precipitants, tinctures, spirits, medicaments, and the like.
  • Mucosal applications include, but are not limited to, troches, oral tablets, sublingual tablets, suppositories, nasal sprays. Injections include, but are not limited to, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, implantable tablets, and the like.
  • External preparations include, but are not limited to, antifoams, eye drops, ear drops, ophthalmic ointments, pasta preparations, cataplasmics, lining agents, lotions, coating agents, spraying agents, external preparations, and the like.
  • Formulations of the present invention include one or more active carriers in addition to one or more active ingredients, such as excipients such as starch, lactose, carboxymethylcellulose, kaolin, water, gelatin, alcohols, glucose, gum arabic, tra Additional additive components such as binders such as gacanta rubber, disintegrants such as starch, dextrin, sodium alginate, lubricants such as talc, stearic acid, magnesium stearate, liquid paraffin, and dissolution aids may be included.
  • active ingredients such as excipients such as starch, lactose, carboxymethylcellulose, kaolin, water, gelatin, alcohols, glucose, gum arabic, tra Additional additive components such as binders such as gacanta rubber, disintegrants such as starch, dextrin, sodium alginate, lubricants such as talc, stearic acid, magnesium stearate, liquid paraffin, and dissolution aids may be included.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • es-allyl-L-cysteine may be added in amounts of 0.0001 to 90% by weight, preferably 0.1 to 50% by weight, based on the raw materials in the manufacture of foods or beverages and the like.
  • the amount may be below the above range, but the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • Self-explanatory Foods using the food composition of the present invention include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, dairy products including other noodles, gum, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcohol drinks and vitamin complexes, and the like, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory and anti-oxidative activity of S-allyl-L-cysteine is excellent, while preventing and improving colitis.
  • Allyl-L-cysteine has no side effects and has a wide range of applications for colitis.
  • DSS dextran sodium sulfate
  • Figure 3 is a disease activity index (DAI) score for the mouse of each group.
  • DAI disease activity index
  • Figure 4 is a graph showing the average of the colon length for each group.
  • FIG. 5 to 6 are photographs (FIG. 5) and graphs (FIG. 6) showing pathological observations according to Hematoxylin & Eosin staining (H & E stain) according to Examples, Comparative Examples, and Comparative Examples.
  • FIGS. 7 to 10 are graphs showing the results of inflammatory cytokines (Inflammatory cytokine) measurement in accordance with the Examples, Comparative Examples and Controls, respectively, the results graph of IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ and IL-12 .
  • FIG. 11 to 12 are graphs showing antioxidant activity measurement results according to Examples, Comparative Examples, and Comparative Examples, respectively, and are graphs of MDA concentration (FIG. 11) and antioxidant concentration (FIG. 12).
  • Figure 13 is a photograph according to the immunofluorescence method for inhibiting the expression of COX-2 according to the Examples, Comparative Examples and Control.
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Comparative example Control S-allyl-L-cysteine 100 50 25 12.5 0 0 Drinking water 0 50 75 87.5 100 0 Levamifeed 0 0 0 0 0 100
  • the C57BL6 used in this test is a model that is frequently used around the world, and is a test animal suitable for the validation test.There are abundant basic test data for various disease models, so these data can be used for interpretation and evaluation of test results. It was.
  • the supply of experimental animals was Orient Bio Co., Ltd. and was supplied with 18 g ⁇ 20% of animals at the time of supply.
  • the breeding conditions of the experimental animals were ventilated at least 10 times / hour, the lighting was turned on / off for 12 hours, and the illumination was maintained at 150 to 300 Lux.
  • the mean weight of each group was G1: 20.8 ⁇ 1.4 g, G2: 21.0 ⁇ 0.5 g, G3: 20.9 ⁇ 1.5 g, G4: 20.2 ⁇ 0.9 g, G5: 20.7 ⁇ 1.1 g, G6: 20.5 ⁇ 0.9 g, G7: 20.7 ⁇ 0.7 g, there was no significant difference in each group.
  • mice were pretreated using Example 1, Comparative Example, and Comparative Example, and 2 weeks after the start of the test, colitis was induced by colitis using DSS according to an induction model.
  • Test group Disease-causing substance Test substance Dose (g / kg) The number of animals G1 (normal group) - - - 10 G2 DSS 2.5 wt% Comparative example 50 mg / kg 10 G3 DSS 2.5 wt% Example 1 12.5mg / kg 10 G4 DSS 2.5 wt% Example 1 25mg / kg 10 G5 DSS 2.5 wt% Example 1 50 mg / kg 10 G6 DSS 2.5 wt% Example 1 100mg / kg 10 G7 DSS 2.5 wt% Control 50 mg / kg 10
  • the starting weight for DSS treatment in the test group was G1: 23.4 ⁇ 1.5, G2: 23.1 ⁇ 1.2, G3: 22.1 ⁇ 2.4, G4: 22.8 ⁇ 0.8, G5: 22.9 ⁇ 1.1, G6: 22.2 ⁇ 1.3, G7: 23.2
  • the body weight at autopsy was G1: 24.2 ⁇ 1.7, G2: 21.9 ⁇ 1.2, G3: 20.3 ⁇ 2.2, G4: 20.5 ⁇ 0.9, G5: 21.4 ⁇ 0.8, G6: 21.6 ⁇ 0.7, G7: 21.1 ⁇ 0.9. .
  • Body weight means mean ⁇ standard deviation.
  • mice of the G2 to G7 groups had to be compared with the DSS negative treatment due to DDS-induced diarrhea or bloody stool. When the weight is reduced can be seen.
