KR20090068560A

KR20090068560A - 항염증 활성을 갖는 산마늘 추출물

Info

Publication number: KR20090068560A
Application number: KR1020070136236A
Authority: KR
Inventors: 이제혁; 최수임; 이용수; 김건희
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2007-12-24
Publication date: 2009-06-29

Abstract

본원 발명은 항염증 활성을 갖는 산마늘 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원 발명에 따른 산마늘 추출물은 항산화 효과 및 항 면역성 항염증 효과가 있어 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

산마늘, 추출물, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥경화증

Description

항염증 활성을 갖는 산마늘 추출물{Extracts from Allium victorialis subsp. platyphyllum having anti-inflammatory activity}

본원 발명은 항염증 활성을 갖는 산마늘 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

류마티스 관절염은 인체 내 관절의 활막에 발생하는 만성 염증을 말한다. 일단 류마티스 관절염이 시작되면 활막 조직의 혈액으로부터 어려가지 염증 세포들로 이루어진 '판누스(Pannus)'라는 덩어리를 형성하고, 이것이 연골을 파괴하고 관절의 변형을 가져오며 관절 주위에 있는 뼈도 약해지게 된다. 이 질환은 인체 면역 기능에 이상이 오는 것으로, 우리 몸 속에서 세균같은 외부의 이물질에 대하여 몸을 방어하는 역할을 하는 면역계가 알 수 없는 이유로 자신의 관절부위 등을 스스로 공격하기 때문에 발생한다. 남녀 노소를 막론하고 류마티스 관절염에 걸릴 수 있지만, 주로 30대와 40대에서 잘 생긴다.

이러한 류마티스 관절염을 치료하기 위해서는 아스피린 및 비스테로이드성 소염제, 저용량의 경구 스테로이드제, 항류마티스제, 관절내 스테로이드제 주사법을 사용하게 된다. 그러나, 이러한 약물에 의존하는 요법 외에도 일상 생활에서 식품의 섭취를 통해 류마티스 관절염을 예방하거나 치료할 수 있다면, 이는 환자에게 큰 도움이 될 수 있을 것이다.

산마늘(Allium victorialis subsp. platyphyllum)은 외떡잎 식물 백합목 백합과에 속하는 여러해살이 풀로, 전지역에 고루 분포하고 있다. 산마늘의 부위별 추출물은 식용이 가능하고, 전통적으로 감기나 항세균, 소화, 건위 등의 용도로 한방에서 사용되어 왔다. 또한, 최근에는 잠재적인 항 혈전 작용을 가지는 황 화합물과 항 혈소판 응집 활성이 보고되었다. 또한, 산마늘 추출물의 효과에 대해서는 널리 연구되어 산마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호 또는 간질환의 예방 및 치료용 조성물(대한민국 공개특허번호 2005-102572호), 산마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨성 질환의 예방 및 치료용 조성물(대한민국 공개특허번호 2005-43092), 및 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 피부 외용제 조성물(대한민국 공개특허번호 제2006-12805)가 보고되었다.

본원 발명자들은 산마늘을 이용하여 용매 추출법으로 추출물을 분리하였고, 얻은 추출물이 항산화 활성 및 항염증 활성이 있음을 밝힘으로써 본원 발명을 완성하였다.

본원 발명의 목적은 항산화성 및 항염증 활성을 갖는 물질을 포함하는 새로운 식물 추출물과 이를 포함하는 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 산마늘의 항산화성 및 항염증성 추출물을 제공한다.

또한, 본원 발명은 산마늘 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공한다.

이하, 본원 발명을 상세히 설명한다.

본원 발명은 용매 추출법을 사용하여 산마늘로부터 얻은 추출물을 제공한다. 용매 추출법은 산마늘의 일정 부위에 용매를 첨가하여 통상적인 방법으로 추출물을 얻는 방법이다. 상기 용매 추출법에서 사용되는 용매로는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 클로로포름, 아세톤 등의 유기 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용한다.

에탄올을 용매로 이용하는 경우, 상기 용매 추출법은 산마늘의 일정 부위를 건조시켜 분쇄하고, 분쇄하여 얻은 산마늘 분말 30 g 당 에탄올 100ml를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

산마늘로부터 추출물을 얻기 위해서는 산마늘의 뿌리, 씨, 잎, 꽃대, 줄기 또는 이들의 혼합물을 사용하며, 바람직하게는 산마늘의 잎 또는 씨를 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 산마늘의 잎과 씨는 시기를 가리지 않고 쉽게 구할 수 있으며, 추출물을 얻을 때 별도의 과정을 필요로 하지 않고 용이하게 얻을 수 있기 때문이다.

또한, 본원 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물 을 제공한다.

상기 항염증성 조성물은 산마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물과 기능성 식품을 포함한다.

상기 약학적 조성물에 포함되는 산마늘 추출물은 산마늘의 씨, 잎, 뿌리, 꽃대, 줄기로부터 얻은 추출물일 수 있고, 이들의 혼합물이 될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 활성산소에 의해 손상된 인간 제대 정맥 내피 세포 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)는 관절 내에 있는 호중성 백혈구(neutrophile)와 단핵 백혈구(monocyte)의 흡착을 야기하며 류마티스 관절염을 악화시키는 하나의 원인으로 작용한다. 또한, 단핵 백혈구와 HUVEC 세포간 흡착 반응은 면역학적 염증 반응의 초기 단계에서 일어나는데, 여기에 관여하는 단백질인 CAM(cellular adhesion molecule)은 면역학적 염증 매개인자인 TNF(tumor necrosis factor)-α에 의해 발현이 증가되고, 발현이 증가된 CAM은 단핵 백혈구와 호중성 백혈구의 흡착을 증진시켜 류마티스 관절염과 아테롬성 동맥경화증을 유발한다. 그러나, 본원 발명에 따른 산마늘 추출물은 하기 실험예에서 살핀 바와 같이, HUVEC와 단핵 백혈구의 세포간 흡착을 저해하고, CAM의 발현을 저해하는 효과가 있어, 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥 경화증의 예방 또는 치료에 유용하다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 실 제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본원 발명의 꽃향유 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순히 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비서성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원 발명의 약학적 조성물에 포함되는 산마늘 추출물의 유효량은 0.1-10 mg/kg이고, 하루 1-3회 투여될 수 있다.

또한, 본원 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공하며, 상기 기능성 식품은 산마늘 추출물의 효과에 기인하여 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증의 예방에 사용된다.

본원 발명에 따른 산마늘 추출물은 항산화 효과가 있고, 특히 산마늘의 잎 부위 추출물은 산마늘의 다른 부위에 비해 비교적 높은 항산화 효과가 있었다. 또한, 본원 발명에 따른 산마늘 추출물은 활성화된 호중성 백혈구로부터 분비되는 슈퍼옥사이드 음이온으로부터 HUVEC를 보호하는 효과가 있었다. 또한, 단핵 백혈구 세포와 HUVEC 단일 층의 세포간 흡착을 저해하는 효과가 있었고, 특히 산마늘 씨 부위의 추출물은 세포간 흡착을 기초적인 수준으로까지 저해하는 효과가 있었다. 또한, 본원 발명의 산마늘 추출물은 면역학적 염증 매개자인 TNF-α에 의해 발현이 증가되고 류마티스 관절염과 아테롬성 동맥경화증 등을 발병시키는 CAM 단백질의 발현을 저해하는 효과가 있다. 따라서, 본원 발명의 산마늘 추출물은 염증성 질환의 매개 인자로 작용하는 HUVEC와 단핵 백혈구의 흡착을 저해하고 관련 유전자 CAM의 발현을 저해함으로써, 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본원 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 산마늘 추출물의 제조

산마늘을 뿌리, 씨, 잎, 꽃대, 줄기로 분리하여, 세척하였고, 진공 건조하여 분쇄하였다. 분쇄된 산마늘 부위별 분말 30g에 70% 에탄올 100ml를 첨가하였고 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 얻은 혼합물을 여과하였고, 감압 하에서 용매를 증발시켰고 농축시켜 산마늘 추출물을 제조하였다.