  • DAI Disease Activity Index
  • Table 4 Score and criteria of Disease Activity Index score Stool consistency Occult or Gross rectal bleeding 0 Normal stool Negative One Loose stool Negative 2 Loose stool Positive 3 Diarrhea Positive 4 Diarrhea Gross bleeding
  • the DAI score was increased due to changes in clinical signs such as diarrhea and bloody stool due to inflammation of mucosal tissue in the colon, but by treatment with G3 to G6. Diarrhea and bloody stools were reduced by decreasing inflammation of mucosal tissues in the colon, and this clinical sign was a decrease in DAI score.
  • the length of the colon is shortened compared to the normal group due to inflammation of the symptoms of colitis induced by DSS compared to the DSS treated group by the length of the colon was significantly significantly recovered. It was confirmed that this compared to the control group G7 equivalent or more effect.
  • the collected colon was fixed in a 10% formalin solution and subjected to Hematoxylin & Eosin staining (H & E stain), which is shown in FIG. 5.
  • H & E stain Hematoxylin & E stain staining
  • a total of six types of histopathological findings were scored by blind test.
  • the total pathological score obtained by adding the scores of each test group for each item and the scores for the six items is shown in FIG. 6.
  • intestinal mucosa due to the action of inflammation, follicle aggregation, oedema, etc. in the case of intestinal mucosal tissues induced by inflammation of DSS compared to the normal group as a result of H & E stainin Tissue was different from normal group.
  • mesenteric tissue was recovered by the treatment of G3 to G6.
  • histopathological findings were evaluated. The pathologic score was increased in the DSS group compared to the normal group, and the pathologic score by the G3 to G6 treatment. Was reduced. This showed the same or more than equivalent effect compared to the control group G7.
  • IL-1 ⁇ Fig. 7
  • IL-6 Fig. 8
  • TNF- ⁇ Fig. 9
  • IL-12 Fig. 12
  • Malondialdehyde (MDA) concentration which measures lipid peroxidation, a representative marker of oxidative stress, was measured.
  • MDA malondialdehyde
  • DSS-induced oxidative stress compared to the normal group
  • this lipid peroxidation was increased as in the H & E staining result of FIG. 5.
  • Induced mucosal inflammatory response induced mucosal loss Treatment with G3 to G6 reduced MDA levels and decreased MDA levels resulted in reduction of inflammatory responses by oxidative stress, leading to recovery to normal mucosal tissues, which had an equivalent or better effect than the control group G7.
  • the G3 treatment group showed the highest effect, which was shown to be more effective as the antioxidant concentration in the cell was increased, and as shown in the total pathologic score of FIG. 6, it was found that the mucosal tissue recovery was the best in the G3 treatment group.
  • the G3 treatment group showed the highest effect, which was shown to be more effective as the antioxidant concentration in the cell was increased, and as shown in the total pathologic score of FIG. 6, it was found that the mucosal tissue recovery was the best in the G3 treatment group.
  • COX-2 a representative inflammatory enzyme, was significantly increased in the test groups of G2 to G3, and the expression was decreased in the group treated with the test substance. Western blot was performed several times, but the results were difficult to obtain, and immunofluorescence of COX-2 was performed on paraffin unstained slides of animal tissues.
  • COX-2 is a representative indicator of the inflammatory response was confirmed that the COX-2 expression in the colon mucosa tissue inflammatory response induced by oxidative stress caused by DSS was significantly increased compared to the normal group
  • Treatment with G3 to G6 reduced COX-2 expression in mucosal tissues and decreased COX-2 expression induced inflammatory stress-induced recovery to normal mucosal tissues, which was equivalent to the control group G7. The above effect was shown.
  • control group G7 inhibited COX-2 expression in mucosal tissues, but did not effectively inhibit COX-2 expression in the fascia tissues below the mucosal tissues, while G4 to G6 treated groups also inhibited COX-2 expression in the mucosal tissues. It was confirmed.
  • a powder was prepared by filling and sealing a polyethylene-coated cloth.
  • the above ingredients were mixed and filled into gelatin light capsules according to a conventional method for preparing capsules to prepare capsules.
  • the above components were mixed to prepare a suspension according to a conventional method for preparing a suspension, and then filled into a 100 ml brown bottle and sterilized to prepare a suspension.
  • the soft capsule film is gelatin known in the art, soft formulation of plasticizer, gelatin 132 mg per 1 capsule, concentrated glycerin 52 mg, 70% dissolbitol solution 6 mg and the amount of ethyl vanillin as a flavoring agent, carnauba wax as coating agent It was prepared by the conventional manufacturing method using.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating colitis, and more particularly, comprising S-allyl-L-cysteine as an active ingredient, and a composition useful for preventing or treating colitis and a method of using the same.
  • a composition for preventing or treating colitis and more particularly, comprising S-allyl-L-cysteine as an active ingredient, and a composition useful for preventing or treating colitis and a method of using the same.

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Abstract

본 발명은 대장염 예방용 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine), 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 항염증(Anti-inflammation) 활성을 나타내는 것이다. 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인의 항염증 활성효과 및 항산화 활성효과로서 대장염에 대한 예방 및 개선효과가 우수하면서도, 에스-알릴-엘-시스테인은 부작용을 동반하지 않으므로 대장염에 대한 활용범위가 높다.

Description

에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 의약제제
본 발명은 대장염 예방용 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine)을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 대한 예방 또는 치료에 유용한 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
대장염은 크게 두 가지로 분류되는데 아메바성 이질, 편모충증, 장결핵, 진균증 등의 감염성 대장염과 크론씨병, 궤양성 대장염 등의 비특이적 대장염으로 분류된다.
특히 상기 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론씨병(crohn's disease)이 문제가 되는데 이는 감염성 장질환과는 달리 원인과 병태생리가 명확히 밝혀져 있지 않아 치료가 어렵다는 문제가 있다. 과거에는 만성대장염 중 다수가 대장 결핵이었으나 생활환경이 서구화되면서 궤양성 대장염, 크론씨병 등이 점차로 늘어나고 있는 추세다.
상기 궤양성 대장염은 점막과 점막하조직에만 염증이 생기고 이 이하의 조직인 근육층과 장막층에는 염증이 없는 것이 특징이다. 대개 항문과 직장에 호발하며, 쥐어짜는 듯한 복통과 항문출혈, 대변 속에 고름이나 이상한 점액의 배출 등이 증상으로 나타난다. 이것이 오래 지속이 될 경우에는 대장암으로 이행될 수도 있다.
상기 궤양성 대장염을 완치시키는 방법은 아직까지 알려져 있지 않으므로, 염증 반응을 가라앉히고, 조직의 손상이 치유되도록 하며, 설사, 혈변 및 복통 등의 증상을 완화시키는 것이 현재의 내과적 치료방법이다. 이를 위해서는 치료를 시작하기 전에 궤양성 대장염이 있는 부위와 범위 및 염증의 정도를 정확하게 평가하는 것이 우선적으로 필요하며 치료의 효과는 치료 전의 상태를 토대로 판정하게 된다.
상기 궤양성 대장염의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았으나 발생과정에 대해서는 어느 정도의 지식이 축적되었고 이를 토대로 여러 가지의 약제가 개발되어 사용되고 있다. 많이 사용되고 있는 궤양성 대장염의 치료제는 항염증제, 부신피질 호르몬제, 면역억제제, 항생제 등으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 항염증제로서는 설파살라진(sulfasalazine) 및 메살라진(mesalazine) 등, 부신피질호르몬제로서는 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone) 및 엔토코트(entocort, budesonide) 등, 면역억제제로서는 이뮤란(immuran), 6-MP, 사이클로스포린(cyclosporine) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등, 항생제로서는 메트로니다졸(metronidazole) 및 시프로베이(ciprobay) 등, 내강 변환제로서는 단쇄 지방산 및 글루타민 등, 항산화제로서는 알로퓨리놀(allopurinol) 및 디메틸 설폭사이드 등, 국소 마취제로서는 리도카인(lidocaine) 등 그리고 기타 약제로서 니코틴, 헤파린, 케도티펜(ketotifen), 탈리도마이드(thalidomide), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor), 표피성장인자(epidermal growth factors) 등을 사용할 수 있다.
상기 크론씨병은 소화기관 어느 부분에서나 생길 수 있으나, 이 중 주로 막창자와 연결되는 큰창자의 말단부에 생기는 염증성장질환으로 설사, 체중감소, 하복통, 발열 및 직장출혈 등의 장관 증상이 나타나며, 장관 외 증상으로 빈혈, 영양결핍, 근골격계 및 신장기능 이상 및 안과적 증상 등 복합적인 증상이 따른다. 장협착, 장농양, 장누공 등의 합병증이 생길 수 있으며 드물게는 장암을 유발하기도 한다. 창자의 염증이 만성적이고, 재발률이 높으며, 대장벽 깊숙이 침범하여 육아종을 형성하는 것이 특징이다. 20~30대의 젊은층에게 많이 생기며, 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았다. 치료는 다른 감염성 장질환이나 허혈성 장질환, 궤양성 대장염, 결핵성 장질환 등과 구분해서 해야 하며 장내시경적 조직검사와 방사선적 조영술 등으로 확실히 진단한 뒤에 수액요법 등의 보존적인 치료와 약물요법 등을 함께 사용해서 치료한다. 약물치료를 원칙으로 하는데, 심한 경우에는 스테로이드를 투여하고 증상이 완화되면 설파살라진이나 메살라진 등을 투여한다. 합병증 및 재발률을 줄이기 위해서는 거의 평생 동안 약을 복용해야 한다. 합병증이 생겨서 약물로도 조절되지 않는 경우에는 수술을 할 수도 있지만 완치되지는 않으며 수술 후에도 재발할 수 있다.
상기 궤장성 대장염 및 크론씨병의 치료를 위해 항염증제로서 사용되는 설파살라진은 설파계 항생제인 설파피리딘 분자와 아스피린과 비슷한 5-aminosalicylic acid(5-ASA) 분자가 결합된 약제로서, 이 약을 복용하면 장내 세균이 이 두 분자 사이의 결합을 분리하여 항염증 작용을 나타내는 5-ASA가 유리된다. 설파살라진은 궤양성 대장염과 대장을 침범하는 크론병 및 베체트병에 효과가 있으며, 궤양성 대장염에서는 관해(증상이 완전히 없어진 상태)에서 다시 나빠지는 것(재연)을 예방하기 위하여 이 약을 처방하지만 크론병에서는 재연 예방 효과가 확실하게 증명되어 있지는 않다. 설파살라진의 부작용으로 피부발진, 오심, 복부 통증, 간기능 이상, 드물게 골수기능 저하가 발생할 수 있다.
상기 설파살라진의 부작용은 대부분 설파피리딘 분자에 기인하므로 설파피리딘 분자는 없애고 5-ASA 분자만 갖도록 만든 약이 메살라진(또는 메살라민(mesalamine)이라고도 함)이다. 5-ASA를 그냥 복용하면 병이 없는 소장에서 모두 흡수되어 정작 약이 필요한 부분에는 도달하지 않으므로 5-ASA를 여러 가지의 방법으로 특수 처리하여 병이 있는 부분까지 도달하도록 만들었는데, 메살라진은 설파살라진과 효과는 비슷하지만 부작용이 다소 적다. 메살라진은 경구 복용을 위한 약제도 있고, 좌약 또는 관장으로 투여할 수도 있는데, 좌약과 관장은 각각 직장 또는 왼쪽 대장까지 염증이 있는 경우 유효하며, 관해를 유지하기 위한 목적으로도 사용할 수 있다. 경구용 메살라민은 활동성인 궤양성 대장염, 크론병및 베체트병에 효과가 있을 뿐 아니라 이들 질환의 관해를 유지하는 데에도 유효한 것으로 최근 밝혀졌다.