실험예 1: 산마늘 추출물의 항산화 활성

(1) DPPH 라디칼 소거 활성

상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 산마늘의 씨, 잎, 꽃대, 줄기, 뿌리로부터 산마늘 부위별 추출물을 제조하여, 산마늘 추출물의 DPPH 소거 활성을 통상의 방법으로 측정하였다. 각각의 산마늘 추출물이 함유된 메탄올 용액(1,000 ㎍/ml) 0.2 ml에 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴 히드라질) 메탄올 용액 (1mmol/ml, 0.5 ml)을 첨가하였다. 얻은 혼합물을 15초 동안 교반하였고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 산마늘 추출물을 함유하지 않은 DPPH 메탄올 용액을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1: 산마늘 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성

산마늘 부위	DPPH 라디칼 소거 활성(%)¹ ⁾
씨	1.69±0.72
잎	51.39±4.51
꽃대	ND² ⁾
줄기	ND
뿌리	5.29±0.66

1) DPPH 라디칼 소거 활성을 대조군에 대한 비율로 나타낸 것임

2) ND는 활성이 검출되지 않았음을 의미함.

상기 표 1에서 살핀 바와 같이, 산마늘 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 특히, 잎 부위 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 51.4%로서 타 부위의 추출물보다 DPPH 라디칼 소거 활성이 뛰어났다. 반면, 꽃대와 줄기는 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내지 않았다.

(2) 환원력 (reducing power)

상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 산마늘의 씨, 잎, 꽃대, 줄기, 뿌리로부터 산마늘 부위별 추출물을 제조하였다. 각각의 산마늘 추출물을 증류수에 넣어 1000 ㎍/ml로 만들었다. 얻은 용액을 0.2 M 포스페이트 완충용액 (pH 6.6) 2.5 ml와 1% K₃Fe(CN)₆ 2.5 ml와 혼합하였다. 얻은 혼합물을 20분 동안 50℃에서 반응시켰다. 그런 다음 10% 트리클로로아세트산 2.5 ml를 첨가하였고, 2,090 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 얻은 혼합물 중 상층액 2.5 ml를 증류수 2.5 ml 및 0.1% FeCl₃ 0.5 ml와 혼합하였고, UV-분광계(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2: 산마늘 추출물의 환원력(산마늘 추출물의 농도는 1,000 ㎍/ml임)

산마늘 부위	환원력
씨	0.11±0.00
잎	0.42±0.01
꽃대	0.27±0.01
줄기	0.09±0.00
뿌리	0.05±0.00

상기 표 2에서 살핀 바와 같이, 산마늘 추출물의 환원력을 나타내었다. 특히 잎 부위 추출물은 타 부위의 추출물보다 월등히 높은 환원력을 나타내었다. 또한, 꽃대와 잎 부위의 추출물은 뿌리와 줄기의 추출물보다 높은 환원력을 나타내었다.

실험예 2: 산마늘 추출물의 호중성 백혈구로부터 HUVEC 보호 효과

(1) 호중성 백혈구(neutrophile)(PMN)의 분리

건강한 성인 남자로부터 전혈(whole blood)을 채취하였고 헤파린(Sigma-Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA))으로 처리하여 응고를 방지하였다. Histopaque-1083(Sigma-Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA))을 첨가하여, 원심분리하여 다른 세포내 입자들로부터 호중성 백혈구를 분리하였다. 그런 다음 덱스트란 용액(dextran T-500, Amersham Biosciences Inc., Uppsala, Sweden)을 이용한 침전과 저장성 식염수를 이용한 삼투압 차이에 의해 호중성 백혈구를 분리하였다. 분리한 호중성 백혈구를 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가 함유되지 않은 HBSS(Hank's balanced salt solution, GIBCO, Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA)(pH 7.4)를 사용하여 1 x 10⁷ 세포/ml의 농도로 현탁하여 사용하였다.