소장의 끝 부분 또는 대장에 5-ASA를 전달하기 위하여 다양한 형태의 메살라진 제제가 개발되어 시판되고 있는데 5-ASA 두 분자를 결합시킨 다이펜툼 (dipentum, olsalazine), 설파피리딘 대신 독성이 없는 다른 분자를 사용한 콜라자이드 (colazide)와 입살라자이드 (ipsalazide), 5-ASA가 서서히 유리되도록 셀루로즈 또는 레진에 흡착시킨 펜타사 (pentasa) 및 아자란 (azalan), 장내의 산성도 (pH)가 알카리화 되면 5-ASA가 유리되도록 포장한 아사콜 (asacol), 로와사 (rowasa) 및 살로팔크 (salofalk, claversal, mesasal) 등이 그 예이다. 설파살라진과 다이펜툼은 대장의 염증에 유효한 반면 아사콜, 살로팔크 및 펜타사는 소장의 염증에도 효과를 나타낸다.
현재 상기 궤양성 대장염 또는 크론씨병 등의 염증성 대장 질환의 치료를 위해 상기 메살라진 제제들이 널리 이용되고 있지만, 이들은 여전히 알레르기성 피부발진, 약물로 인한 이상 고열증, 기관지경련 및 홍반성낭창증후군과 같은 과민반응이나, 구역, 구토, 두통 등의 부작용을 일으킬 수 있다는 문제가 있다.
따라서, 상기 염증성 대장 질환에 대한 예방 또는 개선효과가 있으면서도 상기와 같은 부작용을 동반하지 않는 새로운 조성물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
본 발명과 관련된 선행기술을 보면 비특허문헌 1은 설파살라진과 스테로이드가 카라기닌-유도 염증 모델에 효과적이라는 것과 스테로이드와 면역 억제제가 T세포와 같은 면역 세포에서 사이토카인의 생성을 억제함을 기재하고 있다. 그러나, 상기 설파살라진과 스테로이드 제제의 경우 위와 같은 부작용이 있고, 스테로이드 제제의 경우 체중이 급격히 증가되는 부작용이 있어 사용범위에 제한이 크게 따른다는 문제가 있다.
(비특허문헌 1) Cronstein BN, Montesinos MC and Weissman G, Salitylate and sulfasalazine, but not glucocorticoid, inhibit leukocyte accumulation by an adenosinedependent mechanism that is independent of inhibition of prostaglandin synthesis and p105 NF-κB, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, May 25, 1999, 96(11): 6377-6381
본 발명의 목적은 대장염에 대한 예방 및 개선효과가 우수하면서도 부작용을 동반하지 않는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine), 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 항염증(Anti-inflammation) 활성을 나타내는 것이다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 항염증(Anti-inflammation) 활성 및 항산화(Anti-Oxidant) 활성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 에스-알릴-엘-시스테인을 5 내지 99.9 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 에스-알릴-엘-시스테인이 부추속(Allium genus) 식물로부터 분리 정제된 것, 합성된 것, 발효에 의하여 제조 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물에 대하여 항염증제 또는 항산화제를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 항염증제는 이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 페노프로펜(feno-profen), 나프록센(naproxen), 피록시캄(piroxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 이속시캄(isoxicam), 멜록시캄(melo-xicam), 인도메타신(indomethacin), 아세클로페낙(aceclofenac), 디클로페낙(diclofenac) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드, 아연, 구리, 철, 망간, 루테인, 제아잔틴, 셀레늄, 글루타치온(GHS), 리코펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약제제(製劑)는 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 경구투여용 제제, 점막적용제제, 주사제, 흡입제 및 외용제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine), 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 항염증(Anti-inflammation) 활성을 나타내는 것이다.
상기 에스-알릴-엘-시스테인은 숙성된 마늘 유효성분 중 하나로서 이러한 항산화 활성으로 동맥경화에도 억제 효과를 나타내며, 몇몇 암 세포주에 대해서도 항암활성(Proceedings of the American Association for Cancer Research, 30, p181, 1989)을 나타내는 등 다양한 효능이 보고되어 있다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 8-옥소-데옥시구아노신은 덱스트란 소듐 설페이트(Dextran sodium sulfate, DSS)로 대장염을 유도한 마우스 모델에서 상기 에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 하는 대장염 예방 및 치료용 조성물을 사용하는 경우 항염증 활성효과로서 대장염에 대한 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
또한 상기 에스-알릴-엘-시스테인 또는 그의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염은 용매화물 또는 수화물로서 존재하는 것도 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 이들의 용매화물 또는 수화물을 이용할 수 있다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물에 있어서 유효성분으로 포함되는 에스-알릴-엘-시스테인의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 이용하여도 좋다. 이와 같은 염으로서는 산 부가염이나 제4급 암모늄 염 등을 들 수 있다. 상기 산 부가염으로서는 예컨대, 염산 염, 브롬화수소산 염, 요오드화수소산 염, 황산 염, 인산 염 등의 무기산 염이나 옥살산염, 말레인산 염, 푸마르산 염, 유산 염, 말산 염, 숙산산 염, 주석산 염, 안신향산 염, 메탄설폰산 염 등의 유기산 염을 들 수 있다. 다만, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한 제4급 암모늄 염으로서는 예컨대, 메틸요오다이드, 메틸브로마이드, 에틸요오다이드, 에틸브로마이드 등의 저급 알킬할로게니드; 메틸메탄설포네이트, 에틸메탄설포네이트 등의 저급 알킬설포네이트; 메틸-p-톨루엔설포네이트 등의 저급 알킬아릴설포네이트 등의 제 4급 암모늄 염을 들 수 있다. 다만, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 에스-알릴-엘-시스테인은 상기 대장염에 대하여도 항산화 활성이 우수함을 확인하였다.