(2) 활성화된 호중성 백혈구로부터 HUVEC 보호 효과

상기에서 준비한 호중성 백혈구 일정량에 fMLP(n-포르밀-메티오닐-레우실-페닐알라닌)(Sigma-Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA))(1uM)를 첨가하고 1 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양하여 호중성 백혈구로부터 슈퍼옥사이드의 분비를 활성화시켰다. fMLP는 호중성 백혈구를 활성화시켜 슈퍼옥사이드를 분비하도록 자극하는 생화학적 물질이다. 인간 제대 정맥 내피 세포인 HUVEC(CRL-2480, ATCC, Manassas, VA, USA)를 96 웰 플레이트에 1× 10⁵ 농도로 접종하여 24시간 동안 배양시켰다. 그런 다음, 배양시킨 HUVEC에 상기 fMLP으로 활성화시킨 호중성 백혈구 1× 10⁵ 농도 (100 μl)를 첨가하여 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양시켰다. 그 후, 통상적인 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 방법으로 HUVEC에 대한 세포 독성 정도를 평가하였다. 구체적으로는, MTT(Sigma Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA)) 용액을 각각의 웰이 최종 농도 0.5 mg/ml가 되도록 첨가하였고, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 플레이트로부터 모든 배지를 제거하였고, DMSO 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여, 생성된 포르마잔이 5분 동안 실온에서 용출되도록 하였다. UV-분광 플레이트 리더(Emax, Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 fMLP를 처리하지 않은 호중성 백혈구를 첨가하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.

HUVEC의 생존률은 fMLP를 처리하지 않은 군에서의 HUVEC 단일 층에 대한 비율로 나타내었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 살핀 바와 같이, 본원 발명의 산마늘 추출물을 함께 처리한 HUVEC는 fMLP를 처리하지 않은 군과 거의 유사한 HUVEC 생존률을 나타내었다. 따라서, 본원 발명의 산마늘 추출물은 활성화된 호중성 백혈구로부터 분비되는 슈퍼옥사이드 음이온으로부터 HUVEC를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있다. 구체적으로 산마늘의 씨 부위 추출물은 HUVEC를 94% 보호하는 효과를 나타내었고, 잎 부위의 추출물은 85%의 보호 효과를 나타내었다. 또한, 이러한 보호 효과는 산마늘 추출물의 농도를 높일수록 증가되었다.

실험예 3: 산마늘 추출물의 세포 독성( cytotoxicity ) 조사

(1) 세포 배양

(a) HUVEC 배양

인간 제대 정맥 내피 세포인 HUVEC(CRL-2480, ATCC, Manassas, VA, USA)을10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 100 유닛/ml, 헤파린 0.1 mg/ml 및 ECGC(endothelial cell growth supplement, GIBCO, Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA) 0.03 mg/ml를 함유하는 F-12K 영양 혼합물(Kaighn's modification, GIBCO, Invitrogen Inc.,)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양하였다. 배지액 중의 트립신 저해제를 함유하는 혈청 성분을 제거하기 위하여 HUVEC 단일 층을 PBS(pH 7.4)로 2회 세척한 후, 0.05% 트립신(0.53 mM EDTA)(Gibci, Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA)을 사용하여 세포를 계대 배양하였다.

(b) 랫트 간 상피 세포(Rat liver epitherial cell)의 배양

랫트 간 상피 세포(WB-F344 cell, East Lansing, MI, USA)를 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신 100 유닛/ml를 함유하는 DMEM(Gibco, Invitrogen Inc.,) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 0.05% 트립신을 사용하여 계대 배양하였다.

(2) 세포 독성 조사

WB-F344 세포와 HUVEC를 96 웰 배양 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 사용하여 1 x 10⁴ 세포/웰의 농도로 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양하였다. 산마늘의 씨, 잎, 뿌리를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방 법으로 산마늘 부위별 추출물을 제조하였다. 산마늘 추출물을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. HUVEC에 대해서는 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 250 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 1000 ㎍/ml 농도로 산마늘 추출물을 사용하였다. WB-F344 세포에 대해서는 3.125 ㎍/ml, 6.25 ㎍/ml, 12.5 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml의 농도로 산마늘 추출물을 사용하였다. MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)(Sigma Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA)) 용액을 각각의 웰이 최종 농도 0.5 mg/ml가 되도록 첨가하였고, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 플레이트로부터 모든 배지를 제거하였고, DMSO 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여, 생성된 포르마잔이 5분 동안 실온에서 용출되도록 하였다. UV-분광 플레이트 리더(Emax, Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 산마늘 추출물을 처리하지 않은 세포군을 사용하였다. 생존률은 대조군에 대한 산마늘 추출물 처리군의 흡광도 비율로 정의하였다. 그 결과를 하기 표 3과 표 4에 나타내었다.

표 3: HUVEC에 대한 산마늘 추출물의 세포 독성

산마늘 추출물 농도	산마늘 추출 부위
산마늘 추출물 농도	씨	잎	뿌리
0	100.4±5.7	100.4±5.7	100.4±5.7
50	95.6±4.8	98.8±11.6	105.9±4.2
100	93.8±7.5	92.3±7.9	106.5±4.7
250	100±6.8	104.8±6.9	117.4±1.3
500	107.2±2.5	126.9±4.2	139.2±6.1
1000	122.0±5.4	181.3±9.6	132.5±8.0

표 4: WB-F344 세포에 대한 산마늘 추출물의 세포 독성

산마늘 추출물 농도	산마늘 추출 부위
산마늘 추출물 농도	씨	잎	뿌리
0	100±2.2	100±5.4	100±2.2
3.125	85.3±2.1	86.3±3.2	80.1±8.9
6.25	80.2±5.5	80.0±5.3	79.2±3.5
12.5	78.1±3.3	82.2±4.9	70.7±6.3
25	72.5±1.1	68.2±4.2	74.8±5.4
50	60.1±3.1	74.5±4.6	70.1±3.7
100	57.2±2.2	77.6±7.8	66.5±6.0

상기 표 3과 표 4에서 살핀 바와 같이, 산마늘 추출물은 HUVEC 단일층에 대해서는 세포 독성을 보이지 않았다. 그러나, WB-F344 세포에서는 세포 독성을 나타내었다. 따라서, 산마늘 추출물은 WB-F344 세포에서서는 심각한 세포 독성을 보이지만, 혈관내 기능 이상과 관련된 HUVEC 단일층의 세포 증식에는 특이적으로 세포 독성을 나타내지 않았음을 알 수 있다. 따라서, HUVEC 단일층에 대하여 산마늘 추출물의 세포 흡착 실험을 수행하였다.

실험예 4: 산마늘 추출물의 단핵 백혈구 세포와 HUVEC 의 흡착 저해 효과

(1) 세포 배양

(a) 단핵 백혈구 세포(Monocytic cell)인 THP-1 세포 배양

단핵 백혈구 세포인 THP-1은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 구입하였다. 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신 100 유닛/ml를 함유하 는 RPMI-640(GIBCO, Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA) 배지에서 단핵 백혈구 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포현탁액을 2,090 x g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였고, 계대 배양하였다.

(b) HUVEC 배양

인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)(CRL-2480, ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 100 유닛/ml, 헤파린 0.1 mg/ml 및 ECGC 0.03 mg/ml를 함유하는 F-12K 영양 혼합물(Kaighn's modification, GIBCO, Invitrogen Inc.,)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양하였다. 트립신 저해제를 함유하는 혈청 성분을 제거하기 위하여 HUVEC 단일 층을 PBS(pH 7.4)로 2회 세척하였다. 0.05% 트립신(0.53 mM EDTA)를 사용하여 세포를 계대 배양하였다.

(2) 세포 흡착 분석 실험

계대 배양한 단핵 백혈구 세포(THP-1 세포)를 5 μM calcein-AM(칼세인 O,O'-디아세테이트 테트라키스(아세톡시메틸)에스테르)(Sigma-Aldrich Inc., (St. Louis, MO, USA)(PBS 용액, pH 7.4)으로 30분 동안 37℃에서 처리하여, 단핵 백혈구 세포를 형광을 나타내는 calcein-AM으로 표지화하였다. 그런 다음 PBS로 3회 세척하여 세포를 표지화하고 남은 calcein-AM을 제거하였다. 흡착 실험을 수행하기 위해서는, 표지화된 세포를 RPMI-640에 현탁하여 사용하였다.