따라서, 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 포함하여 대장염에 대한 항염증(Anti-inflammation) 활성과 동시에 항산화(Anti-Oxidant) 활성으로 2이상의 약제를 혼용하는 사용하지 않더라도 대장염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 가진다는 것을 확인하였다.
또한, 일반적으로 상기 대장염에 대하여 사용하는 설파살라진은 그 부작용으로 피부발진, 오심, 복부 통증, 간기능 이상, 드물게 골수기능 저하가 발생할 수 있고, 관해를 유지함에 있어 어려움이 따른다. 그러나 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 에스-알릴-엘-시스테인을 유효성분으로 포함하는바, 상기 에스-알릴-엘-시스테인은 설파살라진과 같은 부작용이 없고, 스테로이드 제재 등을 동시에 사용해야 하는 문제도 없어 대장염에 대한 예방 및 치료에 있어 그 활용범위가 넓다는 장점이 있다.
특히, 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 에스-알릴-엘-시스테인을 5 내지 99.9 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 에스-알릴-엘-시스테인이 상기 중량% 범위에 의하는 경우 항염증(Anti-inflammation) 활성과 항산화(Anti-Oxidant) 활성이 동시에 나타나면서 대장염을 매우 효과적으로 치료할 수 있는 특징이 있을 뿐만 아니라 설파살라진 등과 같은 일반적인 대장염 치료제와 달리 부작용도 없다는 장점을 가진다.
상기 대장염은 감염성 대장염 및 염증성 장질환을 포함한다. 상기 염증성 장질환은 특발성 만성 지속성 유형의 비특이적 장염, 즉, 궤양성 대장염과 크론병을 비롯한, 전형적인 질환을 가리킨다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 상기 에스-알릴-엘-시스테인이 부추속(Allium genus) 식물로부터 분리 정제된 것, 합성된 것, 발효에 의하여 제조된 것으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 구체적으로는 상기 에스-알릴-엘-시스테인은 유럽공개특허공보 EP 0429080A1에 [0031] 기재된 방법으로 마늘(garlic), 코끼리마늘(elephant garlic), 양파(onino), 파(scallion) 등의 부추속 (Allium genus) 식물로부터 제조될 수 있으며, 그 외 합성, 발효 등 이 기술 분야에 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 에스-알릴-엘-시스테인, 그의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물은 이들 자체를 환자에 투여하여도 좋지만 일반적으로는 이들의 유효성분 1종 또는 2종 이상을 포함하는 조성물을 조제하여 투여하거나, 다른 유용한 항염증제 또는 항산화제와 혼합하여 복합제제 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.
상기 항염증제는 이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 페노프로펜(feno-profen), 나프록센(naproxen), 피록시캄(piroxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 이속시캄(isoxicam), 멜록시캄(melo-xicam), 인도메타신(indomethacin), 아세클로페낙(aceclofenac), 디클로페낙(diclofenac) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드, 아연, 구리, 철, 망간, 루테인, 제아잔틴, 셀레늄, 글루타치온(GHS), 리코펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약제제는 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 경구투여용 제제, 점막적용제제, 주사제, 흡입제 및 외용제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 경구 투여용 제제는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제 또는 산제, 서방형제제, 장용성 제제, 과립제, 유당제, 세립제, 환제, 엑기스제, 액제, 방향수제, 유제, 시럽제, 엘릭실제, 유동엑시스제, 침전제, 틴크제, 주정제, 약유제등을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 점막적용제에는 트로키제, 구강정, 설하정, 좌제, 비강분무제를 포함되나 이로 제한되지 않는다. 주사제에는 피하주사, 근육주사, 정맥주사, 이식정 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다. 외용제에는 경비제, 점안제, 점이제, 안연고제, 파스타제, 카타플라스마제, 리니멘트제, 로오션제, 도포제, 산포제, 외용액제 등이 포함되며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제제에는 하나 또는 그 이상의 활성 성분이외에 하나 또는 그 이상의 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제, 용해보조제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품조성물일 경우, 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 에스-알릴-엘-시스테인은 식품 또는 음료 등의 제조시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 자명하다. 본 발명의 식품조성물을 사용하는 식품으로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하는 경우 에스-알릴-엘-시스테인의 항염증 활성효과 및 항산화 활성효과로서 대장염에 대한 예방 및 개선효과가 우수하면서도, 에스-알릴-엘-시스테인은 부작용을 동반하지 않으므로 대장염에 대한 활용범위가 높다.
본 발명의 다른 일실시예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하는 방법으로 제공한다.
도 1은 덱스트란 소듐 설페이트(Dextran sodium sulfate, DSS)에 노출한 마우스의 몸무게 변화에 관한 그래프이다.
도 2는 실시예, 비교예 및 대조예를 처리한 마우스에 대한 부검후 대장(colon) 에 대한 사진이다.
도 3은 각 군의 마우스에 대한 Disease Activity Index (DAI) Score 그래프이다.
도 4는 각 군에 대한 대장 길이의 평균을 나타낸 그래프이다.
도 5 내지 도 6은 실시예, 비교예 및 대조예에 따른 Hematoxylin & Eosin 염색(H&E stain)에 따른 병리학적 관찰결과를 나타낸 사진(도 5) 및 그래프(도 6)이다.
도 7 내지 도 10은 실시예, 비교예 및 대조예에 따른 염증성 사이토카인(Inflammatory cytokine) 측정 결과를 나타낸 그래프로서, 각각 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 IL-12의 결과그래프이다.
도 11 내지 도 12는 실시예, 비교예 및 대조예에 따른 항산화 작용 측정 결과를 나타낸 그래프로, 각각 MDA 농도 그래프(도 11) 및 항산화 농도(도 12) 그래프이다.
도 13은 실시예, 비교예 및 대조예에 따른 COX-2의 발현을 억제효과에 관한 면역형광법에 따른 사진이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예: 실시예, 비교예 및 대조예의 제조]
하기의 표 1에 따른 조성비의 혼합물을 포함하는 실시예 및 비교예를 제조하였다. 또한, 종래의 대장염 치료제와의 효과 및 부작용 비교를 위해 대장염의 치료를 위해 레바미피드를 하기의 표 1과 같은 조성비로 대조예로 하여 제조하였다.
표 1
실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 비교예 대조예
에스-알릴-엘-시스테인 100 50 25 12.5 0 0
음용수 0 50 75 87.5 100 0
레바미피드 0 0 0 0 0 100
- 에스-알릴-엘-시스테인: 하나제약㈜
- 레바미피드: Ostuka pharmaceutical 사 제품
[실험예 1: 덱스트란 소듐 설페이트에 의한 염증성 장질환 유도]
(1) 실험동물의 준비
본 시험에 사용하는 C57BL6는 전세계적으로 자주 사용되는 모델로서 유효성 평가 시험에 적당한 시험동물로서 여러 질환 모델에 대한 풍부한 시험기초자료가 축적되어 있어 시험결과의 해석 및 평가에 이러한 자료를 이용할 수 있어 선정하였다. 실험동물의 공급은 (주)오리엔트바이오이며 공급당시 18 g ± 20% 의 동물들로 공급받았다. 실험동물의 사육조건은 최소 10회/시간으로 환기를 하였으며 조명은 12시간 점등/소등을 하였고 조도는 150~300 Lux를 유지하였다.
실험을 시작할 때 각 그룹별 평균 체중은 G1: 20.8±1.4 g, G2: 21.0±0.5 g, G3: 20.9±1.5 g, G4: 20.2±0.9 g, G5: 20.7±1.1 g, G6: 20.5±0.9 g, G7: 20.7±0.7 g이었고, 각 그룹별 큰 차이는 나타나지 않았다.
(2) 대장염 유발
상기 실시예, 비교예 및 대조예의 대장염에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여 마우스(G1 내지 G7)에 2.5중량%의 덱스트란 소듐 설페이트(Dextran sodium sulfate, DSS) 수용액을 음용하도록 하여 염증성 장질환을 유도하였다.
상기 염증성 유도 질환 유도 당일에는 사망 또는 빈사동물이 관찰되지 않았다.
[실험예 2: 에스-알릴-엘-시스테인에 의한 대장염 치료효과 확인]
실험예 2-1. 실시예 1, 비교예 및 대조예의 처리
하기의 표 2에 따라 마우스에 대하여 상기 실시예 1, 비교예 및 대조예를 사용하여 전처리를 하였고, 시험시작 2주 후 상기 대장염을 유도모델에 따라 DSS를 사용하여 대장염 질환을 유도하였다.
표 2
시험군 질환유발물질 시험물질 투여용량(g/kg) 동물수
G1(정상군) - - - 10
G2 DSS 2.5중량% 비교예 50mg/kg 10
G3 DSS 2.5중량% 실시예1 12.5mg/kg 10
G4 DSS 2.5중량% 실시예1 25mg/kg 10
G5 DSS 2.5중량% 실시예1 50mg/kg 10
G6 DSS 2.5중량% 실시예1 100mg/kg 10
G7 DSS 2.5중량% 대조예 50mg/kg 10
실험예 2-2. 기초적인 관찰결과
상기 시험군에 있어 DSS 처리시 시작 체중은 G1: 23.4±1.5, G2: 23.1±1.2, G3: 22.1±2.4, G4: 22.8±0.8, G5: 22.9±1.1, G6: 22.2±1.3, G7: 23.2±1.2이었고, 부검시 체중은 G1: 24.2±1.7, G2: 21.9±1.2, G3: 20.3±2.2, G4: 20.5±0.9, G5: 21.4±0.8, G6: 21.6±0.7, G7: 21.1±0.9이었다.
실험일자별 각 처리군의 체중을 측정한 결과는 다음 표 3 및 도 1과 같다. 이때 체중은 평균±표준편차를 의미한다.
표 3
G1(g) G2(g) G3(g) G4(g) G5(g) G6(g) G7(g)
2011.12.28 20.8±1.4 21.0±0.5 20.9±1.5 20.2±0.9 20.7±1.1 20.5±0.9 20.7±0.7
2011.12.29
2011.12.30
2011.12.31
2012.01.01
2012.01.02
2012.01.03
2012.01.04
2012.01.05
2012.01.06
2012.01.07
2012.01.08
2012.01.09
2012.01.10
2012.01.11
2012.01.12 23.4±1.5 23.1±1.2 22.1±2.4 22.8±0.8 22.9±1.1 22.2±1.3 23.2±1.2
2012.01.13
2012.01.14
2012.01.15
2012.01.16
2012.01.17
2012.01.18 24.2±1.7 21.9±1.2 20.3±2.2 20.5±0.9 21.4±0.8 21.6±0.7 21.1±0.9
이와 같이, 2012.01.12부터 DSS 2.5중량%수용액을 음수하기 시작하여 7일 동안 DSS 음수를 진행한 결과 DDS로 유도된 설사 또는 혈변 등으로 인해 G2 내지 G7군의 마우스의 경우 DSS 음수처리 시점과 대비할 때 체중이 감소됨을 확인할 수 있다.
또한 DSS 음수 7일째에 에테르 마취 하에 동물을 희생하여 대장을 적출하여 이를 관찰하였다. 그 결과는 도 2와 같이, DDS로 유도된 설사 또는 혈변 등으로 인해 G2 내지 G7군의 마우스의 경우 염증이 발생되었음을 확인할 수 있다.
실험 종료시 혈변(hematochezia)과 설사(diarrhea)의 정도를 반영하여 Disease Activity Index(DAI) Score를 작성하였고, 이를 도 3에 나타내었다. 또한 대장은 맹장으로부터 대장 끝까지로 하여 길이를 측정하여 그 결과를 도 4로 나타내었다. 도 4에 있어서, #은 정상군(G1)에 비해 유의차(p<0.0001)가 있음을 의미하고, *은 대장염모델 동물군에 비해 유의차(p<0.05)가 있음을 의미한다.