세포 흡착 분석을 위해 계대 배양한 HUVEC를 96 웰 조직 배양 플레이 트(Corning 3603, Corning In.)에서 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 24시간 동안 37℃에서 배양한 후, 얻은 HUVEC 단일 층에 산마늘 추출물(1000 ㎍/ml)을 첨가하여 24시간 동안 배양을 계속하였다. 산마늘 추출물은 산마늘의 씨, 잎 또는 뿌리에 대해 상기 실시예 1의 방법으로 이용하여 얻었다. 그런 다음 TNF-α(BD Science, San Jose, CA, USA) 5 ng/ml를 첨가하여 24시간 동안 세포 흡착을 활성화하였다. 세포 흡착 실험 전에 PBS로 3회 세척하였다.

calcein-AM으로 표지화된 THP-1을 5 x 10⁵ 세포/웰의 농도로 상기 활성화된 HUVEC와 혼합하였고 1시간 동안 37℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 배양하였다. PBS로 4회 세척하여 흡착되지 않은 THP-1을 제거하였다. HUVEC에 흡착된 calcein-AM으로 표지화된 THP-1은 형광 플레이트 리더(fluorescence plate reader, FL600, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정하였다. 이때 측정된 calcein-AM의 여기/발광 파장은 485 nm/530 nm 이었다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5: HUVEC 단일층과 THP-1의 세포 흡착 저해 효과

산나물 추출 부위	저해 효과(%)
씨	105.75
잎	ND¹ ⁾
뿌리	45.74

1) ND: 저해 효과가 검출되지 않음

상기 표 5에서 살핀 바와 같이, 본원 발명의 산마늘 추출물은 HUVEC 단일층과 THP-1의 세포 흡착 저해 효과를 나타내었다. 특히 산마늘의 씨로부터 얻은 추 출물은 HUVEC 단일층과 THP-1의 세포 흡착을 기초적인 수준(basal level)까지 저해시켰다.

세포 흡착 저해 효과를 추가로 확인하기 위하여, HUVEC을 24 웰 배양 플레이트에 배양하였고, 상기와 동일한 방법으로 calcein-AM으로 표지화된 THP-1과의 흡착을 역상 형광 마이크로스코프(inverted fluorescence microscope, IX 71, OLYMPUS iNC., Tokyo, 일본)으로 100 배율 및 200 배율로 촬영, 기록하였다. 사용한 산마늘 추출물은 산마늘의 뿌리로부터 얻은 추출물이다. 현미경에 부착된 OLYMPUS DP50 카메라(Imaging software, ViewfinderLite, 1.0.134 버젼, Pixera Corporation, Los GATOS, USA, OLYSIA BioAutoCell 3.2 버젼, SoftImaging System, Tokyo, 일본)를 사용하여 실시간으로 관찰하였고, 사진으로 확인하였다. TNF-α로 활성화된 상태의 사진과 기본적인 수준(basal level)의 사진을 이용하여 산나물 뿌리 추출물의 세포 흡착 저해 효과를 판단하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에서 나타난 바와 같이, 본원 발명의 산마늘 씨 부위의 추출물이 HUVEC 단일층과 THP-1의 세포 흡착을 기초적인 수준(basal level)까지 저해시켰음을 알 수 있다.

실험예 5: 산마늘 추출물의 CAM 단백질 전사 전해 효과

세포 흡착 분자(CAM) 중 VCAM-1(vascular cellular adhesion molecule-1), ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1), E-selectin에 대한 산마늘 추출물의 전사 저해 효과를 조사하였다.

산마늘의 씨, 잎 및 뿌리에 대해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 산마늘의 부위별 추출물을 제조하였다. HUVEC 단일 층에 산마늘 추출물을 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 5 mg/ml를 첨가하여 30분 동안 미리 배양하였다. 그런 다음, TNF-α 10 ng/ml를 첨가하고 6시간 동안 배양하였다. HUVEC로부터 RNA를 RNeasy kt(Quiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. RT-PCR은 Quiagen 사와 Bioneer 사의 One-Step RT-PCR kit를 이용하여 수행되었다. PCR에 사용된 프라이머를 하기 표 6에 나타내었고, 최종 농도는 1 μM 이었다.