표 4 Disease Activity Index의 점수 및 기준
점수 Stool consistency Occult or Gross rectal bleeding
0 Normal stool Negative
1 Loose stool Negative
2 Loose stool Positive
3 Diarrhea Positive
4 Diarrhea Gross bleeding
첨부의 도 3을 참조하면, 정상군에 비해 DSS로 염증성 대장염을 유도했을 때 대장 내 점막 조직의 염증으로 인해 설사와 혈변과 같은 clinical sign의 변화로 DAI score가 증가하였으나 G3 내지 G6의 처리에 의해 대장 내 점막조직의 염증이 감소됨으로써 설사와 혈변이 감소되고 이러한 clinical sign은 DAI score의 감소로 나타났다. 또한 도 4로 나타낸 것과 같이, DSS에 의해 유도된 대장염 증상 중 염증에 의해 대장 길이가 정상군과 비교하여 짧아지는데 G3 내지 G6의 처리에 의해서 대장의 길이가 DSS처리군에 비해 통계적으로 유의하게 회복됨을 확인하였으며 이는 대조군인 G7과 비교하여 동등이상의 효과를 나타내었다.
실험예 2-3. H&E staining을 통한 병리학적 관찰 결과
채취한 대장을 10% 포르말린 용액에 고정하고 Hematoxylin & Eosin 염색(H&E stain)을 실시하여 이를 도 5로 나타내었다. 또한, blind test를 통하여 총 6가지의 염증의 조직병리학적 소견(inflammation, follicle aggregation, oedema, erosion/ulceration, crypt loss, Infiltration of mono- and polymorphonuclear cells)을 관찰하여 점수화하였다. 각 항목에 대한 각 시험군의 점수와 6가지 항목에 대한 점수를 모두 합산한 총 병리학적 점수는 도 6에 제시한 바와 같다.
하기의 도 5 내지 도 6을 참조하면, 장점막 조직에 대한 H&E stainin 결과 정상군에 비해 DSS로 염증이 유도된 장점막 조직의 경우 inflammation과 follicle aggregation, oedema 등의 작용으로 인한 조직병리학적 변화로 장 점막 조직이 정상군과 다름을 확인할 수 있었다. 하지만 G3 내지 G6의 처리에 의해 장점막 조직이 회복됨을 확인하였고 이 결과를 바탕으로 조직병리학적 소견 평가를 도식화한 결과 pathologic score가 정상군에 비해 DSS 처리군에서 증가되었고 G3 내지 G6 처리에 의해 pathologic score가 감소되었다. 이는 대조군인 G7과 비교하여 동등 혹은 동등이상의 효과를 나타내었다.
실험예 2-4. 염증성 사이토카인(Inflammatory cytokine) 측정 결과
염증 반응을 유도하는 대표적인 사이토카인 IL-1β IL-6, IL-12 그리고 TNF-α의 level을 측정해 본 결과, DSS로 유도된 IBD 그룹에서 염증성 싸이토카인들의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었고, G3 내지 G6 의 처리에 의해서 그 발현 정도가 유의성 있게 감소한 것을 관찰하였다. 상기 관찰결과를 하기의 도 5에 나타내었다.
하기의 도 7 내지 도 10를 참조하면, DSS에 의해 유도된 염증반응에 의해 IL-1β(도 7), IL-6(도 8), TNF-α(도9), IL-12(도12)와 같은 염증성 사이토카인들이 증가되고 이로 인하여 도 4의 H&E staining 결과에서처럼 장 점막이 염증반응으로 인해 점막의 기능을 상실하여 설사 및 혈변과 같은 병변현상을 나타내었다. G3 내지 G6의 처리에 의해 염증성 사이토카인들의 발현이 감소되었고 염증성 사이토카인 발현의 감소는 정상 점막 조직으로의 회복을 유도하였고 이는 대조군인 G7과 비교하여 동등의 효과를 나타내었다.
실험예 2-5. 항산화 작용 측정 결과
산화작용(Oxidative stress)의 대표적인 마커(marker)인 지질과산화(lipid peroxidation)를 측정하는 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 농도를 측정하였다.
그 결과, 에스-알릴-엘-시스테인의 저농도인 G3과 G4에서 통계적으로 유의하게 저해되는 것을 관찰하였으며, 그와 상응하는 결과로 조직내 총 항산화제 농도(total antioxidant concentration)를 측정한 결과, G3에서 DSS 처리군에 비해 통계적으로 유의하게 항산화제(antioxidant)의 농도가 증가한 것을 관찰하였다. 상기 관찰결과를 하기의 도 10(MDA 농도) 내지 도 11(총 항산화제 농도)에 나타내었다.
하기의 도 10 내지 도 11을 참조하면, DSS로 유도된 산화적 스트레스에 의해 지질과산화의 대표적 지표인 MDA (malondialdehyde)가 정상군과 비교하여 증가하였고 이러한 지질과산화는 도 5의 H&E staining 결과에서처럼 장 점막의 염증반응을 유도하여 점막 기능 상실을 유도하였다. G3 내지 G6의 처리에 의해 MDA 수준이 감소되었고 MDA 수준 감소는 산화적 스트레스에 의한 염증 반응이 감소됨으로써 정상 점막 조직으로의 회복을 유도하였고 이는 대조군인 G7와 비교하여 동등 이상의 효과를 나타내었다. 특히 G3 처리군에서 가장 높은 효과를 보였는데 이는 세포내 antioxidant 농도가 높아짐에 따라 더 큰 효과를 보인 것으로 보이며 도 6의 total pathologic score에서도 볼 수 있듯이 G3 처리군에서 점막조직의 회복이 가장 뛰어난 것을 알 수 있었다.