표 6: RT-PCR을 위한 프라이머(FP: forward primer, RP: reverse primer)

유전자	프라이머 서열
VCAM-1(FP)	5'-ATGCCTGGGAAGATGGTCGTGA-3'
VCAM-1(RP)	5'-TGGAGCTGGTAGACCCTCGCTG-3'
1CAM-1(FP)	5'-GGTGACGCTGAATGGGGTTCC-3'
ICAM-1(RP)	5'-GTCCTCATGGTCGGGCTATGACTC-3'
E-selectin(FP)	5'-ATCATCCTGCAACTTCACC-3'
E-selectin(RP)	5'-ACACCTCACCAAACCCTTC-3'
GAPDH(FP)	5'-ATGACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'
GAPDH(RP)	5'-CTGGTGGTCCAGGGGTCTTACTCCT-3'

전사 효율의 비교를 위해 GAPDH 유전자의 전사효율과 비교하였다. PCR은 Bio-RAD 써멀 사이클러(thermal cycler)(MJ Mini, Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하였고, RT는 cDNA의 합성과 사전 변성(predenaturation)을 위해 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 동안 실시하였다., PCR 증폭은 95℃에서 1분(변성), 55℃에서 2분(어닐링), 72℃에서 3분(확장)을 30회 실시하였다. 최종적으로 72℃에서 10분 동안 최종 확장시켰다. 얻은 RT-PCR 생성물을 아가로스 겔에서 분리하기 전까지 4℃에서 보관하였다. 대조군으로는 TNF-α를 처리하지 않은 군과 TNF-α를 처리하고 산마늘 추출물을 처리하지 않은 군을 사용하였다. 아가로스 겔에서 분리한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 살핀 바와 같이, TNF-α를 처리하지 않은 경우 HUVEC 내의 CAM 단백질의 기본적인 mRNA 전사 결과에는 밴드가 검출되지 않았다. 그러나, TNF-α를처리하였을 때에는, CAM 단백질의 전사가 상당히 증가하였다. 본원 발명의 산마늘 추출물을 처리하였을 때에는, CAM의 mRNA 전사가 저해되었다. 산마늘 씨 부위의 추출물은 ICAM-1의 경우 mRNA의 전사에 조금 영향을 미친 반면에, VCAM-1과 E-selectin의 전사를 상당히 감소시켰고, 이는 산마늘 추출물의 농도를 증가시킬 수록 전사를 많이 저해하였다. 또한, 산마늘의 잎과 뿌리 부위의 추출물은 VCAM-1의 전사 정도를 상당히 저해하였음을 알 수 있다.

도 1은 활성화된 호중성 백혈구(neutrophile)에 대해 HUVEC를 보호하는 산마늘 추출물(산마늘의 잎, 씨, 뿌리 추출물)의 영향을 나타낸 것이다.

도 2는 THP-1과 HUVEC 단일 층의 세포 흡착에 대한 산마늘의 씨 추출물의 억제 효과를 100 배율(A)과 200 배율(B)의 형광 이미지로 나타낸 것이다.

도 3은 TNF-α로 활성화된 HUVEC에서 CAM mRNA의 전사 발현에 대한 산마늘 추출물(산마늘의 씨, 잎, 뿌리 추출물)의 억제 영향을 나타낸 것이다.

Claims

산마늘(Allium victorialis subsp . platyphyllum)로부터 추출되는 것을 항산화성 산마늘 추출물.
산마늘(Allium victorialis subsp . platyphyllum)로부터 추출되는 것을 항염증성 산마늘 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 에탄올, 메탄올, 프로판올, 클로로포름, 아세톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 첨가하여 추출되는 것을 특징으로 하는 산마늘 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘의 잎 또는 씨로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 산마늘 추출물.
제1항 또는 제2항의 산마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항염증성 질환은 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항의 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 항염증성 질환의 예방용 기능성 식품.
제7항에 있어서, 상기 항염증성 질환은 류마티스 관절염 또는 아테롬성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.