실험예 2-6. 염증성 유전자 발현 측정
G2 내지 G3의 시험군에서 대표적인 염증효소인 COX-2의 발현이 현저히 증가되었고, 시험물질을 처리한 그룹에서 그 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. Western blot을 여러 번 수행하였으나, 결과를 얻기가 힘들어서 동물 조직의 파라핀 언스테인드 슬라이드(unstained slide)에 COX-2의 immunofluorescence를 수행하였다.
그 결과, 모든 그룹에서 DSS에 의한 COX-2의 발현을 억제함을 관찰하였다. 상기 관찰결과를 하기의 도 13(COX-2(green), DAPI(blue), 및 merged image)에 나타내었다.
하기의 도 13을 참조하면, COX-2는 염증반응의 대표적 지표로서 DSS에 의한 산화적 스트레스로 유도된 염증반응이 나타난 대장 점막 조직에서 COX-2 발현이 정상군과 비교하여 매우 증가된 것을 확인하였고 이러한 COX-2의 발현은 도 4의 H&E staining 결과에서처럼 장 점막의 염증반응을 유도하여 점막 기능 상실을 유도하였다. G3 내지 G6의 처리에 의해 점막 조직내 COX-2 발현이 감소되었고 COX-2 발현 감소는 산화적 스트레스에 의한 염증 반응이 감소됨으로써 정상 점막 조직으로의 회복을 유도하였고 이는 대조군인 G7와 비교하여 동등 이상의 효과를 나타내었다. 특히 대조군인 G7의 경우 점막조직에서의 COX-2 발현은 억제하였으나 점막조직 하부의 근막조직의 COX-2 발현은 효과적으로 억제하지 못한 반면 G4 내지 G6 처리군에서는 근막조직의 COX-2 발현도 억제하였음을 확인하였다.
실험예 2-7. 에스-알릴-엘-시스테인의 부작용 효과 확인
면역억제 효과로서 대장염 치료제에 사용되는 사이클로스포린 또는 프레드니솔론의 경우 스테로이드로서 체중증가의 부작용이 보고되고 있다. 그러나, 유효성분으로 에스-알릴-엘-시스테인을 포함하는 실시예 1을 사용하는 시험군 G3 내지 G6의 경우 상기 실시예 1의 처리에 따른 체중증가가 발현되지 않아 체중증가와 같은 부작용은 없는 것을 알 수 있다.
상기 메살리진 또는 메살라진 제제나 NSAIDs계 항염증의 경우 과민반응, 구역, 구토, 두통 등의 부작용이 알려져 있다. 그러나, 에스-알릴-엘-시스테인을 포함하는 상기 G3 내지 G6의 경우에는 시험기간을 12주까지 늘이는 동안에 상기 메살라진을 포함하는 대조군을 사용한 G7과 같은 부작용의 증상은 확인되지 않았다.
[제형예: 에스-알릴-엘-시스테인을 포함하는 제제]
제제예 1. 정제의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 200 ㎎
유당 50 ㎎
전분 10 ㎎
제제예 2. 산제의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 250 ㎎
유당 30 ㎎
전분 20 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분들을 긴밀히 혼합한 후 폴리에틸렌이 코팅된 포에 충진하고 밀봉하여 산제를 제조하였다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 500 ㎎
유당 30 ㎎
전분 28 ㎎
탈크 2 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4. 현탁제의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 50 ㎎
이성화당 10 g
설탕 30 ㎎
나트륨 카복시메틸셀룰로즈 100 ㎎
레몬향 적량
정제수 적량 가하여 전체 100 ㎖
상기의 성분들을 혼합하여 통상적인 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조한 후 100 ㎖ 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.
제제예 5. 연질캅셀제의 제조(연질캅셀제 1정 중 함량)
에스-알릴-엘-시스테인 500 ㎎
폴리에틸렌글리콜 400 ㎎
농글리세린 55 ㎎
정제수 35 ㎎
폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 후 정제수를 첨가한 혼합물을 약 60℃로 유지한 상태에서 플라본을 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합하였다. 상기 혼합액을 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프로 기포를 제거하여 연질캅셀의 내용물을 준비하였다. 연질캅셀의 피막은 당분야에 공지된 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132 ㎎, 농글리세린 52 ㎎, 70% 디솔비톨액 6 ㎎ 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상적인 제조방법으로 제조하였다.
제제예 6. 주사제의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 200 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
Na2HPO412H2O 26 ㎎
통상적인 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 7. 음료의 제조
에스-알릴-엘-시스테인 0.01g
구연산 8.5g
백당 10g
포도당 2.5g
DL-사과산 0.3g
정제수 적량
상기의 성분 함량에 정제수를 적량 배합하여 총 100mL이 되도록 하여 교반하고 통상의 음료제조 방법으로 제조하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
대장염 예방용 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine)을 유효성분으로 포함하고, 대장염에 대한 예방 또는 치료에 유용한 조성물 및 이를 이용하는 방법으로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (5)

  1. 에스-알릴-엘-시스테인(S-allyl-L-cysteine), 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하는
    대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에스-알릴-엘-시스테인이 부추속(Allium genus) 식물로부터 분리 정제된 것, 합성된 것 및 발효에 의하여 제조된 것으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인
    대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    항염증제 또는 항산화제를 더 포함하는 것인 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항염증제는 이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 페노프로펜(feno-profen), 나프록센(naproxen), 피록시캄(piroxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 이속시캄(isoxicam), 멜록시캄(melo-xicam), 인도메타신(indomethacin), 아세클로페낙(aceclofenac), 디클로페낙(diclofenac) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
    상기 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드, 아연, 구리, 철, 망간, 루테인, 제아잔틴, 셀레늄, 글루타치온(GHS), 리코펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 경구투여용 제제, 점막적용제제, 주사제, 흡입제 및 외용제로 이루어진 군에서 선택되는 의약제제(製劑).
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